Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca basata sulle proteine come l'annotazione di nuove proteine o domini proteici, la caratterizzazione delle proprietà strutturali e funzionali delle proteine conosciute, la definizione di reti di interazione proteica o firme di anticorpi antigeni in diverse condizioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è completamente imparziale, ad alta produttività e modulare per qualsiasi tipo di studio che va da un singolo gene fino a un intero genoma. La costruzione di una biblioteca domainone è molto utile per gli studi funzionali.
Può essere trasferito in un contesto di visualizzazione del fago e utilizzato per la selezione rispetto a diversi bersagli come proteine leganti o anticorpi purificati. L'accoppiamento con NGS consente un'analisi estremamente sensibile e potente. Allo stesso tempo, gli strumenti web appositamente sviluppati danno una caratterizzazione precisa dell'intero domainoma e interactome.
Per costruire prima la libreria ORF, sonicare il DNA con impulsi di 30 secondi al 100% di uscita. Dopo la sonicazione, caricare la scala e il DNA sonicato su un gel di agarosio all'1,5%. Quindi avviare l'unità di elettroforesi a cinque volt per centimetro per 15 minuti.
L'elettroforesi del gel di agarosio mostra la presenza di striscio di DNA che conferma la sonicazione. Questo è in confronto alla banda solida ottenuta da un DNA non sottoposto a sonicazione. Quindi tagliare la porzione di gel con lo striscio di DNA frammentato e purificare utilizzando il kit di estrazione del gel a colonna.
Misurare la concentrazione del DNA purificato nello spettrofotometro UV. Quindi seguire le istruzioni del produttore e trattare cinque microgrammi dell'inserto con un microlitro di miscela enzimatica a sminamento rapido. Quindi inattivare la miscela enzimatica a 70 gradi Celsius per 10 minuti.
Per preparare il vettore filtrante, digerire prima cinque microgrammi del vettore di clonazione purificato con enzima di restrizione EcoRV. Quindi caricare i vettori digeriti e non digeriti e il marcatore molecolare su un gel di agarosio dell'1%. Quindi riscaldare inattivare l'enzima di restrizione a 80 gradi Celsius per 20 minuti.
Successivamente, fosforilato il vettore digerito con cinque unità di enzima fosfatasi e 1/10 volume del tampone 10X fosfatasi. Quindi incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi inattivare l'enzima fosfatasi a 65 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi, estrarre il plasmide dal gel e purificare il DNA. Quindi misurare la concentrazione del DNA nello spettrofotometro UV. Per eseguire la reazione di legatura, aggiungere 400 nanogrammi degli inserti fosforilati a un microgrammo di vettore digerito, 10X T4 DNA ligasi buffer e T4 DNA ligasi ad un volume finale di 100 microlitri.
Quindi incubare la reazione di legatura a 16 gradi Celsius per la notte. Il giorno dopo, il calore inattiva la ligasi a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Aggiungere quindi 1/10 volume di tre acetati di sodio molare a pH 5,2 e 2,5 volumi di etanolo al 100% per far precipitare il prodotto di legatura.
Per far precipitare il DNA, mescolare i reagenti e congelare a meno 80 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo 20 minuti, centrifugare alla massima velocità per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, espellere il supernatante.
Al pellet aggiungere 500 microlitri di etanolo freddo al 70% e di nuovo centrifuga. Scartare il supernatante alla fine della centrifugazione. Una volta asciugato il pellet all'aria, sciogliere il DNA precipitato in 10 microlitri di acqua.
Prima di eseguire l'elettroporazione, disporre il numero appropriato di tubi di microcentrifugo e cuvette di elettroporazione di 0,1 centimetri sul ghiaccio. Quindi aggiungere un microlitro del prodotto di legatura purificato a 25 microlitri delle cellule. Quindi pipettare il DNA, miscela cellulare alla cuvetta di elettroporazione fredda e far scorrere il tubo.
Quindi pulire l'acqua dall'esterno della cuvetta e posizionare nell'unità di elettroporazione e colpire l'impulso. Al termine dell'elettroporazione, aggiungere rapidamente un millilitro di mezzo liquido 2X YT senza alcun antibiotico alle cellule nella cuvetta. Quindi trasferire la miscela cellulare in un tubo da 10 millilitri.
Lasciare il tubo su uno shaker a 220 giri al minuto a 37 gradi Celsius per un'ora. Placcare le diluizioni della libreria su piastre di agar 2X YT di 10 centimetri integrate con cloramfenicolo, ampicillina e solo cloramfenicolo. Questo per ottenere singole colonie da testare dalla PCR e per eseguire la titolazione.
Successivamente, placcare le cellule competenti trasformate su piastre di agar 2X YT di 15 centimetri integrate con cloramfenicolo e ampicillina. Quindi incubare le piastre a 30 gradi Celsius per la notte. Il giorno dopo, conta le colonie scegliendo la diluizione dove sono contate.
Quindi calcolare le dimensioni della libreria. La dimensione della libreria è calcolata come segue, il numero medio di colonie volte il fattore di diluizione per il volume totale della libreria. Le dimensioni della libreria dovrebbero essere dell'ordine di 10 alla potenza di sei cloni.
Se la concentrazione di ampicillina è ottimale per eseguire più filtraggio, il numero di cloni si riduce a uno a 20 di quello ottenuto in assenza di questo antibiotico. Per testare le colonie positive, usa un suggerimento per raccogliere circa 15-20 singole colonie. Quindi diluire le colonie con 100 microlitri di mezzo 2X YT senza antibiotici.
Successivamente, la PCR amplifica 0,5 microlitri della coltura come modello di DNA con Taq DNA polimerasi. Durante la PCR, eseguire 25 cicli di amplificazioni utilizzando una temperatura di ricottura di 55 gradi Celsius e un tempo di estensione di 40 secondi a 72 gradi Celsius. Verificare che la lunghezza dell'inserto sia nell'intervallo previsto da 150 a 750 coppie di basi.
E che diverse colonie presentano inserti diversi con dimensioni diverse. Ciò indica una buona preparazione della libreria in termini di variabilità. Successivamente, aggiungere tre millilitri di mezzo YT fresco 2X alle piastre da 150 millimetri per raccogliere i batteri.
Quindi raccogliere i batteri usando un raschietto sterile. Dopo aver mescolato accuratamente, aggiungere il 20% di glicerolo e lasciare in meno 80 gradi Celsius nelle aliquote per un uso futuro. Per un uso immediato, eseguire il kit di estrazione del plasmide a colonna per purificare il DNA plasmide da una delle aliquote della libreria prima di aggiungere glicerolo.
Misurare la concentrazione del DNA nello spettrofotometro UV e quindi conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius fino all'uso. Utilizzare 2,5 microlitri della libreria come modello di DNA per l'amplificazione PCR. Impostare le condizioni del termociclo e avviare la corsa.
Utilizzare quindi un kit PCR di indice per eseguire la PCR di indicizzazione. In questo modo verranno sequenziate le doppie librerie indicizzate all'interno delle esecuzioni di Illumina multiplexate. Quindi impostare le condizioni del termociclo e iniziare la corsa.
Dopo la purificazione con perline AMPure XP, per verificare le dimensioni, eseguire un microliter della diluizione da uno a 10 della libreria finale sul bioanalizzatore. Quindi quantificare selezionando l'area della traccia della libreria finale. Queste rappresentazioni schematiche vengono dimostrate che dopo la clonazione in vettore filtrante P, solo le colonie corrispondenti agli ORF producono beta-lattamasi funzionale in presenza di antibiotici.
Dopo aver filtrato è prevista una diminuzione del numero di cloni di 20 volte. Con ORF di buone cartelle che crescono a concentrazioni antibiotiche più elevate. Inoltre, i frammenti ORF possono essere facilmente recuperati dalla libreria filtrata.
Una libreria ORF di faagemidi è costruita per eseguire la selezione della visualizzazione del fago contro proteine o anticorpi bersaglio. Tutte le librerie e gli output ottenuti vengono poi analizzati in profondità dal NGS. L'NGS fornisce informazioni complete sulla diversità della biblioteca, l'abbondanza e la mappatura precisa di ciascuno dei frammenti selezionati.
Infine il webtool interactome seek sviluppato genera letture di sequenziamento grezze che vanno all'elenco dei domini putativi con annotazioni genomiche. Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire e convalidare una libreria di domainomi da una fonte di DNA desiderata. E per eseguire uno screening ad alta produttività della biblioteca entro il sequenziamento di nuova generazione.
Abbiamo ottimizzato il sequenziamento delle librerie filtranti ORF con le piattaforme Illumina e sviluppato uno strumento web che rende possibile l'analisi di questo tipo di dati senza alcuna necessità di capacità di programmazione.
