Os autores reconhecem pesquisa financiamento de um subsídio de descoberta do NSERC (#05573) e a Fundação do Canadá para a inovação (#222084) para financiamento na vivo micro-CT. W.E. Ward é uma cadeira de pesquisa do Canadá em osso e desenvolvimento muscular.

Este estudo foi aprovado pelo Animal conta Comissão de Brock University e conduzido de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Conselho canadense de cuidado Animal 21.
1. anestesia usando gás de isoflurano
<ol><li>Pre-encha a câmara de incubação de vidro acrílico com qualidade O2 a uma taxa de fluxo contínuo de cerca de 1-2 L/min de uma máquina de anestésica (complementar a Figura 1).</li>
	<li>Transferir o rato com a cauda de câmara de incubação primeiro e feche a tampa de câmara de incubação para criar um selo hermético.</li>
	<li>Comece a encher a câmara de incubação com isoflurano veterinária-série em 3-4% v/v dissolvido em O2 a uma taxa de fluxo contínuo de 1-2 L/min (complementar a Figura 1). Cuidado: Gases anestésicos de resíduos podem afetar adversamente a manipuladores. Um sistema de limpador (ou seja, um filtro de carvão ou diretamente em uma capa das emanações de gases de escape) deve estar sempre no lugar.</li>
	<li>Quando o rato não é mais capaz de suportar, transferir o rato para uma máscara facial ou cone de nariz receberam isoflurano 1-3% dissolvido em O2 com um caudal de 1-2 L/min. ratos principalmente respirar através de seu nariz e assim, enquanto o nariz é coberto pela máscara facial ou nariz cone, haverá entrega de anestesia suficiente.</li>
	<li>Aplica oftálmica lubrificação para as delicadas membranas dos olhos para protegê-los de qualquer gás de escape de isoflurano. Nota: Verifique se a lubrificação oftálmica está sem antibiótico, como isso pode afetar os resultados de uma intervenção.</li>
	<li>Medir palpebral (olho piscando de resposta à estimulação suave da abertura palpebral) e pedal reflexos (retirada das patas em resposta a beliscar); com o aumento da profundidade da anestesia, reflexo palpebral irá estar ausente antes de pedalar reflexos (complementar Figura 2).</li>
	<li>Quando é atingido um nível adequado de anestesia e o rato perdeu reflexos palpebrais e pedais, manter o rato em 0,5-2% de isoflurano dissolvido em O2 com um caudal de 1-2 L/min.</li>
	<li>Monitore continuamente a taxa de respiração do rato ao longo do processo, mantendo uma constante visual no rato diretamente com um sistema de monitoramento interno ou através do live-vídeo alimentar (complementar a Figura 3).</li>
</ol>2. posicionamento e contenção do membro Hind rato
<ol><li>Coloque o rato em posição supina no scanner de fibra de carbono (complementar a Figura 4).</li>
	<li>Conter o pé direito em um maleável, espuma de tubo, com os dedos, estendendo-se fora da extremidade do tubo. Aplica cera dental para segurar o pé firmemente dentro da espuma e fita o tubo fechado hermeticamente. Certifique-se que o diâmetro do tubo segurando o pé é suficiente para se encaixar firmemente o tubo plástico.</li>
	<li>Introduza o tubo plástico do scanner de raios-x (complementar a Figura 5).</li>
	<li>Estenda o membro posterior de ratos até é tenso. Não excesso estenda a perna para que não provoquem nenhum dano para o rato (complementar a Figura 5) como isto pode induzir movimento involuntário dos membros devido a respiração com dificuldade.</li>
	<li>Puxe a perna esquerda (não-verificado o membro posterior) juntamente com a cauda fora do campo de visão digitalização e para o torso, longe da perna estendida a ser digitalizado.</li>
	<li>Segura a perna esquerda (não-verificado o membro posterior) e a cauda na posição usando fita adesiva. Não use nada mais ou menos pegajosa (i.e., fita adesiva ou fita de pintor) como estes materiais também irão prejudicar o rato quando eles são removidos (fita adesiva) ou não fornecer uma preensão forte o suficiente (fita de pintor) (complementar a Figura 6).</li>
	<li>Fixe o corpo do rato para a posição para os quadris, ombros e cabeça com a fita adesiva. Fixe a máscara facial ou cone de nariz para o rato (complementar a Figura 6). Nota: Borre o lado adesivo da fita adesiva para remover a sua capacidade de manter a pele do rato. Não borre as extremidades da fita adesiva para que podem ser firmemente preso à cama de digitalização.</li>
	<li>Embrulhe o rato em vet-filme para limitar a perda de calor (complementar a Figura 6). Nota: Quando sob anestesia geral, ratos perdem calor rapidamente devido a sua grande superfície de corpo peso ratio 19,20.</li>
	<li>Monitore continuamente a taxa de respiração do rato ao longo do processo, mantendo uma constante visual no rato (seja diretamente ou através de um vídeo ao vivo-alimentar). Nota: Aqui configurar leva 5 min, aquisição de varredura é dependente da configuração de aquisição e tempo de recuperação é de 60 minutos.</li>
	<li>Proceda para adquirir as imagens µCT. Nota: As especificações exatas para aquisição de varredura são específicas para cada scanner tipo, sistema de software e a pergunta de pesquisa específica, no entanto, várias publicações metodológicas existem em toda a literatura 1,2 , 9.</li>
</ol>3. recuperação da anestesia
<ol><li>Depois na vivo µCT digitalização for concluída, interromper o fluxo de isoflurano para o rato, mas manter um fluxo de 1-2 L/min de O2.</li>
	<li>Quando o rato recupera o controle motor (1-2 min), removê-lo do respirador e permitir que ele recupere individualmente em uma gaiola parcialmente colocada sobre uma almofada de aquecimento de uso geral em fogo baixo. Ratos são conhecidos para reduzir a temperatura corporal de 1 ° C, quando, sob anestesia geral19. Não abandone o rato até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Nota: A evidência anedótica de nosso grupo de pesquisa informa que imediatamente após a recuperação da anestesia de isoflurano, ratos começam a comer e por isso é importante ter seu alimento e água disponíveis para eles durante a recuperação. Embora temos observado esse comportamento, repetida anestesia geral não provoca um aumento significativo nos alimentos ingestão ou corpo peso 1,9.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Longo, A. B., Sacco, S. M., Salmon, P. L., Ward, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+use+of+micro-computed+tomography+does+not+alter+microarchitecture+of+the+proximal+tibia+in+sham+or+ovariectomized+sprague-dawley+rats.">Longitudinal use of micro-computed tomography does not alter microarchitecture of the proximal tibia in sham or ovariectomized sprague-dawley rats.</a> Calcif Tissue Int. 98 (6), 631-641 (2016).</li><li>Sacco, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+irradiation+from+micro-computed+tomography+scanning+at+2,+4+and+6+months+of+age+does+not+induce+damage+to+tibial+bone+microstructure+in+male+and+female+CD-1+mice.">Repeated irradiation from micro-computed tomography scanning at 2, 4 and 6 months of age does not induce damage to tibial bone microstructure in male and female CD-1 mice.</a> Bonekey Rep. 6, 855 (2017).</li><li>Waarsing, J. H., Day, J. S., Verhaar, J. A., Ederveen, A. G., Weinans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+loss+dynamics+result+in+trabecular+alignment+in+aging+and+ovariectomized+rats.">Bone loss dynamics result in trabecular alignment in aging and ovariectomized rats.</a> J Orthop Res. 24 (5), 926-935 (2006).</li><li>Klinck, R. J., Campbell, G. M., Boyd, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+effects+on+bone+architecture+in+mice+and+rats+resulting+from+in+vivo+micro-computed+tomography+scanning.">Radiation effects on bone architecture in mice and rats resulting from in vivo micro-computed tomography scanning.</a> Med Eng Phys. 30 (7), 888-895 (2008).</li><li>Laperre, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+micro-CT+protocols+for+in+vivo+follow-up+of+mouse+bone+architecture+without+major+radiation+side+effects.">Development of micro-CT protocols for in vivo follow-up of mouse bone architecture without major radiation side effects.</a> Bone. 49 (4), 613-622 (2011).</li><li>Brouwers, J. E., van Rietbergen, B., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+effects+of+in+vivo+micro-CT+radiation+on+structural+parameters+and+bone+marrow+cells+in+proximal+tibia+of+wistar+rats+detected+after+eight+weekly+scans.">No effects of in vivo micro-CT radiation on structural parameters and bone marrow cells in proximal tibia of wistar rats detected after eight weekly scans.</a> J Orthop Res. 25 (10), 1325-1332 (2007).</li><li>Francisco, J. I., Yu, Y., Oliver, R. A., Walsh, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+age,+skeletal+site,+and+time+post-ovariectomy+on+bone+mineral+and+trabecular+microarchitecture+in+rats.">Relationship between age, skeletal site, and time post-ovariectomy on bone mineral and trabecular microarchitecture in rats.</a> J Orthop Res. 29 (2), 189-196 (2011).</li><li>Altman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+skeletal+growth,+modeling,+and+remodeling+by+in+vivo+micro+computed+tomography.">Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro computed tomography.</a> Bone. 81, 370-379 (2015).</li><li>Longo, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifelong+intake+of+flaxseed+or+menhaden+oil+to+provide+varying+n-6+to+n-3+PUFA+ratios+modulate+bone+microarchitecture+during+growth,+but+not+after+OVX+in+Sprague-Dawley+rats.">Lifelong intake of flaxseed or menhaden oil to provide varying n-6 to n-3 PUFA ratios modulate bone microarchitecture during growth, but not after OVX in Sprague-Dawley rats.</a> Mol Nutr Food Res. 61 (8), (2017).</li><li>Sacco, S. M., Saint, C., LeBlanc, P. J., Ward, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+consumption+of+hesperidin+and+naringin+flavanones+exerts+transient+effects+to+tibia+bone+structure+in+female+CD-1+offspring.">Maternal consumption of hesperidin and naringin flavanones exerts transient effects to tibia bone structure in female CD-1 offspring.</a> Nutrients. 9 (3), 250 (2017).</li><li>Campbell, G. M., Buie, H. R., Boyd, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signs+of+irreversible+architectural+changes+occur+early+in+the+development+of+experimental+osteoporosis+as+assessed+by+in+vivo+micro-CT.">Signs of irreversible architectural changes occur early in the development of experimental osteoporosis as assessed by in vivo micro-CT.</a> Osteoporos Int. 19 (10), 1409-1419 (2008).</li><li>De Schaepdrijver, L., Delille, P., Geys, H., Boehringer-Shahidi, C., Vanhove, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+longitudinal+micro-CT+study+of+bent+long+limb+bones+in+rat+offspring.">In vivo longitudinal micro-CT study of bent long limb bones in rat offspring.</a> Reprod Toxicol. 46, 91-97 (2014).</li><li>Perilli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+early+bone+changes+using+in+vivo+micro-CT+in+ovariectomized,+zoledronic+acid-treated,+and+sham-operated+rats.">Detecting early bone changes using in vivo micro-CT in ovariectomized, zoledronic acid-treated, and sham-operated rats.</a> Osteoporos Int. 21 (8), 1371-1382 (2010).</li><li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography.">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li><li>Li, H., Zhang, H., Tang, Z., Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-computed+tomography+for+small+animal+imaging:+Technological+details.">Micro-computed tomography for small animal imaging: Technological details.</a> Progress in Natural Science. 18 (5), 513-521 (2008).</li><li>Campbell, G. M., Sophocleous, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+bone+and+soft+tissue+by+micro-computed+tomography:+applications+to+ex+vivo+and+in+vivo+studies.">Quantitative analysis of bone and soft tissue by micro-computed tomography: applications to ex vivo and in vivo studies.</a> Bonekey Rep. 3, 564 (2014).</li><li>Meganck, J. A., Kozloff, K. M., Thornton, M. M., Broski, S. M., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+hardening+artifacts+in+micro-computed+tomography+scanning+can+be+reduced+by+X-ray+beam+filtration+and+the+resulting+images+can+be+used+to+accurately+measure+BMD.">Beam hardening artifacts in micro-computed tomography scanning can be reduced by X-ray beam filtration and the resulting images can be used to accurately measure BMD.</a> Bone. 45 (6), 1104-1116 (2009).</li><li>Vazquez, C. M., Molina, M. T., Ilundain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+rat+large+intestine+in+reducing+diarrhea+after+50%+or+80%+distal+small+bowel+resection.">Role of rat large intestine in reducing diarrhea after 50% or 80% distal small bowel resection.</a> Dig Dis Sci. 34 (11), 1713-1719 (1989).</li><li>Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+isoflurane,+ketamine-xylazine+and+a+combination+of+medetomidine,+midazolam+and+fentanyl+on+physiological+variables+continuously+measured+by+telemetry+in+Wistar+rats.">Effects of isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl on physiological variables continuously measured by telemetry in Wistar rats.</a> BMC Vet Res. 10, 198 (2014).</li><li>Schmitz, S., Tacke, S., Guth, B., Henke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+physiological+parameters+and+anaesthesia+specific+observations+during+isoflurane,+ketamine-xylazine+or+medetomidine-midazolam-fentanyl+anaesthesia+in+male+guinea+pigs.">Comparison of physiological parameters and anaesthesia specific observations during isoflurane, ketamine-xylazine or medetomidine-midazolam-fentanyl anaesthesia in male guinea pigs.</a> PLoS One. 11 (9), e0161258 (2016).</li><li>Stevens, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+toxicities+of+halothane,+isoflurane,+and+diethyl+ether+at+subanesthetic+concentrations+in+laboratory+animals.">Comparative toxicities of halothane, isoflurane, and diethyl ether at subanesthetic concentrations in laboratory animals.</a> Anesthesiology. 42 (4), 408-419 (1975).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo fornece os telespectadores com a primeira orientação detalhada para a anestesia adequada, colocação e retenção do rato durante na vivo µCT digitalização do membro hind. Essas diretrizes permitem que os utilizadores na vivo µCT sistemas de digitalização para obter alta resolução e imagens de alta qualidade da tíbia que pode ser processado para a quantificação da microarquitetura óssea 3-dimensional. Passos críticos no protocolo necessário para assegurar o correcto posicionamento e restrição envolvem a anestesia adequada de rato, bem como estendendo o membro posterior, longe de todas as outras estruturas críticas até é tenso, mas não em uma posição natural. Para resultados de imagem ideais, é imperativo que o rato ser anestesiada para um nível de relaxamento completo, e que reflexos palpebrais e pedais são perdidos. Além disso, deve abranger também a digitalização perna e o pé inteiro e tornozelo devem ser contidos em espuma. Os métodos descritos acima para obter um posicionamento da perna digitalização irão garantir que: 1) membros posteriores dos ratos dentro de um estudo são consistentemente orientados na mesma direção, permitindo assim que o feixe de raio-x para passar a mesma área de cada perna, pois ele gira ao redor da amostra; 2) movimento ambas voluntário e involuntário do membro hind não ocorrerá, assim, minimizando o potencial de artefatos de movimento interferir com a qualidade das imagens adquiridas; 3) obstruções de objetos (ou seja, a cauda) são impedidas, minimizando assim o potencial para efeitos de volume parcial produzir medidas imprecisas BMD e DTM. Estas orientações podem ser modificadas para cada rato individual, como a taxa de metabolismo de isoflurano e posicionamento pode variar dependendo da estirpe e corpo de tamanho 22. O mais comum na vivo varredura as máquinas é projetadas para pequenos modelos animais (ou seja, ratos, ratos, coelhos, porquinhos da Índia) e terá fases animais intercambiáveis para permitir a exploração de diferentes tamanhos de animais. Portanto, podem acomodar uma ampla gama de peso corporal.
Embora na vivo µCT digitalização licenças para o rato ser reposicionado e verificados novamente se as imagens que adquiriu a partir da digitalização inicial são de má qualidade, repetida digitalização irá expor o rato a doses adicionais de radiação e isoflurano anestesia para um período prolongado de tempo. Exposição de radiação repetidas mensal de 600 mGy focada para a tíbia de ratos durante quatro meses não causa efeitos adversos ao osso microarquitetura em comparação com o membro contralateral do posterior 1, mas isto não verificar a segurança de duas varreduras repetidas em sucessão imediata. Outras limitações da técnica descrita incluem a necessidade de estender o membro posterior tenso com forças aplicadas a ele para mantê-lo ainda, que podem invocar algumas mudanças na estrutura óssea. Enquanto a severidade da contenção do membro hind durante a digitalização vai depender de cada objectivo da investigação, estudos prévios do nosso laboratório envolvendo mensal repetidas na vivo µCT imagem de um membro posterior resultaram em uma diferença na cortical microarquitetura parâmetro, excentricidade, em comparação com o membro posterior contralateral que não passam por extensão repetida, estabilização e digitalização 1. Excentricidade é uma medida da forma elíptica do osso cortical e alterações em resposta a alterou a carga. Portanto, quando usar este método de posicionamento e de restrição do membro hind para repetidas na vivo µCT de imagem, consideração deve ser feita quando avaliar e interpretar alterações aos parâmetros de microarquitetura de carga.
Enquanto as orientações acima foram fornecidas para a geração de imagens e análise do tecido ósseo, pequenos ajustes no protocolo devem ser feitos quando a imagem de tecidos moles do membro hind. Especificamente, a maneira em que o membro posterior é estendido a partir do tronco e contido deve ser tomada em conta, como o atual procedimento deforma a orientação do tecido mole (músculo, tecido adiposo) em posicionamento anormal para a duração da verificação. Portanto, quando extrapolando este modelo para uso em imagens dos tecidos moles do membro hind, alguns ajustes devem ser feitos com a técnica de contenção para reduzir ou eliminar as alterações no posicionamento dos tecidos em relação um ao outro.
Além disso, as orientações foram escritas especificamente com base nas experiências do nosso grupo de pesquisa, no entanto, eles podem ser modificados para acomodar outros scanners µCT comercialmente disponíveis na vivo . Outros métodos sugeridos para posicionar e restringir o membro posterior podem estar disponíveis pelo fabricante do µCT na vivo , sistema de digitalização. Mais comercialmente disponível na vivo unidades µCT listam de poliestireno expandido, polipropileno e tubos plásticos com cera dental para segurar um saliente do pé como aceitáveis materiais e métodos para imobilizar a perna de digitalização. No entanto, o método apresentado neste protocolo fornecer mais controlado e consistente de posicionamento e contenção da perna digitalizada e, consistentemente produz imagens de alta qualidade. As diretrizes apresentadas no presente método requerem equipamento especializado necessário para a anestesia do rato, como um vaporizador, tubos, máscaras, câmaras de indução e oxigênio. Embora o equipamento esteja associado com um custo um pouco maior, em comparação com anestésicos injetáveis, permite que os pesquisadores a capacidade de rapidamente e precisamente induzir anestesia em profundidades específicas da consciência, que fornece uma vantagem sobre a alternativa métodos.
Usando as diretrizes descritas no presente método vídeo, pesquisadores utilizando tecnologias de alta resolução na vivo µCT para investigar a sua intervenção de interesse será capaz de corretamente e consistentemente orientar e conter um membro posterior de ratos para alta imagem de raio x de qualidade. Isso fornecerá um continuum em matéria de aquisição de imagens na vivo µCT e servir como um passo para otimizar a consistência e a precisão dentro de estudos e permitir comparações entre estudos na literatura. Da mesma forma, estes protocolos e métodos podem ser expandidos para uso em outras espécies de roedores, incluindo ratos, apesar de algumas mudanças serão necessárias 2,10. Por exemplo, o apoio do pé no tubo de espuma pode incluir o tornozelo para minimizar a possibilidade de movimento da perna durante a verificação. Além disso, o pé completo vai caber no suporte da espuma. Assim, os dedos não se estendem do final do titular como fazem ao fixar o pé de um rato. Além disso, o corpo do rato não exige a mesma contenção com fita como o rato. Um cone de nariz menor pode ser usado para a manutenção de anestesia em ratos durante a verificação. Se um cone de nariz menor não estiver disponível, podemos garantir uma luva de nitrilo sobre o cone de nariz disponível e faça uma pequena incisão no porta-luvas para proporcionar um espaço que pode caber o nariz do rato para fornecer anestesia, mantendo uma vedação em volta do nariz.
Enquanto a tíbia proximal é o site principal da investigação de alterações no rato da microestrutura óssea, orientações para o posicionamento adequado e consistente de outros sites esqueléticos como o fêmur e vértebras lombares devem ser investigadas e estabelecidas para consistência na literatura. No entanto, quando a realização de futuras pesquisas envolvendo a imagem das vértebras lombares, considerações devem ser feitas como imagem da coluna vertebral fornece a exposição à radiação para os tecidos e órgãos circundantes.

O uso de na vivo microtomografia computadorizada (µCT) é uma ferramenta poderosa, que envolve a imagem não-destrutiva de estruturas internas em alta resolução usando modelos de roedores. A natureza não-destrutiva de µCT na vivo permite múltiplas imagens de roedores a mesma ao longo do tempo. Esse recurso não só reduz o número total de roedores necessários em um projeto experimental e reduzindo a variação entre sujeitos que pode surgir, mas também permite que os pesquisadores a entender as respostas a longo prazo para uma intervenção. Com o uso repetido na vivo µCT, experimentos em camundongos e ratos têm elucidado alterações do desenvolvimento para microarquitetura nos ossos e ossos densidade mineral (BMD) ao longo de períodos de vida útil 1,2,3 ,4,5,6,7,8 , bem como a resposta da saúde óssea para intervenções como dieta 9,10, ovariectomia 7,11 e agentes farmacológicos 8,12,13. BMD e microarquitetura óssea em locais específicos do esqueletos, nomeadamente a tíbia proximal, fêmur e vértebras lombares, são indicativos da saúde óssea em geral e do risco de sustentar uma fratura e então são as principais medidas quando quantificando respostas para um intervenção.
Aquisição de imagens in vivo µCT envolve bidimensionais projeções de raios-x, sendo adquiridas em vários ângulos, como a fonte de raios-x e detector giram em torno do animal sob investigação 14,15. A qualidade da imagem resultante é dependente de muitos fatores, incluindo, mas não limitado a: selecionados parâmetros de aquisição (i.e., resolução espacial, raio-x tensão, amperagem, passo de rotação, filtro aplicado, tempo de exposição), limitações da µCT scanner (ou seja, baseada em scanner de artefatos como artefatos de anel ou poeira que causam efeitos de volume estrias ou parcial) e o posicionamento adequado e contenção do animal. Os dois antigos desses fatores podem ser manipulados em algum grau pelo usuário, dependendo da máquina de digitalização específico, objetivos do estudo e as correções necessárias para otimizar a função do scanner ou o processamento de imagens adquiridas. O último desses fatores, o posicionamento adequado do roedor antes da digitalização, é possível independentemente das scanner com base em limitações ou os parâmetros de aquisição que são selecionados para atingir um objectivo de estudo específico. Enquanto muitas publicações envolvendo na vivo de imagem foram publicadas na literatura 14,15,16,17, estilo clássico manuscrito é tal que detalhada "como" informações Não pode ser incluída. Portanto, o objetivo do presente artigo e o vídeo-guia é preencher esse vazio. Aqui nosso objetivo instruir os usuários de scanners de µCT na vivo como anestesiar um rato e a posição e a restringir o membro posterior para produzir imagens de alta qualidade que podem ser analisadas com mais precisão quantificar resultados da microarquitetura óssea.
Evitar obstruções do feixe de raios-x através de objetos que não sejam os membros traseiros são imperativas para quantificar o BMD mais precisa e os valores da microarquitetura óssea. Como os raios x passam através de objetos e tecidos de diferentes espessuras e densidades, alguns dos raios x são absorvidos (ou seja, atenuado) pelos materiais passam por. Desde que a densidade da massa medida de uma amostra é afetada pela sua espessura e a presença e espessuras dos tecidos circundantes, é imperativo que os espectros de calibração utilizados para determinar a densidade óssea mineral são verificados da mesma maneira. Portanto, se o feixe de raios-x é a passagem de objetos (ou seja, a cauda) antes ou depois de passar pela região de interesse, esses objetos irão absorver algumas das energias de raio-x e irão interferir com a transmissão de imagem adquirida. Além disso, estes exames seria muito difícil simular ao digitalizar os phantoms que devem se assemelham a exames de amostra. Como resultado, estas diferenças de atenuação levam a imprecisão na avaliação das medições de densidade óssea mineral do osso. Assim, para facilidade e precisão, recomenda-se limitar o número de obstáculos entre a fonte de raios-x, detector de interesse e raio-x da região.
Avaliação longitudinal da estrutura óssea de uma intervenção em modelos pré-clínicos envolvem a anestesia repetida do animal para limitar seus movimentos durante a verificação de protocolos. Existem vários métodos de anestesia geral para subjugar os animais submetidos a um exame µCT, incluindo anestesia injetável e inalantes 1,2,4,5,6, 12. ao contrário de inalantes anestésicos como o isoflurano, anestesia geral repetida usando anestésicos injetáveis causar uma redução no peso corporal, tolerância cirúrgica e mudanças significativas para outros parâmetros fisiológicos em roedores, especificamente ratos e cobaias, sugerir significativas contra-indicações de repetido uso 18,19,20. Enquanto o isoflurano é altamente volátil e permite a rápida indução e recuperação, agentes anestésicos injetáveis produzem níveis variados de anestesia e tempo sob anestesia varia de acordo com a cepa, sexo, composição corporal, estado de jejum e ciclo circadiano do animal. Anestésicos injetáveis também representam barreiras adicionais para seu uso como eles são altamente regulamentados pelos órgãos de direcção nacionais. Anestesia por inalação, no entanto, envolve a entrega direta no sistema respiratório; Este método permite para uma mais rápida indução e recuperação tempo e melhor controlam sobre o comprimento e a profundidade da anestesia19,20. Limitações para o método de anestesia por inalação envolvem sua exigência para vaporização de equipamentos especializados e algumas mudanças de frequência cardíaca e pressão arterial durante a indução, manutenção e recuperação 18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi Animal Health</td>
			<td>108737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer</td>
			<td>Dispomed</td>
			<td>990-1091-3SINEWA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scavengers/Charcoal Filters</td>
			<td>Dispomed</td>
			<td>985-1005-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-CT Scanner</td>
			<td>Bruker microCT</td>
			<td>SkyScan 1176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Kerr Dental Laboratory</td>
			<td>623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam (Backer Rod)</td>
			<td>Rona</td>
			<td>CF12086</td>
			<td>1&#8221;x10&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube</td>
			<td>Bruker microCT</td>
			<td>SP-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon-fiber bed</td>
			<td>Bruker microCT</td>
			<td>SP-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Wrap/Bandage</td>
			<td>Dura-Tech</td>
			<td>17473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Gel</td>
			<td>OptixCare</td>
			<td>006CLC-4256</td>
			<td>Antibiotic-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>000731-500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proper positioning and restraint of a rat hind limb for focused high resolution imaging of bone micro-architecture using in vivo micro-computed tomography

O uso de na vivo microtomografia computadorizada (µCT) é uma ferramenta poderosa, que envolve a imagem não-destrutiva de estruturas internas em alta resolução em modelos animais vivos. Isto permite imagens repetidas de roedores a mesma ao longo do tempo. Esse recurso não só reduz o número total de roedores necessários em um projeto experimental e reduzindo a variação entre sujeitos que pode surgir, mas também permite que os pesquisadores avaliar respostas longitudinais ou ao longo da vida para uma intervenção. Para adquirir imagens de alta qualidade que podem ser processadas e analisadas com mais precisão quantificar resultados da microarquitetura óssea, usuários de scanners de µCT na vivo devem corretamente anestesiar o rato e posição e restringir o membro posterior. Para fazer isso, é imperativo que o rato ser anestesiada para um nível de relaxamento completo, e que o pedais reflexos são perdidos. Estas orientações podem ser modificadas para cada rato individual, como a taxa de metabolismo de isoflurano pode variar dependendo do tamanho da estirpe e corpo. A técnica apropriada para aquisição de imagens na vivo µCT permite uma medição exata e consistente da microarquitetura do osso dentro e através de estudos.

Este método de anestesia para o rato e o posicionamento e a contenção do membro hind na vivo imagem µCT facilita a aquisição de alta qualidade imagens adequadas para a análise da microarquitetura de tíbia. Posicionamento adequado do membro hind rato envolve sendo totalmente estendido a perna e o pé inteiro e tornozelo contido em espuma (figura 1A), resultando em uma imagem adquirida de qualidade suficiente para análise do (microarquitetura trabecular e cortical Figura 1B). Colocação de insuficiente e contenção do membro hind (Figura 1) podem resultar em imagens com artefatos de movimento (Figura 1), enquanto uma cauda que não é totalmente removida da varredura do campo de visão (Figura 1E) irá interferir com raio-x atenuação pelas amostras digitalizadas (Figura 1F) e alterar as medições de densidade mineral (DTM) BMD e tecido. Qualquer um desses erros de posicionamento resultará em uma varredura de má qualidade que não deve ser mais analisada. Alcançar imagens de baixa qualidade irão alterar a quantificação da rede trabecular fina e estrutura cortical do membro hind e produzirão dados inadequados ou inconclusivos14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56346/56346fig1.jpg"> Figura 1. Imagens representativas de colocação do membro hind rato e correspondentes imagens adquiridas da tíbia proximal em secção transversal. (A) colocação apropriada do membro hind rato com o tornozelo amarrado em espuma, perna estendida e cauda se afastou de tíbia fornece qualidade de imagem suficiente em (B) seção transversal da tíbia trabecular e cortical microarquitetura. (C) colocação imprópria do membro hind rato com a perna não totalmente estendido e tornozelo não está completamente contido em espuma pode resultar em artefatos de movimento (D), vistos como estrias em secção transversal. (E) objetos interferindo com o campo de visão, tais como a cauda que não se afastou de tíbia (F) interfere com atenuação de raios-x da tíbia e pode resultar em BMD alterado e DTM medições, embora não visualmente evidente. O canto inferior esquerdo no painel F mostra uma parte da cauda, no campo de visão, que interferiu com o feixe de raios-x que posteriormente passou a tíbia. Linhas pontilhadas vermelhas nos painéis da esquerda indicam a seção transversal apresentada nos painéis da direito. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56346/56346fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Complementar Figura 1. Isoflurano anestésico unidade Isoflurano anestésica unidade criada para fornecer 3-4% de isoflurano dissolvido em O2 em uma taxa de fluxo contínua de 1-2 L/min para a indução da anestesia geral. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_1.jpg">Clique aqui para baixar esta figura.</a>
Complementar Figura 2. Garantindo a profundidade da anestesia. Pedais reflexos de medida por beliscar os dedos do pé do rato recebendo contínua inalado anestésico através de uma máscara facial ou cone de nariz. A resposta de dor é mais evidente quando a perna é ligeiramente estendida. Pitadas de muito fortes ou o uso de pinças ou grampos pode induzir dano tecidual e, portanto, não deve ser usado. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_2.jpg">Clique aqui para baixar esta figura.</a>
Complementar Figura 3. Tela captura da visão da câmera monitorização fisiológica feed live. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_3.jpg">Clique aqui para baixar esta figura.</a>
Complementar Figura 4. Rato, deitado em posição supina na base do scanner de fibra de carbono. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_4.jpg">Clique aqui para baixar esta figura.</a>
Complementar Figura 5. Pé do rato contido em um tubo de espuma maleável direito. Pé direito do rato é contido em um tubo de espuma maleável com os dedos, estendendo-se fora do tubo (não retratado aqui). O tubo de espuma é contido em um suporte plástico (por favor consulte a Tabela de materiais/equipamento específico para informações mais detalhadas). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_5.jpg">Clique aqui para baixar esta figura.</a>
Complementar Figura 6. Rato, fixado em posição com a perna direita estendida direto. O pé esquerdo e caudo é gravado longe da perna direita (em direção ao tronco), os quadris estão garantidos e o torso de rato é envolto em vet-envoltório (azul) para limitar a perda de calor. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_6.jpg">Clique aqui para baixar esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography at 

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

Posicionamento adequado e a contenção de um membro posterior de ratos para concentrado de alta resolução de imagem de osso usando Microarquitetura na Vivo Microtomografia computadorizada

Este papel instrui os usuários de scanners de microtomografia computadorizada (µCT) na vivo como anestesiar, corretamente, posicionar e restringir o membro posterior de um rato para o mínimo movimento durante a geração de imagens de alta resolução da tíbia. O resultado é imagens de alta qualidade que podem ser processadas para quantificar com precisão a microarquitetura óssea.

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

proper-positioning-restraint-rat-hind-limb-for-focused-high

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

9.8K visualizações.  Brock University. Este papel instrui os usuários de scanners de microtomografia computadorizada (µCT) na vivo como anestesiar, corretamente, posicionar e restringir o membro posterior de um rato para o mínimo movimento durante a geração de imagens de alta resolução da tíbia. O resultado é imagens de alta qualidade que podem ser processadas para quantificar com precisão a microarquitetura óssea.

Vídeo: Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

De alta resolução de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imagem

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Bioengenharia

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Imagens de alta resolução em 3D de Ex-Vivo Amostras Biológicas por Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Nanopartículas virais para<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Tumor

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An oscillatory motion is generated at the focus of a 93-element and 4.5 MHz center frequency HIFU transducer by applying a 25 Hz amplitude-modulated signal using a function generator. A 64-element and 2.5 MHz imaging transducer with 68kPa peak pressure is confocally placed at the center of the HIFU transducer to acquire the radio-frequency (RF) channel data. In this protocol, real-time monitoring of thermal ablation using HIFU with an acoustic power of 7 W on canine livers in vitro is described. HIFU treatment is applied on the tissue during 2 min and the ablated region is imaged in real-time using diverging or plane wave imaging up to 1,000 frames/second. The matrix of RF channel data is multiplied by a sparse matrix for image reconstruction. The reconstructed field of view is of 90&#176; for diverging wave and 20 mm for plane wave imaging and the data are sampled at 80 MHz. The reconstruction is performed on a Graphical Processing Unit (GPU) in order to image in real-time at a 4.5 display frame rate. 1-D normalized cross-correlation of the reconstructed RF data is used to estimate axial displacements in the focal region. The magnitude of the peak-to-peak displacement at the focal depth decreases during the thermal ablation which denotes stiffening of the tissue due to the formation of a lesion. The displacement signal-to-noise ratio (SNRd) at the focal area for plane wave was 1.4 times higher than for diverging wave showing that plane wave imaging appears to produce better displacement maps quality for HMIFU than diverging wave imaging.

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

This article describes real-time monitoring of HIFU ablation in canine liver with high frame rate ultrasound imaging using diverging and plane wave imaging. Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound is used to image the decrease of acoustic radiation force induced displacement in the ablated region.

Monitoramento em tempo real de High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablação de<em&gt; In Vitro</em&gt; Canine Fígados Usando Movimento Harmônico Imaging para ultra-som focalizado (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo quantitativa Avaliação da Estrutura do miocárdio, função, perfusão e viabilidade Usando Cardiac Micro-Tomografia Computadorizada

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A High-performance Compact Photoacoustic Tomography System for In Vivo Small-animal Brain Imaging

In vivo small-animal imaging has an important role to play in preclinical studies. Photoacoustic tomography (PAT) is an emerging hybrid imaging modality that shows great potential for both preclinical and clinical applications. Conventional optical parametric oscillator-based PAT (OPO-PAT) systems are bulky and expensive and cannot provide high-speed imaging. Recently, pulsed-laser diodes (PLDs) have been successfully demonstrated as an alternative excitation source for PAT. Pulsed-laser diode PAT (PLD-PAT) has been successfully demonstrated for high-speed imaging on photoacoustic phantoms and biological tissues. This work provides a visualized experimental protocol for in vivo brain imaging using PLD-PAT. The protocol includes the compact PLD-PAT system configuration and its description, animal preparation for brain imaging, and a typical experimental procedure for 2D cross-sectional rat brain imaging. The PLD-PAT system is compact and cost-effective and can provide high-speed, high-quality imaging. Brain images collected in vivo at various scan speeds are presented.

A High-performance Compact Photoacoustic Tomography System for In Vivo Small-animal Brain Imaging

A compact pulsed-laser diode-based photoacoustic tomography (PLD-PAT) system for high-speed in vivo brain imaging in small animals is demonstrated.

Um sistema de tomografia fotoacústica compacta de alto desempenho para<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de cérebro de animais pequenos

In vivo small-animal imaging has an important role to play in preclinical studies. Photoacoustic tomography (PAT) is an emerging hybrid imaging modality ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.