Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa Intramural do NIH, ICN e CCR. Todos os autores receberam Intramural bolsa de pesquisa de NIH, ICN e CCR.

1. preparar reagentes <ol><li>1X PBS <ol><li>diluir 100 mL x 10 PBS com 900 mL dH 2 O e ajustar o pH para 7,4 usando um medidor de pH. Armazenar em temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Solução de lise (LS) <ol><li>preparar 2,5 M NaCl, EDTA dissódico de 100 mM, 10 mM Tris base e 200mm NaOH em 900 mL dH 2 O; comumente leva cerca de 20 min para permitir a mistura dissolver totalmente. Ajuste o pH a 10 usando um medidor de pH. Adicionar sarcosinate de Laurilsulfato de sódio 1% e 1% Triton X-100 e ajustar o volume final de 1.000 mL. Legal a 4 ° C, durante pelo menos 30 min antes do uso.</li>
	</ol></li> <li>Solução de eletroforese alcalina (AES), pH &#62; 13 <ol><li>preparar dissódico NaOH e 1 mM 200 mM EDTA em 800 mL dH 2 O. ajustar o pH e certifique-se que é pH &#62; 13. Ajuste o volume final de 1.000 mL. Fazer fresco antes do utilizar e refrigerar a 4 ° C, durante pelo menos 30 min antes do uso.</li>
	</ol></li> <li>Sollution electroforese neutro (NES) <ol><li>preparar 1.000 mL de tampão de eletroforese neutro misturando 100 mM Tris base e 300mm de acetato de sódio para 1.000 mL dH 2 O. ajustar o pH a 9.0 com ácido acético glacial. Legal a 4 ° C, durante pelo menos 30 min antes do uso.</li>
	</ol></li> <li>Solução de precipitação de DNA (DPS) <ol><li>preparação de ações de acetato de amónio de 7,5 M 10 mL. Para 50 mL de solução de precipitação de DNA, mistura de acetato de amónio 6,7 mL 7,5 M com 43,3 mL de etanol 95%. Armazenar em temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Solução de coloração <ol><li>Adicionar 1 µ l 10.000 x mancha verde fluorescente de ácidos nucleicos (por exemplo, SYBR Green) em tampão de 30 mL de Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl, EDTA dissódico de 1 mM, pH 7,4) e loja em 4 ° C. proteger da luz.</li>
	</ol></li> <li>1% baixa fusão agarose <ol><li>derreter 1% baixa fusão ponto agarose (1 g em 100 mL dH 2 O) no microondas. Agite a agarose cada 15-20 s para certificar-se que a agarose é completamente derretido. Coloque o agarose em banho de água a 37 ° C pelo menos 20 min antes do uso.</li>
	</ol></li> <li>Pontas de pipetas pre-quente <ol><li>cortar as extremidades estreitas de pontas de pipetas P200 por 3 mm e quente a 37 ° C antes de pipetagem agarose.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparar os Slides cometa <ol><li>, deslize o revestimento <ol><li>Melt agarose a 1% (1 g em 100 mL dH 2 O) no microondas durante 2-3 minutos ou até que a agarose é completamente derretido. Mergulhar as vidro corrediças do microscópio para a agarose e limpar um lado da lâmina utilizando um cotão.</li>
		<li>Colocar os slides sobre uma superfície plana para secar ao ar livre ou aqueça a 50 ° C para secagem mais rápida; um filme de agarose transparente deve ser formado após a secagem. Coloque as lâminas revestidas em 37 ° C antes do uso.</li>
	</ol></li> <li>Preparação de suspensões celulares único <ol><li>cultura e tratar as células de glioma <ol><li>cultura as células U251 MG em meio DMEM-Ham F-12 suplementado com 10% FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 10 de µ g/mL em 37 & # 176; C com 5% de CO 2.</li>
			<li>Digerir as células usando a tripsina 1 mL por 3 min e neutralizar a tripsina usando meio DMEM-Ham F-12 com FBS. Coletar em tubo de 15 mL, giram a 300 x g, durante 4 min, Aspire o meio e suspender as células em 2 x 10 5 células/mL de 1X PBS. 
			Nota: A amostra de célula deve ser preparada imediatamente antes de iniciar o ensaio e todas as amostras devem ser manuseadas em um ambiente escuro ou esmaecido para evitar danos no DNA da luz.</li>
			<li>Combinar a suspensão de células com agarose a 1% derretido baixo ponto de fusão (a 37 ° C) na proporção de 01:10 (v/v), misture suavemente pipetando para cima e para baixo e imediatamente distribuir 30 µ l de uma lâmina. Use o lado da ponta da pipeta para espalhar a mistura para garantir a formação de uma camada fina de agarose/célula.</li>
			<li>Coloque a corrediça plana a 4 ° C, no escuro por 10 min., aumentando o tempo de coagulação para 30 min melhora a aderência das amostras em ambientes de alta umidade.</li>
			<li>Imergir o slide em 4 ° C LS no escuro por 1h durante a noite.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. Única célula eletroforese <ol><li>prosseguir com alcalino (passo 3.2) ou cometa neutro (passo 3.3) do ensaio</li> <li>para ensaio cometa alcalina <ol><li>gentilmente remover slides de LS, escorra o excesso reserva e delicadamente mergulhe na AES por 1h no 4 ° C para permitir o desenrolar de DNA. Manter os slides no escuro.</li>
		<li>Adicionar pre-refrigerados AES na bandeja de slide de electroforese, não deve exceder 0,5 cm acima os slides (isso depende do tamanho das unidades de eletroforese), coloque os slides dentro e cubra com uma tampa. Definir a tensão de alimentação para 1 V/cm (o comprimento entre os eletrodos) e executada por 30 min em 4 ° C.</li>
		<li>Solução de electroforese em excesso de dreno de slide. Mergulhe delicadamente slides duas vezes na dH 2 O por 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Delicadamente mergulhe slides em etanol a 70% por 5 min à temperatura ambiente. Avance para o passo 4.</li>
	</ol></li> <li>Para ensaio cometa neutro <ol><li>Remover suavemente os slides de LS, escorra o excesso tampão e delicadamente mergulhe no NES por 30 min em 4 ° ° C. conservar o slide no escuro.</li>
		Tampão de eletroforese neutro previamente refrigerados <li>Add na bandeja de slide de electroforese, não deve exceder 0,5 cm acima slides (isso depende do tamanho das unidades de eletroforese), coloque os slides dentro e cubra com uma tampa. Definir a tensão de alimentação para 1 V/cm (o comprimento entre os eletrodos) e executada por 45 min em 4 ° C.</li>
		<li>Buffer excesso de drenagem das lâminas de. Mergulhe delicadamente slides em DPS por 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Delicadamente mergulhe os slides em etanol a 70% durante 30 min à temperatura ambiente. Avance para o passo 4.</li>
	</ol></li></ol> 4. Mancha de Slides cometa <ol><li>seco slides a 37 ° C por 10-15 min no escuro.</li>
	<li>Lugar 50-100 µ l verde fluorescente ácido nucleico manchando a solução em cada secas agarose e mancha durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Lavar os slides brevemente em dH 2 O e secar completamente a 37 ° C, no escuro. Proceder à análise e aquisição de imagens.</li>
</ol> 5. Aquisição e análise de imagens Nota: A visualização e a quantificação de quebras de DNA baseiam-se na microscopia de epifluorescência e o software do ensaio cometa (ver Tabela de materiais) 12 .
<ol><li>Coloque os slides sobre o microscópio com um suporte de slide. Certifique-se que o gel de agarose é voltado para a lente objetiva. Aleatoriamente, capturam imagens de slides cometa manchada usando um microscópio de fluorescência com uma lente objetiva de 10x. Evitar as bordas e as áreas ao redor de quaisquer bolhas de ar.</li>
	<li>, Certifique-se de cada cauda de cometa é distribuída horizontalmente. Cabeças de cometa devem se originam da esquerda e a cauda da direita.</li>
	<li>Salvar cada imagem em um formato binário de TIF com mancha brilhante de DNA e fundo escuro. Carregar imagens para o software usando o &#34; selecione arquivos para analisar &#34; botão, que está localizado no lado esquerdo da barra de ferramentas. Uma janela de exibição de imagem deve aparecer ( Figura 1).</li>
	<li>Desenhar um quadro de medição na tela e ajustar seu tamanho em conformidade com o cometa da célula. Clique o &#34; ajustar &#34; o botão para configurar o limite da cabeça, cometa, cauda de acordo com a imagem e, em seguida, clique o &#34; começar as medições &#34; botão ( Figura 1).</li>
	<li>, Selecione uma célula usando o frame e ativar a medição clicando com o mouse sobre o &#34; do ensaio cometa &#34; botão; uma intensidade imagem aparece no &#34; perfis &#34; janela com os parâmetros de medição selecionado. Os resultados podem ser salvos clicando o &#34; armazenar resultado &#34; botão ( Figura 1). 
	Nota: O software calcula os parâmetros, incluindo o comprimento da cauda de cometa, a porcentagem de DNA cauda, o momento de cauda (TM) e o momento de cauda verde-oliva (OTM). Os momentos de cauda são calculados por fórmulas como segue: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56450/56450eq1.jpg" /> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56450/56450eq2.jpg" /></li> <li>analisar pelo menos 50 células por tratamento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+gel/comet+assay:+guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing.">Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li><li>Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxicity+in+lead+treated+human+lymphocytes+evaluated+by+micronucleus+and+comet+assays.">Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays.</a> Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).</li><li>Azqueta, A., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+comet+assay:+a+comprehensive+guide+to+measuring+DNA+damage+and+repair.">The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair.</a> Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).</li><li>Goldstein, M., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+implications+for+tumor+responses+to+radiation+and+chemotherapy.">The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy.</a> Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).</li><li>Gavande, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+targeted+therapy:+The+past+or+future+of+cancer+treatment?.">DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?.</a> Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).</li><li>Torgovnick, A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+mechanisms+in+cancer+development+and+therapy.">DNA repair mechanisms in cancer development and therapy.</a> Front Genet. 6, 157 (2015).</li><li>Weston, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARP+inhibitor+olaparib+induces+significant+killing+of+ATM-deficient+lymphoid+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo.">The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo.</a> Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).</li><li>Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+Repair+in+Cancer:+Beyond+PARP+Inhibitors.">Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors.</a> Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+of+IDH1-Mutated+Gliomas+Due+to+an+Impairment+in+PARP1-Mediated+DNA+Repair.">Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair.</a> Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).</li><li>Konca, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+public+domain+PC+image-analysis+program+for+the+comet+assay.">A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay.</a> Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).</li><li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay.">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair:+principles,+applications,+and+limitations.">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li><li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+high-throughput+processing+of+slides+for+the+comet+assay.">Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay.</a> Sci Rep. 4, 7200 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O ensaio cometa é uma ferramenta eficiente para medir intervalos de single e double-strand DNA a nível celular. O ensaio foi amplamente aplicado como um "padrão ouro" em estudos sobre a genotoxicidade e biomonitorização13, variando de ligações cruzadas base lesões, DNA, desenvolvimento de drogas e locais sensíveis do alcaloide. No presente estudo, mostramos dois protocolos distintos de passo a passo para ensaios de cometa alcalino e neutro, respectivamente. Combinando a electroforese única célula, microscopia fluorescente e interpretação de imagem, ambos os ensaios de cometa alcalino e neutro fornecem abordagens quantitativas para avaliar a extensão do DNA danos em vitro.
Diversas etapas-chave são essenciais para a execução bem-sucedida do ensaio cometa. Por exemplo, deve-se ter cuidado nas etapas de preparação dos reagentes. Cada solução deve ser recentemente preparada e mantida à temperatura apropriada durante pelo menos 30 minutos antes do uso, para evitar danos ao DNA endógeno ou reparar durante a preparação da amostra. Mais um passo vital é a preparação da suspensão de célula única viável. É importante manter o agarose a 37 ° C antes do uso, para maximizar a sobrevivência da pilha durante a preparação dos slides cometa. A suspensão de célula/agarose deve ser preparada imediatamente antes de iniciar o ensaio. Usando o lado das pontas de pipetas para espalhar a suspensão celular/agarose ajuda a atingir uma camada fina de agarose nos slides, para que a maioria das células pode ser posicionada no mesmo plano focal durante a microscopia. Opcionalmente, arranhe as bordas dos slides usando uma caneta com ponta de diamante para melhorar a fixação de agarose.
Apesar das vantagens do ensaio cometa, existem várias limitações deste método tradicional de14,15. Por exemplo, a taxa de transferência do ensaio cometa é limitada pelo processo de preparação de slides o vidro. Em algumas ocasiões, uma lâmina de vidro de oito-jorrava fornece uma solução para melhorar o throughput de ensaio. Outra limitação é que o ensaio cometa simplesmente representa a relação entre o DNA fragmentado nas células. Informações adicionais de apoia é necessária para descrever completamente as alterações celulares, além de danos no DNA. Nesse caso, análise de apoptose, γH2A.X coloração e immunoblotting poderiam ser muito útil para fornecer uma análise minuciosa dos diferentes aspectos para revelar o efeito do DNA de agentes nocivos.
Existem inúmeros softwares para análise de imagem do cometa e a saída inclui uma variedade de parâmetros diferentes. Os parâmetros mais comumente usados são o comprimento da cauda, a porcentagem de DNA na cauda e o momento de cauda. Comprimento da cauda só pode ser usado em baixos níveis de dano do ADN, desde que não tende a mudar uma vez que a cauda é estabelecido14. Posteriormente, a intensidade da cauda aumenta à medida que o dano é reforçado. A porcentagem de DNA na cauda do cometa é outro parâmetro útil, como está relacionada linearmente com a frequência de quebra. O momento de cauda combina comprimento da cauda e intensidade de cauda em um único valor, portanto, é o parâmetro mais úteis e usado com frequência.
O ensaio cometa foi amplamente aplicado em testes de genotoxicidade e biomonitorização humana. Com o desenvolvimento de inibidores de enzima de reparo de DNA, o ensaio cometa poderia uma ferramenta valiosa para testar terapias de combinação que melhoram os resultados da quimioterapia tradicional.

O ensaio cometa foi primeiro desenvolvido por Ostling e Johanson, em 1984, demonstrando que a migração do DNA fragmentos dos núcleos sob uma condição neutra1. A técnica foi desenvolvida mais tarde por Singh et al, mostrando que uma condição alcalina aumentou substancialmente a especificidade e a reprodutibilidade do ensaio2. Desde então, o ensaio cometa neutro é usado principalmente para detectar quebras de DNA dupla-hélice, Considerando que o ensaio cometa alcalino é mais sensível para pequenas quantidades de dano do ADN, incluindo único e quebra de DNA de fita dupla, alcaloide-labile sites, DNA-DNA ou Cross-linking da ADN-proteína e quebras de single-strand DNA associadas com incompleta excisão reparar sites3,4. Ambos os ensaios permitem a visualização de DNA fragmentado e fornecem uma maneira simples de avaliar quantitativamente o dano do ADN. O ensaio cometa é considerado como um método sensível para os estudos toxicológicos in vitro e em vivo genéticos e é aplicável a áreas de investigação diferentes, tais como a seleção precoce de drogas-candidato, monitoramento ambiental, a biomonitorização humana, e fundamental Pesquisar no dano do ADN e reparar5.
O princípio do ensaio é que sob um campo elétrico, DNA fragmentado migra para fora do corpo do nucleoide (também conhecido como o "cabeça de cometa") e forma uma mancha de DNA no gel do agarose (também conhecido como a "cauda de cometa"). Com coloração de nucleótidos, a extensão dos danos do DNA pode ser quantificada pela análise "cometas", formados por electroforese esta única célula. Cálculo do momento de cauda mais pode ajudar a comparar o dano do ADN entre diferentes grupos experimentais. Em comparação com métodos tradicionais de detecção de danos do DNA, o ensaio cometa é direta, sensível, barata e relativamente simples.
Radioterapia e agentes quimioterápicos são estratégias comuns para o tratamento de câncer, gerando único filamento e quebras de DNA de fita dupla em cromossomos6. O avanço recente em inibidores de reparação do ADN permite um mais eficaz efeito genotóxico pela quimioterapia de combinação e, portanto, potencialmente reduz os efeitos secundários sistêmicos tais como anemia, infecção e medula óssea supressão7, 8. neste estudo, mostramos a investigação de um inibidor de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), olaparib (Ola)9. PARP é uma proteína nuclear abundante e é responsável pelo reparo de excisão de base de DNA, formando um polímero de poli (ADP-ribose)10. Temozolomide (TMZ) é um Agente alquilante disponível por via oral e tem sido amplamente utilizada para o tratamento do paciente de glioma. Usando o ensaio cometa para quantificar os danos do DNA, demonstramos que combina olaparib com temozolomide profundamente aumenta o dano de DNA em células de glioma, que sugere a terapia combinada de olaparib/temozolomide é uma estratégia eficaz para tratar de glioma, comparado com o temozolomide sozinho11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">10x PBS(Ca++, Mg++ free)</td>
			<td style="width:101px;">TEKnova</td>
			<td style="width:119px;">P0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:101px;">TEKnova</td>
			<td style="width:119px;">E0308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium lauryl sarcosinate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L7414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium acetate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Green</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Low melting point agarose</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">95% ethanol</td>
			<td style="width:101px;">WARNER-GRAHAM</td>
			<td style="width:119px;">#64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:101px;">GIBICO</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:101px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Consumables</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glass tissue slides</td>
			<td style="width:101px;">ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td style="width:119px;">63422-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:101px;">KIMberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:101px;">DENVILLE</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette Tips</td>
			<td style="width:101px;">SHARP</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:101px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipments</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microwave</td>
			<td style="width:101px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Waterbath</td>
			<td style="width:101px;">PRECISION</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horizontal electrophoresis chamber</td>
			<td style="width:101px;">TREVIGEN</td>
			<td style="width:119px;">Cometassay ES II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Power supply</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:101px;">Quincy Lab</td>
			<td style="width:119px;">Model 12-140E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micropipettor</td>
			<td style="width:101px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating in vitro dna damage using comet assay

Dano do ADN é um fenômeno comum para cada célula durante sua vida útil e é definido como uma alteração da estrutura química do DNA genômico. Terapias de câncer, tais como o rádio e quimioterapia, apresentar a enorme quantidade de danos adicionais de DNA, levando à detenção do ciclo celular e apoptose para limitar a progressão do câncer. Avaliação quantitativa do dano do ADN durante a terapia de câncer experimental é um passo fundamental para justificar a eficácia de um agente genotóxico. Neste estudo, focamos em um ensaio de electroforese única célula, também conhecido como o ensaio cometa, que pode quantificar single e double-strand DNA quebras em vitro. O ensaio cometa é um método de quantificação de dano de DNA que é eficiente e fácil de executar, e tem exigências de tempo/orçamento baixas e alta reprodutibilidade. Aqui, destacamos o utilitário do ensaio cometa para estudos pré-clínicos, avaliando o efeito genotóxico de terapia de combinação olaparib/temozolomide U251 células de glioma.

O presente protocolo descreve um fluxo de trabalho passo a passo para a execução do ensaio cometa e análise de dados (Figura 1). Resultados de ensaios os cometa alcalino e neutro, mostrou que a cauda do cometa de células U251 tratados com doxorrubicina (1 µM, 20 h) era maior e tinha maior intensidade de DNA, sugerindo um acúmulo substancial de DNA fragmentado devido à quimioterapia (Figura 2).
Análise quantitativa para ambos o ensaio cometa alcalino ou neutro mostrou formação de cauda cometa significativamente aumentada após o tratamento de doxorrubicina (Figura 3A) indicando dano do ADN. Os resultados são apresentados como média ± SEM e t-testes foram usados para comparações estatísticas. Quantificação do momento cauda de ambos os ensaios confirmou o aumento do momento de cauda média: para o ensaio cometa alcalina, 0.134 ± 0.0448 (n = 52) vs 13.84 ± 1.325 (n = 51), p &#60; 0,01; Para o ensaio cometa neutro, 0.596 ± 0.06668 (n = 78) vs 9.979 ± 0.658 (n = 51), p &#60; 0,01. Estes dados fornecem um índice quantificável para avaliar os danos do DNA. Além disso, o tratamento de combinação de olaparib de inibidor PARP e temozolomide significativamente reforçada dano de ADN em células de glioma (Figura 3), com um aumento do comprimento e da intensidade do sinal da cauda do cometa. Olaparib sozinho não apresentou danos do DNA, Considerando que é potencializado o efeito genotóxico do temozolomide agente de quimioterapia (DMSO, 0.9836 ± 0.3377 (n = 64); Olaparib, 0.6663 ± 0.2325 (n = 51); TMZ, 6.197 ± 0.572 (n = 51); Olaparib + TMZ, 44.04 ± 1.269(n = 115), p &#60; 0,01).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56450/56450fig1.jpg"> 
Figura 1 : Guia passo a passo da análise da imagem usando o software do ensaio cometa. Software (A), a barra de ferramentas do ensaio cometa. Ensaio de cometa alcalina (B) como um exemplo: a interface do usuário do software de ensaio cometa consiste em um modo de exibição de imagem, perfil de intensidade e janela de aquisição de dados. (C) a imagem de fundo, região de cometa e cabeça do cometa foram definidas no software. (D) a intensidade de perfis da cabeça do cometa (vermelho) e cauda (verde) são plotados, respectivamente. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56450/56450fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56450/56450fig2.jpg"> 
Figura 2 : Imagens representativas dos ensaios alcalino e neutro cometa. Células de glioma U251 foram tratadas com doxorrubicina e investigado pela alcalinos (painéis superiores) e cometa neutro (painéis inferiores) ensaios (barra de escala = 10 µm). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56450/56450fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56450/56450fig3.jpg"> 
Figura 3: Dados representativos do cometa cauda momento. Plotagem de dados do ensaio cometa alcalina (A). p &#60; 0,01. Plotagem de dados do ensaio cometa neutro (B). p &#60; 0,01. (C) análise de ensaio cometa revelou o efeito sinérgico da terapia combinada incluindo temozolomide (TMZ) e olaparib (Ola). p &#60; 0,01. (D) imagens representativas de células de glioma sob tratamento de combinação de temozolomide e olaparib (barra de escala = 10 µm). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56450/56450fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

O ensaio cometa é um método eficiente para detectar danos do DNA incluindo single e double-stranded DNA quebra. Descrevemos o cometa alcalino e neutro de ensaios para medir o dano de DNA em células cancerosas para avaliar o efeito terapêutico da quimioterapia.

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

evaluating-in-vitro-dna-damage-using-comet-assay

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

36.9K visualizações.  National Cancer Institute. O ensaio cometa é um método eficiente para detectar danos do DNA incluindo single e double-stranded DNA quebra. Descrevemos o cometa alcalino e neutro de ensaios para medir o dano de DNA em células cancerosas para avaliar o efeito terapêutico da quimioterapia.

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Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Pesquisa do câncer

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human central nervous system (CNS). However, both the cytological origin and the evolutionary process of HBs (including neovascularization) remain controversial, and anti-angiogenesis for VHL-HBs, based on classic HB angiogenesis, have produced disappointing results in clinical trials. One major obstacle to the successful clinical translation of anti-vascular treatment is the lack of a thorough understanding of neovascularization in this vascular tumor. In this article, we present a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in HBs, as well as its role in HBs. With this procedure, researchers can accurately understand the complexity of HB neovascularization and identify the function of this common form of angiogenesis in HBs. These protocols can be used to evaluate the most promising anti-vascular therapy for tumors, which has high translational potential either for tumors treatment or for aiding in the optimization of the anti-angiogenic treatment for HBs in future translations. The results highlight the complexity of HB neovascularization and suggest that this common form angiogenesis is only a complementary mechanism in HB neovascularization.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

This paper presents a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in hemangioblastomas (HBs) and its role in HBs. The results highlight the complexity of HB-neovascularization and suggest that this common form of angiogenesis is only a complementary mechanism in the HB-neovascularization.

Um procedimento abrangente para avaliar o desempenho In Vitro da neovascularização de Hemangioblastoma putativo usando o Spheroid brotando do ensaio

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to objectively measure the severity of this condition. Here we describe an optimized method for assessing mitochondrial function of PBMCs collected from fatigued cancer patients. Using a compact extracellular flux system and sequential injection of respiratory inhibitors, we examined PBMC mitochondrial functional status by measuring basal mitochondrial respiration, spare respiratory capacity, and energy phenotype, which describes the preferred energy pathway to respond to stress. Fresh PBMCs are readily available in the clinical setting using standard phlebotomy. The entire assay described in this protocol can be completed in less than 4 hours without the involvement of complex biochemical techniques. Additionally, we describe a normalization method that is necessary for obtaining reproducible data. The simple procedure and normalization methods presented allow for repeated sample collection from the same patient and generation of reproducible data that can be compared between time points to evaluate potential treatment effects.

Our goal was to develop a practical protocol to evaluate mitochondrial dysfunction associated with fatigue in cancer patients. This innovative protocol is optimized for clinical use involving only standard phlebotomy and basic laboratory procedures.

Avaliando o papel da função mitocondrial em fadiga relacionadas ao câncer

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful immunotherapies. Several studies have indicated that tumor infiltrating myeloid cells (e.g., myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) and tumor-associated macrophages (TAMs)) suppress cytotoxicity of CD8+ T cells in the tumor microenvironment, and that targeting these regulatory myeloid cells can improve immunotherapies. Here, we present an in vitro assay system to evaluate immune suppressive effects of monocytic-MDSCs and TAMs on the tumor-killing ability of CD8+ T cells. To this end, we first cultured na&#239;ve splenic CD8+ T cells with anti-CD3/CD28 activating antibodies in the presence or absence of suppressor cells, and then co-cultured the pre-activated T cells with target cancer cells in the presence of a fluorogenic caspase-3 substrate. Fluorescence from the substrate in cancer cells was detected by real-time fluorescence microscopy as an indicator of T-cell induced tumor cell apoptosis. In this assay, we can successfully detect the increase of tumor cell apoptosis by CD8+ T cells and its suppression by pre-culture with TAMs or MDSCs. This functional assay is useful for investigating CD8+ T cell suppression mechanisms by regulatory myeloid cells and identifying druggable targets to overcome it via high throughput screening.

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

We describe here a protocol to investigate cytotoxicity of pre-activated CD8+ T cells against cancer cells by detecting apoptotic cancer cells via real-time microscopy. This protocol can investigate mechanisms behind myeloid cell-induced T cell suppression and evaluate compounds aimed at replenishing T cells via blockade of immune suppressive myeloid cells.

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

Ensaio in vitro para estudo do tumor-interação macrófago

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

Avaliando a capacidade de diferenciação das células epitelias da próstata do camundongo usando a cultura organóide

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic target analyses and drug response monitoring using patient derived xenografts (PDX). This strategy was validated using ovarian tumors as an example. The mate-pair next generation sequencing (MPseq) protocol was used to identify structural alterations and followed by analysis of potentially targetable alterations. Human tumors grown in immunocompromised mice were treated with drugs selected based on the genomic analyses. Results demonstrated a good correlation between the predicted and the observed responses in the PDX model. The presented approach can be used to test the efficacy of combination treatments and aid personalized treatment for patients with recurrent cancer, specifically in cases when standard therapy fails and there is a need to use drugs off label.

Here we present a protocol to test the efficacy of targeted therapies selected based on the genomic makeup of a tumor. The protocol describes identification and validation of structural DNA rearrangements, engraftment of patients&#8217; tumors into mice and testing responses to corresponding drugs.

Testando terapias-alvo em câncer usando análise estrutural de alteração de DNA e xenoenxertos derivados do paciente

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using supernatants from Lactobacillus fermentum cell culture, considered as probiotics cultures. The use of 3D cultures to test Lactobacillus cell-free supernatant (LCFS) are a better option than testing in 2D monolayers, especially as L. fermentum can produce anti-cancer effects within the gut. L. fermentum supernatant was identified to possess increased anti-proliferative effects against several colorectal cancer (CRC) cells in 3D culture conditions. Interestingly, these effects were strongly related to the culture model, demonstrating the notable ability of L. fermentum to induce cancer cell death. Stable spheroids were generated from diverse CRCs (colorectal cancer cells) using the protocol presented below. This protocol of generating 3D spheroid is time saving and cost effective. This system was developed to easily investigate the anti-cancer effects of LCFS in multiple types of CRC spheroids. As expected, CRC spheroids treated with LCFS strongly induced cell death during the experiment and expressed specific apoptosis molecular markers as analyzed by qRT-PCR, western blotting, and FACS analysis. Therefore, this method is valuable for exploring cell viability and evaluating the efficacy of anti-cancer drugs.

Here methods are presented to understand anti-cancer effects of Lactobacillus cell-free supernatant (LCFS). Colorectal cancer cell lines show cell deaths when treated with LCFS in 3D cultures. The process of generating spheroids can be optimized depending on the scaffold and the analysis methods presented are useful for evaluating the involved signaling pathways.

Avaliação da morte celular usando supernanato livre de células de probióticos em culturas esferoides tridimensionais de células cancerígenas colorretais

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage response induced by neutron-gamma mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT). Specifically, the proposed methodology is applied for the detection of repair proteins activation which can be visualized as foci using antibodies specific to DNA double-strand breaks (DNA-DSBs). DNA repair foci were assessed by immunofluorescence in colon cancer cells (HCT-116) after irradiation with the neutron-mixed beam. DNA-DSBs are the most genotoxic lesions and are repaired in mammalian cells by two major pathways: non-homologous end-joining pathway (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR). The frequencies of foci, immunochemically stained, for commonly used markers in radiobiology like &#947;-H2AX, 53BP1 are associated with DNA-DSB number and are considered as efficient and sensitive markers for monitoring the induction and repair of DNA-DSBs. It was established that &#947;-H2AX foci attract repair proteins, leading to a higher concentration of repair factors near a DSB. To monitor DNA damage at the cellular level, immunofluorescence analysis for the presence of DNA-PKcs representative repair protein foci from the NHEJ pathway and Rad52 from the HRR pathway was planned. We have developed and introduced a reliable immunofluorescence staining protocol for the detection of radiation-induced DNA damage response with antibodies specific for repair factors from NHEJ and HRR pathways and observed radiation-induced foci (RIF). The proposed methodology can be used for investigating repair protein that is highly activated in the case of neutron-mixed beam radiation, thereby indicating the dominance of the repair pathway.

Radiation-induced DNA damage response activated by neutron mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT) has not been fully established. This protocol provides a step-by-step procedure to detect radiation-induced foci (RIF) of repair proteins by immunofluorescence staining in human colon cancer cell lines after irradiation with the neutron-mixed beam.

Imagens de imunofluorescência de dna dano e reparo de focos em células cancerígenas de cólon humano

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.