Agradecemos a Dipa Bhaumik, Aaron Miller e Bob Hughes para assistência técnica. Cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Estamos gratos à Georgia Woods e membros de Lithgow, Kapahi e Melov Labs para debates úteis. M.L. foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) formação Grant T32 AG000266 e um Ellison Medical Foundation/American Federação de envelhecimento pesquisa Doctoral Fellowship. Este trabalho foi financiado por um subsídio da BioAge Labs, um subsídio de Larry L. Hillblom Foundation, bem como institutos nacionais de saúde concede UL1024917, apoiando o consórcio de pesquisa interdisciplinar em Geroscience e 1R01AG029631-01A1 para G.J.L.

1. preparação de Buffers
<ol><li>
Caldo LB
	<ol>
<li>Use pré-misturados grânulos (veja a Tabela de materiais) e seguir o protocolo do fabricante para a preparação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Crescimento de nematoides Media (NGM) ágar
	<ol>
<li>Misture a 23 g de ágar-ágar, 3 g de NaCl, 2,5 g de bacto peptona, e água desionizada para 0.972 L. Autoclave e deixe esfriar a 60 ° C, em seguida, adicionar 25 mL de tampão de fosfato (KPO4) de potássio 1m (pH 6,0), 1 mL de 1m de sulfato de magnésio (MgSO4) , 1 mL de 1 M de cloreto de cálcio (CaCl2) e 1 mL de colesterol de 5 mg/mL (em etanol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solução de hipoclorito
	<ol>
<li>Misture 5 mL de 5 M de KOH, 4 mL de solução de hipoclorito de sódio (6%) e desionizada H2O para um volume total de 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
S basal
	<ol>
<li>Misture 5 g de NaCl, 1 g de K2HPO4, 6 g de KH2PO4e água desionizada para 1L, então autoclave.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação de concentrado de Escherichia coli (OP50)
Nota: Este passo se concentra em 1 L de uma solução saturada de Escherichia coli em 25 mL de tampão basal de S.
<ol><li>Inocular 5ml de autoclavado caldo LB (etapa 1.1) com uma única colônia de e. coli (cepa OP50) e incube por 4-6 h a 37 ° C, com agitação (250 rpm). Use 0,1 mL desta solução para inocular 1 L de LB em um Erlenmeyer de 2 L. Incube os 1L frascos durante a noite (12-16 h) a 37 ° C, com agitação (250 rpm).</li>
	<li>Centrifugue a culturas durante a noite de 1 L em garrafas de 500 mL centrífuga durante 5 min à 10.000 x g e 4 ° C para as bactérias de pelotas e decantar fora mídia restantes. Resuspenda o pellet em 25 mL de S Basal (etapa 1.4). Loja a 4 ° C.</li>
</ol>3. preparação das placas de cultura NGM
<ol><li>Para placas de cultura de massa usadas para produzir um grande número de vermes, dispense 30 mL de ágar NGM fundido (60 ° C) (etapa 1.2) em um fluxo laminar em placas de cultura de 10 cm com um aparelho de distribuição fluido automatizado ou uma pipeta sorológica. Deixe secar durante a noite.</li>
	<li>Pipetar 2 mL do concentrado OP50 em cada placa de 10 cm, espalhar para cobrir completamente a superfície do agar por inclinar e girar a placa, então deixe chapas secar. Armazenar as placas a 4 ° C por até 2 semanas.</li>
	<li>Para placas de cultura de ensaio de alto throughput usadas para a seleção, utilizam um dispensador de 8 canais automatizados para dispensar 0,15 mL de ágar NGM derretido em cada cavidade de uma placa bem 96 em um gabinete de fluxo laminar. Muito cuidado para fazer poços de certo são desprovido de bolhas, como estas permitirá escoar-se de vermes que irão comprometer o ensaio naquele poço. Deixe secar durante a noite. Armazenar as placas a 4 ° C por até 2 semanas.</li>
</ol>4. preparação de temperatura sensível (ts) culturas de massa estéril C. Elegans
<ol><li>Para iniciar as culturas, usando um 'verme pick' (escolher uma pipeta de vidro com um fio de platina anexado ou um verme manufacturado) sob um microscópio de dissecação, transferir 20 ovos (estirpe TJ1060: spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) em placas de cultura de massa, preparadas na etapa 3.1. Em seguida, incubar as placas a 20 ° C por 6 dias (permite mais de uma geração de crescimento, como você está direcionando para a coleção da descendência dos 20 ovos movidos).</li>
	<li>Visualmente, confirme presença de gravid adultos (ovos presentes no útero) com um microscópio de dissecação. Colete os adultos gravid por dispensar 2-3 mL de S basal na chapa usando uma pipeta de vidro. Agite o líquido ao redor da placa à mão, em seguida, recolher o líquido em um tubo de 15 mL com uma pipeta de vidro.</li>
	<li>Girar o tubo (1.000 x g durante 1,5 minutos a 20 ° C) para vermes de pelotas e, em seguida, Aspire o sobrenadante. Adicionar 10 mL de solução de hipoclorito (etapa 1.3) para a pelota de verme e agitar rapidamente o tubo à mão em uma direção de cima para baixo durante 5 s. Incubar por 5 min, agitando a cada 2,5 min.</li>
	<li>Novamente, girar o tubo (1.000 x g durante 1,5 minutos); o sedimento deve ser marrom-amarelada. Aspire o sobrenadante. Adicionar 10 mL de solução de hipoclorito para a pelota de ovo e agitar vigorosamente o tubo. Incube a 1-3 min, agitando ocasionalmente e enquanto monitora a aparência com o microscópio de dissecação. Confirme visualmente apenas ovos restam e prossiga para a próxima etapa.</li>
	<li>Girar o tubo (1.000 x g durante 1,5 minutos) e aspire o sobrenadante. O sedimento deve ser branco com nenhuma coloração marrom. Nota: Após a remoção da solução de hipoclorito, é fundamental usar técnicas estéreis e buffers, desde contaminação (bacteriana e fúngica, em particular) podem arruinar a experiência, desperdiçando um tempo precioso e reagentes. Este estudo usou um gabinete de filtrado de fluxo laminar e mudou-se líquidos usando somente pipetas estéreis e dicas.</li>
	<li>Abra os tubos em um espaço estéril. Lave o pellet 3 vezes com S basal, girando para baixo (1.000 x g durante 1,5 min) e aspiração afastado o sobrenadante de cada vez. Ressuspender o pellet de ovo em 2-3 mL S basal. Estes ovos agora podem ser usados para uma escotilha da noite no buffer para coletar larva L1 (passo 5).</li>
</ol>5. C. Elegans dos ovos para incubação em Buffer para obter culturas síncronas (preparação de larva L1 C. Elegans )
<ol><li>Decante o buffer e o pellet de ovo para um prato de petri de vidro estéril com uma tampa. Lave os ovos restantes do tubo em um prato com uma pipeta sorológica com 2-3 mL de S basal. Adicione 5 mL de S basal para aliviar apinhamento, como isto pode incentivar a incubação, como acender-se-á de agitação (20 rpm com um agitador orbital de dançarina do ventre). Incube durante uma noite a 20 ° C, para permitir que o tempo de ovos à escotilha (16-24 h). Todos os filhotes prenderá a 1 fase larvalst (L1), devido à ausência de alimentos. Nota: A evidência anedótica indica que preparações frescas de L1 (16-36 h após a coleta de ovos) geram as populações mais síncronas de vermes adultos.</li>
	<li>Colete L1s em um tubo de 15 mL com uma pipeta sorológica. Spin para baixo L1s em um centrifugador (1.000 x g durante 1,5 minutos), embora Aspire o sobrenadante e repita até que todos os L1s foram coletados de incubação placas, deixando 10 mL de S basal para a próxima etapa.</li>
	<li>Do tubo contendo L1s, micropipeta sair 0,01 mL (imediatamente após a mistura) e dispense-lo em um não-semeada (não de e. coli) placa NGM. Conte o número de L1s na placa. Repetir 10 vezes e obter uma média para o número de L1s em cada alíquota. Geralmente, espera-se entre 1-3 L1s por µ l (quando começando com 1 placa de cultura de massa, contendo 20 ovos).</li>
	<li>Determine com uma pipeta sorológica, o volume de S basal segurando o L1s. Então extrapolar com determinado número médio de vermes por 0,01 mL, obtida na etapa anterior, para estimar o número total de L1s. Geralmente, espera que entre 10.000-30.000 L1s (por placa de cultura de massa contendo 20 ovos).</li>
	<li>Para usar esta cultura com 96 poços-teste, diluir a suspensão de L1 a 1 L1 por µ l em um frasco estéril redonda mídia e, em seguida, avance para o passo 7. Se esta cultura é para ser usado para gerar adicionais c. elegans culturas de massa, em seguida, avance para o passo 6.</li>
</ol>6. grande escala síncrono cultura preparação
Nota: Soluções de L1 podem ser usadas para aumentar rapidamente a populações de verme.
<ol><li>Para gerar números de verme grande com uma solução de L1, dispense até 5.000 L1s em cada uma das placas de cultura de massa, o número desejado. Coletar gravid adultos 2,5 dias depois (20 ° C), conforme descrito nas etapas 4.1-2 e avance para o passo 4.3 para recolher os ovos.</li>
	<li>Como curiosamente observou que repetiu coleção hipoclorito pode salientar a população subjugada, dividir as populações por colhendo ovos de propagação antes de submeter a população remanescente para tratamentos de hipoclorito, então esse múltiplo gerações da população não são repetidamente submetidas a tratamento da solução de hipoclorito.</li>
</ol>7. instalação de placas de 96 poços de ensaio
<ol><li>Permitir que as placas de ensaio (preparadas na etapa 3.3) para atingir a temperatura. Em seguida, em um fluxo laminar, adicione 5 µ l de concentrado OP50 (preparado no passo 2.2) a cada poço. Como antes, use um dispensador de 8 canais automatizados.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de suspensão de L1 a cada poço usando um dispensador de 8 canais automatizados. Isto produzirá sobre vermes média 10 por alvéolo, uma vez que eles estão presentes na suspensão em 1 L1 por µ l. Para promover a distribuição igual de L1s do chorume, dispense L1s de uma garrafa redonda mídia ativamente misturada com um moderadamente lentamente girando barra de agitação.</li>
	<li>Cubra o prato com tampa, lotes de caixa de placas e incubar a 25 ° C por 2 dias.</li>
</ol>8. tratamento 1 st dia adultos de c. elegans com produtos químicos
<ol><li>Remover placas de biblioteca química do freezer e deixe chapas atingir a temperatura ambiente antes de prosseguir. Nota: Placas biblioteca química descritos aqui são 96 bem as placas contendo compostos distintos em cada poço, todos os que estão na mesma concentração e dissolvidos em DMSO. Essas bibliotecas não utilizam as colunas externas, e então cada placa tem um máximo de 80 substâncias químicas distintas. O protocolo descrito aqui, a concentração de biblioteca é 10mm. É importante considerar os efeitos de solventes na fenótipos. Enquanto este estudo telas na concentração de 0,5% DMSO, este nível nunca foi ultrapassado nestes ensaios de vida útil e em ensaios de baixa taxa de transferência, onde é mais provável que escolher uma concentração de solução-mãe composto. Este protocolo não excede 0,25%, que é um nível em que modificações de expectativa de vida não ocorrem16, pelo menos da estirpe de N2.</li>
	<li>Agite suavemente o prato em 60 rpm num agitador microplacas para 1 min imediatamente antes da utilização.</li>
	<li>Usando um automatizado líquido 96 poços manipulador, transferência 0,75 µ l do composto (ou DMSO) da placa de biblioteca para a placa de ensaio. A profundidade da pipeta durante a entrega de líquido para a placa de ensaio é controlada cuidadosamente, tal que as pontas de pipeta do manipulador de líquido estão entregando o volume 0,75 µ l para o µ l ~ 15 de líquido na superfície do ágar (com vermes e OP50 concentrado de passos 7.1 -2) e não perfurar a superfície do agar no poço. Não utilize pipetas multicanal de manual 8 ou 12 exceto em telas muito pequenas (< 10 placas), como eles podem aumentar o erro e muitas vezes resultar em perfuração da superfície do agar, que compromete o ensaio.</li>
	<li>Prepare-se placas de controlo negativo biblioteca química com DMSO (dimetil sulfóxido), assumindo que a biblioteca que está sendo testada usa DMSO como solvente. Fazer 1 placa de controlo negativo para cada 5 teste de placas, até 10 placas de controlo negativo. Se possível, também fazer uma placa de controle positivo (PN11 a 20 mM, para uma concentração final de 0,1 mM, é eficaz para este fim; ver seção resultados representante). Não adicione produtos químicos (teste ou controle) para as 2 colunas exteriores das placas, como eles são particularmente suscetíveis a dessecação.</li>
</ol>9. culturas de secagem
<ol><li>Para remover o líquido da superfície do agar, secar as placas no fluxo laminar para 4-8 h. É fundamental que estas placas são secadas completamente mas não tornar-se desidratado. Como algumas placas levará mais tempo para secar do que outros, acompanhar de perto todas as chapas e remover quando estão secos. Confirme a secagem por inspeção visual cuidadosa dos poços individuais da placa. Nota: Dependendo de fatores que incluem a taxa de escape do gabinete, o tempo que isso leva deve ser empiricamente determinado. Essa etapa de secagem pode levar cerca de 4-8 h para um armário cheio.</li>
	<li>Selo de placas com película transparente e, em seguida, colocar as tampas de chapa.</li>
	<li>Girar as placas de 96 poços de ensaio para 45 s a 1.000 x g.</li>
	<li>Armazenar as placas invertidas a 25 ° C.</li>
</ol>10. culturas de C. Elegans de Pontuação para a longevidade
<ol><li>Monitorar placas de controlo negativo até > 95% de mortalidade é observada. Verifica placas semanalmente para as duas primeiras semanas e diariamente depois disso. Caenorhabditis coortes da mesma espécie e estirpe podem exibir lifespans significativamente diferentes julgamento17. Nota: Para o ensaio de vida útil aqui descrito, com TJ1060 animais, cultivados em 25 ° C, 95% de mortalidade nessas populações ocorreu de adulto dia 16-20.</li>
	<li>Quando os poços de controlo negativo são considerados ter chegado a > 95% mark, spin para baixo todas as placas de 96 poços de ensaio para 45 s em uma centrífuga de mesa com uma microplaca adaptado do rotor (250 x g durante 45 s a 20 ° C).</li>
	<li>Marca todos os poços nas placas de controle. Isto é feito contando e registrando o número de animais vivos e mortos em cada poço. Vermes mortos podem ser diferenciadas de vermes vivos por sua completa falta de movimento. Provoca movimento em vermes vivos, largando a placa bem 96 de aproximadamente 7 cm na superfície de microscópio de dissecação ao olhar através da ocular para qualquer resposta evocada. Vermes mortos não vão responder, e companheiros de laboratório nas proximidades não podem apreciar o ruído repetitivo.</li>
	<li>Para as placas de teste, contagem e registro somente poços contendo vermes vivos. Quando uma minhoca ao vivo é observada, conte todos os animais vivos e mortos, naquele poço, juntamente com a posição bem e placa. Nota: Muitas vezes é útil marcar novamente as placas depois de > 99% de controlo negativo vermes estão mortos. Em telas de grande escala, isso pode ser o melhor ponto para fazer o marcador inicial. Em ambos os casos, Pontuação/re-score como descrito acima</li>
</ol>11. re-testes compostos
<ol><li>Ao testar apenas um pequeno número de compostos do candidato (< 320 compostos), como com um re-teste ou uma tela do candidato (ver resultados representativos), restringir o ensaio aos 32 centrais poços em um esforço para minimizar os efeitos possíveis da placa. Isso deixa os 2 poços mais próximo à borda da placa não tratada, mas ainda contendo ágar, comida e vermes.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+activation+of+a+food+deprivation+signal+extends+lifespan.">Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan.</a> Aging Cell. , (2016).</li><li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticonvulsant+medications+extend+worm+life-span.">Anticonvulsant medications extend worm life-span.</a> Science. 307 (5707), 258-262 (2005).</li><li>Melov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+with+superoxide+dismutase/catalase+mimetics.">Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics.</a> Science. 289 (5484), 1567-1569 (2000).</li><li>Benedetti, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+that+confer+thermal+stress+resistance+and+extended+lifespan.">Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan.</a> Exp Gerontol. 43 (10), 882-891 (2008).</li><li>Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Genes+Tied+to+Endocrine,+Metabolic,+and+Dietary+Regulation+of+Lifespan+from+a+Caenorhabditis+elegans+Genomic+RNAi+Screen.">New Genes Tied to Endocrine, Metabolic, and Dietary Regulation of Lifespan from a Caenorhabditis elegans Genomic RNAi Screen.</a> PLoS Genet. 1 (1), 17 (2005).</li><li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity.">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat Genet. 33 (1), 40-48 (2003).</li><li>Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+activities+that+mediate+increased+life+span+of+C.+elegans+insulin-like+signaling+mutants.">Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants.</a> Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).</li><li>Kwok, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist.">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441 (7089), 91-95 (2006).</li><li>Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+chemicals+that+increase+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">A high-throughput screen for chemicals that increase the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Ann N Y Acad Sci. 1170, 698-701 (2009).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Angeli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+synthesis+inhibitor+is+protective+against+proteotoxic+stressors+via+modulation+of+fertility+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).</li><li>Fabian, T. J., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+age-synchronous+mass+cultures+of+Caenorhabditis+elegans.">Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans.</a> J Gerontol. 49 (4), 145-156 (1994).</li><li>Greer, E. L., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+dietary+restriction+regimens+extend+lifespan+by+both+independent+and+overlapping+genetic+pathways+in+C.+elegans.">Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans.</a> Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).</li><li>Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+dietary+restriction+for+genetic+epistasis+analysis+and+gene+discovery+in+C.+elegans.">Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans.</a> PLoS One. 4 (2), 4535 (2009).</li><li>Hamilton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans.">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19 (13), 1544-1555 (2005).</li><li>Frankowski, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+sulfoxide+and+dimethyl+formamide+increase+lifespan+of+C.+elegans+in+liquid.">Dimethyl sulfoxide and dimethyl formamide increase lifespan of C. elegans in liquid.</a> Mech Ageing Dev. 134 (3-4), 69-78 (2013).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+genetic+background+and+experimental+reproducibility+on+identifying+chemical+compounds+with+robust+longevity+effects.">Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects.</a> Nat Commun. 8, 14256 (2017).</li></ol>

Os autores declaram que nenhuma entidade financiamento apoiar este trabalho tinha qualquer entrada na recolha de dados, análise de resultados ou a decisão de publicar.

Aqui descrevemos um método simples para cultivo de c. elegans em placas de 96 poços. Descrevemos essas culturas para uso na análise química e ensaios de vida útil, mas eles podem ser usados para vários tipos de ensaios. Enquanto as condições de cultura multi bem para rastreio química anteriormente foram relatados8, incluindo análise de expectativa de vida10, o ensaio descrito aqui difere de várias maneiras. O ensaio de expectativa de vida descrito aqui utiliza placas de 96 poços, baseia-se na estéril mutantes (em vez de esterilização química), usa as condições de cultura de ágar, usa líquido simples manipulação para mover vermes e manualmente é marcado no ponto de extremidade. As diferentes abordagens utilizadas neste ensaio podem ser de ajuda para investigadores à procura de métodos que incluem estas condições de pré-selecção.
Elementos cruciais para este protocolo centro principalmente na qualidade das placas produzidas para o ensaio. Primeiro, quando fazendo placas é imperativo que a superfície do agar é livre de borbulhas e outras imperfeições. Estas variações na superfície do agar quase sempre levam a construção de galerias e perda do poço. Em segundo lugar, esse protocolo depende secando líquidos depositados durante as fases de instalação e drogado. É fundamental que estes líquidos são completamente removidos, mas o ágar não tornar-se seco. Curiosamente, parece que os vermes em poços que não são completamente seco (natação em líquido) viver mais que poços devidamente secados, enquanto o ressecamento das placas leva à dessecação e rachamento do ágar, que leva ao verme burrowing e perda. Outro elemento crucial do presente protocolo é manutenção de condições estéreis. Como com qualquer ensaio de vida útil, há muito trabalho envolvido com a configuração da placa, e muitas oportunidades e tempo existem para arruinar a contaminação para se estabelecer e crescer com as placas de ensaio.
Enquanto o ensaio de expectativa de vida descrito aqui é útil para o rastreio de compostos em c. elegans, que se limita a determinado origens genéticas, como ele se baseia em uma estirpe sensível (ts) estéril de temperatura; usamos TJ1060, que tem penetrância alta esterilidade. Isso restringe as disponível para a seleção de cepas com este método. Alternativa se aproxima incluindo cruzando ts mutações estéril para o plano de fundo desejado ou usando a esterilização química. Nós não tentamos esterilização química com este ensaio, mas deve ser possível. Obstáculos potenciais incluem colocação o esterilizador nos vermes na fase correta e na dose adequada. O protocolo descrito aqui usa um líquido dispensador que é rápido, mas não aparece para dispensar adultos eficazmente. Então, esses vermes desenvolvem nas placas e, portanto, devem ser tratadas com a esterilização química nas placas. Determinar a dose ótima e o tempo seria importantes para o sucesso. Estratégias alternativas incluem o uso de um método de distribuição que pode mover-se adultos. No passado, nós encontramos que máquinas capazes de identificar e classificar os adultos são geralmente muito mais lentas do que os manipuladores de líquido simples, que podem dispensar lamas homogéneas de larva suspenso.
Em geral, usamos este método rapidamente produtos químicos tela e tratamentos para grandes efeitos positivos sobre a expectativa de vida. O método é particularmente eficaz quando utilizado com doses múltiplas, alta replicar os números e fechar o monitoramento dos controles negativos que são sempre mantidos e intercaladas entre as placas de teste. Controles positivos também são úteis quando projetando e implementando as telas descritas neste manuscrito. No entanto, para ser um positivo eficaz, o controle precisa ser bastante potente e/ou altamente robusto. Quando a tela foi originalmente implantada, um composto suficientemente potente e robusto não pôde ser identificado. Atualmente, existem muitos relatos na literatura 'envelhecimento' dos prováveis candidatos para controles positivos útil nas telas descritas aqui. Conforme descrito na seção de tela candidato da seção resultados esperados este manuscrito e na Figura 2 e tabela 1, o composto PN1 é um eficaz controlo positivo para esta tela. Nós confirmamos geralmente positivas correspondências a partir de telas com ensaios de vida útil padrão em placas de cultura de 3 mm.

Aqui um protocolo é descrito que foi desenvolvido para a seleção de alta taxa de transferência de compostos químicos para efeitos na expectativa de vida Caenorhabditis elegans . O protocolo em si é facilmente adaptável para outras telas fenotípicas, incluindo estudos utilizando cepas de c. elegans de repórter. Este protocolo foi utilizado com sucesso para identificar um novo composto biologicamente ativo, PN1 (nitrofenil-piperazina 1), que fortemente se estende a vida útil de c. elegans , através de um mecanismo de restrição dietética. Pn1 e uma caracterização do seu efeito sobre a expectativa de vida, incluindo uma descrição das vias genéticas em jogo, foi anteriormente descritos em outra parte1. O relatório também inclui uma descrição dos resultados de uma implementação em larga escala da tela. Aqui descrevemos mais detalhadamente a metodologia e a configuração da tela em si, que é escalável para ambas as aplicações de pequena e grande escala.
O gol que levou à criação do protocolo descrito aqui foi desenvolver uma plataforma de cultura de c. elegans que permitiu para a seleção rápida de grandes bibliotecas químicas para romance compostos biologicamente ativos. Enquanto telas químicas foram realizadas antes do desenvolvimento do presente protocolo, estas foram principalmente em pequena escala e/ou tipo de candidato se aproxima de2,3. Na verdade, a maioria das telas realizadas no laboratório em dezenas de compostos utilizados ensaios de resistência do stress, com hits, sendo projectados para longevidade efeitos4. Em vez disso, este estudo procurou diretamente da tela para efeitos de expectativa de vida. Surpreendentemente, houve poucas descrições na literatura científica aquando da realização de telas químicas de grande escala com c. elegans. Com efeito, em comparação com outros tipos de telas5,6,7, triagem de química em larga escala usando c. elegans parecia ser subempregados.
Havia duas descrições das telas de química de grande escala em c. elegans que foram usadas como base para desenvolver esta abordagem. O primeiro deles foi um elegante estudo de laboratório de Peter Roy usando telas químicas para identificar compostos que poderiam perturbar o desenvolvimento dos animais. O estudo seguiu então com uma tela de mutagénese frente para identificar os alvos genéticos destes produtos químicos8. O protocolo descrito nesse estudo usado pates 24-bem, que foi simplesmente impraticável para necessidades específicas do presente estudo (quantidades limitadas de química na biblioteca e espaço limitado disponível incubadora). Outro estudo foi de Michael Petrascheck inovador e ambiciosa pequeno-molécula tela para expectativa de vida estendendo produtos químicos9,10. Esse estudo usou placas boas 384 e culturas líquidas. A outra característica principal desta tela foi o uso de FUDR (5-fluorodeoxyuridine) para inibir a produção de descendência quimicamente. Após considerável consideração do protocolo descrito nesse estudo, foram evitadas tanto esterilização química e culturas líquidas de c. elegans .
Embora FUDR é amplamente utilizado em experiências de vida útil de c. elegans , havia preocupações que FUDR podem causar interações medicamentosas imprevistos, ou aquele FUDR em si pode ter algum efeito na expectativa de vida. Recentemente esta última preocupação foi validada, pelo menos em algumas concentrações e em particular a 25 ° C11. Para contornar o problema da contaminação de progênie, c. elegans estirpe TJ1060 foi usado, que abriga duas mutações sensíveis de temperatura independentes (spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) que suprimir a produção de espermatozoides e tem sido demonstrado para ser útil para culturas em massa das populações síncrona12. Esta estirpe foi completamente estéril a 25 ° C, mas irá produzir descendência quando cultivadas em 15-20 ° C. Este estudo usado condições de cultura convencional, com vermes rastejando na superfície do ágar, conforme os resultados obtidos com as culturas de líquido nem sempre são reproduzíveis com placas de ágar convencional. Enquanto este fenômeno não é completamente compreendido, foi demonstrado que minhocas cultivadas em líquido responder a DR (restrição dietética) de uma maneira diferente do que vermes cultivadas na mídia padrão13,14. Assim, é plausível que media líquidos pode mascarar alguns mimetics DR que caso contrário seria identificado com a tela.
Tendo resolvido sobre as condições de cultura de ágar, consideraram-se diferentes opções para pontuar o desempenho dos poços neste ensaio. Enquanto vários ensaios com base automatizados ou imagem estavam disponíveis, eles exigiram a aquisição e implantação de tecnicamente desafiador dispositivos, a maioria dos quais eram proibitivamente cara. Enquanto essas opções a considerar, era essencial para se referir a anterior telas de expectativa de vida de todos os tipos. Em última análise, este estudo usou um Pontuação método adaptado de tela de RNAi do Siu Sylvia Lee laboratório genoma inteiro para vida útil fenótipos15. Especificamente, todas as placas de expectativa de vida foram criadas da mesma forma, mas somente os controles negativos foram monitorados. Uma vez que as placas de controle negativo foram confirmadas para ter perto de mortalidade completa, placas de teste foram marcadas com a mão. Nesta tela em grande escala, positivos foram confirmados por re-testes com produtos químicos preparados na hora, usando triplicado repete o primário positivos.

<table><tbody><tr><td>LB Broth Miller Granules</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unispense&amp;nbsp;</td><td>Wheaton Science Products</td><td></td><td>automated fluid dispensing apparatus</td></tr><tr><td>96 well assay plate; COSTAR 3370</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop 384; automated 8 channel dispenser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>manufactored worm pick</td><td>Genesee Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belly Dancer Orbital Shaker</td><td>Stovall Life Science inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microplate shaker; MTS 2/4 Digital</td><td>IKA Works, inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler</td><td>&amp;nbsp;Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor&amp;nbsp;</td><td>Sorenson Bioscience, inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>manual 8 or 12 multi-channel pipettes</td><td>we use rainin&amp;hellip;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>table top centrifuge; Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method for high throughput chemical screening in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans é um organismo útil para testar os efeitos químicos sobre fisiologia. Telas de pequenas moléculas de todo organismo oferecem vantagens significativas para a identificação de estruturas químicas biologicamente ativas que podem modificar fenótipos complexos tais como expectativa de vida. Aqui descrito é um protocolo simples para produzir centenas de placas de cultura de 96 poços, com números consistentes de c. elegans em cada poço. Em seguida, especificamos como usar essas culturas para tela milhares de produtos químicos para efeitos sobre a expectativa de vida do nemátodo c. elegans. Este protocolo faz uso de cepas estéril sensível de temperatura e condições de placa de ágar simples animal para facilitar a produção rápida e alta taxa de transferência das culturas animais sincronizadas para rastreio de manipulação.

Vamos começar examinando resultados representativos de empregar este protocolo para ensaios de vida útil de 96 poços. No primeiro exemplo, o método foi usado para a tela com êxito através de 30.000 produtos químicos para identificar os produtos químicos que estendem a vida útil de c. elegans e também inclui os resultados a partir da tela de acompanhamento re-teste de melhor desempenho de produtos químicos utilizando o mesmo protocolo. Estes resultados foram descritas anteriormente1. O segundo exemplo usa o mesmo protocolo em uma tela menor escala de compostos de candidato.
Tela em grande escala e re-teste: A tela em grande escala 30.000 compostos de teste foi realizada em dose única, em duplicado. Cada produto químico, portanto, foi testado em dois poços, com uma população animal total esperado de 20. Para realizar isto, três conjuntos discretos de 10.000 compostos (em duplicado) foram exibidos durante um período de ~ 3 meses para cobrir os todo 30.000 compostos. Isto foi feito em parte, para garantir uma quantidade gerenciável de manual de pontuação no final do ensaio e exigido um total de 260 das placas em cada um dos conjuntos de ensaio de 96 poços. Em placas de biblioteca conservada em estoque, apenas 80 poços continham composto; um replicar de 10.000 compostos faz 125 placas de ensaio. Este estudo utilizou 2 repetições com 10 placas de controlo negativo em cada conjunto. Para aumentar a taxa de transferência, placas foram marcadas quando populações controle negativo foram avaliadas para ter experimentado ~ 99% de mortalidade. Teste todos os poços foram examinados em seguida para vermes vivos.
Produtos químicos em poços com um verme vivo eram chamados de sucessos. Produtos químicos em poços contendo mais de 1 verme vivo também foram hits chamadas e além disso todos os vermes esses poços (vivos e mortos) foram contados gerar uma simples Pontuação (Pontuação viva por cento; o número de vermes vivos dividido pelo número de vermes mortos). Cada produto químico na biblioteca poderia portanto ser chamado um sucesso duas vezes e os sucessos poderiam, mas talvez não, têm resultados associados a eles. 512 produtos químicos distintos foram chamados hits (pelo menos uma vez) no ecrã do 30.000 compostos. A tela foi realizada com a intenção de identificar efeitos de pro-longevidade (reprodutíveis) potentes e/ou robustos. Essas duas propriedades diferentes podem ter efeitos distintos. Produtos químicos potentes poderiam aumentar drasticamente a expectativa de vida, caso em que esperamos que uma porcentagem alta de worms para estar vivo no poço desse químico. Para produtos químicos robustos, ambas as réplicas deveria ter vermes vivos. A lista foi classificada com base nestes critérios. 179 dos produtos químicos rendeu altas pontuações vivas por cento, ou foram atingidos em ambas as réplicas e, portanto, foram escolhidos para o re-teste. A maioria dos restantes produtos químicos que foram chamados hits, mas não selecionados para o re-teste, continha apenas um único verme vivo em um dos poços de replicar.
Re-teste dos hits foi realizada, semelhante à tela principal, exceto com 3 repetições (população animal total esperada, de 30) e cuidadosa quantificação da expectativa de vida dos animais nas placas de controle não tratado. Estas mudanças foram adicionadas para auxiliar na comparação dos poços de teste e controle. 179 dos hits químicas foram reordenados, diluído a 10 mM e mudou-se para 96 placas bem. Só os interiores 24 poços foram utilizados para o ensaio de re-teste (versões atuais do presente protocolo teria usado os interiores 32 poços conforme descrito na seção de protocolo para telas de re-teste) e os compostos foram re-testados em triplicado com seis placas de ensaio de controlo negativo tratadas com solvente DMSO. Uma placa de controlo negativo foi marcada periodicamente pela sobrevivência total (Figura 1A). Quando aproximadamente 95% dos animais controle estivesse morto, todas as placas foram completamente marcadas (todos tratados e vermes mortos foram contados).
Para chamar sucessos dos resultados da re-teste, um corte foi feito para o placar vivo porcentagem médio dos controlo negativo + 2 desvios-padrão (SD). Para o teste de poços, em média por cento vivo (no momento de marcar um gol) escores foram calculados calculando o placar vivo percentual de três repetições para cada poço. Para este teste específico, golo de vivo porcentagem média dos poços de controle negativo foram calculados como a média das três repetições para 48 poços (2 conjuntos de placas de controlo negativo três vias). O SD costumava chamar de sucessos do conjunto química re-teste foi que o SD através do controlo negativo 48 em média por cento vivas partituras. Usando esta estratégia, este estudo encontrou 57 hits da biblioteca re-teste de 179 compostos, demonstrando que um total de 32% dos produtos químicos re-teste deu positivo (Figura 1B). Binning das pontuações vivas por cento em média para os poços de controle e teste negativos indicado que os poços de teste superaram os poços de controle (Figura 1C).
Tela do candidato: Telas de pequena escala podem ser realizadas de maneira semelhante para o reteste descrito acima. Aqui, descrevemos os resultados de uma tela de candidato com 139 compostos. Estes candidatos foram montados como estruturas susceptíveis de promover a longevidade. Para esta tela, foram realizadas 5 repetições das placas de teste em duas diferentes doses (50 µM e 100 µM). Além disso, usamos 8 placas de controlo negativo, com um prato único controle positivo (PN1) contendo duas doses diferentes; 50 µM e 100 µM.
Placas de controlo negativo foram monitoradas até ~ 90% dos animais foram mortos. Naquela época, poços foram marcados pela contagem de vermes vivos e mortos em todos os poços de controle e de teste de poços que continha vermes ao vivo. Os por cento vivos na hora de marcar um gol foram usados para calcular a média partituras vivas por cento para cada poço. Para os controles negativos, 32 poços tinham por cento vivas partituras de 8 repetições. Para os controles positivos, havia 4 pontuações bem médias de 4 repetições para cada dose. Sucessos foram chamados para poços com uma pontuação média de vivo por cento que era maior do que a média por cento controlo negativo vivo pontuação + 2 SD Este corte deixou 14 sucessos a partir da tela de candidatos e excluídos todos os poços de controle negativo. Esse corte também incluiu todos os do controlo positivo poços tratados em 100 µM e 50% dos controles positivos trataram em 50 µM. Estes resultados são apresentados aqui como guardado em média por cento vivas Partituras para ambos a 50 µM(Figura 2)e as telas de teste 100 µM (Figura 2B).
Finalmente, todas as placas foram re-marcou em um ponto do tempo final, que correspondeu a um tempo quando maior que 99% do controle negativo tratados animais foram mortos. Os resultados indicaram que os poços de controle positivo até agora out-realizada poços controle e teste negativos (Figura 2C). Enquanto os poços de teste foram um pouco melhores do que os controles negativos. Este último resultado é tendenciosa pela indicação que muitos dos poços apareceram a apresentam toxicidade em relação ao tratamento controle (tabela 1), desse modo, confundir esta interpretação simples. Isso era de se esperar, uma vez que a biblioteca do candidato foi uma verdadeira tela de substâncias químicas com atividade biológica desconhecida em c. elegans, enquanto a tela re-teste foi essencialmente pré-selecionados para compostos que não eram tóxicos. Desde que esta tela principal foi para compostos que alongou a expectativa de vida, significativamente produtos químicos tóxicos não devem ter sido no re-teste conjunto.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig1.jpg"> Figura 1 : Representante resulta de uma alta taxa de transferência a tela e re-teste Curva de sobrevivência do (A) de uma placa de controlo negativo representante usada no ensaio de re-teste. Esta curva foi construída a partir de marcando todos os vermes vivos e mortos em 24 poços utilizados neste ensaio 4 vezes ao longo dos 18 dias do ensaio. No dia 18 de idade adulta, controles foram avaliados para ter ~ 5% de sobrevivência e todos os testes de controle e placas depois foram também marcou. (B) tabela Resumindo os resultados da tela e re-teste. (C) Binning de poços em média por cento vivo pontuações para condições de controle e teste de tela re-teste. Para controles, pontuações são de 48 poços cada uma consistindo da média de 3 repetições. Resultados do teste são 179 poços cada uma consistindo a pontuação média de três repetições. Figura 1 é reproduzida de uma anterior publicação1. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56892/56892fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig2.jpg"> Figura 2 : Representante resulta de uma tela de candidatos (A) Binning dos resultados a partir da tela de candidato de 50 µM. Os 139 resultados de teste bem representam o placar vivo por cento em média de 5 repetições. Os 32 resultados negativos de controle consistem em partituras de vivas por cento em média de 8 repetições. 4 resultados positivos de controle consistem em partituras de vivas por cento em média de 4 repetições (total 16 poços contendo PN1 em 50 µM). (B) Binning dos resultados a partir da tela de candidato de 100 µM. Tudo o que é o mesmo (A), exceto que o teste de poços e controles positivos foram tratados em concentrações de 100 µM. As mesmas placas de controlo negativo são mostradas em ambos (A e B). (C) representante resulta da re-marcando as placas em um ponto relativamente extremas de tempo atrasado. Controles positivos dramaticamente superaram todos os outros, se apenas representando o por cento de poços com vermes vivos neste ponto do tempo, que é tendencioso contra poços de teste, conforme descrito no texto principal e a tabela 1. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56892/56892fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="6">Binning das pontuações vivas por cento em média</td>
		</tr>
<tr>
<td>Golo de agrupados</td>
			<td>Todos mortos (0)</td>
			<td>1-10</td>
			<td>11-20</td>
			<td>21-30</td>
			<td>31-40</td>
			<td>> 41</td>
		</tr>
<tr>
<td>Re-teste</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>n º de (-) controle</td>
			<td>16</td>
			<td>31</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>n º de poços de teste (50 µm)</td>
			<td>46</td>
			<td>69</td>
			<td>50</td>
			<td>8</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Tela do candidato</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>n º de (-) controle</td>
			<td>0</td>
			<td>11</td>
			<td>21</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>n º de (+) controlar (50 µm)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>n º de (+) de controle (100µM)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>n º de poços de teste (50 µm)</td>
			<td>94</td>
			<td>22</td>
			<td>21</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>n º de poços de teste (100µM)</td>
			<td>86</td>
			<td>25</td>
			<td>21</td>
			<td>6</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Representante resulta de binning telas diferentes Aqui nós apresentamos o binning das pontuações vivas por cento em média de duas telas (candidato e re-teste). Na tela do re-teste, o pico é semelhante ao controle negativo com os re-testes superando o controle negativo drasticamente à direita lado (longa vida) da tabela. Isto indica a presença de vários pro-longevidade compostos presentes no conjunto de re-teste. Na tela do candidato, vemos que o pico é na categoria de todos os mortos, enquanto há também um sinal evidente do lado direito da mesa. Isto indica a presença de compostos de pro-longevidade no conjunto de candidatos, mas também indica a presença de toxicidade significativa entre o conjunto de candidatos de compostos.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Aqui descrevemos um protocolo simples para produzir rapidamente centenas de ágar de mídia de crescimento nematoide, placas de cultura de 96 poços, com números consistentes de Caenorhhabditis elegans por bem. Estas culturas são úteis para a seleção fenotípica de organismos toda. Nós focamos usando essas culturas para produtos químicos de tela para efeitos de pro-longevidade.

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

a-simple-method-for-high-throughput-chemical-screening-caenorhabditis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

8.7K visualizações.  The Buck Institute for Research on Aging. Aqui descrevemos um protocolo simples para produzir rapidamente centenas de ágar de mídia de crescimento nematoide, placas de cultura de 96 poços, com números consistentes de Caenorhhabditis elegans por bem. Estas culturas são úteis para a seleção fenotípica de organismos toda. Nós focamos usando essas culturas para produtos químicos de tela para efeitos de pro-longevidade.

Vídeo: A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Biologia do Desenvolvimento

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple and inexpensive method to obtain a large number of animals for the isolation of proteins to proceed with a western blot, mass spectrometry, or further proteomics analyses. Furthermore, an increase of nematode numbers for immunostainings and the integration of multiple analyses under the same culturing conditions can easily be achieved. Additionally, a transfer between plates with different experimental conditions is facilitated. Common techniques in plate culture involve the transfer of a single C. elegans using a platinum wire and the transfer of populated agar chunks using a scalpel. However, with increasing nematode numbers, these techniques become overly time-consuming. This protocol describes the large-scale culture of C. elegans including numerous steps to minimize the impact of the sample preparation on the physiology of the worm. Fluid and shear stress can alter the lifespan of and metabolic processes in C. elegans, thus requiring a detailed description of the critical steps in order to retrieve reliable and reproducible results. C. elegans is a model organism, consisting of neuronal cells for up to one-third, but lacking blood vessels, thus providing the possibility to investigate solely neuronal alterations independent of vascular control. Recently, early neurodegeneration in diabetic retinopathy was found prior to vascular alterations. Thus, C. elegans is of special interest for studying general mechanisms of diabetic complications. For example, an increased formation of advanced glycation end products (AGEs) and reactive oxygen species (ROS) is observed, which are reproducibly found in C. elegans. Protocols to handle samples of adequate size for a broader spectrum of investigations are presented here, exemplified by the study of diabetes-induced biochemical alterations. In general, this protocol can be useful for studies requiring large C. elegans numbers and in which liquid culture is not suitable.

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

This protocol describes a method for the large-scale cultivation of Caenorhabditis elegans on solid media. As an alternative to liquid culture, this protocol allows obtaining parameters of different scales under plate-based cultivation. This increases the comparability of results by omitting the morphological and metabolic differences between liquid and solid media culture.

Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Bioquímica

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Comportamento

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Um ensaio de alta produtividade para a predição da toxicidade química por Automated Caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Ambiente

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biologia

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Imunologia e Infecção

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Quantitativos e automatizada de alto rendimento de todo o genoma Telas de RNAi em C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

Análise comportamental de grande c. elegans populações usando um amplo campo de visão de rastreamento plataforma automatizada

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo

Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes

Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

Um ensaio de alta produtividade para a predição da toxicidade química por Automated Caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

Quantitativos e automatizada de alto rendimento de todo o genoma Telas de RNAi em C. elegans

Análise comportamental de grande c. elegans populações usando um amplo campo de visão de rastreamento plataforma automatizada

C. elegans Chemotaxis Assay

A rastreï¿½el