Name: assessment of antibody-based drugs effects on murine bone marrow and peritoneal macrophage activation
Uploaded: 2017-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation at JoVE.com

L.K. é o destinatário do prêmio bolsa de estudo de pós-graduação da Universidade da Colúmbia Britânica comunhão 4-ano (4YF). LMS é o destinatário de uma associação canadense de Gastroenterologia / Crohn e colite Canadá / CIHR novo investigador salário prêmio e é um estudioso biomédicas da Fundação de Michael Smith para pesquisa em saúde. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do projeto da canadense serviços de sangue, em colaboração com o canadense institutos de pesquisa em saúde (conceder # CIHR2016-LS).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) da Universidade de Colúmbia Britânica.
1. medula óssea macrófago derivação e ativação com anticorpos
<ol>
	<li>Realize eutanásia usando CO2 asfixia.<ol>
		<li>Rato de lugar na câmara de indução. Eutanásia em rato com anestesia de isoflurano 5%, para 60-90 s, até o imóvel e respirando são profundo e devagar.</li>
		<li>Desligue o isoflurano anestesia e administrar 6-8 L/min de CO2 até rato parou de respirar. Deixe mouse com CO2 pelo menos mais 5 min. verificar que não existe um batimento cardíaco ou respiração. Execute um deslocamento cervical para garantir a morte. Nota: 8-12 semanas os ratos velhos fornecem o mais alto rendimento de macrófagos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pulverizar as pernas do mouse com etanol a 70% e fixá-los com braços e pernas esticadas na posição supina sobre uma placa de espuma. Com tesoura e pinça para segurar a pele, fazer um corte superficial (0,2 cm) para remover a pele e o pelo da superfície de cada uma das patas. Nota: Execute este procedimento e todas as manipulações de cultura de tecidos em uma capa de estéril.</li>
	<li>Apare o músculo para tornar visível a tíbias e fêmures. Remova as tíbias e fêmures, cortando o osso e os músculos logo abaixo da articulação do quadril e acima dos tornozelos. Guarnição tanto músculo fora possível.</li>
	<li>Spray de ossos com etanol a 70% e esperar 1 min para que ele evaporar e, em seguida, coloque-os na chapa bem 6 do médio de descarga de osso (modificado de Iscove médio de Dulbecco (IMDM), 10% de soro fetal bovino (FBS)).</li>
	<li>Apare as pontas dos ossos por um corte 0,1 cm do osso do tornozelo e parte superior do fêmur, para que fique exposta a cavidade óssea. Certifique-se que a medula é visível e uma agulha de 26 calibre pode ser colocada na cavidade óssea.</li>
	<li>Corte os ossos e músculos para separar as tíbias e fêmures das articulações de joelho. Inserir uma agulha de 26 calibre ligada a uma seringa de 10 mL na cavidade. Descarga da medula óssea em um tubo cônico de 50 mL com 5 mL de descarga média do osso. Irrigue duas tíbias e dois fêmures, de um rato, em cada tubo de 50 mL.</li>
	<li>Pipete subindo e descendo várias vezes ou vórtice da medula a uma velocidade lenta para dispersar delicadamente aglomerados. Sequências de caracteres de medula devem ser divididas em partículas pequenas (menos de 0,5 mm) de medula óssea. Encha o tubo cónico de 50 mL com osso flush médio. Pipeta conteúdo do tubo cônico em cultura de tecido2 75cm tratados de balão e incuba a 37 ° C, 5% de CO2 por 1h. Nota: Maduros macrófagos e células mesenquimais se tornarão aderentes no balão e ser descartadas, enquanto os progenitores hematopoiéticos desejados permanecem em suspensão.</li>
	<li>Pipete médio com progenitores hematopoiéticos em um tubo cónico de 50 mL. Centrifugar o tubo a 300 x g em temperatura ambiente por 5 min. descartar o sobrenadante e ressuspender o em 5 mL de meio de cultura de fator (MCSF) da colônia de macrófagos (IMDM, 10% FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL penicilina/estreptomicina e 150 μM monothioglycerol (MTG)).</li>
	<li>Contar as células usando um hemocytometer18. Adicione meio para Ressuspender as células a uma concentração de 0,5 x 106 células/mL, 1,5 x 107 células/balão em 30 mL de meio e pipetar para cima e para baixo suavemente. Pipete 30 mL da suspensão para um frasco de cultura de tecidos Tratado2 75 cm nova.</li>
	<li>No dia 4 e 7 cultura inicial na etapa 1.9, verifique se as células aderentes e ligeiramente ramificada usando um microscópio de campo claro de contraste de fase invertida. Descarte o meio contendo as células não-aderentes. Lavar as células com IMDM uma vez e adicione 30 mL de meio de cultura MCSF.</li>
	<li>Quando as células são maduras por dia 10 (&#62; 95% positivo para F4/80 e Mac-1), verifique novamente que as células são aderentes e ligeiramente.</li>
	<li>Células para estímulos da placa, retire o frasco do meio de cultura e adicionar 8 mL de tampão de dissociação de célula livre, baseada em EDTA de enzima (Tabela de materiais). Incube as celulas por 5 min a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
	<li>Raspe suavemente, as células com uma pequena quantidade de pressão, com uma espátula de célula estéril. Verifique no microscópio que células tem retirado a superfície do balão. Pipete células dissociadas em um tubo cónico de 50 mL. Lavar o balão 3 vezes com 5 mL de IMDM e piscina a solução de lavagem com as células que foram colhidas. Centrifugar as células a 300 x g, à temperatura ambiente por 5 min.</li>
	<li>Ressuspender as células em 3 mL de meio de cultura MCSF por tubo cónico de 50 mL. Contagem de células viáveis usando um hemocytometer18. Ressuspender as células em uma concentração de 1 x 106 células/mL e placa 100 μL de suspensão de célula (1 x 105 células/poço) por bem de uma cultura de tecido de 96 poços tratada, placa de fundo plano. Nota: Os ossos de um rato irão gerar células suficientes para 100 poços. Se desejado, 1 mL de células pode ser revestido em uma placa de 6 (cultura de tecidos tratados, plano inferior). Um maior número de células (1 x 106 ) pode ser útil para análises de borrão ocidental.</li>
	<li>Uma vez aderentes, estimule duplicados ou triplicados poços cada com 10 ng/mL de LPS em IMDM, 30 mg/mL de IVIg, ou IVIg + LPS. Doses de LPS ou IVIg podem ser titulados para otimizar as respostas. Deixe duplicados ou triplicados poços como unstimulated controles. Incube-los durante 24 h (37 ° C, 5% CO2). Nota: Células re-chapeadas devem aderir aos poços de cultura de tecidos dentro de 1h.</li>
	<li>Coletar sobrenadantes de células de cada poço em tubos de microcentrifuga individuais 1,7 mL e remover qualquer matéria particulada girando a 10.000 x g por 5 min.</li>
	<li>Remover a célula de sobrenadante e evitar perturbar a pelota. Coloque a célula esclareceu sobrenadante em um tubo estéril microcentrifuga. Nota: Sobrenadantes de células podem ser analisadas por citocinas, IL-10 e subunidade de citocinas, IL-12 / 23p 40, por ensaio imunoenzimático (ELISA) imediatamente ou armazenados no longo prazo-80 ° C. Segui o protocolo de ELISA do kit comercialmente disponível (Tabela de materiais). Outras citocinas pró-inflamatórias podem ser analisadas, tais como IL-6 e TNF, como eles também são reduzidos pelo tratamento co com IVIg + estimulação LPS em comparação com estimulação com LPS sozinhos. Após a estimulação, células aderentes podem ser preparadas por técnicas tais como a mancha ocidental ou quantitativa do polymerase reação em cadeia (Q-PCR) 19,20.</li>
</ol>
2. desafiando os ratos In Vivo com IVIg e colheita de macrófagos peritoneais
<ol>
	<li>Pese cada rato.</li></ol>Calcule o volume de IVIg (concentração de ações de 100 mg/mL) necessária para fornecer uma dose final de 2,5 g/kg de peso corporal para cada rato. Nota: por exemplo, para um rato de 20 g, 500 µ l de IVIg é necessário.
	<li>Desenhar a quantidade necessária de IVIg para uma seringa estéril 1 mL munida de uma estéril 26 medidor de agulha. Para os ratos de controle que não receberá IVIg, administre um volume de dose equivalente de solução salina estéril tamponada de fosfato (PBS), pH 7,4 em vez de IVIg.</li>
	<li>Nuca o mouse com uma mão agarrando sua pele na parte de trás do pescoço com o polegar e o dedo indicador e segurando sua cauda e patas com os dedos restantes. Incline seu corpo para o solo.</li>
	<li>Coloque a agulha num ângulo de 30-40° em relação ao abdômen do rato, no quadrante inferior direito, bisel para cima e insira a 1,5 cm da agulha. Injete o IVIg ou PBS intraperitonealmente. Espere 1h.</li>
	<li>Eutanásia em ratos com anestesia de isoflurano 5% seguida por 6-8 L/min de CO2 asfixia (ver passos 1.1.1 - 1.1.2), ou de acordo com as diretrizes éticas da instituição.</li>
	<li>Pin o mouse para uma placa de espuma, com membros espalhados. Pulverize as peças com etanol a 70%. Nota: Execute o procedimento em uma capa de estéril.</li>
	<li>Fazer um corte superficial na pele (0,2 cm) com uma tesoura ao longo da linha mediana do mouse, para evitar cortar a cavidade peritoneal. Puxe a pele abdominal de barriga do mouse usando a pinça, para que o revestimento da parede intacta peritoneal é visível.</li>
	<li>Encha uma seringa de 5 mL com 5 mL de PBS estéril (pH 7,4). Inserir um 25 ou 27 medidor de agulha na parte superior da cavidade do lado direito em direção ao centro do mouse com o bisel da agulha ou a esquerda acima. Nota: Coloque a agulha cuidadosamente no mouse para que você não injectar PBS para os órgãos, mas em vez disso, para o espaço peritoneal.</li>
	<li>Empurra o líquido na cavidade peritoneal. Puxe a agulha para fora da cavidade e massagem do peritônio por 10 s para desalojar todas as células. Insira a agulha na parte superior da cavidade e evitar os órgãos. Recolher e colocar o fluido de lavagem recuperado em um tubo cônico de 15 mL no gelo. Nota: Para cada 5 mL de fluido injetado, aproximadamente 3,75 mL será recuperado.</li>
	<li>Repita a injeção e recuperação (etapas 2,8-2,9) 3 mais vezes (volume total de injeção de 20 mL), para recuperar 15 mL de líquido de lavagem no total. Colete lavagem de cada rato em um tubo cônico de 15ml separado. Nota: Após a última injeção, pode ser mais fácil extrair o líquido dos lados distante esquerdos e direito do mouse, onde líquido acumulado. Os órgãos causará menor interferência com a agulha nessa posição.</li>
	<li>Girar as células para baixo a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 500 µ l de meio de chapeamento (IMDM, 10% FBS e 100 U/mL penicilina/estreptomicina) por rato liberado. Contagem de macrófagos viáveis usando um hemocytometer18. Nota: Os macrófagos será ligeiramente maiores do que as outras células peritoneais. Rendimento típico é de 5 x 105 - 1 x 106 macrófagos/rato usando um mouse de C57BL/6 tipo selvagem. Opcional: Se um grande número de células vermelhas do sangue está presente no centrifugado, execute uma etapa de Lise para removê-los, usando a Lise 1 x células vermelhas do sangue, de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Ressuspender as células em chapeamento médio em macrófagos de 1 x 10 6/mL e 100 μL por poço em uma placa de cultura de tecido tratada de fundo plano 96 poços da placa. Nota: Pode ser necessário para o pool de células de mais de um mouse para um experimento se usando triplicata poços ou estimulantes tituladas. Por exemplo, se um rato tinha 5 x 105 macrófagos, 500 μL de chapeamento médio seria necessária. Haveria células suficientes para 5 poços, ou 1 experimento em duplicado, com uma dose de LPS.</li>
	<li>Incubar as células para 1 h a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir que os macrófagos se tornar aderente. As células aderentes são os macrófagos peritoneais. Remova sobrenadantes de células e células não-aderentes. Lavar os poços duas vezes com 200 μL IMDM (pré aquecido a 37 ° C), esperar 10 s e lentamente incline o prato. Substitua o meio de chapeamento. Incube as células a 37 ° C, 5% de CO2 por 30 min antes da estimulação.</li>
	<li>Estimular os macrófagos com 10 ng/mL de LPS em IMDM, ou deixar unstimulated, como um controle. Incubar durante 24 h, recolher e clarificar os sobrenadantes de célula (ver passos 1.16-1,17) para análise de citocinas IL-10 por ELISA. Segui o protocolo de ELISA do kit comercialmente disponível (Tabela de materiais). Nota: Após a estimulação, células aderentes podem ser preparadas por técnicas como borrão ocidental ou PCR.</li>

3. desafiando os ratos in Vivo com IVIg + LPS e colheita de macrófagos peritoneais
<ol>
	<li>Pese cada rato. Calcule o volume de IVIg (concentração de ações de 100 mg/mL) necessária para fornecer uma dose final de 2,5 g/kg de peso corporal. Calcule a quantidade de LPS (concentração de 100 μg/mL estoque na IMDM) necessária para fornecer uma dose final de 0,2 μg/g de massa corporal. Nota: por exemplo, para um rato de 20 g, 500 µ l de solução-mãe de IVIg e 40 μL de uma solução de 100 μg/mL de LPS é necessários.</li>
	<li>Desenhe a quantidade necessária de IVIg e LPS em uma seringa de 1ml estéril, equipado com um estéril 26 medidor de agulha. Para os ratos de controle que não receberá IVIg, substitua uma quantidade equivalente de IVIg com pH de PBS estéril 7,4.</li>
	<li>Nuca o mouse com uma mão agarrando sua pele na parte de trás do pescoço com o polegar e o dedo indicador e segurando sua cauda e patas com os dedos restantes. Incline seu corpo para o solo.</li>
	<li>Lugar a agulha em um ângulo de 30-40° em relação ao abdômen do rato, no quadrante inferior direito, chanfrado e inserir a 1,5 cm. Injete o IVIg + LPS, ou PBS + LPS, intraperitonealmente, como na etapa 2.4.</li>
	<li>Depois de 1h, colheita de macrófagos peritoneais executando etapas 2.5-2.10.</li>
	<li>Girar as células para baixo a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Retire 1 mL de líquido de lavagem recuperados e usar para IL-10 e IL-12/23-p 40 análises por ELISA de acordo com as instruções do fabricante ou congelar a-80 ° C para futuras análises. Nota: Para garantir a exata comparação entre tratamentos para análise de citocinas fluido de lavagem, execute flushs 5ml da cavidade peritoneal 4 vezes para um volume final de 15 mL. Nem todos os fluidos serão recuperados de cada descarga.</li>
	<li>Como na etapa 2.11, resuspenda e contar os macrófagos viáveis. Nota: Os macrófagos será ligeiramente maiores do que as outras células peritoneais.</li></ol>Rendimento típico é de 5 x 105 - 1 x 106 macrófagos/rato usando um mouse de C57BL/6 tipo selvagem. Opcional: Se um grande número de células vermelhas do sangue está presente no centrifugado, execute uma etapa de lise de acordo com as instruções do fabricante para removê-los, como na etapa 2.11.
	<li>Como na etapa 2.12, re-suspenda as células no chapeamento médio. Nota: Pode ser necessário para as células do pool de mais de um mouse para um experimento. Por exemplo, se um rato tinha 5 x 105 macrófagos, 500 μL de chapeamento médio seria necessária.</li>
	<li>Como em 2.13, incubar as células para 1 h a 37 ° C 5% de CO2 para permitir que os macrófagos se tornar aderente.</li>
	<li>Coletar e clarificar meio condicionado, conforme etapas 1.14-1,15, de todas as células peritoneais. Nota: As amostras podem ser usadas imediatamente ou congeladas e armazenadas a-80 ° C para análise de citocinas por ELISA.</li>
	<li>Executar etapa 2.11, mas incubar células para unstimulated 24 h. Coletar e clarificar os sobrenadantes de células, como por etapas 1.16-1.17, para análise de citocinas por ELISA. Nota: As células podem ser preparadas para técnicas como borrão ocidental ou PCR, como em etapas 1.16-1.17 e 2.14.</li>

<ol>
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Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Estados de ativação de macrófagos desempenham um papel importante em ambos de homeostase e doença do tecido22. Os macrófagos podem ter distintas bem como sobreposição de Estados de ativação, dependendo de pistas em seu microambiente3. Eles têm papéis distintos em todas as fases da resposta inflamatória: defesa contra patógenos, ferida restituição cura e tecido, e também tem um estado de ativação anti-inflamatórios distintos que é importante para desligar a resposta inflamatória2 . Ativação de macrófagos anti-inflamatórios requer dois estímulos externos para macrófagos a produzir quantidades elevadas das citocinas anti-inflamatórias, IL-10 e pequenas quantidades de citocinas pró-inflamatórias, como IL-12,23. Um sinal vem de anticorpos agindo através de receptores de gama Fc, e o segundo sinal é um estímulo pro-inflamatórios, tais como LPS ou relato de24,25. Soro, complexos imunes e anticorpos anti-TNFa, todos foram encontrados para induzir um estado de ativação anti-inflamatórias IL-10-produing alto em macrófagos8,23,25,26. Nosso grupo tem publicado anteriormente que murino medula óssea derivada de macrófagos e macrófagos peritoneais estimulados com IVIg também produzem altas quantidades de IL-10 e pouco a nenhuma pró-inflamatórias IL-12 / 23p 40 em resposta a LPS8. Também encontramos outras citocinas pró-inflamatórias, TNF e IL-6 também são reduzidas pelo IVIg em medula óssea derivada de macrófagos8. Os métodos descritos aqui podem ser aplicados para testar outras respostas de droga do anticorpo com base em BMDMs de rato e macrófagos peritoneais em vitro e em vivo.
Há muitas etapas críticas em testes baseados em anticorpos terapêutica na medula óssea de rato e macrófagos peritoneais. Manutenção de esterilidade é importante para cada protocolo. Se as culturas de macrófagos estão contaminadas com microorganismos do ar, pele ou fezes de ratos, os macrófagos responderá a esses estímulos através da produção de citocinas pró-inflamatórias. Executar todas as experiências em uma armário de biossegurança, pulverizando o mouse liberalmente com etanol e garantindo a integridade do intestino durante peritoneais flushes são essenciais. O anticorpo também deve ser mantido estéril e armazenados de acordo com as instruções do fabricante. Não pode ser usado se for contaminada, expirado ou turvas. Turbidez irá diminuir a eficácia da droga e pode ocorrer se a droga não é armazenada na temperatura adequada ou foi armazenada por muito tempo. IVIg pode ser armazenada a 4 ° C e usada somente antes da data de expiração é alcançada, desde que os níveis de produção de IL-10 podem ser afetados. Como alternativa, temos visto que ele pode ser congelado a-20 ° C com nenhum efeito nas respostas. Diferentes lotes de IVIg conduzem a resultados experimentais semelhantes, Considerando que diferentes tipos de preparações de marca de IVIg, como na Figura 1, podem causar respostas diferentes em macrófagos. Controles essenciais, tais como unstimulated células e células estimuladas com anticorpo sozinho, devem ser incluídas em cada experimento para descartar a contaminação dos macrófagos ou a droga.
Várias modificações podem ser feitas para esses protocolos para personalizar um experimento. No estado não-inflamado, pode ser difícil isolar suficiente macrófagos peritoneais para grandes experiências. Macrófagos peritoneais podem ser provocados pela injeção intraperitoneal de tioglicolato (TG). Ocorre uma resposta imune, e depois de 4 dias, eliciados macrófagos peritoneais podem ser colhidos27. Os macrófagos recrutados podem ser menos maduros e não representam as células residentes, como usamos aqui, que são considerações importantes. TG-suscitou macrófagos podem também interiorizou ágar de caldo de TG, que pode ser uma complicação, particularmente se faz experiências com fagocitose27. Ratos de diferentes origens genéticas, C57BL/6 ou BALB/c, também podem ser usados para experiências e podem ser escolhidos para examinar o impacto de anticorpos nas respostas de macrófagos que serão avaliados em modelos de doenças que exigem um fundo genético específico. Além disso, camundongos geneticamente modificados, tais como Il10- / - ratos, podem ser utilizados para avaliar a função das proteínas específicas no mecanismo de ação de uma droga, como fizemos em nosso próprio trabalho8. Diferentes estímulos inflamatórios também podem ser usados para avaliar o impacto de anticorpos na ativação de macrófagos. Relato e anfitrião derivado pedágio como agonistas do receptor (TLR) (por exemplo, ácido hialurônico), tem sido usados para ativar de25,de macrófagos produzem IL-1028. Uma consideração importante é a dose do anticorpo. A dose deve ser titulada para obter a dose ideal na cultura e na experimentação animal, como ele será diferente entre anticorpos, bem como fornecedores. A dose escolhida também deve refletir a dose dada aos seres humanos e serão diferentes entre as drogas. IVIg é dada como uma terapia anti-inflamatórios em doses elevadas (25-35 mg/mL ou 2 g/kg de peso corporal), que reflecte as doses tituladas usadas nestes protocolos29,30.
A utilização de medula óssea e macrófagos peritoneais têm limitações. Apesar de uma melhoria ao longo de linhas de células de macrófagos, rato BMDMs são células ainda artificialmente derivadas de precursores hematopoiéticos. Testar as respostas imunes de macrófagos em vitro é um passo importante para respostas de anticorpos de compreensão, mas na vivo experiências precisam ser realizadas também. Injetar estímulos na vivo seguido de cultivo de células ex vivo, pode fornecer mais informações para futuros estudos investigar se drogas baseadas em anticorpos também podem ativar macrófagos anti-inflamatórios em um estado de doença. Conclusões sobre o que ocorre em pessoas que recebem produtos biológicos baseados em anticorpo não podem ser desenhadas destas experiências. Poucos estudos têm sido publicados para avaliar os efeitos de IVIg em monócitos humanos derivado de macrófagos in vitro. Uma redução no número de IL-6 produzindo os monócitos humanos em vitro foram relatados, quando IVIg é co estimulada com LPS comparados à estimulação com LPS sozinho12. IVIg reduz TNFa e produção de IL-6, quando estimulado com pró-calcitonina (PCT) em humanos THP-1 monocítica células31.
Os protocolos dentro deste papel têm vantagens sobre os métodos existentes. Medula óssea derivada de macrófagos e macrófagos peritoneais são células primárias, isoladas diretamente de ratos, em vez de ser imortalizado linhas celulares.Linhas de células de macrófagos, como mouse, tais como células RAW264.7, não produzem as citocinas pró-inflamatórias, IL-12, em resposta ao LPS, que é uma citocina importante que é regulamentada pela IL-10 que é produzido em resposta ao IVIg8,13. Testando uma droga na vivo com LPS permite o exame do efeito da droga no ambiente peritoneal local através da análise do líquido de lavagem, células peritoneais e especificamente, os macrófagos peritoneais. É um curto prazo, um modelo simples que pode fornecer informações importantes para justificar o exame dos efeitos não-específicos de anticorpos na ativação de macrófagos em mais e mais caros modelos animais de doença. Tem uma vantagem sobre modelos de endotoxemia, onde a medida experimental é muitas vezes apenas a sobrevivência de rato ou citocinas no soro14. As taxas de sobrevivência e soro citocinas são medidas importantes da resposta imune, mas eles não mostram a contribuição que os macrófagos podem ter especificamente. Isolamento e cultivo de macrófagos peritoneais de um experimento do desafio mostram um efeito direto e mensurável que terapêutica de anticorpo pode ter em função do macrófago.
Esses métodos têm aplicações para testes e concepção de terapias biológicas. O uso de anticorpos como terapêutica aumentou dramaticamente nos últimos anos. No entanto, estas terapias podem ter efeitos desconhecidos adicionais em macrófagos que podem reconhecer a porção Fc do anticorpo e mudar a sua produção de citocinas. O anticorpo anti-TNFa, infliximab, tem sido mostrado para induzir a IL-10 e suprimir a proliferação de células T através de sua porção Fc, e que tem sido proposto como um dos seus mecanismos de ação7,15,26. Usando modelos genéticos, proteínas específicas podem ser implicadas no mecanismo de como estas drogas estão afetando a ativação de macrófagos. Classes de anticorpos IgG e preparações de anticorpos podem ser alteradas para alterar como os macrófagos são afetados por produtos biológicos. Nossos dados indicam que a preparação e/ou armazenamento da mesma droga anticorpo (IVIg) pode afetar os seus efeitos na ativação de macrófagos. Os métodos dentro este papel podem ser usados para projetar terapias que não têm estes efeitos, que podem ser essenciais para manter a immunosurveillance durante terapias de câncer, onde macrófagos anti-inflamatórios podem promover a progressão do tumor. Essas técnicas também podem ser usadas para projetar e avaliar medicamentos que têm estes efeitos, se desejável. Por exemplo, isso pode ser benéfico para reduzir as respostas inflamatórias de macrófagos e criar anti-inflamatório macrófagos IL-10-produzindo para melhorar o tratamento de doenças inflamatórias intestinais ou artrite reumatoide.

Os macrófagos são células do sistema imunológico inatas, que desempenham várias funções na resposta imune à infecção ou lesão. Os macrófagos são responsáveis por iniciar uma resposta imune a danos de infecção ou tecido, parando a resposta inflamatória e promover a cura de resposta1. Exemplos dos três Estados-ativação melhor estudados macrófago são: 1) macrófagos tratados com interferon gama (relato) e bacteriano lipopolissacarídeo (LPS), designado M (relato + LPS), que contribuem para a resposta inflamatória; 2) macrófagos estimulados com interleucina 4 (IL-4), M(IL-4), que são associados com a resposta de cura; 3) macrófagos estimulados com complexos imunes (IC) e LPS, M (IC + LPS), que têm a capacidade de desligar a resposta inflamatória2,3. M (IC + LPS) são distinto dos macrófagos de cicatrização de feridas M(IL-4) e não expressam a arginase enzima (Arg-1) ou FIZZ14. O melhor marcador para estes macrófagos anti-inflamatórios é a produção de citocinas5. Os macrófagos têm várias funções na manutenção da saúde, mas também contribuam para doenças inflamatórias e câncer3. Por causa disso, os macrófagos são um chave alvo terapêutico para o tratamento de uma ampla variedade de doenças. É importante investigar os efeitos dos anticorpos sobre seu estado de ativação para desenvolver tratamentos baseados em macrófagos para doença.
O foco deste artigo é sobre o uso de murino medula óssea derivada de macrófagos (BMDMs) e macrófagos peritoneais para testar o efeito de drogas de anticorpo em respostas inflamatórias em vitro e em vivo. Recentemente, tem havido vários estudos mostrando os efeitos dos anticorpos na ativação de macrófagos a6,7,8. Macrófagos ativados conjuntamente com complexos imunes, que são anticorpos complexos com um antígeno e LPS, um estímulo inflamatório normalmente, produzem níveis muito elevados de citocinas anti-inflamatórias, IL-10 e níveis muito baixos das citocinas pró-inflamatórias, Interleucina 12 (IL-12)9. Além disso, infliximab, um anticorpo monoclonal contra TNFa, verificou-se a trabalhar, em parte, através da indução de anti-inflamatórios macrófagos através de seu fragmento cristalizável (Fc) região7. Informamos que IVIg + LPS induzem ativação de macrófagos anti-inflamatório que é semelhante a M (IC + LPS), onde os macrófagos co estimulados produzem grandes quantidades de IL-10 e quantidades baixas da subunidade de citocina pró-inflamatória interleucina 12 ou 23 p40 ( Il-12/23p40), interleucina-6 (IL-6) e TNF8. IVIg é um fármaco composto por Anticorpos policlonais, principalmente IgG, que tem sido em pool de sangue de mais de 1.000 doadores10. Ele é usado para tratar uma ampla variedade de doenças imunológicas, tais como Púrpura Trombocitopênica Idiopática e polineuropatia desmielinizante crônica, mas seu mecanismo de ação não é completamente compreendido,11. Os efeitos das drogas do anticorpo com base na ativação de macrófagos podem ser avaliados usando os métodos descritos neste documento.
Os efeitos de produtos biológicos específicos na ativação de macrófagos podem ser testados em BMDMs e macrófagos peritoneais. Usar essas fontes macrófago permite avaliação de células primárias. Testes preliminares de anticorpos em culturas primárias de células requer menos tempo e investimento monetário do que outros modelos de doença demorado e caro. Injetar uma droga em um rato saudável na vivoe isolando as células e analisando-os ex vivo, pode-se determinar se os estudos são garantidos para avaliar se o tratamento com produtos biológicos afeta a ativação de macrófagos em modelos de doenças.
Com alguns estudos que testam o efeito das terapias biológicas na ativação de macrófagos in vitro e em vivo diretamente, nossas técnicas fornecem uma vantagem sobre técnicas alternativas. As técnicas atuais envolvem testes efeitos de drogas biológicas na célula mista populações em vitro, tais como o efeito de infliximab em uma reação linfocitária mista (MLR) ou IVIg em macrófagos humanos em células mononucleares do sangue periférico, onde o efeito Não pode ser atribuída a um tipo de célula específica7,12. Usar BMDMs e macrófagos peritoneais é vantajoso sobre usando linhas de células, como células RAW264.7, que não produzem a citocinas pró-inflamatórias, IL-12, em resposta a LPS8,13. Testar o efeito de uma droga baseada em anticorpos no macrófago respostas ex vivo tem vantagens porque o cytokine respostas podem ser atribuídas diretamente aos macrófagos, ao invés de inferir respostas macrófago medindo os níveis séricos de citocinas14 . BMDMs e macrófagos peritoneais podem ser derivados e isolados de ratos geneticamente modificados para determinar o papel específico de uma proteína na ativação de macrófagos anti-inflamatórios. Por exemplo, nós usamos Il10 deficiente(- / -) BMDMs para demonstrar que IVIg-induzido redução da produção de citocinas pró-inflamatórias é parcialmente dependente da IL-108. Mecanismo de uma droga de ação pode ser investigado usando mancha ocidental, onde o papel de proteínas específicas e sinalização de eventos pode ser determinado. Reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) podem ser executada em BMDMs ou macrófagos peritoneais para mostrar os padrões de expressão gênica que resultam da ativação de anticorpos. Modelos de doenças em camundongos podem fornecer informações sobre a potencial eficácia de terapias biológicas anticorpo-baseado em modelos para as doenças inflamatórias intestinais doenças, artrite reumatoide e câncer15,16, 17. no entanto, as técnicas descritas aqui irão fornecer informações sobre o mecanismo de ação destes produtos biológicos, determinando se eles induzem a atividade do macrófago anti-inflamatórios.

<table><tbody><tr><td>Iscove&amp;rsquo;s modified Dulbecco&amp;rsquo;s medium (IMDM)</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF)</td><td>Stemcell technologies</td><td>78059</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>88640</td><td></td></tr><tr><td>1X red blood cell lysis buffer</td><td>eBioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation buffer</td><td>Life technologies</td><td>13150016</td><td>Enzyme-Free, Hanks&#039;s-based, EDTA</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>L 4516</td><td>From E. coli 0127:B8</td></tr><tr><td>IVIg (Gammunex)</td><td>Grifols</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (Gammagard liquid)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (Octagam)</td><td>Octapharma</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>mouse IL-10 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555252</td><td></td></tr><tr><td>mouse IL-12/23p40 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555165</td><td></td></tr><tr><td>anti-Erk1/2 antibody</td><td>Cell signalling technology</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>anti-pp38 antibody</td><td>Cell signalling technology</td><td>9211</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH antibody</td><td>Fitzgerald industries</td><td>10R-G109A</td><td></td></tr><tr><td>26 g needle</td><td>BD biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>BD biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>BD biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>BD biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>BD biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tube (1.7 mL)</td><td>Diamed</td><td>SPE155-N</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;tissue culture treated flask</td><td>BD biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD biosciences</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>fine tip, dissecting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td>Delicate, 4 &lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;/&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&quot;</td></tr><tr><td>Brightfield microscope</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td>Inverted phase contrast</td></tr><tr><td>Scale&amp;nbsp;</td><td>Mettler&amp;nbsp;</td><td>PE 3000</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of antibody-based drugs effects on murine bone marrow and peritoneal macrophage activation

Os macrófagos são células do sistema imunológico inatas fagocíticas, iniciar respostas imunes a agentes patogénicos e contribuir para a restituição de cura e de tecido. Os macrófagos são igualmente importantes em desligar respostas inflamatórias. Mostramos que os macrófagos estimulados com imunoglobulina intravenosa (IVIg) podem produzir grandes quantidades das citocinas anti-inflamatórias, interleucina 10 (IL-10) e baixos níveis de citocinas pró-inflamatórias em resposta a lipopolissacarídeo bacteriano ( LPS). IVIg é que um anticorpo polivalente, principalmente imunoglobulina Gs (IgGs), pool de plasma de mais de 1.000 doadores de sangue. É usado para complementar os anticorpos em pacientes com deficiências imunológicas ou suprimir a resposta imune em pacientes com doenças auto-imunes ou inflamatórias. Infliximab, um anticorpo de alfa (TNFa) terapêutica anti-tumor necrose fator, também foi mostrado para ativar os macrófagos a produzir IL-10 em resposta a estímulos inflamatórios. IVIg e outros produtos biológicos baseados em anticorpo podem ser testados para determinar seus efeitos na ativação de macrófagos. Este artigo descreve métodos para derivação, estimulação e avaliação de medula murino macrófagos ativados por anticorpos em vitro e macrófagos peritoneais murino, ativados com anticorpos em vivo. Finalmente, vamos mostrar o uso da mancha ocidental para determinar a contribuição da célula específica, sinalização de caminhos para a atividade do macrófago anti-inflamatórios. Esses protocolos podem ser usados com ratos geneticamente modificados, para determinar o efeito de um somáticas específicas na ativação de macrófagos anti-inflamatórios. Essas técnicas também podem ser usadas para avaliar se os produtos biológicos específicos podem agir alterando os macrófagos para um estado de ativação anti-inflamatórias IL-10-produzindo que reduz respostas inflamatórias em vivo. Isso pode fornecer informações sobre o papel da ativação de macrófagos na eficácia de produtos biológicos durante modelos de doenças em camundongos e fornecer informações sobre um novo mecanismo de potencial de ação nas pessoas. Por outro lado, isto pode advertir contra o uso de produtos biológicos de baseados em anticorpos específicos para tratar doenças infecciosas, particularmente se os macrófagos desempenham um papel importante na defesa do hospedeiro contra a infecção.

Murino osso medula derivada de macrófagos podem ser cultivados de precursores de células hematopoiéticas em aspirados de medula óssea. Aspirados de medula óssea em pool de fêmures e tíbias de um rato C57BL/6 normalmente rendem 107 medula óssea derivada macrófagos, tornando-os uma fonte conveniente de macrófagos para experimentos. BMDMs podem ser usados para testar respostas de droga do anticorpo baseado quando desafiados com um estímulo inflamatório em vitro. A Figura 1 mostra essa marca de IVIg, Gammunex (GX), + LPS aumenta a produção das citocinas anti-inflamatórias, IL-10, 7-fold em relação à estimulação de LPS sozinha (Figura 1A) e diminui a produção de IL-12/23 p 40 (Figura 1 B). A Figura 1 demonstra também que diferentes preparações de IVIg executam de forma diferente. Embora as três diferentes preparações de IVIg são capazes de diminuir a IL-12 / 23p 40 significativamente (Figura 1B), Octagam (OG) e Gammagard líquido (GL), não aumentar significativamente a produção de IL-10 em resposta a LPS (Figura 1 A). OG e GL são capazes de reduzir significativamente a produção de IL-12/23-p 40 em resposta a LPS, mas em menor grau do que GX. Estes resultados demonstram que o anticorpo afeta medula derivada da ativação de macrófagos, e que existem diferenças entre os preparativos da mesma droga que pode causar mudanças nas respostas.
BMDMs podem ser usados para testar os efeitos mecanicistas de IVIg, pela mancha ocidental. Macrófagos ativados com IC + LPS aumentaram a fosforilação de quinases de proteína (mapa) o mitógeno ativado, p38 e Erk1/2, que são responsáveis por aumento de produção de IL-1021. Resultados na Figura 2 mostram um típico western blot para detectar a ativação da quinase de mapa necessária para a produção de IL-10 por macrófagos que são unstimulated, ou foram estimulados com LPS, IVIg, ou IVIg + LPS. IVIg estimulação sozinha ou IVIg + LPS co estimulação aumentada da ativação de quinases o mapa, Erk1/2, com fosforilação anterior e prolongada em comparação ao observado com LPS sozinhos. Ativação de p38 ocorreu anteriormente em macrófagos estimulados com IVIg + LPS comparados àqueles estimulados com LPS sozinhos. Esses resultados mostram que os métodos, tais como a mancha ocidental, podem ser usados para mostrar os efeitos das drogas do anticorpo na BMDMs de sinalização celular. Além da produção de citocinas, ativação da quinase de mapa pode ser usada para mostrar que a ativação de macrófagos anti-inflamatórios ocorreu.
Maduro, macrófagos residentes de tecido também podem ser isolados de ratos para avaliar as respostas de IVIg 5.0 x 105 - 1,0 x 106 de macrófagos peritoneais pode ser isolado de um rato saudável de C57BL/6. Na Figura 3, os macrófagos peritoneais de ratos injetados com IVIg não aumentar significativamente a produção de IL-10 na ausência de estimulação em vitro, em comparação com ratos PBS injetado. Quando injetado de macrófagos peritoneais de IVIg ratos são estimulados com LPS ex vivo, eles produzem IL-10 mais 6-fold do que os ratos injetados com PBS. Não, no entanto, produzem quantidades detectáveis de IL-12 / 23p 40 quando estimulados com LPS ex vivo. Estes resultados demonstram que os efeitos do anticorpo podem ser testados em macrófagos por injetar a droga na vivo e cultivo de células ex vivo com esse método.
Macrófago respostas de anticorpos e estímulos inflamatórios podem ser avaliados em vivo. Produção de citocinas pode ser avaliada no líquido de lavagem e em sobrenadantes de ex vivo estimulou os macrófagos peritoneais. A Figura 4 mostra as citocinas anti-inflamatórias IL-10 é aumentada no líquido de lavagem(Figura 4), células peritoneais (Figura 4B) e macrófagos peritoneais (Figura 4C) quando os ratos são desafiados com IVIg + LPS em comparação com PBS + LPS. Produção de citocinas pró-inflamatórias subunidade, IL-12 / 23p 40, é significativamente reduzida em macrófagos peritoneais culturas, mas não no líquido de lavagem. Esse método permite o exame do impacto de uma droga anticorpo em respostas inflamatórias em vivo , bem como ex vivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56689/56689fig1.jpg"> 
Figura 1 : Macrófago IL-10 e IL-12/23-p 40 produção em resposta à estimulação co com diferentes marcas de IVIg e LPS. C57Bl/6 MCSF medula óssea derivada de macrófagos foram ou unstimulated (C), ou estimulados com LPS (10 ng/mL), IVIg (30 mg/mL), ou IVIg + LPS. Testaram-se três marcas diferentes de IVIg: Gammagard líquido (GL), Gammunex (GX) e Octagam (OG). Sobrenadantes de macrófagos foram coletadas 24 horas após a estimulação e clarificados por centrifugação. Elisa para (A) de IL-10 e IL-12/23 p 40 (B) foram realizada. São dados para macrófagos de n = 3 experimentos independentes, com células de 1 mouse individual por experimento, com Elisa ensaio em duplicado. Dados são meios ± SD. *P &#60; 0.05, * * P &#60; 0.001, * * *P &#60; 0,0001 para comparação entre estimulação LPS e IVIg + estimulação co LPS. Uma forma de análise de variância (ANOVA) com pós-teste de Tukey para comparações múltiplas foram usados para análises estatísticas. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56689/56689fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56689/56689fig2.jpg"> 
Figura 2 : Análise ocidental do borrão de ativação da quinase de mapa em macrófagos IVIg está ativado. MCSF derivadas da medula óssea macrófagos foram unstimulated ou estimulados com LPS (10 ng/mL), GX IVIg (30 mg/mL), ou GX IVIg + LPS; para 0, 10, 40 ou 120 min. lysates de célula inteira (1.0 x 106 macrófagos/pista) foram submetidos a Dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida gel eletroforese (SDS-PAGE) e western mancha com Anticorpos fosfo-específicos para p38 e extracelular sinal-regulada quinase (Erk1/2), bem como gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), como um controle de carregamento. Resultados mostrados são representativos de n = 3 experimentos independentes, com células de 1 mouse individual por experiência.Densitometria para pp38 e níveis de proteína de pErk1/2, normalizada para GAPDH, em média de 3 experimentos independentes são mostradas abaixo de cada banda. Esta figura foi modificada de Kozicky et al.8. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56689/56689fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56689/56689fig3.jpg"> 
Figura 3 : Produção de IL-10 por macrófagos de ratos desafiados com IVIg em vivo. camundongos C57BL/6 de 8 semanas de idade foram dadas intraperitonealmente PBS estéril (controle de injeção) ou GX IVIg (2,5 g/kg). Depois de 1h, os ratos foram sacrificados e peritoneais lavages foram realizados. Macrófagos peritoneais foram isolados usando seleção de aderência. Os macrófagos foram ou unstimulated (C), ou estimulados com LPS (10 ng/mL). Sobrenadantes de células foram colhidas e esclarecidas após 24 h para ELISA de IL-10. São dados de n = 5 ratos individuais por grupo realizada em 3 experimentos independentes, com Elisa ensaio em duplicado. Dados são meios ± SD. * P &#60; 0,01 e NS = não significativo. Análises estatísticas foram realizadas utilizando um ANOVA de duas vias com depois do teste do Sidak para comparações múltiplas. Esta figura foi modificada de Kozicky et al.8. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56689/56689fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56689/56689fig4.jpg"> 
Figura 4 : Produção de IL-10 e IL-12/23-p 40 de ratos desafiado com IVIg + LPS na vivo. camundongos C57BL/6 de 8 semanas de idade foram injetados intraperitonealmente com ou PBS + LPS (0,2 µ g/g de massa corporal), como um controle; ou GX IVIg (2,5 g/kg de peso corporal) + LPS (peso de 0,2 µ g/g). Depois de 1h, os ratos foram sacrificados e peritoneais lavages foram realizados. (A) fluido de lavagem clarificada, (B) esclareceu condicionados sobrenadantes de células peritoneais durante uma etapa de aderência do macrófago 1h, e (C) esclareceu 24h sobrenadantes de macrófagos peritoneais (Mφ) foram testados para IL-10 e IL-12 / 23p 40 por ELISA. Dados são meios ± SD para n = 5 ratos em 3 experimentos independentes, com Elisa ensaio em duplicado. P &#60; 0.05, * *P &#60; 0,01, * * *P &#60; 0,001 e NS = não significativo. Os ratos injetados com PBS + LPS foram comparados aos ratos injetados com IVIg + LPS usando um t de Student. Esta figura foi modificada de Kozicky et al.8. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56689/56689fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Drogas baseadas em anticorpos revolucionaram o tratamento de doenças inflamatórias. Além de ter efeito direto sobre a alvos específicos, os anticorpos podem ativar macrófagos tornar-se anti-inflamatórios. Este protocolo descreve como anti-inflamatórios macrófago ativação pode ser avaliada in vitro, usando os macrófagos da medula óssea de rato e in vivo usando os macrófagos peritoneais.

Avaliação dos efeitos de drogas baseados em anticorpo murino da medula óssea e ativação de macrófagos peritoneais

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

assessment-antibody-based-drugs-effects-on-murine-bone-marrow

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.2K visualizações.  University of British Columbia. Drogas baseadas em anticorpos revolucionaram o tratamento de doenças inflamatórias. Além de ter efeito direto sobre a alvos específicos, os anticorpos podem ativar macrófagos tornar-se anti-inflamatórios. Este protocolo descreve como anti-inflamatórios macrófago ativação pode ser avaliada in vitro, usando os macrófagos da medula óssea de rato e in vivo usando os macrófagos peritoneais.

Vídeo: Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

Depleção e reconstituição de macrófagos em Ratos

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Imunologia e Infecção

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Investigação de polarização de macrófagos Usando medula macrófagos derivados

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Medula Óssea derivadas de macrófagos Produção

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Isolamento de Murino macrófagos peritoniais de Cumprir a análise de expressão gênica Após Toll-like receptors Estimulação

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by osteoclasts in response to different stimuli. Osteoclast precursors differentiate into multinuclear osteoclasts in response to macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL). Under pathologic conditions, the cytokine profile is different and involves a mixture of inflammatory cytokines. Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) is one of the most important cytokines as it is found in large amounts in areas involved with inflammatory osteolysis. The purpose of this protocol is to provide a method by which murine bone marrow is isolated to generate osteoclasts through induction with M-CSF and either RANKL or TNF-&#945; which will be subsequently inhibited by increasing doses of anti-c-fms antibody, the receptor for M-CSF. This experiment highlights the therapeutic value of anti-c-fms antibody in diseases of inflammatory bone resorption.

This protocol includes dissection of murine long bones and bone marrow isolation, to generate bone marrow macrophages and produce osteoclasts using macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL) or tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) and their arrest by anti-c-fms antibody, M-CSF receptor.

Efeito de anticorpo Anti-c-fms Osteoclast formação e proliferação de Osteoclast Precursor In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, and foreign pathogens. The phagocytic capacity of monocytes versus macrophages is a concept that is not well understood. Here, we aim to examine a difference in the phagocytosis of monocytes versus macrophages, specifically M1/M2 macrophages, against various opsonized red cells using a modified and updated version of the established monocyte monolayer assay (MMA). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from donor buffy coats. Using purified monocytes, inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 macrophages were produced by in vitro culture and polarization. M1/M2 cells were harvested and used in an MMA-like assay, which we refer to as the M-MA, to decipher clinically significant phagocytosis of various red cell antibodies. A phagocytic index (PI) &#62; 5 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of monocytes. A phagocytic index (PI) &#62; 12 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of M1/M2 macrophages. M2 macrophages demonstrate an increased ability to phagocytose opsonized RBCs compared to monocytes and M1s. The same weak antibody (anti-S) yields significant phagocytosis with only M2 macrophages (PI=43) but not M1s (PI=2) or monocytes (PI=0), and this was demonstrated repeatedly using various antibodies. The use of M2 macrophages instead of monocytes may allow for more accurate results as these cells are more phagocytic, offering further clinical relevance to the assay. Further studies with different antibodies to red blood cells, including validation of the monocyte-macrophage assay (M-MA) with antibodies having known clinical significance, may show the M-MA&#160;more useful to help predict clinically significant red cell alloantibodies and transfusion reactions. This method will advance the field of transfusion medicine and immunology.

We have developed enhancements and updated methods for the existing monocyte-monolayer assay (MMA), in which macrophages are used to help better predict the clinical relevance of red cell alloantibodies in transfusion medicine and immunology. This assay is named the monocyte-macrophage assay (M-MA).

Previsão da significância do anticorpo eritrocitário usando o ensaio de monócitos-macrófagos

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, ...

Activation of Mouse Bone Marrow-Derived Macrophages in Response to Antibodies

Source: Kozicky, L. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56689">Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate the activation of bone marrow-derived macrophages in response to bacterial lipopolysaccharide and intravenous immunoglobulin.

Ativação de macrófagos derivados de medula óssea de camundongo em resposta a anticorpos

Source: Kozicky, L. et al., Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation. J. Vis. Exp. (2017)
In ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunologia

Resposta Imune

Mecanismo de Defesa do Hospdeiro

In Vivo Activation of Peritoneal Macrophages in Response to Antibodies in a Murine Model

Source: Kozicky, L., et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56689">Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the activation of a mouse&#39;s peritoneal macrophages using intravenous immunoglobulin and bacterial lipopolysaccharide. The co-stimulation activates the peritoneal macrophages into anti-inflammatory macrophages possessing immune regulatory activity.

Ativação in vivo de macrófagos peritoneais em resposta a anticorpos em modelo murino

Source: Kozicky, L., et al., Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation.&#160;J. Vis. Exp. ...