Il lavoro è stato supportato dall'Università di Verona all'interno della cornice del comune progetto 2014 (caratterizzazione della famiglia del gene ATL a grapevine e del suo coinvolgimento nella resistenza alla peronospora della vite).

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Nell'era genomica, molte famiglie geniche sono state profondamente caratterizzate in diverse specie di piante. Queste informazioni sono preliminari studi funzionali e forniscono una cornice per studiare ulteriormente il ruolo di diversi membri di una famiglia. In questo contesto, c'è anche un'esigenza di un sistema di nomenclatura che permette di identificare in modo univoco ogni membro di una famiglia, evitando la ridondanza e le confusioni che possono sorgere quando i nomi vengono assegnati in modo indipendente per diversi geni di diversi gruppi di ricerca.
Dopo considerazione premurosa, la comunità scientifica di vite ha accettato di nome grapevine geni in una famiglia sulla base di somiglianze con geni di Arabidopsis e stabilito una serie di regole che devono essere applicate per descrivere nuove famiglie geniche a grapevine, fondamentalmente a partire dal confronto filogenetico delle sequenze nucleotidiche tra vite e Arabidopsis i membri della famiglia8. Pertanto, soli geni che si trovano già annotati e denominati correttamente in Arabidopsis possono essere utilizzati nella nomenclatura grapevine. La procedura applicata per l'identificazione di grapevine ATL ortologhi in Arabidopsis descritto qui è stato pertanto effettuata esclusivamente per soddisfare i requisiti di assegnazione la nomenclatura di famiglia del gene corretto grapevine. Tuttavia, per altre specie di piante, approcci alternativi potrebbero essere un'opzione. Per esempio, potrebbe essere arguito ortologhe utilizzando un hits BLAST bidirezionale (BBH), dove ortologhi sono definiti come coppie di geni in due specie che sono più simili (cioè, con punteggio più alto di allineamento) tra loro rispetto a qualsiasi altro gene in altro specie44. Tuttavia, questo metodo potrebbe perdere molti ortologhi in caso di elevato tasso di duplicazione genica, come in piante e animali45. Inoltre, nel caso di geni codificanti ATL, BBH può recuperare geni carente la struttura precisa di ATL-tipo anello-H2 (compresi i residui di prolina) o geni che non sono annotati e nominati come ATLs in Arabidopsis. Anche se da una prospettiva evoluzionistica questa ricerca può essere rilevante, il recupero di ortologhi non annotati non avrebbe compiuto l'ambito di annotazione famiglia del gene di grapevine ATL e nomenclatura ortologhi non annotati come ATLs non può essere utilizzato per membri della famiglia di nome grapevine. Un'altra possibilità è di dedurre ortologhe basato su aminoacido invece di sequenze nucleotidiche utilizzando InParanoid46, o il più recente Hieranoid 247, anche se tali flussi di lavoro non sono espressamente raccomandati dalla comunità scientifica.
Meta-analisi di espressione, che possono essere definito come un approccio sistematico per studiare e combinare diversi set di dati pubblicamente disponibili repository di dati di espressione, permettono di evidenziare condivise e differenti meccanismi molecolari in una varietà di condizioni. Quindi, l'integrazione di informazioni di espressione del gene da esperimenti su larga scala Transcrittomica multipli possa migliorare la caratterizzazione di una famiglia di geni, definendo i profili di espressione dei membri della famiglia attraverso esperimenti, riducendo così al minimo il impatto di fattori specifici all'esperimento e sostenere un presupposto più robusto della funzione del gene presunto in particolari processi. Tuttavia, l'uso dei dati microarray richiede l'integrazione dei dati di espressione ottenuti con diverse piattaforme, considerando i propri limiti. Per esempio, nella piattaforma microarray Nimblegen grapevine, una percentuale significativa di probesets per geni corrispondenti rappresentati sulla matrice (~ 13.000 geni) hanno problemi potenzialmente cross-ibridazione48. Nel caso della famiglia ATL grapevine, 15 geni possono dipendere da tale fenomeno. Tuttavia, come discusso da Cramer et al. 48, la croce-identificazione dei membri della famiglia genica altamente simili dalla sonda stessa potrebbe fornire informazioni interessanti riguardanti l'espressione, in condizioni specifiche, non solo di un singolo gene, ma di due o più geni condivisione alta sequenza somiglianze e quindi potenzialmente condivisione obiettivi e funzioni. Un altro potenziale problema relazionato ai microarray DataSet è il limite di rilevamento di espressione delle piattaforme microarray, che non sono molto sensibili. Per risolvere entrambi riguarda, vale a dire., cross-ibridazione e segnale di sensibilità, una possibile soluzione potrebbe essere considerare solo RNAseq espressione set di dati. Tuttavia, la meta-analisi di RNAseq dati del set di dati molto grandi da diversi studi può diventare estremamente che richiede tempo e può richiedere molte risorse computazionali e alto livello di esperienza.
Sebbene l'approccio qui presentato intende essere esaustivo, esso può essere certamente ulteriormente completata con altre analisi. In primo luogo, per ottenere ulteriori approfondimenti in evoluzione molecolare e le relazioni filogenetiche tra i membri della famiglia genica in piante, l'analisi filogenetica potrebbe essere esteso edificio un albero filogenetico usando allineamenti multipli di sequenza dei membri della famiglia da diverse specie di piante. È anche possibile calcolare il tempo evolutivo dei geni della famiglia, una stima dei loro tassi di sostituzione sinonima e non sinonimo nel corso dell'evoluzione, determinando i valori Ks (numero di sostituzioni sinonima per ogni sito sinonimo in un determinato periodo di tempo) e Ka (numero di sostituzioni nonsynonymous per ogni sito non sinonimo nello stesso periodo). Il rapporto di Ka/Ks viene utilizzato per inferire i meccanismi degli eventi di duplicazione genica dopo divergenza dai loro antenati. Un valore di Ka/Ks = 1 suggerisce neutro selezione, un valore di Ka/Ks di &#60; 1 suggerisce purificante selezione e un valore di Ka/Ks di &#62; 1 suggerisce selezione positiva49. Inoltre, se l'analisi del gene struttura rivela la presenza di introni, la caratterizzazione di famiglia genica può essere ulteriormente esteso al rilevamento delle varianti di splicing alternativo. Infatti, basato su un'indagine profonda di RNA-seq dati da diversi tessuti, condizioni di stress e genotipi43, 21 (del 96) ATLs sono ottimi candidati per gli eventi di splicing alternativi, con numero potenziale di isoforme che vanno da 2 a 16 per questi ATLs (Vedi Complementare tabella 1). Trascritti alternativi producono frequentemente isoforme della proteina che variano nelle sequenze dell'amminoacido e questi cambiamenti possono alterare le proprietà delle proteine cellulari e possono causare alterazioni da sottile modulazione alla perdita della funzione del prodotto genico. Per questo motivo, gli eventi di splicing alternativi sono stati coinvolti nelle funzioni di pianta importante, compreso la risposta allo stress, resistenza alle malattie, fotosintesi e fioritura50,51.Integrazione di informazioni di promotore del gene ATL contenente putativo cis-elementi regolatori52 o trovare molecole (ad es., microRNA e RNA lunghi non codificanti) potenzialmente targeting ATLs53 possono anche essere completati a rivelano intuizioni sistema la complessa regolazione molecolare e l'interazione della vite ATLs.
In conclusione, la scelta delle analisi da eseguire, nonché le procedure da applicare per caratterizzare una nuova famiglia di geni in una specie di pianta principalmente sono guidate dalle regole della comunità scientifica, così come nel campo di applicazione del trascrittoma di famiglia. È importante tenere a mente i passaggi possibili successive indagini, che sfrutteranno l'insieme di informazioni, fra che comprende evoluzione tra le specie vegetali, descrizione della struttura del genoma o affidabili candidati per la selezione in funzionale studi.

Durante l'ultimo decennio, molta ricerca è stata effettuata in grapevine genomica. Vigna è una coltura economicamente rilevante riconosciuta, che è diventato un modello per la ricerca sullo sviluppo di frutta e sulle risposte delle piante legnose agli stress biotici e abiotici. In questo contesto, il rilascio del genoma di Vitis vinifera c.v. PN40024 nel 20071 e la sua versione aggiornata nel 20112 ha portato a un rapido accumulo di dati "Omics"-scala e a una raffica di studi di alto-rendimento. Base ai dati pubblicati sequenza, l'analisi completa di una famiglia di dato gene (generalmente composta da proteine condividono motivi conservati, somiglianze strutturali e/o funzionali e rapporti evolutivi), possono ora essere eseguite per scoprire la funzioni molecolari, evoluzione e profili di espressione genica. Queste analisi possono contribuire alla comprensione di come le famiglie geniche controllano processi fisiologici a livello del genoma.
Molti aspetti del ciclo di vita della pianta sono regolati dalla degradazione ubiquitina-mediata di proteine chiave, che richiedono un fatturato fine-tuned per garantire regolari processi cellulari. Importanti componenti del processo di degradazione ubiquitina-dipendente sono la ligasi di ubiquitin E3, che sono responsabili della flessibilità del sistema, grazie all'assunzione di specifici obiettivi3. Di conseguenza, questi enzimi rappresentano una famiglia di geni enorme, con circa 1.400 E3 ligasi-codifica geni preveduti in Arabidopsis thaliana genoma4, ogni E3 ubiquitina ligasi che agiscono per l'ubiquitinazione delle proteine target specifici. Nonostante l'importanza del substrato specifico ubiquitinazione nella regolazione cellulare nelle piante, piccolo è conosciuto circa come è regolato il pathway di ubiquitinazione e solo in pochi casi sono state identificate proteine bersaglio. La decifrazione di tali meccanismi di specificità e regolamento si basa innanzitutto sull'identificazione e la caratterizzazione delle diverse componenti del sistema, in particolare la ligasi E3. Tra ubiquitin-ligasi, sottofamiglia ATL è caratterizzata da 91 membri identificati in a. thaliana visualizzati un anello-H2 dito dominio5,6, alcuni di loro un ruolo in difesa e ormone risposte7.
Il primo passo cruciale per definire i membri di una nuova famiglia genica è la definizione precisa delle caratteristiche familiari, quali motivi di consenso, settori chiave e le caratteristiche di sequenza della proteina. Infatti, il recupero affidabile di tutti i membri della famiglia genica basato su analisi BLAST richiede alcune caratteristiche di sequenza obbligatoria, nei domini di particolare proteina responsabile di funzione/attività della proteina, che funge da firma di proteina. Questo può essere facilitato dalla caratterizzazione precedente della famiglia del gene stesso in altre specie vegetali o ottenuto analizzando diversi geni putativamente appartenendo alla stessa famiglia in specie di piante diverse, per isolare sequenze comuni. I membri della famiglia possono singolarmente denominati seguendo regole comuni che si stabilì di consorzi internazionali per una determinata specie. A grapevine, per esempio, tale procedura è sottoposta alle raccomandazioni del Comitato Super-nomenclatura per l'annotazione del Gene dell'uva (sNCGGa), che stabilisce la costruzione di un albero filogenetico tra cui V. vinifera e a. thaliana membri della famiglia genica per consentire l'annotazione del gene basato su sequenze di nucleotidi8.
Localizzazione del cromosoma dei membri della famiglia e indagine di duplicazione genica consentire evidenziando la presenza di geni duplicati intero genoma o tandem. Tali informazioni appaiono utile per svelare le funzioni del gene presunto, poiché esso potrebbe mostrare ridondanza funzionale o rivelare situazioni differenti, cioè, non-funzionalizzazione, neo-funzionalizzazione o Sub-funzionalizzazione9. Entrambi neo - e sub - functionalization sono eventi importanti che creano novità genetica, fornendo nuove componenti cellulari per adattamento della pianta alle mutevoli ambienti10. In particolare, le duplicazioni dei geni ancestrali e produzione di nuovi geni erano molto frequenti nel corso dell'evoluzione del genoma della vite e neonate geni provenienti dalle duplicazioni prossimali e tandem a grapevine erano più probabili produrre nuovo funzioni11.
Un altro fattore chiave nel decifrare la funzione della famiglia genica è il profilo di trascrittomica. La disponibilità di banche dati pubbliche, dando accesso a un'enorme quantità di dati di trascrittomica può essere così sfruttata per assegnare funzioni putative ai membri della famiglia genica utilizzando su larga scala in silico analisi di espressione. Infatti, la peculiare espressione di alcuni geni negli organi vegetali specifiche o in risposta a determinate sollecitazioni possa dare alcuni suggerimenti per quanto riguarda i presunti ruoli delle proteine corrispondenti in condizioni definite e dare sostegno alle ipotesi sulle possibili Sub-funzionalizzazione dei geni duplicati per rispondere alle diverse sfide. A tale scopo, è importante prendere in considerazione diversi set di dati: questi possono essere già disponibili gene matrici di espressione, come l'Atlante di trascrittomica genoma della vite organi e fasi di sviluppo12, o possono essere costruiti ad hoc di recupero di trascrittomica DataSet per la specie di pianta particolare definito sollecitato. Inoltre, un approccio semplice utilizzando due matrici, una con dati pairwise somiglianza e l'altra con coefficienti pairwise co-espressione può essere applicati per valutare le relazioni tra modelli di somiglianza ed espressione di sequenza all'interno di una famiglia di geni.
Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire un approccio globale, definizione di struttura del gene, conservato proteina motivi, posizione cromosomica, duplicazioni del gene e modelli di espressione, come anche la previsione di siti di localizzazione e fosforilazione di proteine, per raggiungere un esauriente caratterizzazione di una famiglia di geni in piante. Un tale approccio globale viene applicato qui alla caratterizzazione della famiglia ATL E3 ubiquitina ligasi a grapevine. Secondo il ruolo emergente dei membri sottofamiglia ATL nella regolazione dei processi cellulari chiave7, questo lavoro può anche aiutare l'identificazione dei forti candidati per studi funzionali e finalmente svelare i meccanismi molecolari che regolano la adattamento di questa coltura importante al suo ambiente.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Personal computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.megasoftware.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motif-based sequence analysis tools (MEME)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://meme-suite.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneious</td>
			<td>Biomatters Limited</td>
			<td></td>
			<td>http://www.geneious.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtParam Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://web.expasy.org/protparam/</td>
		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TargetP v1.1 Server</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/</td>
		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/</td>
		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://musite.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://pfam.xfam.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHMM Server v. 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtScale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://web.expasy.org/protscale/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grape Genome Database (CRIBI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://genomes.cribi.unipd.it/grape/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoGram</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCScanX</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interactive Tree Of Life (iTOL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://itol.embl.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UniProt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.uniprot.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phylogeny.fr</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.phylogeny.fr/index.cgi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUSCLE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gblocks Server</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitis vinifera cv. Corvina gene expression Atlas datamatrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_datamatrix_geneIDs_Fasoli2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi Experiment Viewer (MeV)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://mev.tm4.org/#/welcome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequence Read Archive (SRA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMBOSS Needle (EMBL-EBI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive workflow for the genome-wide identification and expression meta-analysis of the atl e3 ubiquitin ligase gene family in grapevine

Classificazione e nomenclatura dei geni in una famiglia può contribuire significativamente alla descrizione della diversità delle proteine codificate e alla previsione delle funzioni di famiglia basato su diverse funzionalità, come la presenza di motivi di sequenza o di particolare siti per modificazione post-traduzionale e il profilo di espressione dei membri della famiglia in condizioni diverse. Questo lavoro descrive un protocollo dettagliato per la caratterizzazione dei geni familiari. Qui, la procedura viene applicata per la caratterizzazione della famiglia Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitina ligasi a grapevine. I metodi includono l'identificazione del genoma di membri della famiglia, la caratterizzazione del gene localizzazione, struttura e duplicazione, l'analisi dei motivi della proteina conservata, la previsione dei siti di localizzazione e la fosforilazione delle proteine, nonché espressione genica in tutta la famiglia in diversi set di dati. Tale procedura, che potrebbe essere esteso a ulteriori analisi a seconda gli scopi sperimentali, potrebbe essere applicato a qualsiasi famiglia genica in qualsiasi specie di piante per i quali sono disponibili dati genomici e fornisce informazioni utili per identificare i candidati interessanti per gli studi funzionali, dando comprensioni nei meccanismi molecolari dell'adattamento della pianta al loro ambiente.

Il gene VIT_05s0077g01970, identificato come il più simile a a. thaliana ATL2 (At3g16720) attraverso una ricerca di BLASTp, fu usato come sonda per rilevare i membri della famiglia ATL del genoma della vite (V. vinifera cv Pinot Noir PN40024). L'analisi di PSI-BLAST convergenti dopo alcuni cicli rivelando una lista di geni putativi appartenendo alla famiglia del gene ATL grapevine (Figura 1A). La presenza del dominio canonico anello-H2 per ogni candidato è stata valutata mediante ispezione visiva dell'allineamento muscolo di tutte le voci risultanti dall'analisi (Figura 1B). Solo quei geni che contengono gli aminoacidi conservati correttamente distanziati, i due residui di istidina, così come i residui di prolina prima la terza cisteina sono stati considerati come ATLs secondo la definizione originale di ATL in Arabidopsis5. Un totale di 96 grapevine geni soddisfatto le esigenze e sono stati considerati per ulteriore caratterizzazione. Ogni membro della famiglia ATL è stata analizzata per definire le caratteristiche specifiche del gene e la proteina codificata corrispondente, cioè, la presenza di altri domini noti oltre l'anello-H2, transmembrane o idrofobiche regioni ricche, subcellulare localizzazione e siti di fosforilazione putativo (tabella 1 e tabella 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56626/56626fig1.jpg"> 
Figura 1: indagine PSI-BLAST e allineamento della vite putativo ATLs. (A) Screenshot della top 10 hits della prima ricerca PSI-BLAST iterazione usando la sequenza della proteina VIT_05s0077g01970 come esca. (B) parte dell'allineamento della vite 96 selezionato putativo ATLs mostrando loro dominio RING-H2 e il LOGO corrispondente ottenuto utilizzando una suite di biologia molecolare (Vedi Tabella materiali). Tratto da Ariani et al. , concesso in licenza sotto una licenza Creative Commons Attribution 4.0 International42.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56626/56626fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Nome</td>
			<td colspan="2">Identificazione del gene</td>
			<td>Lunghezza del gene (bp)</td>
			<td>Numero dell'introne</td>
			<td>UniProt ID</td>
			<td>Lunghezza della proteina (aa)</td>
			<td>Motivo di anello-H2</td>
			<td>Numero di dominio TM/H</td>
			<td>Altri domini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL3</td>
			<td colspan="2">VIT_09s0002g00220</td>
			<td>1245</td>
			<td>0</td>
			<td>F6HXK6</td>
			<td>304</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL4 [VviRHX1A]</td>
			<td colspan="2">VIT_15s0021g00890</td>
			<td>1827</td>
			<td>3</td>
			<td>D7SM36</td>
			<td>203</td>
			<td>PxC</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL18</td>
			<td colspan="2">VIT_11s0118g00780</td>
			<td>1113</td>
			<td>2</td>
			<td>F6HCI8</td>
			<td>193</td>
			<td>PC</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL23a</td>
			<td colspan="2">VIT_18s0001g01060</td>
			<td>935</td>
			<td>0</td>
			<td>F6H0E4</td>
			<td>114</td>
			<td>PxC</td>
			<td>0,5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL23b</td>
			<td colspan="2">VIT_18s0001g01050</td>
			<td>399</td>
			<td>0</td>
			<td>E0CQX3</td>
			<td>132</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL24</td>
			<td colspan="2">VIT_17s0000g06460</td>
			<td>4466</td>
			<td>4</td>
			<td>D7SI89</td>
			<td>217</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL27</td>
			<td colspan="2">VIT_00s0264g00020</td>
			<td>2554</td>
			<td>4</td>
			<td>D7T1R5</td>
			<td>235</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL43</td>
			<td colspan="2">VIT_11s0052g00530</td>
			<td>1576</td>
			<td>2</td>
			<td>D7SQD9</td>
			<td>457</td>
			<td>PxC</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL54a</td>
			<td colspan="2">VIT_18s0001g06640</td>
			<td>3221</td>
			<td>1</td>
			<td>F6H0Y5</td>
			<td>405</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL54b</td>
			<td colspan="2">VIT_03s0017g00670</td>
			<td>2774</td>
			<td>1</td>
			<td>F6HTI0</td>
			<td>427</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL55 [VviRING1]</td>
			<td colspan="2">VIT_07s0191g00230</td>
			<td>1844</td>
			<td>0</td>
			<td>F6HRP9</td>
			<td>372</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL63</td>
			<td colspan="2">VIT_06s0004g06930</td>
			<td>804</td>
			<td>0</td>
			<td>D7SJU6</td>
			<td>267</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL65</td>
			<td colspan="2">VIT_03s0063g01890</td>
			<td>2068</td>
			<td>0</td>
			<td>F6HQI8</td>
			<td>396</td>
			<td>PxC</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL82</td>
			<td colspan="2">VIT_01s0026g02540</td>
			<td>820</td>
			<td>0</td>
			<td>F6HPQ9</td>
			<td>233</td>
			<td>PC</td>
			<td>0,5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL83</td>
			<td colspan="2">VIT_17s0000g08400</td>
			<td>1887</td>
			<td>0</td>
			<td>F6GSQ4</td>
			<td>143</td>
			<td>PC</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL84</td>
			<td colspan="2">VIT_06s0004g00120</td>
			<td>1853</td>
			<td>0</td>
			<td>F6GUP5</td>
			<td>368</td>
			<td>PC</td>
			<td>0,5</td>
			<td>ZF-RING_3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL85</td>
			<td colspan="2">VIT_12s0034g01400</td>
			<td>786</td>
			<td>0</td>
			<td>F6H965</td>
			<td>261</td>
			<td>PC</td>
			<td>0,5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL86</td>
			<td colspan="2">VIT_12s0034g01390</td>
			<td>1434</td>
			<td>1</td>
			<td>D7T016</td>
			<td>451</td>
			<td>PC</td>
			<td>0,5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL87</td>
			<td colspan="2">VIT_18s0001g03270</td>
			<td>1002</td>
			<td>0</td>
			<td>F6H0T2</td>
			<td>333</td>
			<td>PC</td>
			<td>0,5</td>
			<td>ZF-RING_3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">VviATL88</td>
			<td colspan="2">VIT_08s0040g00590</td>
			<td>1320</td>
			<td>0</td>
			<td>F6HQR2</td>
			<td>314</td>
			<td>PC</td>
			<td>0</td>
			<td>ZF-RING_3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: primo 20 VviATL geni e le caratteristiche di sequenza delle proteine corrispondenti. TM: transmembrana; H: idrofobo; 0,5 indica la presenza di una o più regioni idrofobiche. Tratto da Ariani et al. , concesso in licenza sotto una licenza Creative Commons Attribution 4.0 International42.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/56626/56626table2.jpg"> 
Tabella 2: dettagli sui primi 20 VviATL posizione di gene in V. vinifera genoma, stato di duplicazione e caratteristiche fisico-chimiche della proteina ATL e percorso. (a) numero di siti di fosforilazione predetto di Musite; (b) previsioni simili ottenute con almeno due software sono evidenziate in grassetto; ngLOC è stato utilizzato con le impostazioni predefinite, mentre TargetP v 1.1 e localizzazione sottocellulare della proteina Prowler sono stati usati con un cut-off di probabilità pari a 0.5. NUC, nucleo; MIT, mitocondri; CHL, cloroplasto; PLA, membrana plasmatica; S, via secretiva (presenza di un peptide di segnale); M, mitocondri; C, cloroplasto; O o -, altre posizioni; ND, non determinato (cioè, valore inferiore alla soglia). Tratto da Ariani et al. , concesso in licenza sotto una licenza Creative Commons Attribution 4.0 International42. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56626/Table_2.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Un'analisi filogenetica del nucleotide sequenze di geni codificanti ATL di grapevine identificate insieme le sequenze della famiglia del gene di riferimento a. thaliana ATL è stata utilizzata per la nomenclatura ATL di vite, secondo le indicazioni del il sNCGGa8. Novantasei e 83 sequenze nucleotidiche da V. vinifera e a. thaliana, rispettivamente, sono stati sottoposti alla pipeline di Phylogeny.fr per ottenere un albero filogenetico affidabile.Le sequenze di quest'ultime più successivamente sono state utilizzate per annotare e il nome di geni di vite sulla base di solide relazioni (Figura 2). Seguendo questo approccio, 13 su 96 grapevine ATLs ha ricevuto un identificatore specifico considerando loro ortologhe uno a uno con un a. thaliana ATL I nomi di altri 83 geni sono stati assegnati basato sull'albero filogenetico, con una progressiva numerazione dall'alto verso il basso, a partire da un numero di gene ATL superiore il più alto numero usato in a. thaliana.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56626/56626fig2.jpg"> 
Figura 2: Albero filogenetico di V. vinifera e a. thaliana ATL E3 ubiquitina ligasi-codifica geni. L'albero unrooted è stata generata con la suite di Phylogeny.fr (V. vinifera (in verde) ed i geni ATL 83 di a. thaliana riportati nel database UniProt (in giallo). I valori di supporto del ramo sono stati ottenuti da 100 repliche bootstrap. Le stelle rosse indicano la presenza di un dominio di dito (BZE) di zinco BCA2 delle proteine corrispondenti. Tratto da Ariani et al. , concesso in licenza sotto una licenza Creative Commons Attribution 4.0 International42. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56626/56626fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Mappatura di geni codificanti ATL ai cromosomi grapevine ha mostrato un'ampia distribuzione in tutto il genoma, suggerendo la duplicazione di intero genoma come la forza evolutiva importante nell'espansione della famiglia genica ATL a grapevine. Infatti, sono stati trovati 31 ATLs in regioni cromosomiche omologhe potenzialmente provenienti da eventi di duplicazione del genoma intero o segmentale. Inoltre, la stessa analisi evidenziato 13 geni tandemly duplicati, una duplicazione prossimale e 51 dispersi duplicati (Figura 3). Considerando il grande numero di geni duplicati nella famiglia ATL, abbiamo effettuato un test di arricchimento (test esatto di Fisher) per controllare la ritenzione preferenziale dei geni duplicati durante il frazionamento del genoma. Con un p-valore &#60; 0.001, questo test ha confermato l'ipotesi che duplicato geni ATL sono stati mantenuti più di casualmente previsto, suggerendo un ruolo per la famiglia del gene ATL durante grapevine adattamento e l'evoluzione.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56626/56626fig3.jpg"> 
Figura 3: Distribuzione di gene Grapevine ATL-codifica nel V. vinifera cromosomi e duplicazione stato. I geni ATL 96 grapevine con esatte cromosomiche informazioni disponibili nel database sono stati mappati ai 19 V. vinifera cromosomi. I colori indicano l'originale evento di duplicazione. Linee nere verticali e linee rosse identificano le coppie derivate da tandem sovrapposizioni e duplicazioni di intero genoma, rispettivamente. Tratto da Ariani et al. , concesso in licenza sotto una licenza Creative Commons Attribution 4.0 International42. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56626/56626fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per indagare ulteriormente le funzioni biologiche putative di ATLs a grapevine, una meta-analisi è stata effettuata sulla V. vinifera c.v. espressione genica globale Corvina Atlas12. Il set di dati include i valori di espressione intero genoma di 54 vite differenti organi e fasi di sviluppo ed è stato utilizzato per eseguire un'analisi bi-cluster gerarchica. Risultati non solo confermato che tutti i 96 ATLs erano espressi in almeno una delle 54 tessuti/tappe, ma ha anche sottolineato la presenza di cinque gruppi principali dei profili di espressione (Figura 4A). Brevemente, i cluster A ed E ha mostrato di fronte i comportamenti, in particolare la prima è caratterizzata da un generale downregulation dei geni ATL in campioni giovanili, comprese le fasi iniziali di bacca, foglia giovane, viticci, infiorescenza e la maggior parte delle fasi bud. D'altra parte, nel mazzo stesso A, maturi campioni quali le bacche a maturazione e post-raccolta appassimento fasi, tessuti legnosi e fasi ritardate di seme sviluppo ATL geni hanno mostrati un upregulation predominante. Geni in Cluster C erano principalmente downregulated nella maggior parte dei campioni, mentre geni ATL cluster D erano spesso sovraregolati alle ultime fasi di sviluppo di bacca. Infine, cluster B non ha mostrato alcuna variazione rilevante nei profili di espressione.
Un approccio simile è stato applicato per studiare l'espressione di grapevine ATL familiari in risposta agli stress biotici e abiotici, utilizzando set di dati specifici costruito per questo scopo. Una quantità enorme di dati di espressione derivanti da esperimenti di RNA-seq e microarray sono disponibili dal database di pubblico accesso quali Gene Expression Omnibus (GEO) e ArrayExpress. Una volta raccolti e convenientemente normalizzato, le informazioni è state sfruttate per ulteriori approfondimenti la potenziale funzione di ATLs nella risposta della pianta agli stress. Analizzando i profili di espressione della vite ATLs in risposta a stress biotici ha rivelato che le trascrizioni 62 su 96 ha mostrato una significativa modulazione (log2 piega-cambiamento (FC) &#62; | 0,5 |) in almeno due circostanze, con un tasso di falsi scoperta (FDR) &#60; (0,05 Figura 4B). Il numero aumenta a 81 considerando solo la soglia di FDR in una singola condizione. Questi risultati hanno suggerito forte un coinvolgimento diretto della famiglia del gene ATL nella risposta agli agenti patogeni anche a grapevine. In particolare, un gruppo di 12 geni (VviATL3-27-54b-55-90-97-123-144-148-149-156) erano fortemente upregulated in risposta alla maggior parte dei agenti patogeni, compreso biotrophic e funghi necrotrofi ed erbivori e così, meritano attenzione per ulteriormente funzionale analisi.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56626/56626fig4.jpg"> 
Figura 4: l'espressione genica ATL clusteringof gerarchica a grapevine Atlas e nel dataset correlati allo stress biotici in grapevine. (A) l'espressione di registro trasformato valori dei geni ATL vite a vite Atlas12 sono stati utilizzati per analisi dei cluster gerarchica basata su metriche di distanza di Pearson. Il colore scala rappresenta superiore (rosso) o inferiore (verde) espressione livelli rispetto all'abbondanza di trascrizione mediano di ogni gene in tutti i campioni. Lettere da A E sul lato destro indicano i diversi cluster identificati.AB: dopo scoppio; B: scoppiare; germoglio del germoglio-w: inverno; F: fioritura; FB: fioritura comincia; FS: allegagione; G: verde; MR: metà-maturazione; PFS: post-allegagione; PHWI-II-III: postraccolta appassimento 1, 2 e 3 mesi; R: maturazione; S: senescente; staminali-w: fusto legnoso; V: invaiatura; WD: ben sviluppato; Y: giovane. (B) il colore scala rappresenta il maggiore (rosso) o diminuito (blu) piega cambiamenti dell'espressione genica di grapevine ATL nei campioni infetti rispetto ai controlli per ogni condizione. Gli asterischi indicano l'espressione differenziale significativa (FDR &#60; 0,05) di ogni ATL nelle condizioni corrispondenti. Tratto da Ariani et al. , concesso in licenza sotto una licenza Creative Commons Attribution 4.0 International42. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56626/56626fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Complementare tabella 1: ATL geni candidati per splicing alternativo. (un) ATL gene ID secondo la predizione genica dell'uva V1 e annotazione, identificazione del gene (b), ATL secondo il V2 uva gene pronostico e annotazione43, (c) numero di presunti varianti alternative d'impionbatura di ATL, (d) informazioni sulla sequenza di ogni variante ATL putativo di codifica. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56626/Supplementary_Table_I.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare tabella 2: <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56626/Supplementary_Table_II.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementari 1: <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56626/Supplementary_File_1.txt">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine at JoVE.com

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Questo articolo descrive la procedura per l'identificazione e la caratterizzazione di una famiglia di geni a grapevine applicato alla famiglia di Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitina ligasi.

Flusso di lavoro globale per l'identificazione del genoma e la Meta-analisi di espressione della famiglia genica ATL E3 ubiquitina ligasi a Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...

comprehensive-workflow-for-genome-wide-identification-expression-meta

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Views.  Università degli Studi di Verona. Questo articolo descrive la procedura per l'identificazione e la caratterizzazione di una famiglia di geni a grapevine applicato alla famiglia di Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitina ligasi.

Video: Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

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The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

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Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robotica e Image Analysis dinamica per gli Studi di espressione genica nei tessuti vegetali

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Genoma Analisi mediante ChIP per identificare Isoform obiettivi specifici per Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genome-wide gene delezioni in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Da Throughput PCR ad alta

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...