Os autores gostaria de agradecer o Sr. Michael Connolly e Dr. Ronald Zuckermann (The Foundry Molecular, Lawrence Berkeley National Laboratory) técnica apoio na síntese de peptoid. Reconhecemos o apoio da Fundação Nacional de ciência (-1301505). Todos os experimentos de espectrometria de massa foram realizados na instalação de espectrometria de massa de química na Universidade do Pacífico.

1. síntese de Peptoid
Nota: A síntese começa com a ativação da resina inchaço da resina e removendo o grupo protegendo. Isto é seguido pelo crescimento da cadeia de peptoid para a resina através de ciclos de adição do monômero de repetição. O primeiro monómero acoplado à resina é o resíduo do C-terminal. O peptoid é alongada do C-terminal para o extremidade N-terminal. Uma vez que a sequência de peptoid desejada é alcançada, a resina é clivada fora e o produto peptoid é purificado.
<ol><li>Preparação dos reagentes Nota: Os reagentes líquidos são medidos através de uma micropipeta e os reagentes sólidos são medidos através de uma balança analítica.<ol>
<li>Misturar 6,2 mL de N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) e 43,8 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) para preparar um 0,8 M de solução DIC/DMF.</li>
		<li>Dissolva 5,56 g da BMA em 50,0 mL de DMF para preparar uma solução de 0,8 M. o BMA/DMF.</li>
		<li>Misture 2 mL de piperidina (Pip) e 8 mL de DMF para atingir 20% solução de Pip/DMF.</li>
		<li>Dissolver 1,9 mL de Npe em 13,1 mL de DMF para atingir 1,0 M Npe/DMF.</li>
		<li>Dissolver a 1,3 mL de Nme em 13,7 mL DMF para atingir 1,0 M Nme/DMF.</li>
		<li>Dissolver 0,32 mL de Nae em 2 mL de DMF para atingir 1,0 M Nae/DMF. Cuidado: A maioria dos produtos químicos usados na síntese é perigosa. Ácido trifluoroacético (TFA), DIC, Pip e BMA são perigosos para a pele, olhos e vias respiratórias. DMF e diclorometano (DCM) são suspeitos de serem agentes cancerígenos. Todas as reações devem ser executadas em uma coifa e equipamento de protecção adequado deve ser usado. Por favor, verifique a folha de dados de segurança do material (MSDS) de todos os produtos químicos usados na síntese.</li>
	</ol></li>
	<li>Ativação de resina
	<ol>
<li>Meça 84 mg de resina de amida de Rink (resina, 0.047 mmol, carregando 0,56 mmol/g) e adicioná-lo para um recipiente de reação de fase sólida polipropileno de 10 mL. Insira o êmbolo na embarcação.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de CPO para o recipiente de reação e tampar o recipiente com uma tampa de pressão. Coloque o recipiente em um shaker e agitar o recipiente à temperatura ambiente em um ângulo de movimento de aproximadamente 12 graus e 385 oscilações/min para 30 min. Escorra a solução para um contentor de resíduos removendo a tampa e empurrar o êmbolo da embarcação da reação.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de solução de Pip/DMF de 20% para o navio e capitão do navio. Agite-o agitador por 2 min e drenar a solução para o recipiente de resíduos.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de solução de Pip/DMF de 20% para o navio, capitão do navio e agite-o em temperatura ambiente por 12 min. remover a tampa e esvazie a solução para o recipiente de resíduos.</li>
		<li>Lave a resina, adicionando 1 mL de DMF, tampando o recipiente e agitando o recipiente para 1 min. Retire a tampa e escorra a solução, empurrando o êmbolo. Lave a resina com DMF para 4 vezes adicionais.</li>
	</ol></li>
	<li>Adição do monômero e Acetilação N-terminal Nota: Cada ciclo de adição do monômero que envolve o deslocamento, bromoacetylation e reação de duas etapas.<ol>
<li>Realizar o primeiro ciclo de adição de monômero para formar o Nme-resina.</li>
		<li>Execute uma reação bromoacetylation. Misture 1 mL da solução de 0,8 M. o BMA/DMF e 1 mL de solução de 0,8 M DIC/DMF num copo. Transfira a mistura para um recipiente de reação contendo resina e capitão do navio. Coloque o recipiente no agitador e agite-o à temperatura ambiente por 20 min. remover a tampa e drenar a solução para o recipiente de resíduos.</li>
		<li>Lave a resina adicionando 1 mL de DMF, tampando o recipiente, agitando-lo por 1 min, e drenar a solução empurrando o êmbolo. Lave a resina adicionando 1 mL de DCM, agitando o recipiente por 1 min, e drenar a solução. Lave a resina com DCM, mais uma vez e depois lave-o com DMF duas vezes.</li>
		<li>Realize uma reação de deslocamento. Adicione 1 mL de solução de 1,0 M Nme/DMF, capitão do navio, agitar o recipiente à temperatura de 60 min. remover a tampa e esvazie a solução empurrando o êmbolo.</li>
		<li>Lave a resina adicionando 1ml DMF, agitando o recipiente por 1 min, e drenar a solução empurrando o êmbolo. Lave a resina por desenho em 1 mL DCM, agitando durante 1 min e drenar a solução. Lave o DCM mais uma vez, seguido por lavagem com DMF duas vezes.</li>
		<li>Repetir ciclos de adição do monômero de passos 1.3.2 a 1.3.5 para formar Nae-(Npe-Nme)4-resina. Quando repetir a etapa de reação de deslocamento (1.3.4), use uma solução de amina específicas de acordo com a sequência de peptoid. Nota: A cadeia de peptoid é alongada do C-terminal para o extremidade N-terminal com o resíduo do C-terminal ligado à resina.</li>
		<li>Executar a Acetilação N-terminal para formar Ac-Nae-(Npe-Nme)4-resina.</li>
		<li>Anidrido acético Mix 92 µ l dos, 43,5 µ l de N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) e 2 mL de DMF num copo para fazer cerca de 2 mL de acetilação cocktail.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de acetilação cocktail para o recipiente que contém resina, tampar o recipiente e agite-o à temperatura ambiente por 60 min. Retire a tampa e escorra a solução, empurrando o êmbolo.</li>
		<li>Lave a resina adicionando 1 mL de DMF, agitando o recipiente por 1 min, e drenar a solução empurrando o êmbolo. Lave a resina adicionando 1 mL de DCM, agitando o recipiente por 1 min, e drenar a solução. Repeti a lavagem da resina com DCM mais uma vez e, em seguida, lave-a com DMF mais duas vezes.</li>
		<li>Lave a resina adicionando 1 mL de DCM, agitando o recipiente por 1 min, e drenar a solução empurrando o êmbolo. Repita a lavagem com DCM duas vezes. Retire a tampa e deixe a resina secar ao ar livre na embarcação da reação por 10 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Clivagem e purificação
	<ol>
<li>Misture 3,8 mL de TFA, 100 µ l de triisopropylsilane (dicas) e 100 µ l de HPLC-classe H2O em um copo para fazer 4 mL de clivagem cocktail.</li>
		<li>Adicionar 4 mL de acabadas clivagem cocktail para o recipiente que contém resina, tampar o recipiente e agite-o em temperatura ambiente por 2 h.</li>
		<li>Retire a tampa e recolher a filtrado solução para um tubo de centrifugação de polipropileno de 50 mL. Adicionar 1 mL de TFA para o navio, tampá-lo e agitar durante 1 min. recolher a filtrado solução no tubo de centrífuga mesmo.</li>
		<li>Evapore o TFA soprando em um fluxo de gás nitrogênio suavemente até que cerca de 1 mL solução viscosa.</li>
		<li>Adicionar 15 mL de éter dietílico para o restante da solução tampão tubo de centrífuga e incube-lo em um congelador-20 ° C durante 2 h durante a noite. O peptoid bruto precipita como sólido branco.</li>
		<li>Sedimento sólido utilizando uma centrífuga a 4.427 x g durante 10 min. remover a tampa do tubo e decantar éter etílico em um béquer cuidadosamente sem perder o sólido. Atenção: o éter etílico é um solvente orgânico inflamável. Por favor, use uma centrífuga seguro de éter dietílico.</li>
		<li>Lavar o sólido adicionando 10 mL de éter dietílico gelado em centrífuga tubo contendo o sólido, tampando o tubo e colocá-lo na centrífuga. Realize a centrifugação a 4.427 x g durante 10 min. Retire o centrifugador do tubo de centrífuga e decantar éter etílico em um béquer cuidadosamente sem perder o sólido.</li>
		<li>Seca o sólido soprando suavemente em um fluxo de gás nitrogênio.</li>
		<li>Adicione 10 mL de HPLC-classe H2O para dissolver o sólido seco. Passar a solução através de um filtro de seringa de nylon com tamanho de poros de 0,45 µm e recolher o filtrado para um tubo de centrifugação polipropileno de 50ml previamente ponderada.</li>
		<li>Escudo congelar a solução colocando e girando o tubo de centrífuga contendo a solução de peptoid em um 12 onças, double-Stack expandido poliestireno copo 1/3 cheio de nitrogênio líquido. Lyophilize a solução congelada durante a noite para render peptoid sólido.</li>
		<li>Repita mais uma vez de liofilização dissolvendo o sólido peptoid em 10 mL de HPLC-classe H2O, shell congelamento em nitrogênio líquido e liofilização durante a noite. A peptoid resultante é suficientemente puro para análise de sequências por espectrometria de massa.</li>
	</ol></li>
</ol>2. MS medições e análise de sequência
Nota: O experimento de MS/MS é realizado em um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo, acoplado a uma fonte de ionização (ESI) electrospray. Coleta de dados é controlada usando o software de aquisição de dados acompanhado com o instrumento. O procedimento geral inclui 1) executa a experiência de espectrometria de massa de varredura completa e gravando o espectro de massa, 2) realizando a CID MS/MS experimentar e gravação do espectro de MS/MS e 3) comparando os dados espectrais de MS/MS com teórica esquema de fragmentação previu baseia a característica estrutural da peptoid.
<ol><li>Preparação da solução de amostra
	<ol>
<li>Pese 1,0-2,0 mg peptoid sólido em um frasco de vidro de 3 a 5 mL. Adicione 1 mL de mistura solvente acetonitrila e água (ACN/H2O, 1:1, v/v) para dissolver o peptoid. Isto dá a solução estoque da amostra com uma concentração de cerca de 10-3 M.</li>
		<li>Transferência de 20 µ l de solução para um tubo de centrifugação de 1,5 mL e adicionar 1 mL de mistura solvente de ACN/H2O para produzir uma solução diluída de amostra de cerca de 10-5 M.</li>
		<li>Remover quaisquer possíveis partículas insolúveis na solução de amostra diluída, realizando a centrifugação a 4.427 x g por 3 min. transferir cerca de 700 µ l da parte superior da solução para outra centrífuga 1,5 mL tubo para fazer o peptoid MS solução de trabalho com concentração de cerca de 10-5 M.</li>
		<li>Ajuste a concentração da solução de trabalho de MS com base na intensidade do sinal observado durante as medições de espectrometria de massa.</li>
		<li>Uma maneira alternativa para remover quaisquer possíveis partículas insolúveis na solução de amostra diluída é passar a solução de amostra através de um filtro de seringa 0,20 µm e recolher o filtrado para um tubo de centrifugação de 1,5 mL para fazer o peptoid MS solução de trabalho de cerca de 10-5 M.</li>
	</ol></li>
	<li>Gravação de espectros de massa
	<ol>
<li>Executar a mistura de solventes de ACN/H2O (1:1, v/v) com a fonte de ionização (ESI) electrospray e configurar o instrumento em um íon positivo padrão, o modo de varredura completa espectrometria de massa com uma gama de relação massa-de-carga (m/z) de 100-1500. Nota: Parâmetros de funcionamento típicos: Tensão de agulha ESI, 5 kV Tensão capilar, 40 V Secagem a temperatura do gás (gás nitrogênio), 200 ° C.</li>
		<li>Adicionar aproximadamente 300 µ l de solução de trabalho de peptoid MS (cerca de 10-5 M) em um 500 µ l ou uma seringa de 1 mL e conecte a seringa de entrada do ESI usar capilar poliéter éter cetona (PEEK) produto. Coloque a seringa para a bomba de seringa e definir a taxa de fluxo em 10 µ l/min para infundir a solução de amostra na entrada do ESI.</li>
		<li>Ligue a tensão de agulha ESI para ativar o processo ESI e em seguida, ligue o detector. Configurar a visualização no modo de perfil e na faixa de 100-1.500 m/z. Exibir um perfil de espectro de massa mostrado na janela de perfil. O pico m/z 1.265 (exibido como m/z de 1,264.6) corresponde a peptoid peptoid de íon ou protonados.</li>
		<li>Grave o espectro de MS por 2 min. Em "Método janela", usar 2 min como o "tempo de execução". Abra a janela de gravação e preencha um nome de arquivo apropriado e começar a gravar o espectro. Nota: O espectro de massa resultante é mostrado na Figura 3.</li>
		<li>Otimize a intensidade do pico m/z de 1.265. Definir o intervalo de m/z para 1.150-1.350 e ajustar a tensão capilar enquanto visualiza o pico de intensidade em mV mostrada na janela de perfil. Por exemplo, aumentar a tensão capilar para 50 V ou superior e visualizar a mudança do pico de intensidade. A intensidade de pico ideal é em torno de 150-200 mV. Nota: Ajuste a tensão capilar pode alterar significativamente a abundância de certos íons. Aumentando a tensão capilar pode aumentar a intensidade do íon peptoid. No entanto, uma alta tensão capilar também pode induzir a dissociação do íon peptoid na fonte de íons e diminuir a intensidade observada. Ajustar a temperatura do gás de secagem pode aumentar a intensidade do pico m/z 1.265, mas é menos eficaz que o ajuste da tensão capilar. Se o pico m/z 1.265 não atingir a intensidade ideal, ajuste a concentração de amostra (ou exemplo, dobro a concentração da solução de trabalho de MS).</li>
		<li>Alterne o aparelho para o modo de MS/MS. Definir o íon precursor em m/z 1.265 e as MS/MS massa gama em m/z de 100-1.400. Em "Método janela," usar m/z 1.265 como a "primeira missa Q1" e deixe a "última missa Q1" em branco. Use m/z 100 como o "Q3 primeira missa" e m/z 1.400 como o "Q3 última missa." Nota: No modo de MS/MS, o primeiro quadrupolo unidade (Q1) funciona como um filtro em massa para isolar o íon peptoid como o íon precursor, a segunda unidade de quadrupolo (Q2) é uma célula de colisão e as funções de unidade (Q3) quadrupolo terceiros como um analisador de massa.</li>
		<li>Conjunto de pressão a energia de colisão em 40 eV e o gás de colisão (árgon, neste caso) em 1,5 mTorr.</li>
		<li>Exibir um perfil de espectro de massa exibido na janela de perfil. O pico m/z de 1.265 corresponde ao íon peptoid, e os picos com valores mais baixos de m/z representam os fragmentos do íon peptoid.</li>
		<li>Ajuste a energia de colisão para otimizar a exibição do espectro de fragmentação. Por exemplo, aumentar a energia de colisão de 45 eV... e ver a mudança do perfil do espectro. Nota: em geral, aumentando a energia de colisão irá aumentar a abundância de íons de fragmento e reduzir a abundância do íon peptoid. Aumentando a pressão do gás de colisão também aumentará a abundância dos íons fragmento. ADVERTÊNCIA: Não aumente a pressão de gás de colisão além 2 mTorr.</li>
		<li>Registro do espectro de MS/MS, por 2 min. Em "Método janela," usar 2 min como o "tempo de execução". Abra a janela de gravação e preencha um nome de arquivo apropriado e começar a gravar o espectro.</li>
		<li>Repeti a gravação 1 - 2 vezes.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de sequência de Peptoid Nota: Sob a condição de CID, o íon peptoid iria fragmentar nas ligações Amida ao longo da espinha de peptoid para produzir uma série de fragmentos de N-terminal chamado B-íons e uma série de fragmentos C-terminal chamado Y-íons<ol>
<li>Retire a estrutura química da peptoid acetificado, colocando o N-terminal do lado esquerdo e o C-terminal do lado direito e desenhar uma linha tracejada em cada ligação Amida para gerar um esquema de fragmentação, como mostrado na Figura 2a. Desenhe um próton com um círculo tracejado para indicar a transportadora de carga. A partir do lado esquerdo da estrutura, Coloque etiquetas em linhas tracejadas para indicar os fragmentos do N-terminal como B1, B2, B8. A partir do lado direito, Coloque etiquetas em linhas tracejadas para indicar os fragmentos C-terminais como Y1, Y2, Y8. Nota: Um software de desenho químico pode ser utilizado para desenhar a estrutura de peptoid.</li>
		<li>Imagine a fragmentação no laço de Amida 4th do lado esquerdo e desenhar as estruturas do fragmento N-terminal e o fragmento do C-terminal com adequada acusações formais, como mostrado na Figura 2b. Colocar a etiqueta de B4 o fragmento N-terminal e colocar a etiqueta de Y5 o fragmento C-terminal. Calcular o valor de B4 m/z somando as massas nominais dos elementos na estrutura para produzir um valor de 580 e coloque o fragmento N-terminal m/z 580. Calcular o valor de Y5 m/z e coloque o fragmento C-terminal m/z 685.</li>
		<li>Calcular os valores de m/z para todos os oito íons de B e todos os oito íons de Y e reuni-los em uma tabela, conforme mostrado na tabela 1. Nota: Os valores de m/z dos fragmentos podem ser calculados usando uma software de desenho de química.</li>
		<li>Abra o espectro de MS/MS gravado da peptoid usando o software de análise de dados acompanhado com o instrumento. Defina as preferências de rotulagem para "Mostrar rótulos de Ion" e limiar de rótulo para 3%. Isso gera um espectro de MS/MS com m/z valores rotulados nos picos.</li>
		<li>Exporte a MS/MS espectrais dados como um arquivo de texto CSV a formatar e reconstruir o espectro usando software de processamento de dados. Coloque valores m/z nos picos. O espectro de MS/MS resultante é mostrado na Figura 4. Nota: Alguns espectrómetros de massa estão equipados com software de processamento de dados capaz para gerar o espectro de MS/MS. Neste caso, exportando os dados espectrais de MS/MS não é necessário.</li>
		<li>Atribua os valores de m/z mostrados o espectro de MS/MS àqueles mostrados na tabela 1 para identificar os correspondentes B - e Y-íons. Por exemplo, o pico m/z 580 é identificado como o B-4-íon e m/z 685 é identificado como o Y5-íon. Rotule os picos com símbolos correspondentes de B e Y no espectro, como mostrado na Figura 4.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Sun, J., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoid+Polymers:+A+Highly+Designable+Bioinspired+Material.">Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material.</a> ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).</li><li>Fowler, S. A., Blackwell, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+peptoids:+Recent+advances+toward+deciphering+the+structural+requirements+for+biological+function.">Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function.</a> Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).</li><li>Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoids+that+mimic+the+structure,+function,+and+mechanism+of+helical+antimicrobial+peptides.">Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).</li><li>Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoid-Peptide+Hybrids+as+Potent+Novel+Melanocortin+Receptor.">Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor.</a> J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).</li><li>Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Potent+Transactivation+Domain+Mimic+with+Activity+in+Living+Cells.">A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).</li><li>Patch, J. A., Barron, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+Peptoid+Mimics+of+Magainin-2+Amide.">Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).</li><li>Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifouling+Glycocalyx-Mimetic+Peptoids.">Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).</li><li>Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-Mimetic+Peptoid+Nanosheets+for+Molecular+Recognition.">Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition.</a> ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).</li><li>Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial,+Hemolytic,+and+Cytotoxic+Activities+of+&#946;-Peptoid-Peptide+Hybrid+Oligomers:+Improved+Properties+Compared+to+Natural+AMPs.">Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of &#946;-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs.</a> ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).</li><li>Lutz, J. -. F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-Controlled+Polymers.">Sequence-Controlled Polymers.</a> Science. 341 (6146), 628 (2013).</li><li>Altuntas, E., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Polymeromics":+Mass+spectrometry+based+strategies+in+polymer+science+toward+complete+sequencing+approaches:+A+review.">"Polymeromics": Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review.</a> Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).</li><li>Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+Hydrophilic+Linker+for+One-Bead-One-Compound+Sequencing+of+Oligomer+Libraries+by+Tandem+Mass+Spectrometry.">Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry.</a> J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).</li><li>Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Sequencing+of+Peptoids+and+Peptide-Peptoid+Hybrids+by+Partial+Edman+Degradation+and+Mass+Spectrometry.">High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry.</a> J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).</li><li>Sarma, B. K., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submonomer+Synthesis+of+A+Hybrid+Peptoid-Azapeptoid+Library.">Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library.</a> ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).</li><li>Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-Down+Multidimensional+Mass+Spectrometry+Methods+for+Synthetic+Polymer+Analysis.">Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis.</a> Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).</li><li>Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+N-substituted+glycine+peptoid+libraries.">Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries.</a> Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).</li><li>Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+method+for+the+preparation+of+peptoids+[oligo(N-substituted+glycines)]+by+submonomer+solid-phase+synthesis.">Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).</li><li>Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Multistep+Synthesis+of+a+Bioactive+Peptidomimetic+Oligomer+for+the+Undergraduate+Laboratory.">Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory.</a> J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).</li><li>Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+submonomer+synthesis+of+peptoid+Polymers+and+their+self-assembly+into+highly-ordered+nanosheets.">Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets.</a> J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).</li><li>Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+the+Synthesis+of+Peptoids+with+Mixed+Lysine-type/Arginine-type+Monomers+and+Evaluation+of+Their+Anti-leishmanial+Activity.">An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+studies+of+protonated+and+alkali+metalated+peptoids:+Enhanced+sequence+coverage+by+metal+cation+addition.">Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition.</a> Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).</li><li>Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Capture+Dissociation+Studies+of+the+Fragmentation+Patterns+of+Doubly+Protonated+and+Mixed+Protonated-Sodiated+Peptoids.">Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).</li><li>Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragmentation+Patterns+and+Mechanisms+of+Singly+and+Doubly+Protonated+Peptoids+Studied+by+Collision+Induced+Dissociation.">Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Um peptoid nonamer, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, tem sido sintetizado usando o protocolo apresentado. O aparelho de síntese envolve uma embarcação da reação de fase sólida polipropileno como seringa e um agitador mecânico. Os vasos de reação são comercialmente disponíveis e de baixo custo. Um agitador mecânico é um aparelho comum em laboratórios de química. Com o uso de uma embarcação da reação como seringa, soluções podem ser sugadas e empurradas para fora do navio, manualmente, movendo o êmbolo. Esta técnica permite que o monômero reações de clivagem adição e resina ocorrer no recipiente de uma única reação e elimina a etapa de transferência do produto intermédio de resina-ligado em outro navio para a segmentação. Essa técnica também elimina a necessidade de um dispositivo de aspiração remover soluções a embarcação da reação. Aspiração é comumente usada na síntese de peptoid manual que foi demonstrado por outros pesquisadores19,20. Lavar cuidadosamente a resina entre etapas de reação é crucial para a obtenção de um produto de alta pureza. Um problema potencial é o entupimento do frit na embarcação da reação após vários ciclos de adição do monômero. Uma solução para este problema é para transferir a resina em um novo recipiente de reação e para continuar o processo de síntese. Esta técnica de síntese funciona bem para peptoids até 10-12 resíduos. Para mais peptoids, torna-se difícil retirar o recipiente de reação soluções, empurrando o êmbolo. Neste caso, um dispositivo de aspiração pode ser utilizado para remover o recipiente de reação (o atuador deve ser substituído por uma rolha) soluções. No protocolo de síntese, o produto bruto é purificado por precipitando o peptoid em éter dietílico. Alguns peptoids mais curto e altamente polar não podem formar precipitado em éter dietílico. Neste caso, o peptoid pode ser isolada por dissolver o produto bruto em 10% de ácido acético e a solução com éter dietílico de lavagem várias vezes, que é seguido por liofilização. Alguns peptoids altamente hidrofóbicos também não podem formar precipitado em éter dietílico. Neste caso, evaporar o éter etílico e usar uma HPLC de fase reversa para purificar o produto peptoid.
Neste estudo, o íon peptoid é gerado pelo ESI e o experimento de MS/MS é realizado em um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo. Devido a capacidade de isolamento de íon pela unidade primeira quadrupolo, a amostra é infundida diretamente a fonte ESI, que elimina a necessidade para cromatografia líquida (LC). Isoladamente protonados peptoids também podem ser facilmente gerados usando a técnica de dessorção-ionização (MALDI) laser assistida por matriz. As MS/MS podem ser realizadas experiências usando outros tipos de espectrómetros de massa, tais como um espectrômetro de íons-armadilha. Apesar da abundância relativa dos íons fragmento pode parecer diferente se os espectros de MS/MS são registrados usando instrumentos diferentes, as características espectrais qualitativas devem ser semelhantes. Em geral, a abundância relativa de íons diferentes de fragmento é altamente sensível para os parâmetros do instrumento. Mudando a energia da colisão e a pressão do gás de colisão pode alterar significativamente a abundância relativa dos íons fragmento. Por exemplo, aumentando a energia de colisão ou aumentando a pressão do gás de colisão irá promover a fragmentação e como resultado, a abundância do íon precursor peptoid irá diminuir e a abundância dos íons fragmento aumentará. Este estudo se concentra em peptoids carregada isoladamente. O comprimento da peptoids estudada usando este protocolo é limitado pelo intervalo de m/z do espectrômetro de massa. Para um espectrômetro de massa com alcance de massa até 2.000 de m/z, os valores de m/z de peptoids a carga devem ser menores do que o limite superior. Se o peptoids tem uma massa molecular superior ao limite do espectrômetro de massa, um duplamente protonados peptoid pode ser usado como o íon precursor. Um peptoid duplamente carregado teria um valor de m/z, que é aproximadamente metade do cobrado isoladamente.
O peptoid apresentado neste trabalho contém um resíduo básico com uma amina primária, como o grupo de cadeia lateral. O resíduo básico serve como um site de protonação, que aumentaria a eficiência de ionização na fonte ESI do espectrômetro de massa. Menos polares peptoids (mais hidrofóbicos) têm a eficiência de ionização pobre na fonte de ESI. Neste caso, uma fonte de ionização química de pressão atmosférica (APCI) pode ser utilizada para ionizar o peptoids. Sob as condições do CID, os íons peptoid fragmentam-se principalmente nas ligações Amida para produzir uma série de fragmentos de N-terminal e uma série de fragmentos C-terminal. Se a transportadora de carga, o próton, reside nos fragmentos N-terminal, a forma de B-íons. Caso contrário, a forma de Y-íons. A Figura 2 mostra uma estrutura da B4-íon. Esta é uma estrutura simplificada, que ajuda a calcular o valor de m/z. Os reais B-íons formam-se, provavelmente, uma estrutura cíclica, como um anel de cinco membros oxazolone23. Nem todos previram fragmento íons são formados no espectrômetro de massa e observadas no espectro de massa. A eficiência de formar positivamente carregado íons de fragmento é largamente determinado pela basicidade da fase gasosa (ou afinidade protônica) do fragmento. Fragmentos altamente básicos tem uma grande chance para formar íons carregados positivamente e devem ser observados em espectros de massa. Em geral, observando pelo menos 70% dos íons fragmento previsto dá uma razoavelmente alta confiança para prever a sequência de um peptoid. Na concepção de peptoids para análise de sequências por espectrometria de massa, é importante colocar resíduos com grupos de cadeia lateral polares, tais como grupos alcoxi, em diferentes locais ao longo da cadeia de peptoid.
Para peptoids mais isoladamente carregada com Acetilação N-terminal, os Y-íons mostram muito maior abundância do que o B-íons21,23. Como mostrado na Figura 3, exceto pelo fato da B1-íon, a intensidade dos picos correspondentes para os B-íons é muito inferior dos íons-Y. Para peptoids com grupos aminoácidos livres do N-terminal, maior abundância de Y-íons sobre B-íons tem sido observada também21. O favorecimento de Y-íons sugere que o próton portador de carga prefere residir nos fragmentos C-terminal, que é devido a maior afinidade protônica da fragmentos C-terminal23. Além da formação de B - e Y-íons, íons de fragmento secundário associado a perda de água ou perda do grupo lábil de cadeia lateral são frequentemente observados em peptoids protonado. Estes íons de fragmento secundário frequentemente aparecem como uma série de picos de companheiro ao lado dos picos dos íons fragmento primário (especialmente Y-íons) e podem ser identificados subtraindo a massa do grupo lábil da cadeia lateral da massa das primárias correspondentes fragmento de íons.
Este protocolo demonstra como manualmente sintetizar um oligo-peptoid e analisar a sequência de monômero de um peptoid usando um método de espectrometria de massa em tandem. Este protocolo de síntese pode ser facilmente adotado em um laboratório para treinar novos pesquisadores na síntese peptoid de ensino de química. Este protocolo de espectrometria de massa serve como uma ferramenta eficiente, não só para confirmar a identidade do peptoid, mas também para caracterizar as características estruturais da peptoid em relação os padrões de fragmentação observada. Futuras aplicações podem envolver a desenvolver um mapa de correlação vinculando a estrutura peptoid e o padrão de fragmentação através da síntese e análise de espectrometria de massa de uma biblioteca de diversos peptoids.

Peptoids são uma classe de polímeros sequência controlada com estruturas de espinha dorsal, imitando a estrutura de peptídeos. Peptoids pode ser sintetizado a partir diversas aminas, que permite peptoids a expor propriedades altamente sintonizável1,2. Peptoids têm sido utilizados como modelos moleculares para pesquisas biofísicas, considerados como agentes terapêuticos e concebido como ligantes para proteínas3,4,5,6. Peptoids foram desenvolvidos em uma variedade de compostos biologicamente ativos, tais como materiais anti-incrustantes e anticorpo-mimética, agentes antimicrobianos e inibidores de enzima7,8,9. Com uma natureza altamente ordenada e ajustável, peptoids têm também sido pensado como um tipo de armazenamento de informação molecular10. A descoberta dessas chamadas de diversas aplicações para o desenvolvimento de métodos analíticos eficientes para caracterizar a sequência e estrutura de peptoids. Técnicas de espectrometria de massa em tandem-baseado mostraram a promessa como o método de escolha para analisar as propriedades de sequência de polímeros sequência controlada, incluindo peptoids11,12,13, 14,15. No entanto, estudos sistemáticos, correlacionando os padrões de fragmentação do íon peptoid resultantes de estudos de espectrometria de massa e as informações estruturais de peptoids são muito limitados.
Peptoids podem ser facilmente sintetizados usando um método de fase sólida. O método desenvolvido envolve uma iteração de um monômero do Two-Step adição ciclo16,17. Em cada ciclo de adição, uma amina ligados a resina é acetilada por um haloacetic ácido (normalmente bromoacético BMA), e este é seguido por uma reação de deslocamento com uma amina primária. Embora a síntese automatizado protocolos foram rotineiramente aplicados para a síntese de peptoid, peptoids podem ser sintetizados manualmente com excelente rendimento em um padrão química laboratório16,18,19, 20.
Nosso laboratório tem adotado o método da síntese de peptoid manual e simplificado o aparelho utilizado nos métodos existentes. Estudamos, anteriormente, os padrões de fragmentação de uma série de peptoids, usando técnicas de MS/MS21,22,23. Nossos resultados mostram que peptoids produzir fragmentações características quando eles estão sujeitos a dissociação induzida por colisão (CID)21,23 ou captura eletrônica-experiências de dissociação (ECD)22 . Neste artigo, demonstramos como oligo-peptoids pode ser sintetizado em um laboratório de química padrão, como a realizar os experimentos de CID usando um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo e como analisar os dados espectrais. O peptoid a ser sintetizado e caracterizado é um nonamer com Acetilação N-terminal e C-terminal amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. A estrutura da peptoid é mostrada na Figura 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td></td>
			<td>The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software</td>
			<td>Varian Inc.</td>
			<td></td>
			<td>The software is a part of the Varian 320L package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD</td>
			<td>Fisher Scientific International Inc.</td>
			<td>14-400-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hermle Centrifuge, Model Z 206 A</td>
			<td>Hermle Labortechnik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid phase reaction vessel, 10 mL</td>
			<td>Torviq</td>
			<td>SF-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure caps for reaction vessels</td>
			<td>Torviq</td>
			<td>PC-SF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, pore size 0.2 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>03-391-3B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, pore size 0.45 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>03-391-3A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>490001-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>490001-620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0</td>
			<td>CambridgeSoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td>CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam cup, 12 Oz</td>
			<td>Common Supermarket</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rink amide resin</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>10619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piperidine</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>02351</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N&#8217;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00110</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>26843</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phenylethylamine</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>EM8.07334.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methyoxyethylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>241067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Boc-ethylenediamine</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>AAAL19947-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>252845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-dimethylformamide</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>BDH1117-4LG</td>
			<td>Further distillation before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-diisopropylethylamine</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>01966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00289</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>ZMQP60001</td>
			<td>For generating HPLC grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced from Millipore MILLI-Q&#174; Academic Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>339USP/NF</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific International, Inc.</td>
			<td>A998-4</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>BDH1121-19L</td>
			<td>Further distillation before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>BDH1113-19L</td>
			<td>Further distillation before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td>
			<td>NIT 50-C-F</td>
			<td>Ultra high purity, 99.9995%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td>
			<td>ARG 50-C-F</td>
			<td>Ultra high purity, 99.9995%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids

Peptoids são oligômeros peptídeo-imitando sequência controlada constituído por unidades de N-alquilados de glicina. Entre muitas aplicações potenciais, peptoids ter sido pensado como um tipo de armazenamento de informação molecular. Análise de espectrometria de massa tem sido considerada o método de escolha para peptoids de sequenciamento. Peptoids podem ser sintetizados via química de fase sólida usando um repetição ciclo de reação em duas fases. Aqui nós apresentamos um método para sintetizar manualmente oligo-peptoids e analisar a sequência do peptoids usando técnicas de espectrometria de massa (MS/MS) em tandem. A amostra peptoid é um nonamer consistindo de alternadas de N-(2-methyloxyethyl) glicina (Nme) e N-(2-feniletílico) glicina (Npe), bem como uma N-(2-aminoetil) glicina (Nae) no N-terminal. A fórmula de sequência do peptoid é Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, onde Ac é o grupo acetila. A síntese ocorre em uma embarcação da reação de fase sólida comercialmente disponível. A resina de Amida rinque é usada como o sólido apoio para produzir o peptoid com um grupo de amido no C-terminal. O produto resultante do peptoid é submetido a análise de sequência usando um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo, acoplado a uma fonte de ionização electrospray. A medição de MS/MS produz um espectro de íons fragmento resultante da dissociação do peptoid carregado. Os íons de fragmento são classificados com base nos valores de sua relação massa-de-carga (m/z). Os valores de m/z dos íons fragmento são comparados com as massas nominais de íons do fragmento teoricamente previsto, de acordo com o esquema de peptoid de fragmentação. A análise gera um padrão de fragmentação do peptoid carregado. O padrão de fragmentação é correlacionado com a sequência de monômero do peptoid neutro. A este respeito, MS análise lê as informações de sequência do peptoids.

A estrutura de um peptoid 9-mer com Acetilação N-terminal, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, é mostrada na Figura 1. O peptoid foi sintetizado manualmente em uma embarcação da reação de polipropileno fritado através de abordagem de fase sólida. Resina de amida de pista (0,047 mmol, 84 mg com carregamento 0,56 mmol/g) é usada como o sólido apoio para produzir o peptoid com um amidated C-terminal. A cadeia de peptoid é construída por vários ciclos de adição do monômero. Cada ciclo de adição do monômero envolve deslocamento, bromoacetylation e passos de duas reações. A bromoacetylation é conseguida pela adição de solução 0,8 M de BMA e solução 0,8 M de DIC e a reação leva 20 min. O deslocamento é conseguido pela adição de solução de amina de 1,0 M para o produto de acetilação e a reação leva 1 h. N-terminal acetilação foi realizada pela adição de uma solução de cocktail contendo 92 µ l de anidrido acético, 43,5 µ l de DIPEA e 2 mL de DMF. O peptoid é clivado fora da resina, adicionando uma cocktail solução contendo 3,8 mL de TFA, 100 µ l de dicas e 100 µ l de qualidade para HPLC H2O, e a reação leva 2 h. TFA é removido do capuz soprando em um fluxo de gás nitrogênio até cerca de 1 mL de viscoso solução é deixada. O produto peptoid precipita-se em éter dietílico e é isolado por centrifugação, e este é seguido por duas iterações de liofilização. A peptoid resultante é suficientemente puro para análise de MS/MS.
O esquema de fragmentação previsto para o peptoid é mostrado na Figura 2a, onde o próton no círculo tracejado indica o próton"móvel" que induziria peptoid fragmentação durante o experimento de CID. O íon peptoid fragmentos nas ligações Amida ao longo da espinha de peptoid, para que os sites de fragmentação são indicados por linhas tracejadas. Os fragmentos do N-terminal são rotulados como íons do tipo B e os fragmentos C-terminais são rotulados como íons do tipo Y. Se a fragmentação ocorre em todos os títulos disponível amida, um total de oito fragmentos de N-terminal, B1 , B8, e um total de oito fragmentos C-terminal, Y1 Y8, formaria. Cada fragmento tem um valor de m/z correspondente que é calculado somando-se as massas nominais de todos os elementos no fragmento. Como exemplo, as estruturas e os valores correspondentes de m/z (massas nominal) do B4-íon e o Y5-íon são mostrados na Figura 2b. A fórmula química para o íon de4 B é C31H42N5O6+, e a massa nominal é calculada pela equação (31 x 12) + (42 x 1) + (5 x 14) + (6 x 16) = 580. Desde que o B-4 é um íon carregado individualmente, o valor de m/z seria 580/1 = 580. Na Figura 2b, a estrutura do B4-íon é um simplificado formar (consulte a seção de discussão para detalhes). Os valores de m/z calculado (massas nominal) de todos os íons de fragmento de B1-B8 e Y1-Y8 são descritos na tabela 1.
A análise de massa inclui dois processos. O primeiro processo é executar a varredura completa análise de espectrometria de massa da amostra peptoid. Este resultado indica se a amostra contém uma quantidade mensurável do peptoid e a pureza relativa da amostra. O espectro de massa de varredura completa do íon peptoid é mostrado na Figura 3, onde os valores de m/z são arredondados para o número inteiro mais próximo. O pico m/z 1.265 corresponde a peptoid protonados, e o pico m/z 1.287 corresponde ao íon sódio aduto do peptoid. Os dois picos em m/z 633 e m/z 644 correspondem duplamente protonados e protonados misto-sodiated peptoids, respectivamente. Estes resultados sugerem que a amostra de peptoid é suficientemente pura para realizar a análise de MS/MS.
O segundo processo em análise em massa é realizar o experimento de MS/MS sobre o peptoid protonado em m/z 1.265. Este processo inclui isolando o íon de peptoid precursor pela primeira unidade de quadrupolo, fragmentando o íon peptoid na CID e os íons de fragmento de acordo com seus valores m/z pela terceira unidade de quadrupolo de classificação. O espectro resultante é mostrado na Figura 4, onde os valores de m/z são arredondados para o número inteiro mais próximo. O pico m/z 1.265 corresponde a peptoid protonado. Outros picos em valores mais baixos de m/z correspondem os íons de fragmento do íon peptoid. Os íons de fragmento são atribuídos como o B-íon ou o Y-íon, comparando seus valores m/z com aqueles previstos (mostrado na tabela 1) com base no regime de fragmentação peptoid (mostrado na Figura 2). Sete Y-íons (Y2 Y8) e sete B-íons (B1 B7) são formadas com abundâncias observáveis. Observe que a abundância dos íons-Y é muito maior do que a maioria dos B-íons.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56652/56652fig1.jpg"> Figura 1: estrutura química da peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. O peptoid foi sintetizado manualmente através da abordagem de fase sólida. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56652/56652fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56652/56652fig2.jpg"> Figura 2: Esquema de fragmentação para o protonados peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Os fragmentos do íon peptoid nas ligações Amida ao longo da espinha de peptoid para produzir uma série de fragmentos de N-terminal chamado B-íons e uma série de fragmentos C-terminal chamado Y-íons. a) previu o regime de fragmentação para o protonados peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. As linhas tracejadas indicam os locais de fragmentação, os símbolos B1 B8 indicam os fragmentos do N-terminal, e os símbolos Y1 Y8 indicam os fragmentos C-terminal; b) fragmentação da amostra com estruturas esquemáticas. As estruturas de mostram o B4-íon e o Y5-íon com m/z correspondente valores, respectivamente. Os valores de m/z são calculados somando as massas nominais dos elementos nas estruturas. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56652/56652fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56652/56652fig3.jpg"> Figura 3: Varredura completa massa espectro do peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, onde os valores de m/z são arredondados para o número inteiro mais próximo. o pico m/z 1.265 corresponde ao íon peptoid, [P + H]+, e o pico m/z 1.287 corresponde ao íon sódio aduto da peptoid, [Na + P]+. Os dois picos em m/z 633 e m/z 644 correspondem ao peptoid duplamente carregado, [P + H 2]2 + e [Na + P + H]2 +, respectivamente. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56652/56652fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56652/56652fig4.jpg"> Figura 4: Espectro de MS/MS de peptoid o protonados Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2 rotulado com fragmentos atribuídos. o pico m/z 1.265 corresponde a peptoid protonados, [P + H]+, e os picos com valores mais baixos de m/z correspondem aos íons do fragmento. O B-Y-íons e são atribuídos por comparação dos seus valores m/z com aqueles calculados com base no esquema de fragmentação do íon peptoid. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56652/56652fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>B-íon</td>
			<td>m/z valor (massa Nominal)</td>
			<td>Y-íon</td>
			<td>m/z valor (massa Nominal)</td>
		</tr>
<tr>
<td>B1
</td>
			<td>143</td>
			<td>Y1
</td>
			<td>133</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2
</td>
			<td>304</td>
			<td>Y2
</td>
			<td>294</td>
		</tr>
<tr>
<td>B3
</td>
			<td>419</td>
			<td>Y3
</td>
			<td>409</td>
		</tr>
<tr>
<td>B4
</td>
			<td>580</td>
			<td>Y4
</td>
			<td>570</td>
		</tr>
<tr>
<td>B5
</td>
			<td>695</td>
			<td>Y5
</td>
			<td>685</td>
		</tr>
<tr>
<td>B6
</td>
			<td>856</td>
			<td>Y6
</td>
			<td>846</td>
		</tr>
<tr>
<td>B7
</td>
			<td>971</td>
			<td>Y7
</td>
			<td>961</td>
		</tr>
<tr>
<td>B8
</td>
			<td>1132</td>
			<td>Y8
</td>
			<td>1122</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Valores m/z teórica calculada com base no esquema de fragmentação previsto do protonados peptoid Ac-Nae-(Npe-Nme) 4 -NH 2 . O B-íon e o Y-íon indicam os correspondentes íons de fragmento N-terminal e C-terminal, respectivamente. Cada valor de m/z (massa nominal) é calculado somando-se as massas nominais dos elementos em que íon fragmento.

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Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Síntese e análise de espectrometria de massa de Oligo-peptoids

Um protocolo é descrito para a síntese manual de oligo-peptoids seguido por análise de sequência por espectrometria de massa.

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

synthesis-and-mass-spectrometry-analysis-of-oligo-peptoids

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.6K visualizações.  University of the Pacific. Um protocolo é descrito para a síntese manual de oligo-peptoids seguido por análise de sequência por espectrometria de massa.

Vídeo: Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

Analisando Dynamics proteína utilizando hidrogênio câmbio Espectrometria de Massa

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Química

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The analysis of volatile and oxidation sensitive compounds by mass spectrometry is not easily achieved, as all state-of-the-art mass spectrometric methods require at least one sample preparation step, e.g., dissolution and dilution of the analyte (electrospray ionization), co-crystallization of the analyte with a matrix compound (matrix-assisted laser desorption/ionization), or transfer of the prepared samples into the ionization source of the mass spectrometer, to be conducted under atmospheric conditions. Here, the use of a sample inlet system is described which enables the analysis of volatile metal organyls, silanes, and phosphanes using a sector field mass spectrometer equipped with an electron impact ionization source. All sample preparation steps and the sample introduction into the ion source of the mass spectrometer take place either under air-free conditions or under vacuum, enabling the analysis of compounds highly susceptible to oxidation. The presented technique is especially of interest for inorganic chemists, working with metal organyls, silanes, or phosphanes, which have to be handled using inert conditions, such as the Schlenk technique. The principle of operation is presented in this video.

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The presented technique is especially of interest for inorganic chemists, working with metal organyls, silanes, or phosphanes which have to be handled using inert conditions, such as the Schlenk technique.

Análise de compostos sensíveis voláteis e oxidação usando um sistema de frio e de entrada Electron Impact Espectrometria de Massa

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass spectrometer, it is necessary to characterize and understand the physical principles of the source. Most commercial ambient ionization sources utilize jets of nitrogen, helium, or atmospheric air to facilitate the ionization of the analyte. As a consequence, schlieren photography can be used to visualize the gas streams by exploiting the differences in refractive index between the streams and ambient air for visualization in real time. The basic setup requires a camera, mirror, flashlight, and razor blade. When properly configured, a real time image of the source is observed by watching its reflection. This allows for insight into the mechanism of action in the source, and pathways to its optimization can be elucidated. Light is shed on an otherwise invisible situation.

This paper presents a protocol for the visualization of gaseous streams of an ambient ionization source using schlieren photography and mass spectrometry.

Visualização de ambiente Espectrometria de Massa com o uso da fotografia Schlieren

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

Rápida de alta capacidade: Identificação de Espécies de material botânico Usando Direct Análise em Tempo Real alta resolução Espectrometria de Massa

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Análise de respiração em tempo real usando o Nanoelectrospray secundário ionização acoplada a espectrometria de massa de alta resolução

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Análise de arquiteturas de proteínas e complexos proteína-ligante por espectrometria de massa estrutural Integrativa

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. The single-probe, a microscale sampling and ionization device, can be coupled with a mass spectrometer for on-line, rapid SCMS analysis of cellular constituents under ambient conditions. Previously, the single-probe SCMS technique was primarily used to measure cells immobilized onto a substrate, limiting the types of cells for studies. In the current study, the single-probe SCMS technology has been integrated with a cell manipulation system, typically used for in vitro fertilization. This integrated cell manipulation and analysis platform uses a cell-selection probe to capture identified individual floating cells and transfer the cells to the single-probe tip for microscale lysis, followed by immediate mass spectrometry analysis. This capture and transfer process removes the cells from the surrounding solution prior to analysis, minimizing the introduction of matrix molecules in the mass spectrometry analysis. This integrated setup is capable of SCMS analysis of targeted patient-isolated cells present in body fluids samples (e.g., urine, blood, saliva, etc.), allowing for potential applications of SCMS analysis to human medicine and disease biology.

An integrated cell manipulation platform is developed for use in conjunction with a single-probe mass spectrometry setup for the on-line analysis of individual suspension cells under ambient conditions.

Plataforma integrada da manipulação da pilha acoplada com a único-ponta de prova para a análise da espectrometria maciça das drogas e dos metabolitos em únicas pilhas da suspensão

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

Análise de Moléculas Complexas e Suas Reações em Superfícies por meio da espectrometria de desormetria/desonização induzida por cluster

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Troca de hidrogênio/deutério à base de eletroforose capilar para caracterização conformacional de proteínas com espectrometria de massa de cima para baixo

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

Caracterizando modificações de RNA em neurônios únicos usando espectrometria de massa

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...