O trabalho foi apoiado pela Universidade de Verona, dentro do quadro de comum projeto 2014 (caracterização da família do gene ATL em videira e da sua participação na resistência à Plasmopara viticola).

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Na era genômica, muitas famílias de gene foram caracterizadas profundamente em várias espécies de plantas. Esta informação é preliminar do estudos funcionais e fornecer um quadro para investigar mais profundamente o papel dos diferentes membros de uma família. Neste contexto, há também a necessidade de um sistema de nomenclatura que permite para identificar exclusivamente cada membro de uma família, evitando a redundância e confusões que podem surgir quando os nomes são atribuídos de maneira independente de diferentes genes por grupos de pesquisa diferentes.
Após a consideração pensativa, a comunidade científica de videira concordou com genes de videira nome em uma família com base em semelhanças com os genes de Arabidopsis e estabeleceu uma série de regras que devem ser aplicados para descrever novas famílias de genes em videira, Basicamente a partir de comparação filogenética das sequências nucleotídicas entre videira e membros da família de Arabidopsis8. Portanto, apenas os genes que já são anotados e nomeados corretamente em Arabidopsis podem ser usados na nomenclatura de videira. O procedimento aplicado para a identificação de videira ATL orthologues em Arabidopsis descrito aqui foi realizado, portanto, unicamente para cumprir a exigência de atribuição de nomenclatura correta videira gene familiar. No entanto, para outras espécies de plantas, abordagens alternativas poderiam ser uma opção. Por exemplo, homologia pode ser inferida utilizando um sucessos de explosão bidirecional (BBH), onde os orthologues são definidos como pares de genes em duas espécies que são mais semelhantes (ou seja, com maior pontuação de alinhamento) um ao outro do que para qualquer outro gene no outro espécie de44. No entanto, esse método poderia faltar muitos orthologues no caso de alta taxa de duplicação de genes, tais como em plantas e animais45. Além disso, no caso de genes codificação de ATL, BBH pode recuperar genes falta a estrutura exacta de ATL-tipo anel-H2 (incluindo o resíduo prolina) ou genes que não são anotados e nomeados como ATLs em Arabidopsis. Embora sob uma perspectiva evolucionista, essa busca pode ser relevante, a recuperação de orthologues que não são anotados não teria cumprido o escopo de videira ATL gene familiar anotação e nomenclatura e orthologues que não são anotadas como ATLs Não pode ser usado para os membros da família nome videira. Outra possibilidade é inferir homologia com base em aminoácidos em vez de sequências nucleotídicas usando InParanoid46, ou o mais recente Hieranoid 247, embora tais fluxos de trabalho não são expressamente recomendados pela comunidade científica.
Meta-análise de expressão, que pode ser definida como uma abordagem sistemática para estudar e combinar diferentes repositórios de dataset publicamente disponível de dados de expressão, permite destacar compartilhados e diferentes mecanismos moleculares em uma variedade de condições. Assim, a integração de informações de expressão do gene de múltiplas experiências transcriptomic em grande escala pode melhorar a caracterização de uma família de gene, definindo os perfis de expressão dos membros da família através de experimentos, minimizando assim o impacto de fatores específicos do experimento e apoiar uma suposição mais robusta da função do gene putativo em processos particulares. No entanto, a utilização de dados de microarray exige a integração de dados de expressão obtidos com diferentes plataformas, considerando suas próprias limitações. Por exemplo, na plataforma de microarray de Nimblegen de videira, uma proporção significativa de probesets para os genes correspondentes representados na matriz (~ 13.000 genes) têm problemas potencialmente Cruz-hibridação48. No caso da família ATL de videira, 15 genes podem ser afetados por tal fenômeno. No entanto, como discutido por Cramer et al 48, a Cruz-identificação dos membros da família gene altamente similar pela mesma sonda poderia fornecer informações interessantes sobre a expressão, em condições específicas, não apenas de um único gene, mas de dois genes mais compartilhamento sequência de alta semelhanças e, portanto, potencialmente compartilhamento de metas e funções. Outro problema potencial relacionado a conjuntos de dados microarray é o limite de detecção da expressão de plataformas microarray, que não são muito sensíveis. Para resolver os dois diz respeito, isto é., Cruz-hibridação e a sensibilidade do sinal, uma solução possível seria a considerar apenas RNAseq expressão de conjuntos de dados. No entanto, a meta-análise de dados RNAseq de muito grandes conjuntos de dados de muitos estudos diferentes pode tornar-se altamente demorada e pode exigir muitos recursos computacionais e alta especialização.
Embora a abordagem aqui apresentada pretende ser exaustiva, pode ser certamente mais complementado com outras análises. Em primeiro lugar, para alcançar ainda mais insights sobre a evolução molecular e a relação filogenética entre membros da família gene em plantas, a análise filogenética poderia ser estendida construindo uma árvore filogenética usando alinhamentos múltiplos da sequência dos membros da família de várias espécies de plantas. Também é possível calcular o tempo evolutivo de genes de família, uma estimativa das suas taxas de sinônimos e não-sinônimo de substituição durante a evolução, determinando os valores de Ks (número de substituições sinônimas por sinônimo local em um determinado período de tempo) e Ka (número de substituições nonsynonymous por site não-sinônimos no mesmo período). O rácio de Ka/Ks é usado para inferir os mecanismos de eventos de duplicação de gene após divergência dos seus antepassados. Um valor de Ka/Ks = 1 sugere seleção neutra, um valor de Ka/Ks de &#60; 1 sugere purificando a seleção e um valor de Ka/Ks de &#62; 1 sugere selecção positiva49. Além disso, se a análise da estrutura genética revela a presença de intrões, a caracterização de família do gene pode ser novamente prorrogada para a detecção de alternativa variantes de emenda. De fato, baseado em uma pesquisa profunda de RNA-seq dados de diferentes tecidos, condições de estresse e genótipos43, 21 (da 96) ATLs são fortes candidatos para eventos splicing alternativos, com potencial número de isoformas variando de 2 a 16 para estes ATLs (ver Complementar tabela 1). Transcrições alternativas frequentemente produzem isoformas de proteínas que variam em sequências de aminoácidos e essas mudanças podem alterar as propriedades de celulares das proteínas e podem causar alterações da modulação sutil à perda da função do produto do gene. Por esse motivo, eventos de splicing alternativos estiveram envolvidos em funções de vegetais importantes, incluindo a resposta ao estresse, resistência a doenças, fotossíntese e floração50,51.Integração de informações de promotor do gene ATL que contém putativo cis-elementos reguladores52 ou encontrar moléculas (por exemplo, microRNA e tempo não-codificantes do RNA) potencialmente alvo ATLs53 também pode ser complementado para revelam insights de sistema sobre o complexo molecular regulamento e interação de videira ATLs.
Em conclusão, a escolha das análises a serem executadas, bem como os procedimentos a aplicar para caracterizar uma nova família de gene em uma espécie de planta são impulsionados principalmente pelas regras da comunidade científica, bem como pelo escopo da identificação de família de gene. É importante ter em mente os passos de possível investigação subsequente, que irão explorar o conjunto de informações, entre que inclui a evolução de genes entre espécies de plantas, descrição de estrutura do genoma ou candidatos confiáveis para seleção em funcional estudos.

Durante a última década, muita pesquisa realizada na genômica de videira. Videira é uma reconhecida cultura economicamente relevante, que se tornou um modelo para a investigação sobre o desenvolvimento do fruto e sobre as respostas de plantas lenhosas a estresses bióticos e abióticos. Neste contexto, o lançamento do genoma Vitis vinifera CV. PN40024 em 2007-1 e sua versão atualizada em 20112 levou a uma rápida acumulação de dados "Omics"-escala e a uma explosão de estudos de alto rendimento. Baseado nos dados de sequência publicada, a análise abrangente de uma família de determinado gene (geralmente composta por proteínas partilha motivos conservados, semelhanças estruturais e/ou funcionais e as relações evolutivas), agora pode ser realizada para descobrir sua perfis de expressão genética, evolução e funções moleculares. Essas análises podem contribuir para a compreensão de como as famílias gene controlam processos fisiológicos em um nível de todo o genoma.
Muitos aspectos do ciclo de vida da planta são regulados pela mediada por ubiquitina de degradação de proteínas chaves, que requerem um volume de negócios de aperfeiçoá-lo para assegurar o regulares processos celulares. Importantes componentes do processo de degradação mediada por ubiquitina são os E3 ubiquitina ligases, que são responsáveis pela flexibilidade do sistema, graças ao recrutamento de alvos específicos3. Por conseguinte, estas enzimas representam uma família enorme de gene, com cerca de 1.400 E3 ligase-codificação genes previstos em Arabidopsis thaliana genoma4, cada ligase de ubiquitina E3 atuando para o ubiquitination de proteínas alvo específico. Apesar da importância da ubiquitination substrato específico no Regulamento celular em plantas, pouco se sabe sobre como o caminho da ubiquitination é regulamentado e proteínas alvo foram identificadas somente em alguns casos. O deciframento de tais mecanismos de especificidade e regulamentação depende primeiramente a identificação e caracterização das diferentes componentes do sistema, em particular as ligases E3. Entre ubiquitina ligases, subfamília ATL é caracterizada por 91 Membros identificados em a. thaliana , exibindo um anel-H2 dedo domínio5,6, alguns deles desempenhando um papel na defesa e hormônio respostas7.
O primeiro passo crucial para definir os membros de uma família nova do gene é a definição precisa das características familiares, tais como motivos de consenso, domínios-chave e características da sequência da proteína. Com efeito, a recuperação confiável de todos os membros da família gene com base na análise de explosão requer algumas características de sequência obrigatória, em domínios de particular da proteína responsáveis pela proteína função/atividade, servindo como assinatura de proteína. Isto pode ser facilitado pela caracterização anterior da mesma família gene em outras espécies de plantas ou alcançado através da análise de diferentes genes presumidamente pertencentes à família mesma em diferentes espécies de plantas, para isolar as sequências comuns. Os membros da família podem então ser individualmente nomeados seguindo regras comuns colonizadas por consórcios internacionais para uma espécie de determinada planta. Em videira, por exemplo, tal procedimento é submetido às recomendações do Comité de nomenclatura super para anotação de Gene de uva (sNCGGa), que estabelece a construção de uma árvore filogenética, incluindo V. vinifera e a. thaliana membros da família para permitir a anotação de gene gene baseiam em sequências de nucleotídeos8.
Localização de cromossomo de membros da família e pesquisa de duplicação do gene permitir destacando a presença de genes duplicados do inteiro-genoma ou em tandem. Essa informação aparece útil para desvendar as funções do gene putativo, desde que pode mostrar a redundância funcional ou revelar situações diferentes, ou seja, não-functionalization, neo-functionalization ou functionalization sub9. Ambos os neo - e sub - functionalization é eventos importantes que criam novidade genética, fornecendo novos componentes celulares para adaptação da planta às mudanças ambientes10. Em particular, as duplicações de genes ancestrais e produção de novos genes eram muito frequentes durante a evolução do genoma de videira e recém-formado genes originários de duplicações em tandem e proximais em videira eram mais propensos a produzir novos funções de11.
Outro fator chave em decifrar a função dos genes familiares é o perfil de transcriptomic. A disponibilidade de bases de dados públicas, dando acesso a uma enorme quantidade de dados de transcriptomic pode ser explorada, assim, para atribuir funções putativos para membros da família gene usando análises de expressão em larga escala em silico . Com efeito, a expressão peculiar de alguns genes em órgãos da planta específica ou em resposta a certas tensões pode dar algumas dicas sobre os putativos papéis das proteínas correspondentes em condições definidas e dar suporte a hipóteses sobre possíveis sub functionalization dos genes duplicados para responder aos desafios diferentes. Para esse efeito, é importante considerar os vários conjuntos de dados: estas podem ser gene já disponível matrizes de expressão, tais como o atlas transcriptomic de todo o genoma da videira órgãos e estádios de desenvolvimento,12, ou podem ser construídas ad hoc por recuperação de conjuntos de dados transcriptomic para as espécies de planta particular sujeitados a tensões definidas. Além disso, uma abordagem simples, usando duas matrizes, uma com dados de similaridade emparelhadas e outro com os coeficientes emparelhadas expressão co podem ser aplicados para avaliar as relações entre padrões de semelhança e a expressão de sequência dentro de uma família de gene.
O objetivo deste trabalho é apresentar uma abordagem global, definindo a estrutura do gene, motivos de proteína conservada, localização cromossômica, duplicações do gene e padrões de expressão, como também a previsão de sites localização e fosforilação da proteína, para atingir uma caracterização exaustiva de uma família de genes em plantas. Uma abordagem abrangente é aplicada aqui, para a caracterização da família ATL E3 ubiquitina ligase em videira. De acordo com o papel emergente de membros da subfamília ATL na regulação de processos celulares chave7, este trabalho pode também auxiliar a identificação dos fortes candidatos para estudos funcionais e eventualmente a desvendar os mecanismos moleculares que regem o adaptação desta cultura importante para seu ambiente.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Personal computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.megasoftware.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motif-based sequence analysis tools (MEME)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://meme-suite.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneious</td>
			<td>Biomatters Limited</td>
			<td></td>
			<td>http://www.geneious.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtParam Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://web.expasy.org/protparam/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ngLOC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TargetP v1.1 Server</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Prowler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUsite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://musite.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://pfam.xfam.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHMM Server v. 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtScale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://web.expasy.org/protscale/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grape Genome Database (CRIBI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://genomes.cribi.unipd.it/grape/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoGram</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCScanX</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interactive Tree Of Life (iTOL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://itol.embl.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UniProt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.uniprot.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phylogeny.fr</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.phylogeny.fr/index.cgi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUSCLE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gblocks Server</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitis vinifera cv. Corvina gene expression Atlas datamatrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_datamatrix_geneIDs_Fasoli2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi Experiment Viewer (MeV)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://mev.tm4.org/#/welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequence Read Archive (SRA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMBOSS Needle (EMBL-EBI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive workflow for the genome-wide identification and expression meta-analysis of the atl e3 ubiquitin ligase gene family in grapevine

Classificação e nomenclatura dos genes em uma família podem contribuir de forma significativa para a descrição da diversidade das proteínas codificadas e a previsão da família funções com base em diversas características, tais como a presença de motivos de sequência ou de particular sites para modificação pós-traducional e o perfil de expressão dos membros da família em diferentes condições. Este trabalho descreve um protocolo detalhado para a caracterização de família do gene. Aqui, o procedimento é aplicado para a caracterização da Arabidopsis Tóxicos em Levadura (ATL) E3 ubiquitina ligase família na videira. Os métodos incluem a identificação de todo o genoma dos membros da família, a caracterização da localização do gene, estrutura e duplicação, a análise dos motivos da proteína conservada, a previsão dos sites de localização e fosforilação de proteínas, bem como Gene expressão perfila através da família em diferentes conjuntos de dados. Tal procedimento, que poderia ser alargado a novas análises dependendo fins experimentais, poderia ser aplicado a qualquer família de gene em quaisquer espécies de plantas para as quais dados genomic estão disponíveis, e fornece informações valiosas para identificar candidatos interessantes para estudos funcionais, dando insights sobre os mecanismos moleculares de adaptação da planta para seu ambiente.

O gene VIT_05s0077g01970, identificado como o mais parecido com a. thaliana ATL2 (At3g16720), através de uma pesquisa BLASTp, foi usado como sonda para inspeccionar os membros da família ATL no genoma da videira (V. vinifera cv Pinot Noir PN40024). A análise de PSI-BLAST convergiu depois de alguns ciclos, revelando uma lista de putativos genes pertencentes à família de gene videira ATL (figura 1A). A presença do anel-H2 domínio canônico para cada candidato foi avaliada pelo inspeção visual do alinhamento muscular de todas as entradas identificados na análise (figura 1B). Apenas os genes contendo os aminoácidos conservados corretamente espaçados, os dois resíduos de histidina, bem como os resíduos de prolina antes o terceiro cisteína foram considerados como ATLs de acordo com a definição original de ATL em Arabidopsis5. Um total de 96 genes videira cumprido os requisitos e foram considerados para a caracterização mais. Cada membro da família ATL foi analisado para definir as características específicas do gene e a correspondente proteína codificada, ou seja, a presença de outros domínios conhecidos além do anel-H2, transmembranares ou hidrofóbicas regiões ricas, subcellular localização e sítios de fosforilação putativo (tabela 1 e tabela 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56626/56626fig1.jpg"> 
Figura 1: pesquisa PSI-BLAST e alinhamento de videira putativo ATLs. (A) Screenshot dos hits top 10 da primeira pesquisa PSI-BLAST iteração usando a sequência de proteínas VIT_05s0077g01970 como isca. (B) parte do alinhamento da videira selecionados 96 ATLs putativos, mostrando seu domínio de anel-H2 e o logotipo correspondente obtidos usando um conjunto de biologia molecular (ver Tabela de materiais). Reproduzido de Ariani et al . licenciado sob uma licença Creative Commons Attribution 4.0 internacional42.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56626/56626fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Nome</td>
			<td colspan="2">Identificação do gene</td>
			<td>Comprimento do gene (bp)</td>
			<td>Número de intron</td>
			<td>UniProt ID</td>
			<td>Comprimento de proteínas (aa)</td>
			<td>Motivo de anel-H2</td>
			<td>Número de domínio TM/H</td>
			<td>Outros domínios</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL3</td>
			<td colspan="2">VIT_09s0002g00220</td>
			<td>1245</td>
			<td>0</td>
			<td>F6HXK6</td>
			<td>304</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL4 [VviRHX1A]</td>
			<td colspan="2">VIT_15s0021g00890</td>
			<td>1827</td>
			<td>3</td>
			<td>D7SM36</td>
			<td>203</td>
			<td>PxC</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL18</td>
			<td colspan="2">VIT_11s0118g00780</td>
			<td>1113</td>
			<td>2</td>
			<td>F6HCI8</td>
			<td>193</td>
			<td>PC</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL23a</td>
			<td colspan="2">VIT_18s0001g01060</td>
			<td>935</td>
			<td>0</td>
			<td>F6H0E4</td>
			<td>114</td>
			<td>PxC</td>
			<td>0,5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL23b</td>
			<td colspan="2">VIT_18s0001g01050</td>
			<td>399</td>
			<td>0</td>
			<td>E0CQX3</td>
			<td>132</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL24</td>
			<td colspan="2">VIT_17s0000g06460</td>
			<td>4466</td>
			<td>4</td>
			<td>D7SI89</td>
			<td>217</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL27</td>
			<td colspan="2">VIT_00s0264g00020</td>
			<td>2554</td>
			<td>4</td>
			<td>D7T1R5</td>
			<td>235</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL43</td>
			<td colspan="2">VIT_11s0052g00530</td>
			<td>1576</td>
			<td>2</td>
			<td>D7SQD9</td>
			<td>457</td>
			<td>PxC</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL54a</td>
			<td colspan="2">VIT_18s0001g06640</td>
			<td>3221</td>
			<td>1</td>
			<td>F6H0Y5</td>
			<td>405</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL54b</td>
			<td colspan="2">VIT_03s0017g00670</td>
			<td>2774</td>
			<td>1</td>
			<td>F6HTI0</td>
			<td>427</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL55 [VviRING1]</td>
			<td colspan="2">VIT_07s0191g00230</td>
			<td>1844</td>
			<td>0</td>
			<td>F6HRP9</td>
			<td>372</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL63</td>
			<td colspan="2">VIT_06s0004g06930</td>
			<td>804</td>
			<td>0</td>
			<td>D7SJU6</td>
			<td>267</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL65</td>
			<td colspan="2">VIT_03s0063g01890</td>
			<td>2068</td>
			<td>0</td>
			<td>F6HQI8</td>
			<td>396</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL82</td>
			<td colspan="2">VIT_01s0026g02540</td>
			<td>820</td>
			<td>0</td>
			<td>F6HPQ9</td>
			<td>233</td>
			<td>PC</td>
			<td>0,5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL83</td>
			<td colspan="2">VIT_17s0000g08400</td>
			<td>1887</td>
			<td>0</td>
			<td>F6GSQ4</td>
			<td>143</td>
			<td>PC</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL84</td>
			<td colspan="2">VIT_06s0004g00120</td>
			<td>1853</td>
			<td>0</td>
			<td>F6GUP5</td>
			<td>368</td>
			<td>PC</td>
			<td>0,5</td>
			<td>ZF-RING_3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL85</td>
			<td colspan="2">VIT_12s0034g01400</td>
			<td>786</td>
			<td>0</td>
			<td>F6H965</td>
			<td>261</td>
			<td>PC</td>
			<td>0,5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL86</td>
			<td colspan="2">VIT_12s0034g01390</td>
			<td>1434</td>
			<td>1</td>
			<td>D7T016</td>
			<td>451</td>
			<td>PC</td>
			<td>0,5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL87</td>
			<td colspan="2">VIT_18s0001g03270</td>
			<td>1002</td>
			<td>0</td>
			<td>F6H0T2</td>
			<td>333</td>
			<td>PC</td>
			<td>0,5</td>
			<td>ZF-RING_3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL88</td>
			<td colspan="2">VIT_08s0040g00590</td>
			<td>1320</td>
			<td>0</td>
			<td>F6HQR2</td>
			<td>314</td>
			<td>PC</td>
			<td>0</td>
			<td>ZF-RING_3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: primeira 20 VviATL de genes e características da sequência das proteínas correspondentes. TM: transmembrana; H: hidrofóbicos; 0,5 indica a presença de uma ou mais regiões hidrofóbicas. Reproduzido de Ariani et al . licenciado sob uma licença Creative Commons Attribution 4.0 internacional42.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/56626/56626table2.jpg"> 
Tabela 2: detalhes sobre o primeiro 20 VviATL posição do gene no V. vinifera genoma, estado de duplicação e as características físico-químicas de proteínas ATL e localização. (um) número de sítios de fosforilação predito por Musite; (b) predições similares obtidas pelo menos dois software são destacadas em negrito; ngLOC foi usado com configurações padrão, Considerando que TargetP v 1.1 e proteína Prowler localização Subcellular foram usados com um corte de probabilidade de 0,5. NUC, núcleo; MIT, mitocôndrias; CHL, cloroplasto; PLA, a membrana plasmática; S, via secretora (presença de um peptídeo sinal); M, mitocôndria; C, cloroplasto; Ó ou -, outros locais; nd, não determinado (ou seja, valor abaixo do limiar). Reproduzido de Ariani et al . licenciado sob uma licença Creative Commons Attribution 4.0 internacional42. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56626/Table_2.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Uma análise filogenética, incluindo as sequências de nucleotídeos dos genes de ATL-codificação de videira identificados em conjunto com as sequências de referência a. thaliana ATL gene da família foi usada para a nomenclatura ATL de videira, de acordo com as diretrizes do o sNCGGa8. Noventa e seis e 83 sequências nucleotídicas de V. vinifera e a. thaliana, respectivamente, foram submetidas ao pipeline de Phylogeny.fr para obter uma árvore filogenética confiável.As último sequências foram usadas mais tarde para anotar e nomear os genes de videira com base em relacionamentos sólidos (Figura 2). Seguindo esta abordagem, a 13 de 96 videira ATLs recebeu um identificador específico, considerando sua homologia-para-um com um a. thaliana ATL. Os nomes dos outros 83 genes foram atribuídos com base na árvore filogenética, com um progressivo numeração de cima para baixo, a partir de um número de gene ATL mais elevado do que o usado no número mais alto a. thaliana.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56626/56626fig2.jpg"> 
Figura 2: Árvore filogenética de V. vinifera a. thaliana ATL E3 ubiquitina ligase-codificação genes e. A árvore não enraizada foi gerada com a suite de Phylogeny.fr (V. vinifera (em verde) e 83 genes ATL de a. thaliana relatado no banco de dados UniProt (em amarelo). Foram obtidos valores de apoio de filial 100 repetições de inicialização. As estrelas vermelhas indicam a presença de um domínio de dedo (BZF) zinco BCA2 as proteínas correspondentes. Reproduzido de Ariani et al . licenciado sob uma licença Creative Commons Attribution 4.0 internacional42. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56626/56626fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Mapeamento de genes ATL-codificação para os cromossomos de videira mostrou uma ampla distribuição em todo o genoma, sugerindo que a duplicação do inteiro-genoma como a principal força evolutiva na expansão da família do gene ATL em videira. Com efeito, 31 ATLs foram encontradas em regiões cromossômicas homólogas potencialmente provenientes de eventos de duplicação do genoma inteiro ou segmentar. Além disso, a mesma análise destacou 13 tandemly de duplicação de genes, uma duplicata proximal e 51 duplicatas dispersas (Figura 3). Considerando o grande número de genes duplicados da família ATL, realizamos um teste de enriquecimento (teste exato de Fisher) para verificar a retenção preferencial dos genes duplicados durante o fracionamento do genoma. Com um p-valor &#60; 0.001, este teste confirma a hipótese de que a duplicação de genes ATL foram retidos aleatoriamente mais do que esperado, sugerindo um papel para a família do gene ATL durante videira adaptação e evolução.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56626/56626fig3.jpg"> 
Figura 3: Distribuição de gene Grapevine ATL-codificação na V. vinifera cromossomos e a duplicação estado. Os genes ATL 96 videira com informação cromossômica exata disponível no banco de dados foram mapeados para os 19 cromossomos de V. vinifera . As cores indicam o evento original de duplicação. Linhas pretas verticais e linhas vermelhas identificam pares derivados de duplicações em tandem e duplicações de genoma inteiro, respectivamente. Reproduzido de Ariani et al . licenciado sob uma licença Creative Commons Attribution 4.0 internacional42. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56626/56626fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para investigar as funções biológicas putativos dos ATLs em videira, foi realizada uma meta-análise sobre o V. vinifera CV Corvina global expressao Atlas12. O conjunto de dados inclui valores de expressão de todo o genoma de 54 órgãos diferentes videira e estádios de desenvolvimento e foi usado para executar uma análise bi-cluster hierárquica. Resultados não só confirmaram que todos os 96 ATLs foram expressos em pelo menos um dos tecidos 54/estágios, mas também apontou a presença de cinco grupos principais de perfis de expressão (Figura 4A). Brevemente, grupos A e E mostraram-se em frente de comportamentos, em particular o primeiro é caracterizado por um general downregulation de genes ATL em amostras juvenis, incluindo estágios iniciais de baga, folha jovem, gavinhas, inflorescência e maioria das etapas do broto. Por outro lado, no mesmo cluster A, maduras amostras tais como bagas no amadurecimento e pós-colheita murchando estágios, tecidos lenhosas e estágios finais de sementes desenvolvimento ATL genes mostrou um upregulation predominante. Genes em Cluster C foram principalmente ativador na maioria das amostras, enquanto os genes ATL em cluster D eram frequentemente upregulated em estágios finais do desenvolvimento da baga. Finalmente, cluster B não apresentaram qualquer variação relevante nos perfis de expressão.
Uma abordagem similar foi aplicada para estudar a expressão da videira ATL familiares em resposta a estresses bióticos e abióticos, usando conjuntos de dados específicos, construídos para este fim. Uma enorme quantidade de dados de expressão derivando de microarray e RNA-seq experiências estão disponíveis a partir de bancos de dados de acesso público como Gene Expression Omnibus (GEO) e ArrayExpress. Uma vez coletados e convenientemente normalizada, a informação foi explorada durante mais insights sobre a função potencial do ATLs na resposta da planta ao estresse. Analisar os perfis de expressão de videira ATLs em resposta a estresses bióticos revelou que 62 de 96 transcrições mostraram uma significativa modulação (mudança de dobra log2 (FC) &#62; | 0.5 |) pelo menos duas condições, com uma taxa falsa da descoberta (FDR) &#60; (0.05 Figura 4B). O número aumenta para 81, considerando somente o limiar do FDR em uma única condição. Estes resultados sugeriram um envolvimento direto da família do gene ATL na resposta aos agentes patogénicos, também em videira. Em particular, um grupo de 12 genes (VviATL3-27-54b-55-90-97-123-144-148-149-156) foram fortemente upregulated em resposta a maioria dos patógenos, incluindo biotrófica e necrotrophic e outros herbívoros e assim, merece atenção para ainda mais funcional análises.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56626/56626fig4.jpg"> 
Figura 4: expressão de gene ATL clusteringof hierárquica em videira Atlas e no dataset videira de estresse biótico. (A) a expressão log transformada valores de genes ATL videira em videira Atlas12 foram usados para análise de cluster hierárquica com base na métrica de distância de Pearson. A cor escala representa a mais elevada (vermelho) ou inferior (verde) expressão níveis com respeito para a abundância de transcrição mediana de cada gene em todas as amostras. Letras de À E do lado direito indicam os diferentes clusters identificados.AB: depois da explosão; B: estouro; broto-w: broto de inverno; F: floração; FB: floração começa; FS: conjunto de frutas; G: verde; Senhor: meados-maturação; PFS: pós-fruta conjunto; PHWI-II-III: pós-colheita minguante 1, 2 e 3 meses; R: maturação; S: senescentes; haste-w: caule lenhoso; V: veraison; WD: bem desenvolvido; Y: jovens. (B) a cor escala representa aumento (vermelho) ou diminuído (azul) prega mudanças videira ATL da expressão do gene em amostras infectadas comparado com controles para cada condição. Asteriscos indicam a expressão diferencial significativa (FDR &#60; 0,05) de cada ATL nas condições correspondentes. Reproduzido de Ariani et al . licenciado sob uma licença Creative Commons Attribution 4.0 internacional42. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56626/56626fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Suplementares tabela 1: candidatos de genes ATL por splicing alternativo. (um) ATL gene ID de acordo com a previsão de uva gene V1 e anotação, identificação do gene (b), ATL de acordo com o V2 gene uva previsão e anotação43, (c) número de putativo ATL alternativas emenda variantes, (d) informações sobre a sequência de cada variante ATL putativo de código. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56626/Supplementary_Table_I.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementares tabela 2: <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56626/Supplementary_Table_II.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 1: <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56626/Supplementary_File_1.txt">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine at JoVE.com

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Este artigo descreve o procedimento para a identificação e caracterização de uma família de gene em videira aplicada à família de Arabidopsis Tóxicos em Levadura (ATL) E3 ubiquitina ligases.

Fluxo de trabalho abrangente para a identificação de todo o genoma e Meta-análise da expressão da ATL E3 ubiquitina Ligase Gene família em videira

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...

comprehensive-workflow-for-genome-wide-identification-expression-meta

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K visualizações.  Università degli Studi di Verona. Este artigo descreve o procedimento para a identificação e caracterização de uma família de gene em videira aplicada à família de Arabidopsis Tóxicos em Levadura (ATL) E3 ubiquitina ligases.

Vídeo: Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biologia

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Eletrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robótica e Análise de Imagem Dinâmica de Estudos de Expressão Gênica em Tecidos Vegetais

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Análise do genoma usando chip para identificar alvos isoforma específica Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...