Esta pesquisa foi apoiada pela concessão do National Institutes of Health (R01-DE025985) e por um americano câncer sociedade Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Este trabalho também foi apoiado por subsídios do departamento de agricultura dos EUA (2015-67015-23268 e 2014-67015-21787) e nova bolsa de iniciativa de investigação da Universidade da Califórnia, Davis.

Cuidado: Linhas celulares usadas neste procedimento contêm vírus infecciosos, cuidado e só avançar na instalação de BSL de nível 2 ou superior.
1. preparação e manutenção de celular
<ol><li>Cultura de células de TREx-K-RTA BCBL-1 (ou outra KSHV infectado linhas celulares PEL) em RPMI1640 suplementado com 15% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina estreptomicina solução de glutamina.</li>
	<li>Desenvolvem-se células a 37 ° C com 5% de dióxido de carbono (CO2), certificando-se de crescer continuamente e dividir as células em uma proporção de 1:4 em 2 – 4 dias.</li>
	<li>Monitorar as culturas de células com um microscópio de luz todos os dias para confirmar o crescimento de células boas e morfologia, caso contrário é recomendável para reiniciar a cultura de pilha ou para ajustar de acordo com as condições de cultura celular.</li>
</ol>2. timidina sincronização e indução lítica
<ol><li>Em um prato de Petri de 10 cm, células de TREx-K-Rta BCBL-1 placa em preparadas de mídia (1 x 106 células/2 mL de mídia)</li>
	<li>Adicionar timidina 200mm (concentração final: 2 mM) ao prato, misturar e incubar por 18 h.</li>
	<li>Centrifugar as células durante 5 min à 500 x g. lavam as células com estéril 1x tampão fosfato salino (PBS), centrifugue novamente e ressuspender as células em meios preparados na hora. Repita para um total de 3 lavagens. Resuspenda em mídia recentemente preparada.</li>
	<li>Permitir que as células sair de fase S para 8 h.</li>
	<li>Adicionar timidina (concentração final: 2 mM), misturar e incubar durante 16 h.</li>
	<li>Centrifugar as células durante 5 min à 500 x g. lavam as células com estéril 1x tampão fosfato salino (PBS), centrifugue novamente e ressuspender as células em meios preparados na hora. Repita para um total de 3 lavagens. Resuspenda em mídia recentemente preparada.</li>
	<li>Para induzir a reativação viral, adicionar 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, concentração final 20 ng/mL) e doxiciclina (DOX, concentração final 100 ng/mL) para a cultura de células, misturar e incubar durante 4 h. Para linhas de células sem uma gaveta inducible K-Rta, estimule a reativação usando TPA (concentração final 20 ng/mL e sódio butirato (1 mM)).</li>
	<li>Centrifugar as células durante 5 min à 500 x g. lavam as células com estéril 1x tampão fosfato salino (PBS), centrifugue novamente e ressuspender as células em meios de cultura completa. Repita para um total de 3 lavagens. Resuspenda em meios de cultura completo.</li>
	<li>Permitir que as células a crescer durante 24 h.</li>
</ol>3. fixação e permeabilização
Nota: Antes de prosseguir, certifique-se de fixação solução (3,7% de formaldeído em PBS tratada com DEPC), dietil tratada pyrocarbonate fosfato salino (DEPC-PBS), glicina DEPC PBS (concentração final de glicina: 100 mM) e solução de permeabilizating (50% acetona, metanol 50%) estão preparados. Normalmente, cada slide vai exigir pelo menos 0,5 milhões de células, multiplicar se necessário e incluem células extras para trás acima, especialmente se as células não são saudáveis.
<ol><li>Colete as células em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar as células por 2 min em 200 x. g. lavagem das células 3 vezes com 1 mL de PBS estéril DEPC. Resuspenda em 1,2 mL de PBS DEPC.</li>
	<li>Coloque o número apropriado de lamelas (determinados pela configuração do experimental) no fundo de uma placa de 6.</li>
	<li>Pipetar 200 µ l da célula mistura de DEPC PBS em cada lamela, que sejam pelo menos 0,5 milhões de células em cada slide. Permitir que as células que se contentar em 2 min e aspire o excesso DEPC PBS, deixando apenas uma fina camada de células. É normal para as células a serem removidos neste processo. Cuidado: PFA é tóxica, use proteção adequada.</li>
	<li>Cuidadosamente, adicione 1 mL de solução (3,7% de formaldeído em PBS DEPC) para cada lamela de fixação. Permitir que as células corrigir por 10 min.</li>
	<li>Lave as lamelas 3 vezes com PBS DEPC.</li>
	<li>Cuidadosamente, adicionar 1 mL de PBS DEPC a glicina (concentração final de glicina: 100 mM) para cada lamela. Permitir que as células saciar por 5 min.</li>
	<li>Adicione 1,5 mL de PBS DEPC e de qualquer lugar num agitador por 5 min ou apertar firme mas delicadamente na mão por 1 min. Aspire o excesso DEPC PBS. Tenha cuidado para não perturbar as células. Repita esta etapa para um total de 3 lavagens.</li>
	<li>Cuidadosamente, adicione 1 mL de solução (50% de acetona, metanol 50%) para cada lamela de permeabilizing. Permitir que as células para permeabilize por 15 min. Nota: Neste momento, as lamelas podem ser armazenadas em um freezer-20 ° C para não mais de uma semana. Congelamento de evitar ou minimizar o tempo gasto no congelador, como qualidade de imagem pode degradar rapidamente. Certifique-se que quando no congelador que as células permanecem molhados e coberto em acetona/metanol e para garantir que eles devidamente Re-hidratar com PBS DEPC após a retirada do freezer.</li>
	<li>Adicione 1,5 mL de PBS DEPC e de qualquer lugar num agitador por 5 min ou apertar firmemente mas delicadamente na mão por 1 min. Aspire o excesso DEPC PBS, tenha cuidado para não perturbar as células. Repita esta etapa para um total de 3 lavagens.</li>
</ol>4. IFA e RNA-peixe
Nota: Em relação a sonda RNA peixe rotulagem e preparação: para o K-Rta intrão 959 pares de bases, 31 diferentes sondas foram gerados, que eram 20 pares de bases cada, contendo um GC conteúdos de cerca de 50%. Soluções de trabalho e estoque das sondas foram aliquotadas em 100 µM e concentrações de 2,5 µM, respectivamente.
<ol><li>Corrediças do microscópio rótulo com as informações necessárias experimentais ou algum tipo de rótulo distinguível.</li>
	<li>Forre o fundo de um recipiente de plástico selável com uma toalha de papel úmida.</li>
	<li>
Preparar a solução de anticorpo primário (1,5 µ l de anticorpo de LANA, 0,75 µ l de anticorpo de RNA Pol II, 3 µ l de padeiro fermento tRNA, DEPC PBS até 30 µ l) e multiplicar a receita para cada lamela presente. Lugar de 30 µ l de solução de anticorpo primário para cada slide de microscópio rotulada.
	<ol>
<li>Titula-se o anticorpo primário de interesse primeiro e usar a quantidade ideal. Certifique-se de usar a IgG purificada, como soro (líquido de ascite) pode conter grande quantidade de RNase.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque as lâminas de microscópio rotulada a lamela (virado para a solução de células) e mover os slides no recipiente com a toalha de papel úmida. Tenha cuidado para não introduzir bolhas. Cobrir o exterior do recipiente com filme plástico. Mova o recipiente em uma incubadora conjunto para 37 ° C, durante 1 h.</li>
	<li>Prepare um peixe o tampão de lavagem (2 x salina de sódio tampão citrato (CCD) (final), 10% formamida, 90% DEPC dH2O).</li>
	<li>Prepare 2 x tampão de hibridização (4 x SSC, 20% de sulfato de dextran).</li>
	<li>Preparar o peixe intrão sonda buffer e o anticorpo secundário (20 µ l de 2x do tampão de hibridização (final 1 x Buffer Hyb), 4 µ l de fermento de padeiro tRNA (final 10%), 4 µ l de formamida (final 10%), sonda intrão K-Rta (final 125 nM), 0,8 µ g do anticorpo secundário, DEPC dH2 O até 40 µ l). Multiplica a receita para cada slide necessário.</li>
	<li>Após a incubação, lave as células 3 vezes com PBS DEPC em um prato bem 6 por 5 min cada.</li>
	<li>Lavar com tampão de lavagem peixe 3 vezes por 5 min cada. Manter lamela em tampão de peixe-lavagem até terminar de preparar mistura de segundo anticorpo e intrão sonda (etapa 4.7).</li>
	<li>Corrediças de vidro limpo, utilizadas para a incubação do anticorpo primário para a hibridação.</li>
	<li>Coloque 40 µ l do anticorpo secundário e peixe intrão sonda contendo solução cada lâmina de vidro.</li>
	<li>Coloque as lamelas com as células para os slides com o lado da célula voltada para baixo em cima do tampão, ter cuidado para não introduzir bolhas.</li>
	<li>Coloque as lâminas em um recipiente de plástico com uma toalha de papel úmida na parte inferior. Envolva o recipiente de plástico no primeiro filme de plástico e, em seguida, a folha de alumínio.</li>
	<li>Incube o recipiente com os slides a 37 ° C por 16-24 h.</li>
	<li>Após a incubação, cuidadosamente deslize a lamela da borda da lâmina de vidro, volte a colocar no 6 placas bem virada para cima e lavar as células com tampão de peixe-lavagem 3 vezes em um prato bem 6 por 5 min cada.</li>
	<li>Lavar as células 2 vezes com 2 x SSC.</li>
	<li>Adicionar DAPI (1:1, 000) no 2 x SSC e deixe-a descansar por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar as células 2 vezes com 2 x SSC.</li>
	<li>Limpar as lâminas de vidro usadas para a hibridação e adicionar 10 µ l de solução para as lâminas de vidro de montagem.</li>
	<li>Coloque o rosto de lamelas para baixo para a solução de montagem. Tenha cuidado para não introduzir bolhas.</li>
	<li>Com um tecido de laboratório, retire com cuidado a solução de montagem em excesso, tomando cuidado para não esmagar as células.</li>
	<li>Usando o esmalte, aplique uma camada ampla em torno da borda das lamelas e deixe para secar.</li>
	<li>Proceda para realizar a microscopia de fluorescência.</li>
</ol>5. microscopia de fluorescência 3D
Nota: Enquanto protocolos variará com o tipo de sistema de microscópio de fluorescência usado, as etapas a seguir ajudará a garantir a aquisição de dados de imagem ideal para análise quantitativa.
<ol><li>Pré-tratamento de amostras fixas e montar na mídia antidesbotamento para atrasar a fluorescência fotobranqueamento durante a imagem latente.</li>
	<li>Use o campo de visão um objectivo de alta qualidade (como um 60 X 1,42 N.D. óleo-imersão da lente), que pode capturar uma célula inteira (ou o núcleo celular).</li>
	<li>Definir parâmetros de exposição (por exemplo, poder da excitação, tempo de exposição) para cada canal de cor de fluorescência, utilizando amostras de controlo de positivo e negativo. Adquira imagens de fluorescência. Nota: As amostras de controlo positivo que contêm apenas uma etiqueta fluorescente também devem ser usadas para determinar o nível do "crosstalk" entre os canais de cor. Para amostras de célula fixa de imagem, poder de excitação da fluorescência pode ser reduzida (com tempos de exposição ligeiramente mais longos) para minimizar o fotobranqueamento.</li>
	<li>Uma vez que o protocolo de imagem tiver sido estabelecido, manter os mesmos parâmetros de exposição consistente para todas as amostras em estudo — para que os dados de imagem podem ser analisados e comparados com precisão.</li>
	<li>Execute o processamento de imagem pós aquisição e reconstrução 3D. Identifica as transcrições de K-Rta por sinal de RNA-peixe (vermelho), moléculas de LANA por imunofluorescência (verde) e da cromatina nuclear (onde aplicável) corados com DAPI (azul). Nota: Regiões do núcleo celular, em que K-Rta e LANA são co em cluster, assim são acreditadas para ser associado com fábricas de transcrição viral e replicação complexa.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores deste trabalho não têm laços financeiros ou concorrentes conflitos de interesses.

Existem alguns aspectos do protocolo que pode ser alterada para acomodar circunstâncias incomuns. A escolha de fixação e permeabilização de buffers também pode ser alterada. Para os buffers de fixação, paraformaldeído também é eficaz e etanol pode ser usado para permeabilização.
Extingue o formaldeído com glicina que PBS é recomendado pois impede o formaldeído desabilitando os anticorpos na ausência de albumina de soro bovino (BSA), mas se as lamelas são lavadas completamente suficiente, a etapa de PBS glicina pode ser ignorada. No protocolo, evite o uso de albumina de soro bovino como uma solução de bloqueio. Estudos-piloto realizado no laboratório Izumiya mostrou sinais de RNA-peixes mais fracos, presumivelmente devido à degradação do RNA. Se houver necessidade de bloqueio para o anticorpo primário, é recomendável usar o RNase livre BSA. Da experiência, percebeu-se que, se o anticorpo é específico, inclusão de BSA não é necessário na reação. No entanto, recomenda-se sempre incluir uma quantidade adicional de levedura tRNA em incubação de todos os passos para prevenir a degradação de RNA. Tem sido notado que usando o tRNA como agente de bloqueio aumentou sinais específicos de RNA-peixe.
Sincronização do ciclo celular foi implementada para produzir uma reativação de KSHV síncrona e mais eficiente. Para a sincronização do ciclo celular, Hidroxiureia ou soro fome pode ser abordagens alternativas. Foi confirmado que a hidroxiureia é tão eficaz quanto usando um bloco de timidina, apesar de incubação com hidroxiureia sozinha reativa KSHV fracamente.
Como esta técnica pode ser aplicada a outros estudos? Em publicação mais recente do laboratório Izumiya, foi mostrado o colocalization de ativamente transcrevendo episomes KSHV e pol de RNA II, uma enzima essencial para a transcrição do RNA. No entanto, sabe-se que há um número de co-ativadores e repressores co fatores transcricionais celulares envolvidos na regulação dos genes KSHV. RT-PCR quantitativo historicamente tem sido usado em uma população (mistura de reativando e latente) de células cultivadas, quantificação virais transcrições e avaliar os efeitos sobre a expressão do gene viral. Usando a abordagem descrita acima, análises podem ser reduzidas ao único nível epissomal para examinar a transcrição viral. Assim, o Regulamento spatiotemporal de outras enzimas celulares e virais pode ser examinado para ganhar a introspecção em sua associação com a reativação de KSHV. É também digno de nota para mencionar que porque a natureza transitória da região intrão RNA é dependente de sua degradação que sondas de RNA peixes irão cruzar e normalmente localizar onde transcrição ativa está ocorrendo, no entanto se os introns não são degradados imediatamente, sondas de peixe podem apresentar sinais que não estão sempre localizados perto de transcrição ativa.
No momento, é difícil estudar a relação entre a formação das fábricas de transcrição celular e expressão de gene subsequentes devido a seus tamanhos genômicos e a complexidade da configuração dos promotores celulares. A este respeito, episomes KSHV podem ser uma ferramenta ideal como resultado de seu tamanho relativamente pequeno genoma, mecanismos de reativação definidos com claras formações de agregados de RNA Pol II. Usando o cromossomo de mini viral manipulável do KSHV, herpesvirology pode contribuir para o campo de investigação epigenética celular de um ângulo exclusivo.

Tornou-se cada vez mais claro que a organização spatiotemporal do núcleo desempenha um papel importante em modular a expressão gênica afinada em eucariontes. A maioria dos genes específicos do tecido estão distribuídos em muitos cromossomos e precisam ser regulada de forma síncrona a fim de responder a estímulos específicos em uma maneira coordenada1. Células constroem cubos cromatina ativa (ACH), como uma forma de reunir os genes e seus componentes cis-regulatórios para um espaço nuclear específico1.
Também foi demonstrado por vários estudos que embora o núcleo parece muito denso e viscoso, moléculas biologicamente ativas podem atravessar o núcleo rapidamente através de de difusão2. Como consequência dessa propriedade efêmera, a maioria das proteínas de ligação de DNA 'salto' de ligação local para ligação local, sentindo o seu caminho em torno do espaço nuclear, que permite a um núcleo altamente adaptável e versátil2.
Apesar deste comportamento dinâmico de biomoléculas dentro do núcleo, nuclear corpos sem membranas tais como (mas não se limitando a) o nucléolo, corpos de Cajal e corpos nucleares do leucemia promielocítica (PML-NB) ainda existem. É através de uma variedade de mecanismos, tais como repetições de DNA em tandem (nucléolo), rRNA (nucléolo) e proteínas estruturais como coilina (corpos de Cajal) ou PML proteínas (PML-NB) que mantêm essas construções juntos3,4,5 . Estas estruturas e outras congregações como fábricas de transcrição servem como andaimes que não apenas aumentam a concentração local de componentes necessários, mas também regulam a composição de proteínas e ácidos nucleicos dentro deles para, finalmente, criar um site central para funções celulares eficiente6.
Visualizar onde e quando forma estruturas nucleares oferece uma riqueza de informação para pesquisadores estudando epigenética. De uma perspectiva de virologia, a reativação do vírus Latentemente infectadas, tais como KSHV, altera significativamente a paisagem do núcleo e distribuição das enzimas nucleares para shift transcrição principalmente a partir de genes celulares para genes virais, em última análise, para produzir progênie viral totalmente funcional7,8. Como KSHV manipular a maquinaria de expressão do gene celular para facilitar a expressão dos genes virais? Essas informações também poderiam lançar luz sobre mecanismos de regulação do gene celular temporal.
Como todos os outros herpesviruses, KSHV tem dois ciclos de vida chamados latência e replicação lítica. KSHV reside principalmente na fase de latência, em que a maioria de seu gene viral, expressão é silenciado, exceto latência associado genes9,10. Durante a latência que KSHV produz latência associado antígeno nuclear (LANA), que constitutivamente vincula os genomas virais e amarras viral da cromatina do cromossomo humano11. Por causa do relacionamento íntimo da LANA com o genoma viral, é possível usar o IFA e DAPI para manchar e localizar onde os episomes virais foram em relação a cromatina de anfitrião.
Para estudar a reativação de KSHV no nível do episome único e a associação com outros episomes virais em uma célula infectada, foi estabelecida uma estratégia para localizar ativamente transcrevendo cromatina viral em situ . Por conseguinte, LANA e RNAPII IFA com intrão RNA-peixe foram combinadas, através da geração de sondas de RNA-peixe que se ligam à região intrão (sonda exata sequências podem ser encontradas em de publicação mais recente do laboratório Izumiya8) de KSHV K-Rta-a proteína viral-chave que é essenciais e suficientes para KSHV reativação foi possível identificar onde a transcrição na verdade estava tomando lugar8,11,12,13,14,15 . Este intrão técnica RNA-peixe permite que pesquisadores de Visualizar onde mRNA ser transcrito imediatamente antes de ser emendado e exportado para o citoplasma16,17.
KSHV pode ser reativado por vários estímulos químicos incluindo phorbol ésteres como 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) e inibidores de histona deacetilase como butirato de sódio, adicionalmente KSHV podem ser induzidos a reativar pela superexpressão de o fator de transcrição viral, K-Rta19. Pesquisadores com sucesso aumentaram a eficiência de reativação KSHV sincronizando ciclos da célula antes de induzir a reativação18. Assim, para estes estudos especiais, as células foram sincronizadas usando um bloco de timidina duplo (protocolo descrito abaixo) e incubadas com TPA e doxiciclina (Dox) durante um curto período de tempo. Doxicilina foi usada porque a linha de celular utilizada nestas experiências tem uma gaveta de doxiciclina-inducible K-Rta, que foi clonada do cDNA e não inclui a região de intron do K-Rta. Embora seja possível reativar KSHV usando apenas induzida expressão K-Rta, está comprovado por outros pesquisadores que, devido a uma variedade de diferentes fatores bioquímicos só expressão de K-Rta revela-se uma reativação fracos estímulos20. Através da combinação de todos estes e limitando-se a incubação do droga para um curto período de tempo, uma reativação de KSHV robusta mas não excessivamente artificial foi alcançada para a imagem latente.
Depois da rotulagem LANA, RNAPII, intrões K-Rta e DNA como descreveram neste artigo, imagem de fluorescência 3D foi realizada utilizando um microscópio de deconvolução widefield. Após o processamento com software de imagem, a distribuição espacial de episomes virais ativos pode ser avaliada corretamente. Usando esta técnica, as questões centrais sobre a natureza fundamental da formação da cromatina ativo hubs e outras estruturas nucleares podem ser estudadas. Ter episomes virais idênticos em uma única célula que processa os mesmos elementos normativos pode representar uma ferramenta de pesquisa exclusivo para aprofundar a compreensão dos mecanismos de regulação do gene spatiotemporal.
Uma limitação em termos de imagens várias espécimes de célula fixadas em pontos de tempo diferentes para caracterizar um processo inerentemente dinâmico molecular é que mudanças sutis ou em pequena escala na distribuição de fluorescência são detectadas ou considerado insignificantes. Isto é verdadeiro, a não ser no caso raro, cada célula observada exibe a mesma mudança sutil. Assim, a relação completa spatiotemporal de transcrição viral ativa e outras estruturas nucleares não pode ser criticamente avaliada utilizando imagens fixas. Para solucionar esses desafios técnicos, a melhor abordagem é a imagem ao vivo de células que têm marcado a episomes virais e a seguir a localização das principais enzimas celulares ao longo do tempo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">RPMI medium 1650 GlutaMAX</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">61870-036</td>
			<td style="width:167px;">Needs to be warmed to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Omega Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FB-11</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10378-016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Thymidine&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9250</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Solution</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">TPA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sodium Butyrate&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B5887</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Formaldehyde Solution&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">252549</td>
			<td style="width:167px;">Corrosive, toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Diethyl Pyrocarbonate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D-5758</td>
			<td style="width:167px;">Acute toxicity&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">410225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Acetone</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">179124</td>
			<td style="width:167px;">Flammable, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Chemical&#160;</td>
			<td style="width:119px;">67-56-1</td>
			<td style="width:167px;">Flammable, toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73</td>
			<td style="width:71px;">Advanced Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">13-210-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8</td>
			<td style="width:71px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">05-623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Ribonucleic acid, transfer from baker&#8217;s yeast (S. cerevisiae)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">9014-25-9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Saline sodium citrate buffer 20x (SSC)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15557044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Formamide&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">295876</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution</td>
			<td style="width:71px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">1916C093</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">DAPI (4&#8217;,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">slowFade Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S36936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Micro cover glass 22x22</td>
			<td style="width:71px;">Matsunami</td>
			<td style="width:119px;">C022221</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">VoloCITY</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;">3D imaging software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DeltaVision microscope</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Superfrost/Plus microscope slides</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional imaging of viral transcription factories using 3d fluorescence microscopy

É sabido que o Regulamento espacial e temporal de genes é parte integrante que regulam a expressão genética adequada. Consequentemente, é inestimável para entender onde e quando a transcrição está ocorrendo dentro espaço nuclear e para visualizar a relação entre episomes infectado dentro do núcleo da célula da mesma. Aqui, tanto de imunofluorescência (IFA) e RNA-peixe tem sido usadopara identificar ativamente transcrevendo episomes herpesvirus associado sarcoma de Kaposi (KSHV). Manchando o antígeno nuclear KSHV associada a latência (LANA), é possível localizar onde episomes virais existem dentro do núcleo. Além disso, através da concepção de sondas de RNA-peixe para atingir a região intrão de um gene viral, que é expressa somente durante a infecção produtiva, transcritos de RNA nascentes podem ser localizados. Usando esta combinação de sondas moleculares, é possível visualizar a montagem de fábricas grandes transcrição viral e analisar o Regulamento espacial da expressão do gene viral durante a reativação KSHV. Incluindo a mancha do anticorpo anti-RNA polimerase II, se pode visualizar também a associação entre a agregação de RNA polimerase II (RNAPII) e transcrição de KSHV durante a reativação.

Realizou-se um protocolo ligeiramente abreviado onde células BCBL-1 foram usadas e somente a LANA e a K-Rta RNA foram corados (Figura 1). Esta experiência permite-nos examinar onde estão ativamente transcreve episomes virais e a heterogeneidade da resposta aos estímulos de reativação KSHV em uma população de células. Na célula indicada pela seta na Figura 1, a fluorescência K-Rta distinta nas regiões que correspondem estreitamente a distribuição de episomes virais (marcado com LANA) provas para a transcrição ativa ocorrendo perto de genomas KSHV. Na mesma amostra, as células como o representado pela seta na Figura 1 podem ser observadas, que exibem muito mais fraca e difusa K-Rta fluorescência que não significativamente se sobreponha com a LANA. Isto ilustra a conclusão geral de que, dentro de uma população de células, há uma variação considerável no grau de resposta aos estímulos de reativação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56832/56832fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> Figura 1: Visualização ativa transcrição de episomes virais. IFA e RNA-peixe realizou-se em células BCBL-1. As células BCBL-1 não foram sincronizadas, mas tratadas com butirato TPA e sódio para 4 h. usando LANA imunocoloração, genomas virais foram visualizadas em verde, enquanto o peixe-RNA foi realizada visando intrões K-Rta para transcrição ativo localizado em vermelho. Cromatina celular estava manchada post fixação e permeabilização com DAPI. Intrão K-Rta e LANA manchas foram fundidas juntos. Os pontos de seta completa para uma célula que tem totalmente reativado e está se formando VTFs. Enquanto a seta está apontando para uma célula que está apenas começando para reativá-lo, como sugerido pelo sinal fraco K-Rta. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56832/56832fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Em seguida, a eficácia da sincronização de timidina foi examinada por visualizando a expressão da proteína viral K-Rta (Figura 2). Depois de um bloco de timidina duplo foi realizado para sincronizar TREX BCBL-1 células durante a transição da fase G1/S, o protocolo descrito anteriormente foi realizado (sem LANA e RNAPII de coloração). Examinando a coloração K-Rta, é claramente evidente que células sincronizadas responderam mais aos estímulos reativação do que a população não sincronizado. De estudos anteriores realizados no laboratório Izumiya (dados não mostrados), ele foi validado que RNAPII também colocalizes mais frequentemente com K-Rta após a sincronização do ciclo celular.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56832/56832fig2.jpg" style="font-size: 14px;"> Figura 2: Eficácia thymidine. RNA-peixe realizou-se em células de TREX K-Rta BCBL-1. As células (indicado pelo "2x Thy" título) foram sincronizadas com um bloco de timidina duplo. As duas populações de células não sincronizadas e sincronizados foram tratadas com TPA e DOX para os intrões de 4 h. K-Rta foram hibridizados para RNA peixe sondas. As células que são uniformemente vermelho não são superexpressão K-Rta, em vez disso, eles estão mortos, validado com DAPI coloração (não mostrado). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56832/56832fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Como uma nota geral, é muito importante manchar as células com DAPI ao realizar este protocolo. Apototic células podem ser facilmente reconhecidas pelo blebbing e fragmentação nuclear. Dada a estímulos de indução pesados e práticas de cultura celular geral, é comum para algumas células mortas ser visto. É importante sempre mancha com DAPI como um método primário para discernir entre células vivas e mortas. Às vezes os anticorpos ou sondas de RNA serão pego nas células apoptóticas e produzem sinais, consequentemente é importante excluir essas células de análises. DAPI coloração pode servir várias funções adicionais, por exemplo, na Figura 3, é claro que o objeto indicado pela seta é na verdade três celas separadas em vez de um.
É importante notar que as imagens mostradas na Figura 3 e Figura 4 foram deconvolved, criando assim um padrão mais punctate. Examinando-se a mancha RNAPII, a diferença entre as células, indicado pela seta e as outras células vizinhas podem ser vistas. É digno de nota para mencionar que o sinal RNAPII é muito mais pronunciado do que o normal devido a deconvolução.
Usar microscopia 3D ao lado esta técnica permite-na interrogar a relação espacial entre RNAPII, LANA e K-Rta. Por exemplo, na Figura 4, estruturas RNAPII anel podem ser vistas com genomas KSHV pontilhadas na periferia. Em geral, LANA tipicamente colocalizes com RNAPII em desenvolvimento de fábricas de transcrição de células. No entanto, nem todos os pontos de LANA colocalize com RNAPII, estudos, incluindo os 4th dimensão (tempo) seria necessário clarificar este fenótipo. É importante adicionar que os poucos pontos de LANA que não colocalize com sinais de K-Rta representam a heterogeneidade epissomal em resposta a estímulos de reativação, mesmo dentro de uma célula individual (Figura 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56832/56832fig3.jpg"> Figura 3: IFA combinados e intrão RNA-peixes. IFA e RNA-peixe realizou-se em células de TREX K-Rta BCBL-1. Genomas virais foram localizadas com imunocoloração de LANA (verde), ativa a transcrição foi visualizada com RNA-peixe da região intrão do mRNA K-Rta (amarelo), congregações de RNAPII (vermelho) foram rotuladas com IFA, e as células foram finalmente coradas usando DAPI para imagem DNA (azul). TREx K-RTA BCBL-1 células foram sincronizadas usando um bloco de timidina duplo, em seguida, as células foram reativadas através de incubação com TPA e DOX por 4 h, e 24 horas mais tarde, as células foram fixadas, permeabilizado e preparados para a imagem latente. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56832/56832fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56832/56832fig4.jpg"> Figura 4: Visualização em 3D das fábricas de transcrição Viral. Intrão RNA-peixe usando sondas de intrão K-Rta (luz azul), imunocoloração de DAPI DNA coloração (azul escuro), RNAPII (vermelho) e LANA (verde). Deconvolved de renderização 3D de uma pilha de Z tomadas no microscópio, processados e construído em software de imagem comercial (consulte a tabela de materiais). 28h TREx K-Rta BCBL-1 células timidina dupla sincronizado e então tratados com TPA e DOX para h. 4 células foram processadas e após reativação foi estimulada. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56832/Figure.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>

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Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Fábricas de transcriptional virais são estruturas discretas que são enriquecidas com celular RNA polimerase II para aumentar a transcrição do gene viral durante a reativação. Aqui, um método para localizar sites de ativamente transcrevendo cromatina viral em 3D espaço nuclear por uma combinação de hibridação de RNA de coloração e em situ de imunofluorescência é descrito.

Imagem latente funcional das fábricas de transcrição Viral usando microscopia de fluorescência 3D

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

functional-imaging-viral-transcription-factories-using-3d

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.0K visualizações.  University of California, Davis. Fábricas de transcriptional virais são estruturas discretas que são enriquecidas com celular RNA polimerase II para aumentar a transcrição do gene viral durante a reativação. Aqui, um método para localizar sites de ativamente transcrevendo cromatina viral em 3D espaço nuclear por uma combinação de hibridação de RNA de coloração e em situ de imunofluorescência é descrito.

Vídeo: Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biologia

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Análise rápida e Exploração de microscopia de fluorescência Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-resolution Imaging do Z Anel Cytokinetic em bactérias vivas Usando o Fast-estruturados 3D Iluminação Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal fluid accumulation and extracellular matrix formation. Activity of ion channels and intracellular calcium signaling are key physiologic parameters which determine functions of tubular epithelium. We developed a method suitable for real-time observation of ion channels activity with patch-clamp technique and registration of intracellular Ca2+ level in epithelial monolayers freshly isolated from renal cysts. PCK rats, a genetic model of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD), were used here for ex vivo analysis of ion channels and calcium flux. Described here is a detailed step-by-step procedure designed to isolate cystic monolayers and non-dilated tubules from PCK or normal Sprague Dawley (SD) rats, and monitor single channel activity and intracellular Ca2+ dynamics. This method does not require enzymatic processing and allows analysis in a native setting of freshly isolated epithelial monolayer. Moreover, this technique is very sensitive to intracellular calcium changes and generates high resolution images for precise measurements. Finally, isolated cystic epithelium can be further used for staining with antibodies or dyes, preparation of primary cultures and purification for various biochemical assays.

Ion channels expressed in renal tubular epithelium play a significant role in the pathology of polycystic kidney disease. Here we describe experimental protocols used to perform patch-clamp analysis and intracellular calcium level measurements in cystic epithelium freshly isolated from rodent kidneys.

Implementando Grampo patch e ao vivo microscopia de fluorescência para monitorar propriedades funcionais de recentemente isolados PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Identificação de cinesina-1 Cargas Utilizando microscopia de fluorescência

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source Análise alta Conteúdo Utilizando Automated microscopia de fluorescência Lifetime Imagiologia

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...