Os autores desejam reconhecer Mark Rodgers para delinear os procedimentos de infecção e L. Eoin Carney e Brian Lopresti para orientação no estabelecimento desses procedimentos de imagem. Financiamento para este trabalho foi fornecido pela Fundação Bill e Melinda Gates (J.L.F., P.L.L.), National Institutes of Health, institutos nacional de alergia e AI111871 de R01 de doenças infecciosas (P.L.L.), nacional coração, pulmão e sangue Instituto R01 HL106804 (J . L.F.), R01 HL110811.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Dados adquiridos de PET/CT podem ser usados como medições de substituto para muitos aspectos da infecção por M. tuberculosis que seria não-observável sem tal tecnologia. PET/CT é muito mais sensível do que a tecnologia de raio x, que é frequentemente utilizada em estudos de macacos. PET/CT fornece informações estruturais, espaciais e funcionais. As análises descritas acima têm muitas aplicações práticas, tais como monitoramento de progressão da doença, avaliando a eficácia do tratamento da toxicodependência e prevê reativação6,10,11, fatores de risco 13.
Rastreando a propagação de granulomas e captação FDG das lesões individuais pode ser comparado entre controle e grupos experimentais não só fornecer a localização específica da infecção, mas também acompanhar a disseminação da doença25. Por exemplo, nos trabalhos de Coleman et al. descrevendo a infecção precoce em macacos cynomolgus, seguindo a progressão da infecção pode determinar se a infecção dentro de um animal vai permanecer ativo e agravar ou ser contido pelo sistema imunológico (ou seja, ILTB)11. Este é apenas um exemplo do poder que as imagens de PET/CT tem em estudar a progressão da doença em relação a granulomas. O mesmo método pode ser usado para estudar uma grande variedade de parâmetros experimentais ao longo do tempo. Por exemplo, enumeração de granulomas que estabelecem por infecção após 4 semanas pode fornecer uma medida de resultado poderoso para uma vacina, desde que as vacinas melhores iria impedir ou limitar o estabelecimento de granuloma seguindo o desafio. Outra medida de resultado para vacinas pode estar limitando a divulgação. Estas medidas de resultados quantificáveis fornecem importantes dados sem a necessidade de realizar necropsias precoce dos animais. Uma limitação de avaliação individuais granulomas é a sensibilidade do scanner CT; Visualizar granulomas &#60; 1 milímetro de tamanho, muitas vezes não é possível.
Avaliação de linfonodos mediastinais (MLNs) é importante quando estudar o M. tuberculosis infecção também. MLNs são importantes para a célula T escorva e o tráfico de células do sistema imune durante a infecção. No entanto, em quase todos os macacos, pelo menos e às vezes várias MLNs podem ser infectados. Assim, MLNs são um site adicional de persistência bacteriana durante ativo TB e ILTB e podem servir como um reservatório de bactérias, possivelmente contribuindo para reativação26,27. Em casos de grave envolvimento MLN, vias aéreas podem ser compactadas. Grandes MLNs necróticos podem corroer em vias aéreas, levando à disseminação da infecção. Analisar dados de PET/CT em gânglios linfáticos é mais complexo que granulomas porque os componentes estruturais de nós não são facilmente visíveis na tomografia computadorizada. Além disso, somente os linfonodos que são metabolicamente ativos podem ser analisados devido a captação FDG. Por causa disso, ao analisar a quente dos gânglios linfáticos, é importante assegurar que a imagem da PET é dimensionada para a mesma escala de intensidade máxima e mínima para cada análise de imagem garantir a consistência. Uma vez que eles podem ser grandes estruturas, o centro necrótico pode ser negativo para a avidez FDG e assim avidez FDG pode aparecer para ser reduzido ao longo do tempo, mesmo quando doença está aumentando nos MLNs.
Pulmonar total avidez FDG representa a total inflamação dentro dos pulmões. A quantidade de inflamação pulmonar é uma indicação da severidade da doença e está correlacionada com carga bacteriana6,10,28 , portanto, nesse quantitativa e avaliação objectiva tem inúmeras aplicações. Para medir a avidez FDG total, todos os voxels dentro de uma imagem de PET que mostram um SUV de maior de 2.3 são combinados em um único volume de interesse (VOI) e o valor total de SUV da VOI todo é o valor final da avidez. Este valor foi selecionado a partir da literatura que comparou valores SUV de captação FDG em tumores de pulmão para várias patologias infecciosas em humanos24. É importante notar que este valor total de avidez FDG é limitado somente à doença no espaço pulmão e todos FDG captação doença não-relacionada ou localizada em estreita proximidade com os pulmões não deve ser considerada. Além disso, o pulmão total avidez FDG não inclui MLNs. Enquanto a avidez de granulomas individuais e linfonodos nos permite ver a variabilidade dos resultados TB dentro do host, avidez FDG do pulmão total é integral para avaliar o host como um todo. Esses métodos também funcionam como ferramentas analíticas para medir a resposta de droga para doença TB. Trabalho anterior demonstrou-se que o tratamento de drogas TB pode reduzir o tamanho e a avidez FDG de granulomas individuais ao longo do tempo12 e essas mudanças foram associadas com reduzida carga bacteriana. Mudanças na inflamação no curso completo de regimes da droga também podem ser usadas para avaliar a eficácia da droga ou falha.
Devido à natureza altamente detalhada desses procedimentos, uma quantidade razoável de solução de problemas pode ser necessária a fim de obter os dados mais consistentes durante os estudos. É o objetivo deste trabalho para delinear os procedimentos para habilitar os indivíduos em todo o mundo a usar estas técnicas, enquanto mantendo em mente que precisa atenção aos detalhes é essencial. Avaliar imagens de pessoas devem ser bastante familiarizadas com a anatomia e fisiologia para reconhecer a anormalidade dentro exames particulares. Leitores de imagem precisam reconhecer a captação de sonda não-normal, por todo o corpo, porque TB pode se espalhar além da cavidade torácica. Além disso, PET e CT registro em imagem não é um processo perfeito e podem ocorrer desvios ocasionais no registo da imagem; Reconhecendo isso pode ser extremamente importante ao avaliar características de doença muito pequeno (ou seja, granulomas de 1-2 mm). Uma verificação de pré-infecção pode ser particularmente útil como um comparador para identificar o pulmão normal (e outros órgãos) estruturas e padrões do animal de estimação e reconhecer aqueles que são novos ou alterados após a infecção. Outro componente importante para esta análise é a medida de fundo. Todos os dados de PET são normalizados para captação muscular como base fisiológica como captação FDG é baseada no metabolismo. Uma combinação de músculos romboide e serratus nas costas são usados para medições de fundo devido à proximidade com a cavidade torácica e consistência relativa na captação de FDG em jejuados animais. No caso de M. tuberculose -infectados macacos, é preferível usar outro órgão, tais como o fígado, para medições de fundo como M. tuberculosis pode infectar o fígado e o metabolismo do fígado pode ser afetado durante o tratamento de animais com vários fármacos anti-TB. Tomar os fatores acima em conta, bem como assegurar que todas as imagem regiões de interesse é salvos no final de análise deve produzir resultados altamente reprodutíveis.
classe = "jove_content" &gt; em resumo, PET/CT oferece um único e poderoso método para investigar a infecção de M. tuberculosis em primatas não-humanos, fornecendo medidas de resultados quantitativos relacionados à infecção inicial, divulgação, e carga bacteriana. Isto permite acompanhamento os variáveis resultados da infecção em animais individuais sem a necessidade de necropsias em vários pontos de tempo, assim, economizando recursos e reduzindo o uso de animais. Esta tecnologia é traduzível diretamente aos seres humanos, como PET/CT tem sido utilizado em diversos estudos para avaliar o tratamento medicamentoso em TB, bem como ILTB em HIV - e HIV + temas10,29,30,31. Finalmente, esta tecnologia e ferramenta quantitativa para analisar dados de PET/CT são susceptíveis de serem úteis no futuro para estudos de eficácia da vacina e provavelmente podem ser usados como um modelo para análise de outras doenças infecciosas em modelos animais e seres humanos.

Mycobacterium tuberculosis tem atormentado os humanos por milênios e provoca mortalidade mais do que qualquer outro agente infeccioso único no mundo de hoje. Em 2015, foram relatados 10,5 milhões de novos casos de tuberculose (TB) globalmente1 com a maioria dos casos provenientes da Índia, Indonésia, China, Nigéria, Paquistão e África do Sul. Estimativas coloca o número de mortes global de TB em 1,4 milhões de pessoas durante o mesmo período de tempo. Esse valor é quase 25% menor que a taxa de morte há mais de 100 anos. Embora sensível TB drogas é tratável, o regime é moroso que requer múltiplos medicamentos e conformidade é uma preocupação. O surgimento de multi, cepas resistentes (MDR) contabilizados ~ 580.000 dos novos casos de TB em 2015. A taxa de sucesso do tratamento de pacientes com cepas MDR de M. tuberculosis é apenas estimada em cerca de 50%. Ainda mais alarmante é o surgimento de extensivamente resistente (XDR) cepas de M. tuberculosis, que são resistentes a quase todas as drogas disponíveis. Assim, novas técnicas são necessárias dentro do campo de pesquisa de TB que melhoram a capacidade de diagnosticar a TB, aumentar a compreensão imunológica do processo de doença e permitir a seleção de novos tratamentos e estratégias de prevenção, incluindo o antibiótico regimes e estudos de eficácia da vacina.
M. tuberculosis é um bacilo ácido-álcool resistentes aeróbio que fisicamente se caracteriza por sua parede de pilha exterior muito complexa e cinética de crescimento lento. A infecção geralmente ocorre através da inalação de bactérias individuais contidos em aerossol gotículas que são expelidas de um indivíduo infectado, sintomático, enquanto tosse, espirro ou cantar. Dos indivíduos expostos que desenvolvem a infecção, apenas 5-10% das pessoas desenvolvem TB clínico ativo. Os restantes 90% têm um espectro variando de infecções assintomáticas que varia de infecção subclínica a nenhuma doença, que é classificada clinicamente como latente TB infecção (ILTB)2,3. Da população que tenha esta infecção assintomática, aproximadamente 10% desenvolverão ativo TB por reativação da infecção contida em sua vida. O risco de reativação dramaticamente aumenta se uma pessoa com infecção assintomática contratos HIV ou são submetidas a tratamento com uma droga imunossupressora, tais como inibidores TNF a4,5,6. Doença de TB ativa apresenta-se também como um espectro, com a maioria das pessoas com tuberculose pulmonar, que afeta os pulmões e linfonodos torácicos. No entanto, o M. tuberculosis pode infectar qualquer órgão, para que a infecção também pode apresentar em sites extrapulmonar de envolvimento.
A marca patológica da infecção por M. tuberculosis é uma estrutura esférica organizada das células do hospedeiro, chamado o granuloma. Macrófagos, células T e células B são os principais componentes da granuloma, com um número variável de neutrófilos7. O centro da granuloma é muitas vezes necrótico. Assim, granulomas funcionam como um microambiente imune para matar ou contêm bacilos, impedindo a propagação para outras partes do pulmão. No entanto, M. tuberculosis pode subverter matar o granuloma e mantidas dentro destas estruturas por décadas. Monitoramento consistente e regular para o desenvolvimento da doença de TB ativa após nova infecção ou reativação da ILTB é impraticável, cientificamente desafiador e demorado. Técnicas que estudar estes processos longitudinalmente, em humanos e modelos animais parecidos com os humanos, são extremamente úteis para a comunidade científica em promover a compreensão das complexidades muitos do M. tuberculosis infecção e doença.
PET/CT é uma técnica de imagem extremamente útil que tem sido empregada para estudar uma vasta gama de Estados de doença em seres humanos e modelos animais8. Animal de estimação é uma técnica funcional que usa compostos radioativos emissores de pósitrons como repórter. Esses radioisótopos são normalmente acrescidos de um composto metabólico, como a glicose, ou a um grupo alvo que é projetado para ligar a um receptor de interesse. Uma vez que a radiação emitida a partir de isótopos de PET é poderosa o suficiente para penetrar o tecido, concentrações muito baixas podem ser usadas que permite estudo abaixo dos níveis de saturação em compostos do receptor-alvo e em concentrações baixas o suficiente para ter nenhum impacto sobre o metabolismo processos quando usando agentes como 2-deoxy - 2-(18F) Fluoro-D-glicose (FDG). CT é uma técnica de imagem tridimensional, raio-x que usa diferentes níveis de atenuação de raios-x para identificar as características físicas dos órgãos dentro do corpo9. Quando emparelhado com PET, CT é usado como um mapa para determinar os locais específicos e estruturas que mostram a absorção de um radiotracer PET. PET/CT é uma poderosa ferramenta para a imagem latente na vivo de seres humanos e modelos animais infectados com M. tuberculosis infecção que levou a muitos insights importantes sobre patogênese, resposta ao tratamento medicamentoso, o espectro da doença, etc6 ,10,11,12. Este trabalho descreve métodos analíticos específicos do PET/CT para estudar TB em modelos de primatas não humanos no sentido longitudinal, utilizando parâmetros como tamanho de granuloma, captação FDG em lesões individuais, toda avidez FDG pulmonar e do nó de linfa e detecção de extrapulmonar doença6,10,11,12.
Este manuscrito descreve metodologias de análise em primatas não-humanos (NHPs), especificamente macacos cynomolgus, que são usados para avaliar longitudinalmente a progressão da doença e o tratamento medicamentoso após infecção com M. tuberculosis de imagem . NHPs são um modelo animal valioso porque quando inoculado com uma dose baixa de M. tuberculosis Erdman estirpe, animais mostram uma variedade de resultados de doença com ~ 50% desenvolvimento de TB ativa e os restantes animais tendo infecção assintomática (ou seja, controlar a infecção, ILTB), fornecendo o modelo mais próximo para o espectro clínico da doença visto nos seres humanos3,13,14,15,16. Reativação da ILTB em macacos é desencadeada pelos mesmos agentes que causam a reativação nos seres humanos, que são exemplos de vírus de imunodeficiência humana (HIV, usando o vírus da imunodeficiência símia (SIV) como a versão de macaca do HIV), depleção de CD4 ou tumor fator de necrose de13,de neutralização (TNF)16. Além disso, os macacos os apresentam com patologia que é extremamente semelhante ao observado em seres humanos, incluindo os granulomas organizados que se formam nos pulmões ou outros órgãos17. Assim, este modelo forneceu insights importantes sobre as interações patógeno-hospedeiro básica em infecção de M. tuberculosis , bem como conhecimentos valiosos sobre regimes de drogas e vacinas para a tuberculose14,18 , 19 , 20 , 21.
Imagens de PET/CT fornece a habilidade de seguir a aparência, distribuição e progressão de granulomas individuais. Este trabalho utilizou principalmente FDG como uma sonda, que, como um análogo da glicose, incorpora em células hospedeiras metabolicamente ativas, como macrófagos, neutrófilos e linfócitos8, todos os quais estão em granulomas. Assim, o FDG é um proxy para a inflamação do anfitrião. Os procedimentos de análise detalhados neste documento usa OsiriX, um visualizador DICOM amplamente usado disponível para compra e uso. Os métodos de análise de imagem descritos rastrear a forma, tamanho e atividade metabólica (através de captação FDG) de granulomas individuais ao longo do tempo e usa a imagem como um mapa para identificar lesões específicas sobre necropsia animal. Além disso, um método separado foi desenvolvido que quantifica o somatório de captação FDG no pulmão acima de um limite específico (SUV ≥ 2.3) e usa esse valor para avaliar as diferenças entre controle e grupos experimentais em estudos variando de vacina ensaios de modelos de co-infecção. Estes dados suportam que esta medida global de captação FDG em pulmões está correlacionada com a carga bacteriana, proporcionando informações sobre o status de doença. Análises semelhantes podem ser executadas na captação FDG dos linfonodos torácicos para estudar a progressão da doença também. O protocolo seguinte descreve o processo experimental de infecção animal através da análise de imagem.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>23061</td>
			<td>Henry Schein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telazol</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>4866</td>
			<td>Henry Schein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetacaine</td>
			<td>Patterson Vet Generics</td>
			<td>07-892-6862</td>
			<td>Patterson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>07-800-9721</td>
			<td>Patterson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H11 agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>283810</td>
			<td>BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV catheter</td>
			<td>Surflash</td>
			<td>07-806-7659</td>
			<td>Patterson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18F-FDG</td>
			<td>Zevacor</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotracheal tube</td>
			<td>Jorgensen Labs Inc</td>
			<td>07-887-0284</td>
			<td>Patterson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears</td>
			<td>Patterson Vet Generics</td>
			<td>07-888-1663</td>
			<td>Patterson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>07-806-3204</td>
			<td>Patterson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurologica Ceretom CT</td>
			<td>Samsung Neurologica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siemens Focus 220 microPET</td>
			<td>Siemens Molecular Imaging Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inveon Research Software</td>
			<td>Siemens Molecular Imaging Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsiriX</td>
			<td>Pixmeo</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of 18fdg pet/ct imaging as a tool for studying mycobacterium tuberculosis infection and treatment in non-human primates

Mycobacterium tuberculosis continua a ser o número um agente infeccioso no mundo hoje. Com o surgimento de cepas resistentes aos antibióticos, novos métodos clinicamente relevantes são necessários que avaliam o processo da doença e tela para tratamentos potenciais de antibiótico e vacina. A tomografia por emissão de pósitrons/Computed Tomography (PET/CT) foi estabelecida como uma valiosa ferramenta para o estudo de uma série de doenças como câncer, doença de Alzheimer e inflamação/infecção. Descritas aqui são um número de estratégias que têm sido empregadas para avaliar imagens de PET/CT em macacos cynomolgus intrabronchially infectados com baixas doses de M. tuberculosis. Através da avaliação do tamanho da lesão no CT e absorção de 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) em lesões e nódulos linfáticos nas imagens de PET, estes métodos descritos mostram que as imagens de PET/CT podem prever desenvolvimento futuro de ativo contra doença latente e o propensão para a reativação do estado latente da infecção. Além disso, ao analisar o nível global de inflamação pulmonar, esses métodos determinam eficácia antibiótica medicamentos contra M. tuberculosis no modelo animal mais clinicamente relevante existente. Esses métodos de análise de imagem são algumas das ferramentas mais poderosas do arsenal contra esta doença, que não só eles podem avaliar uma série de características de infecção e tratamento medicamentoso, mas eles também são traduzíveis diretamente para um ambiente clínico para uso em humanos estudos.

Identificação e análise das lesões individuais
Granulomas individuais podem ser visualizadas por número, tamanho e captação FDG qualitativamente compreender o escopo geral do processo de infecção (Figura 1). Usando essas imagens, contar granulomas ao longo do tempo é uma medida quantitativa da doença se espalhar. A Figura 2 mostra contagens de granuloma individuais ao longo do tempo em um grupo de 10 animais. Dos 10 animais, três desenvolveram a doença ativa e seis desenvolveram infecção latente. Um animal mostrou nenhum sinal de doença ativa, mas ocasionalmente era cultura positiva (em gástrico aspirado e/ou lavado broncoalveolar amostras de lavagem) para M. tuberculosis, colocando-o dentro do espectro da doença entre ativo e latente e assim foi removido a partir da análise para esta experiência particular. Dos três animais com a doença ativa, um animal desenvolvido doença miliar por pós-infecção 12 semanas e foi sacrificado (isto é identificado na Figura 2 como TNTC [demasiado numerosas para Count]). De 6 semanas após a infecção e, posteriormente, os animais que mais tarde iria desenvolver a doença activa mostrou estatisticamente maiores números de granulomas que os animais que se desenvolverá infecção latente.
Para melhor caracterizar e distinguir granulomas entre animais ativos e latentes, lesões individuais nos PET scans foram analisadas para determinar se havia uma diferença no padrão de captação FDG entre os dois grupos. Em todos os animais de infecção ativa, houve um aumento na captação de FDG em cada granuloma de três a seis semanas pós infecção (Figura 3A). Por outro lado, granulomas em animais que desenvolveram infecção latente mostraram uma variação na captação de FDG com algumas lesões, aumentando, diminuindo ou mostrando a mesma absorção de três a seis semanas (Figura 3B). Estes resultados são comparados em grupos, mostrando a diferença na mudança entre animais latentes e ativos em três semanas vs seis semanas (Figura 3) e três semanas vs 24 semanas (Figura 3D). Em ambos os casos, os granulomas de animais ativos mostraram uma mudança positiva e significativamente diferente no SUV (dentro de cada animal (Figura 3A e 3B) e quando comparado por grupos de animais (Figura 3 e 3D).
Analisando a captação FDG em linfonodos "Quente"
Como linfonodos mediastinais não são facilmente visualizados na tomografia computadorizada a menos que grandemente ampliado, imagens PET devem ser usadas para identificar estes tecidos doentes. Ao analisar os gânglios linfáticos, é essencial que a imagem é dimensionada sempre para a mesma escala de PET de máximo e mínima para manter a consistência durante todo o processo. Ao comparar os MLNs de animais que desenvolveram doença ativa ou latente, Lin et al demonstraram, através de análise ROI de MLNs que, enquanto a captação FDG em linfonodos foram semelhantes entre animais ativos e latentes em 3 semanas, MLNs de animais ativos mostrou significativamente maior absorção em 6 semanas11. As diferenças foram vistas em maior grau em 8 e 12 semanas (Figura 4). Assim, dados de PET/CT podem ser utilizados para avaliar diferenças significativas nos nódulos linfáticos, além de estudar granulomas em animais infectados.
Total de pulmão FDG avidez
Como um exemplo do poder da avaliação pulmonar total avidez FDG, Lin et al mostrou que inflamação pulmonar elevada em animais clinicamente classificada como ILTB se correlaciona com o risco de reativação6. Neste estudo, macacos cynomolgus de ILTB (infectados com baixas doses de M. tuberculosis) eram PET/CT fotografada (pós-infecção de 6 meses) antes da neutralização do fator de necrose tumoral (TNF) para avaliar o espectro de lesões, visto em ILTB clinicamente definida e Determine o risco de reativação. Animais com pulmão total maior avidez FDG eram mais propensos a reativar (Figura 5). Mais de 90% dos animais com mais de 103 pulmão avidez FDG ou com visível (por varredura) pelo menos um site extrapulmonar de infecção reativado após neutralização de TNF. Apenas um animal que não reativar ultrapassado este limiar de avidez FDG pulmonar total. Assim, parâmetros de PET/CT podem ser uma poderosa ferramenta para prever o resultado clínico, embora os parâmetros específicos devem ser identificados cientificamente.
Como um exemplo para mostrar a utilidade em cenários de tratamento de drogas, Coleman et al realizaram um estudo oxazolidinones de testes em humanos e cynomolgus macacos onde o pulmão total avidez FDG foi medido pré-tratamento e um e dois meses pós-tratamento10. Dobre as alterações foram calculadas para mostrar resposta drogas um mês (figura 6A) e dois meses pós-tratamento (Figura 6B). Em ambos os pontos de tempo, controle animais apresentaram significativamente maior avidez FDG no espaço inteiro de pulmão do que os animais tratados com drogas. Em todos os animais tratados com drogas, inflamação pulmonar total diminuíram durante o regime de tratamento de dois meses, enquanto na maioria dos animais controle, total de inflamação pulmonar aumentou ao longo do tempo ou foi inalterado.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56375/56375fig1.jpg"> 
Figura 1. Serial de FDG PET-CT imagens mostrando uma divulgação e padrão estável de Granuloma evolução durante o curso da infecção precoce. (Linha superior) Granulomas primários (setas brancas) primeiro estabeleceram-se na pós-infecção 3 semanas, enquanto granulomas novos desenvolveram adjacentes às lesões existentes (setas verdes) ou em novos sites (setas amarelas). Animais que mais tarde iria desenvolver TB ativo desenvolveram mais lesões durante o curso da infecção. (Linha inferior) Granulomas primários (setas brancas) de animais latentes geralmente manteve-se estável, com poucos granulomas novos desenvolvimento através do curso da infecção. WKS PI, pós-infecção semanas. Figura tirada Coleman et al.11 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56375/56375fig1large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56375/56375fig2v2.jpg"> 
Figura 2. Dados do representante da retratando a mediana e intervalo de Granuloma contando do CT Scans comparando animais com infecção activa (símbolos vermelhos) para infecção latente(Símbolos verdes). Animais de infecção activa tinham granulomas mais do que animais infectados Latentemente tão cedo quanto infecção após seis semanas. P &#60; 0.05 (*) pelo teste de Mann-Whitney. PI, pós-infecção semanas de semanas. TNTC, numerosos demais para contar. Figura adaptada de Coleman et al.11 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56375/56375fig2v2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56375/56375fig3.jpg"> 
Figura 3. Utilização de análise de ROI em PET imagens para mostrar esse metabólica atividade de pulmão Granulomas difere entre ativo e Latentemente infectadas animais durante a infecção precoce. Granulomas individuais em animais ativos [A] tem um aumento significativo na atividade metabólica (medido como o valor padrão de absorção normalizado para captação muscular [SUVCMR]) entre 3 e 6 semanas após infecção enquanto Latentemente infectadas animais [B] fazer não. A mudança na atividade metabólica em lesões entre animais latentes e ativas como grupos foram comparados no 3 vs 6 semanas [C] e 3 vs 24 semanas [D], mostrando que os animais infectados ativamente (quadrados vermelhos) tem variar significativamente maior na captação do que latente animais (círculos verdes) em ambos os pontos de tempo. Linhas sólidas pretas representam a mediana. O teste de Wilcoxon rank-soma foi usado para analisar dados em painéis A e B. Para os painéis C e D, os valores foram analisados pelo teste de Mann-Whitney. P &#60; 0,0001 (*) para todos os painéis. Figura adaptada de Coleman et al.11 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56375/56375fig3large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56375/56375fig4.jpg"> 
Figura 4. Análise ROI de PET imagens para mostrar as diferenças na captação de FDG em linfonodos mediastinais entre animais com a doença ativa (quadrados vermelhos) e doença latente (círculos verdes). Absorção foi maior nos animais infectados ativamente na 6, 8 e 12 semanas pós infecção. Cada ponto representa um nó de linfa individual. Linhas sólidas pretas representam a mediana. P &#60; 0.05 (*), P &#60; 0,01 (*) e P &#60; 0.001 (*) pelo teste de Mann-Whitney. Figura adaptada de Coleman et al.11 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56375/56375fig4large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56375/56375fig5.jpg"> 
Figura 5. Análise ROI de pulmão Total FDG avidez medições em seis meses pós infecção destacando diferenças na captação de FDG em animais susceptíveis de reativação de infecção latente (rosa quadrados) em comparação com animais que permanecem latentes (círculos verdes). Três dos quatro animais "reativado" que se encontram abaixo da linha pontilhada tinham doença extrapulmonar antes da neutralização de TNF (fator de necrose tumoral). Cada ponto representa um animal. Linha pontilhada representa o valor limite para o risco provável de reativação. Linhas sólidas pretas representam a mediana. P &#60; 0,01 (*) de Mann-Whitney Test. Data adaptado de Lin et al.6 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56375/56375fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56375/56375fig6.jpg"> 
Figura 6. Representante Total pulmonar FDG avidez ROI medições destacando total mudam na inflamação medida nos pulmões comparando não tratados (círculos vermelhos) e linezolida tratados macacos (círculos azuis). Avidez FDG foi medido antes do tratamento linezolida (30 mg/kg diariamente) e a mudança de dobra na captação de FDG total foi medida em 1 mês [A] e 2 meses [B] pós tratamento. Cada macaco é representado por um círculo individual. Linhas sólidas pretas representam a mediana. P &#60; 0,01 (*) por Mann-Whitney Test. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56375/56375fig6large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever a análise de imagem de 18F-FDG PET-CT em primatas não-humanos que foram infectados com M. tuberculosis para estudar o processo da doença, tratamento medicamentoso e reativação da doença.

Análise de 18FDG PET-CT Imaging como uma ferramenta para estudar infecção por Mycobacterium tuberculosis e tratamento em primatas não-humanos

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

analysis-18fdg-petct-imaging-as-tool-for-studying-mycobacterium

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

18.7K visualizações.  University of Pittsburgh School of Medicine. Aqui, apresentamos um protocolo para descrever a análise de imagem de 18F-FDG PET-CT em primatas não-humanos que foram infectados com M. tuberculosis para estudar o processo da doença, tratamento medicamentoso e reativação da doença.

Vídeo: Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Imunologia e Infecção

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Preparação de amostras de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extractos para Estudos Nucleares metabolômica Ressonância Magnética

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Demonstrando um multi-resistente<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Ampliação Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Um modelo de tecido Pulmão humano 3D para estudos funcionais em<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infecção

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

Murino Linfócitos Rotulagem por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antibody Receptor Segmentação para<em&gt; In Vivo</em&gt; Tráfico celular por PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Mycobacterium tuberculosis em camundongos com fluorescência de enzima do repórter de imagem

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

Uso do invertebrado Galleria mellonella como modelo de infecção para estudo do complexo Mycobacterium tuberculosis

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...