Die Autoren erkennen Forschung Finanzierung aus einem NSERC Discovery Grant (#05573) und die Canada Foundation for Innovation (#222084) für die Finanzierung der in Vivo Mikro-CT W.E Ward ist ein Canada Research Chair in Knochen- und Muskelaufbau.

Diese Studie war die Animal Care Ausschuss der Brock University gebilligt und im Einklang mit der Leitlinien des Canadian Council on Animal Care 21.
1. Anästhesie mit Isofluran Gas
<ol><li>Pre-fill Acrylglas Inkubation Kammer mit qualitativ hochwertigen O2 bei kontinuierlichen Durchfluss von ca. 1-2 L/min von einer Narkose Maschine (ergänzende Abbildung1).</li>
	<li>Übertragen Sie die Ratte Inkubation Kammer Schwanz zuerst und Inkubation Kammer Deckel luftdicht zu erstellen.</li>
	<li>Fangen Sie an, füllen die Inkubation Kammer mit Veterinär-Grade Isofluran bei 3-4 % V/V O2 bei kontinuierlichen Durchfluss von 1-2 L/min (ergänzende Abbildung1) aufgelöst. Achtung: Abfall anästhetische Gase können Handler beeinträchtigen. Ein Scavenger System (d.h.ein Aktivkohlefilter oder Auspuff direkt in einer Dampfhaube) muss immer vorhanden sein.</li>
	<li>Wenn die Ratte nicht mehr in der Lage ist zu stehen, übertragen die Ratte auf eine Gesichtsmaske oder Bugnase erhalten ca. 1-3 % Isofluran aufgelöst in O2 bei einer Durchflussmenge von 1-2 L/min. Ratten vor allem atmen Sie durch die Nase und so, solange die Gesichtsmaske oder Nase Nase gedeckt ist Kegel, werden ausreichende Anästhesie Lieferung.</li>
	<li>Gelten Sie ophthalmologische Schmierung für die zarten Membranen der Augen zum Schutz vor entflohenen Isofluran Gas. Hinweis: Sicherstellen Sie, dass ophthalmologischen Schmierung ohne Antibiotikum, da diese Ergebnisse aus einer Intervention beeinflussen kann.</li>
	<li>Palpebrale (Auge blinkt Reaktion auf sanfte Stimulation der palpebrale Öffnung) zu messen und pedal (Entzug der hinteren Gliedmaßen als Reaktion auf kneifen) Reflexe; mit zunehmender Tiefe der Narkose, wird palpebrale Reflex sein Fehlen zuvor pedal Reflexe (ergänzende Abbildung 2).</li>
	<li>Wenn eine ausreichende Anästhesie erreicht ist und die Ratte palpebrale und Pedal Reflexe verloren hat, halten die Ratte auf 0,5-2 % Isofluran in O2 bei einer Durchflussmenge von 1-2 L/min aufgelöst.</li>
	<li>Kontinuierlich überwachen Sie die Atemfrequenz der Ratte während des Verfahrens halten eine konstante visuelle auf die Ratte direkt mit einem internen Kontrollsystem oder durch das live Video feed (ergänzende Abbildung 3).</li>
</ol>2. Positionierung und Zurückhaltung der Ratte Hind Extremität
<ol><li>Legen Sie die Ratte in der Rückenlage auf dem Kohlefaser-Scanner (ergänzende Abbildung 4).</li>
	<li>Zügeln Sie den rechten Fuß in eine verformbare, Schaum-Röhre, mit den Zehen Verlängerung aus dem Ende des Rohres. Tragen Sie dental Wachs zu halten den Fuß fest im Schaum und kleben Sie das Rohr fest geschlossen. Sicherstellen Sie, dass der Durchmesser des Rohres hält den Fuß fest in das Kunststoffrohr passen ausreicht.</li>
	<li>Schieben Sie das Plastikrohr in das x-ray Scanner-Bett (ergänzende Abbildung 5).</li>
	<li>Die Ratte Hind Gliedmaßen zu verlängern, bis es straff gespannt ist. Erweitern Sie das Bein, der Ratte (ergänzende Abbildung 5) Schaden wie das unwillkürliche Bewegungen der Gliedmaßen durch erschwerte Atmung induzieren kann nicht übermäßig.</li>
	<li>Ziehen Sie das linke Bein (nicht gescannt Hind Gliedmaßen) sowie die Rute aus dem Scan Blickfeld und in Richtung der Torso, dem längeren Schenkel gescannt werden.</li>
	<li>Sichern Sie das linke Bein (nicht gescannt Hind Gliedmaßen) und das Heck mit Klebeband. Nicht alles mehr oder weniger klebrig (d.h., Klebeband oder des Malers Klebeband) verwenden, da diese Materialien entweder die Ratte Schaden werden, wenn sie sind entfernt (Klebeband) oder bieten Sie nicht starken genug Halt (des Malers Band) (ergänzende Abbildung 6).</li>
	<li>Die Ratte Körper in Position an den Hüften, Schultern und Kopf mit dem Klebeband zu sichern. Sichern Sie die Gesichtsmaske oder Nase Kegel, die Ratte (ergänzende Abbildung 6). Hinweis: Tupfen Sie die Klebeseite Klebeband, seine Fähigkeit, an der Ratte Fell haften zu entfernen. Tupfen Sie die Enden der das Klebeband nicht, so dass es fest auf dem Scan Bett befestigt werden kann.</li>
	<li>Wickeln Sie die Ratte in Tierarzt-ein Wärmeverlust (ergänzende Abbildung 6) begrenzen. Hinweis: Wenn Sie unter Vollnarkose, verlieren Ratten Hitze schnell aufgrund ihrer großen Oberfläche, Körper-Gewicht-Verhältnis- 19,-20.</li>
	<li>Kontinuierliche Überwachung der Atemfrequenz der Ratte während des Verfahrens indem eine konstante auf die Ratte (entweder direkt oder durch ein live-Video füttern) visuelle. Hinweis: Hier einrichten dauert 5 min, Scan-Akquisition ist Erwerb Einstellung-abhängige und Erholungszeit beträgt 60 Minuten.</li>
	<li>Fahren Sie mit der µCT-Bilder zu erwerben. Hinweis: Die genauen Spezifikationen für Scan Erwerb sind spezifisch für jeden Scanner Typ, Software-System und die spezifische Fragestellung, jedoch gibt es mehrere Veröffentlichungen zur methodische in der gesamten Literatur 1,2 , 9.</li>
</ol>3. Wiederherstellung aus der Narkose
<ol><li>Nachdem in Vivo µCT Scanvorgang abgeschlossen ist, stoppen Sie die Strömung von Isofluran, die Ratte aber pflegen Sie eine 1-2 L/min Durchfluss O2.</li>
	<li>Wenn die Ratte Motorsteuerung (1-2 min) wiedererlangt hat, entfernen Sie es aus der Atemschutzmaske und lassen Sie es wieder einzeln in einem Käfig, die teilweise auf ein Allzweck Heizkissen bei schwacher Hitze gelegt. Ratten sind dafür bekannt, ihre Körpertemperatur um 1 ° C unter Vollnarkose19zu reduzieren. Nicht unbeaufsichtigt lassen die Ratte bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Hinweis: Anekdotische Evidenz aus unserer Arbeitsgruppe berichtet, dass unmittelbar nach der Genesung von Isoflurane Narkose Ratten anfangen zu essen und so es wichtig ist, ihre Nahrung und Wasser während der Wiederherstellung zur Verfügung. Obwohl wir dieses Verhalten beobachtet haben, bewirkt wiederholten Vollnarkose keine deutliche Steigerung in Essen Ansaug- oder Körper Gewicht 1,9.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Longo, A. B., Sacco, S. M., Salmon, P. L., Ward, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+use+of+micro-computed+tomography+does+not+alter+microarchitecture+of+the+proximal+tibia+in+sham+or+ovariectomized+sprague-dawley+rats.">Longitudinal use of micro-computed tomography does not alter microarchitecture of the proximal tibia in sham or ovariectomized sprague-dawley rats.</a> Calcif Tissue Int. 98 (6), 631-641 (2016).</li><li>Sacco, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+irradiation+from+micro-computed+tomography+scanning+at+2,+4+and+6+months+of+age+does+not+induce+damage+to+tibial+bone+microstructure+in+male+and+female+CD-1+mice.">Repeated irradiation from micro-computed tomography scanning at 2, 4 and 6 months of age does not induce damage to tibial bone microstructure in male and female CD-1 mice.</a> Bonekey Rep. 6, 855 (2017).</li><li>Waarsing, J. H., Day, J. S., Verhaar, J. A., Ederveen, A. G., Weinans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+loss+dynamics+result+in+trabecular+alignment+in+aging+and+ovariectomized+rats.">Bone loss dynamics result in trabecular alignment in aging and ovariectomized rats.</a> J Orthop Res. 24 (5), 926-935 (2006).</li><li>Klinck, R. J., Campbell, G. M., Boyd, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+effects+on+bone+architecture+in+mice+and+rats+resulting+from+in+vivo+micro-computed+tomography+scanning.">Radiation effects on bone architecture in mice and rats resulting from in vivo micro-computed tomography scanning.</a> Med Eng Phys. 30 (7), 888-895 (2008).</li><li>Laperre, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+micro-CT+protocols+for+in+vivo+follow-up+of+mouse+bone+architecture+without+major+radiation+side+effects.">Development of micro-CT protocols for in vivo follow-up of mouse bone architecture without major radiation side effects.</a> Bone. 49 (4), 613-622 (2011).</li><li>Brouwers, J. E., van Rietbergen, B., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+effects+of+in+vivo+micro-CT+radiation+on+structural+parameters+and+bone+marrow+cells+in+proximal+tibia+of+wistar+rats+detected+after+eight+weekly+scans.">No effects of in vivo micro-CT radiation on structural parameters and bone marrow cells in proximal tibia of wistar rats detected after eight weekly scans.</a> J Orthop Res. 25 (10), 1325-1332 (2007).</li><li>Francisco, J. I., Yu, Y., Oliver, R. A., Walsh, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+age,+skeletal+site,+and+time+post-ovariectomy+on+bone+mineral+and+trabecular+microarchitecture+in+rats.">Relationship between age, skeletal site, and time post-ovariectomy on bone mineral and trabecular microarchitecture in rats.</a> J Orthop Res. 29 (2), 189-196 (2011).</li><li>Altman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+skeletal+growth,+modeling,+and+remodeling+by+in+vivo+micro+computed+tomography.">Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro computed tomography.</a> Bone. 81, 370-379 (2015).</li><li>Longo, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifelong+intake+of+flaxseed+or+menhaden+oil+to+provide+varying+n-6+to+n-3+PUFA+ratios+modulate+bone+microarchitecture+during+growth,+but+not+after+OVX+in+Sprague-Dawley+rats.">Lifelong intake of flaxseed or menhaden oil to provide varying n-6 to n-3 PUFA ratios modulate bone microarchitecture during growth, but not after OVX in Sprague-Dawley rats.</a> Mol Nutr Food Res. 61 (8), (2017).</li><li>Sacco, S. M., Saint, C., LeBlanc, P. J., Ward, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+consumption+of+hesperidin+and+naringin+flavanones+exerts+transient+effects+to+tibia+bone+structure+in+female+CD-1+offspring.">Maternal consumption of hesperidin and naringin flavanones exerts transient effects to tibia bone structure in female CD-1 offspring.</a> Nutrients. 9 (3), 250 (2017).</li><li>Campbell, G. M., Buie, H. R., Boyd, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signs+of+irreversible+architectural+changes+occur+early+in+the+development+of+experimental+osteoporosis+as+assessed+by+in+vivo+micro-CT.">Signs of irreversible architectural changes occur early in the development of experimental osteoporosis as assessed by in vivo micro-CT.</a> Osteoporos Int. 19 (10), 1409-1419 (2008).</li><li>De Schaepdrijver, L., Delille, P., Geys, H., Boehringer-Shahidi, C., Vanhove, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+longitudinal+micro-CT+study+of+bent+long+limb+bones+in+rat+offspring.">In vivo longitudinal micro-CT study of bent long limb bones in rat offspring.</a> Reprod Toxicol. 46, 91-97 (2014).</li><li>Perilli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+early+bone+changes+using+in+vivo+micro-CT+in+ovariectomized,+zoledronic+acid-treated,+and+sham-operated+rats.">Detecting early bone changes using in vivo micro-CT in ovariectomized, zoledronic acid-treated, and sham-operated rats.</a> Osteoporos Int. 21 (8), 1371-1382 (2010).</li><li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography.">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li><li>Li, H., Zhang, H., Tang, Z., Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-computed+tomography+for+small+animal+imaging:+Technological+details.">Micro-computed tomography for small animal imaging: Technological details.</a> Progress in Natural Science. 18 (5), 513-521 (2008).</li><li>Campbell, G. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+toxicities+of+halothane,+isoflurane,+and+diethyl+ether+at+subanesthetic+concentrations+in+laboratory+animals.">Comparative toxicities of halothane, isoflurane, and diethyl ether at subanesthetic concentrations in laboratory animals.</a> Anesthesiology. 42 (4), 408-419 (1975).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll bietet Zuschauern die erste ausführliche Leitlinie für die ordnungsgemäße Betäubung, die Platzierung und die Zurückhaltung der Ratte beim in-Vivo µCT Scannen der hinteren Extremität. Diese Richtlinien ermöglichen Benutzern von in Vivo µCT Scansysteme in hoher Auflösung zu erhalten und qualitativ hochwertige Bilder von der Tibia, die für die Quantifizierung von 3-dimensionalen Knochen-Mikroarchitektur verarbeitet werden können. Wichtige Schritte in das Protokoll notwendig um sicherzustellen, dass die richtige Positionierung und Zurückhaltung beinhalten die richtige Narkose die Ratte sowie das Hind Glied Weg von anderen kritischen Strukturen erweitern, bis es straff ist, aber nicht in eine unnatürliche Haltung. Für optimale Bildgebung Ergebnisse ist es unerlässlich, dass die Ratte auf eine Ebene der Entspannung betäubt werden und palpebrale und Pedal Reflexe verloren gehen. Darüber hinaus der Scan Bein ausgedehnt werden und der gesamte Fuß- und Sprunggelenk sollte in Schaumstoff zurückgehalten werden. Die optimale Positionierung der Scan Bein oben beschriebenen Verfahren werden sichergestellt, dass: 1) Hintergliedmaßen von Ratten im Rahmen einer Studie orientieren sich konsequent in die gleiche Richtung, so dass den Röntgenstrahl der gleichen Gegend jedes Bein passieren, während es sich dreht um die Probe; (2) sowohl freiwillige und unfreiwillige Bewegung der hinteren Gliedmaßen wird nicht auftreten, minimiert es das Potenzial für Bewegungsartefakte zu stören, die Qualität der aufgenommenen Bilder; (3) Hindernisse von Objekten (d.h. die Rute) werden verhindert, minimieren damit das Potenzial für Teilvolumen Auswirkungen, ungenaue BMD und TMD Messungen zu produzieren. Diese Richtlinien können für jede einzelne Ratte geändert werden, wie die Rate von Isofluran Stoffwechsel und Positionierung je nach Belastung und Körper Größe 22variieren kann. Die am häufigsten in Vivo Scan Maschinen eignen sich für kleine Tiermodellen (d.h., Mäuse, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen) und austauschbaren tierische Stufen erlauben das Scannen von verschiedenen tierischen Größen haben. Daher können sie eine Vielzahl von Körpergewicht unterbringen.
Obwohl in Vivo µCT Scannen Genehmigungen für die Ratte neu positioniert und erneut gescannt, wenn die Bilder von den ersten Scanvorgang erworben schlechter Qualität werden wiederholt Scannen wird die Ratte zu zusätzlichen Dosen von Strahlung und Isoflurane Narkose für aussetzen einen längeren Zeitraum hinweg. Monatliche wiederholte Strahlenexposition von 600 mGy konzentriert an der Ratte Tibia mehr als vier Monaten verursacht keine Nebenwirkungen zu Mikro-Architektur im Vergleich zu der kontralateralen Hind Limb- 1Knochen, aber dies stellt nicht fest, die Sicherheit der beiden Scans in wiederholt unmittelbar nacheinander. Weitere Einschränkungen der beschriebenen Technik umfassen die Notwendigkeit, die hinteren Gliedmaßen straff mit Kräften angewendet stillhalten, verlängern, die einige Veränderungen in der Knochenstruktur geltend machen kann. Während die Schwere der Zurückhaltung der hinteren Extremität während des Scannens von jedem Forschungsziel abhängen, führte einen Unterschied in der kortikalen frühere Untersuchungen aus unserem Labor mit monatlichen wiederholte in Vivo µCT Bildgebung von einem hinteren Bein mikroarchitektonische Parameter, Exzentrizität, im Vergleich zu den kontralateralen Hind Gliedmaßen, der nicht wiederholten Erweiterung, Stabilisierung und Scannen 1durchlaufen. Exzentrizität ist ein Maß für die elliptische Form der Kortikalis und Veränderungen als Reaktion auf veränderte Belastbarkeit. Daher, wenn Sie mit dieser Methode der Positionierung und Eindämmung der hinteren Extremität für in Vivo µCT imaging wiederholt, sollten Berücksichtigung erfolgen, wenn Bewertung und Interpretation zu tragenden mikroarchitektonische Parameter ändert.
Während die oben genannten Richtlinien für die Bildverarbeitung und Analyse des Knochengewebes bereitgestellt wurden, müssen leichte Anpassungen des Protokolls erfolgen beim Weichgewebe der hinteren Extremität abbilden. Insbesondere muss die Art der hinteren Extremität erstreckte sich von den Torso und zurückhaltend berücksichtigt werden wie die aktuelle Prozedur die Ausrichtung der Weichteile (Muskulatur, Fettgewebe) in abnorme Positionierung für die Dauer des Scans Puppenständer. Daher, wenn dieses Modell für den Einsatz in der Bildgebung des Weichgewebes der hinteren Extremität rechnet man, sollten einige Anpassungen vorgenommen werden, zur Zurückhaltung-Technik zur Verminderung oder Beseitigung der Änderungen in der Positionierung des Gewebes im Verhältnis zueinander.
Darüber hinaus die Richtlinien geschrieben worden speziell basierend auf den Erfahrungen unserer Forschungsgruppe, sie können jedoch geändert werden, um anderen handelsüblichen in Vivo µCT-Scanner aufnehmen. Andere empfohlenen Methoden zur Positionierung und zurückhalten der hinteren Extremität möglicherweise vom Hersteller von in-Vivo -µCT scanning-System verfügbar. Die meisten im Handel erhältlichen in Vivo µCT-Einheiten auflisten aus Polypropylen, erweitertes Polystyren und Kunststoffrohre mit dental Wachs eine hervorstehende halten Fuß als akzeptable Materialien und Methoden zur Eindämmung der Scan Bein. Jedoch in diesem Protokoll vorgestellte Methode bieten mehr kontrollierte und konsistente Positionierung und Zurückhaltung des gescannten Beines und konsequent produziert qualitativ hochwertige Bilder. In dem vorliegenden Verfahren vorgelegten Leitlinien erfordern spezielle Ausrüstung notwendig für die Anästhesie der Ratte, wie ein Vaporizer, Rohre, Masken, Induktion Kammern und Sauerstoff. Obwohl das Gerät mit einem etwas höheren Kosten im Vergleich zu injizierbaren Anästhetika verbunden ist, können Forscher die Fähigkeit, schnell und präzise induzieren Anästhesie in bestimmten Tiefen des Bewusstseins, die einen Vorteil gegenüber Alternative bietet Methoden.
Mit den Richtlinien in dem vorliegenden Verfahren video, Forscher mit hoher Auflösung in Vivo µCT Technologien zu untersuchen, ihre Intervention wird von Interesse richtig in der Lage sein und konsequent orientieren und zurückhalten einer Ratte Hind Gliedmaßen für hohe x-ray-Bildqualität. Dies ein Kontinuum im Bereich der in-Vivo µCT Bildaufnahme und dienen als ein Schritt zur Optimierung der Konsistenz und Genauigkeit innerhalb von Studien und Vergleiche in Studien in der Literatur. Ebenso können diese Protokolle und Methoden erweitert werden, für den Einsatz in andere Nagetierarten, einschließlich Mäuse, obwohl einige Änderungen erforderlich 2,10sein werden. Beispielsweise zählen die Zurückhaltung des Fußes in der Schaum-Röhre den Knöchel um die Möglichkeit der Beinbewegung während des Scans zu minimieren. Darüber hinaus werden die volle Fuß in den Schaumstoff-Halter passen. Damit verlängern die Zehen nicht aus dem Ende des Inhabers, wie sie tun, wenn der Fuß einer Ratte zu sichern. Darüber hinaus erfordert der Körper der Maus nicht die gleiche Zurückhaltung mit Klebeband als die Ratte. Ein kleinere Nase Kegel kann verwendet werden, für die Aufrechterhaltung der Anästhesie bei Mäusen während des Scans. Wenn ein kleinere Nase Kegel nicht verfügbar ist, kann einen Nitril-Handschuh über die verfügbaren Bugnase zu sichern und machen einen kleinen Schnitt in den Handschuh, einen Raum zu bieten, der die Nase der Maus auf die Anästhesie zur Verfügung stellen und gleichzeitig eine Dichtung um die Nase passen.
Während die proximale Tibia der Hauptstandort der Untersuchung der Veränderungen zu Mikro-Struktur bei der Ratte der Knochen ist, sollten Richtlinien für die korrekte und konsequente Positionierung von anderen Stellen des Skeletts wie Femur und Lendenwirbel untersucht und seit Konsistenz in der Literatur. Allerdings müssen bei zukünftigen Forschung mit der Abbildung von den Lendenwirbeln, Überlegungen erfolgen Bildgebung der Wirbelsäule Strahlenbelastung für die umliegenden Organe und Gewebe bietet.

Die Verwendung von in Vivo Mikro-Computertomographie (µCT) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die zerstörungsfreie Darstellung der internen Strukturen bei hohen Auflösungen mit Nager-Modelle umfasst. Die nicht-destruktive Natur der in Vivo µCT ermöglicht für wiederholte Bildgebung der gleichen Nager im Laufe der Zeit. Dieses Feature nicht nur reduziert die Gesamtzahl der Nagetiere in ein experimentelles Design benötigt und dadurch reduziert sich die Inter unterliegt Variation, die entstehen kann, sondern auch erlaubt Forschern, langfristigen Reaktionen auf eine Intervention zu verstehen. Mit dem Einsatz von wiederholten in Vivo µCT haben Experimente an Mäusen und Ratten aufgeklärt Entwicklungs Veränderungen um Knochen-Mikroarchitektur und mineralische Knochendichte (BMD) während der gesamten Lebensdauer 1,2,3 ,4,5,6,7,8 , sowie die Reaktion der Knochengesundheit auf Interventionen wie Diät 9,10, Ovariectomy 7,11 und pharmakologische Agenten 8,12,13. BMD und Mikroarchitektur der Knochen an bestimmten Stellen des Skeletts, nämlich der proximalen Tibia, Femur und Lendenwirbel, sind Richtwerte, allgemeine Gesundheit der Knochen und des Risikos der Aufrechterhaltung einer Fraktur und so sind die primären Maßnahmen bei Antworten auf eine Intervention.
In Vivo µCT Bildaufnahme umfasst zweidimensionale Röntgen-Projektionen wird in mehreren Winkeln erworben, während die Röntgenquelle und Detektor um das Tier unter Untersuchung 14,15drehen. Die Qualität des resultierenden Bildes ist abhängig von vielen Faktoren ab, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: ausgewählte Aufnahmeparameter (d.h., räumliche Auflösung, Röntgen-Spannung, Stromstärke, Rotationsschritt und angewendeten Filter, Belichtungszeit), Einschränkungen der µCT Scanner (d.h., Scanner-basierte Artefakte wie Ring Artefakte oder Staub, die Schlieren oder teilweise Mengeneffekte verursachen) und die richtige Positionierung und Zurückhaltung des Tieres. Die ersten beiden dieser Faktoren können zu einem gewissen Grad durch den Benutzer, je nach der spezifischen Scannenmaschine manipuliert werden, Studienziele und die Korrekturen, die erforderlich sind, optimieren die Funktion des Scanners oder der Verarbeitung der aufgenommenen Bilder. Diese Faktoren, die korrekte Platzierung der Nager vor dem Scannen, Letzteres kann erreicht werden, unabhängig von der Scanner-basierte Einschränkungen oder die Aufnahmeparameter, die ausgewählt werden, um eine spezifische Studienziel zu erreichen. Während viele Publikationen mit in-Vivo Bildgebung in der Literatur 14,15,16,17veröffentlicht wurden, ist klassische Manuskript Stil, so dass detaillierte "How to" Informationen darf nicht enthalten sein. Daher ist das Ziel des vorliegenden Artikels und video-Anleitung, um diese Lücke zu füllen. Hier wollen wir Nutzer von in Vivo µCT-Scanner weisen, wie eine Ratte zu betäuben und zu positionieren und zurückhalten der Hind Gliedmaßen um Bilder in hoher Qualität zu produzieren, die analysiert werden können, um die Ergebnisse der Knochen-Mikroarchitektur genauer quantifizieren.
Verhindert Verstopfungen der Röntgenstrahl durch andere Objekte als die hinteren Gliedmaßen sind unerlässlich für die Quantifizierung der genauesten BMD und Knochen-Mikroarchitektur Werte. Objekte und Gewebe von unterschiedlicher Dicke und Dichte der Röntgenstrahlen durchdringen, sind einige der Röntgenstrahlung absorbiert (d. h. abgeschwächt) durch die Materialien, die sie durchqueren. Da die gemessenen Massendichte einer Probe von seiner Dicke und das Vorhandensein und die dicken der umgebenden Gewebe betroffen ist, ist es unerlässlich, dass Kalibrierung Phantome zur Bestimmung der BMD in gleicher Weise geprüft werden. Daher soll der Röntgenstrahl durch Objekte (d.h. die Rute) vor oder nach dem Durchlaufen des Interessenbereichs passieren, diese Objekte werden einige der Röntgenenergien absorbieren und stören die Übertragung Bild erworben. Darüber hinaus wäre diese Scans sehr schwer zu simulieren, wenn die Phantome zu scannen, die eng Beispielscans ähneln müssen. Infolgedessen führen diese Dämpfung Unterschiede zu Ungenauigkeiten bei der Bewertung der BMD Messungen des Knochens. So empfiehlt es für Leichtigkeit und Genauigkeit, die Anzahl der Hindernisse zwischen der Röntgenquelle, Region von Interesse und Röntgen-Detektor.
Longitudinalen Beurteilung der Knochenstruktur aus einer Intervention in präklinischen Modellen beinhalten die wiederholte Betäubung des Tieres, ihre Bewegung zu begrenzen, während des Scannens Protokolle. Verschiedene Methoden der Vollnarkose vorhanden sein, damit die Tiere durchlaufen einen µCT-Scan, einschließlich injizierbaren und Inhalat Anästhesie 1,2,4,5,6, zu unterwerfen 12. anders als Inhalat Anästhetika wie Isoflurane, wiederholten Vollnarkose mit injizierbaren Anästhetika verursachen eine Reduzierung im Körpergewicht, chirurgische Toleranz und bedeutende Änderungen an andere physiologische Parameter bei Nagetieren, speziell Ratten und Meerschweinchen, wiederholt darauf hindeutet wichtige Kontraindikationen für die Verwendung 18,19,20. Während Isofluran sehr volatil ist und eine schnelle Einarbeitung und Erholung ermöglicht, injizierbaren Anästhetika produzieren unterschiedliche Ebenen der Anästhesie und Zeit unter Narkose hängt davon ab, Stamm, Geschlecht, Körperzusammensetzung, nüchternen Zustand und circadiane Zyklus von der Tier. Injizierbare Anästhetika stellen auch zusätzliche Barrieren für deren Verwendung, da sie stark von nationalen Organen reguliert werden. Inhalation Anästhesie beinhaltet jedoch die direkte Übergabe in die Atemwege; Diese Methode ermöglicht schneller Induktion und Erholung und eine bessere Kontrolle über die Länge und Tiefe der Narkose19,20. Beschränkungen in Bezug auf die Inhalation Anästhesie Methode beinhalten seine Voraussetzung für verdunstende Spezialausrüstung und einige Änderungen auf Herzfrequenz und Blutdruck während der Einarbeitung, Pflege und Wiederherstellung 18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi Animal Health</td>
			<td>108737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer</td>
			<td>Dispomed</td>
			<td>990-1091-3SINEWA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scavengers/Charcoal Filters</td>
			<td>Dispomed</td>
			<td>985-1005-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-CT Scanner</td>
			<td>Bruker microCT</td>
			<td>SkyScan 1176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Kerr Dental Laboratory</td>
			<td>623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam (Backer Rod)</td>
			<td>Rona</td>
			<td>CF12086</td>
			<td>1&#8221;x10&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube</td>
			<td>Bruker microCT</td>
			<td>SP-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon-fiber bed</td>
			<td>Bruker microCT</td>
			<td>SP-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet Wrap/Bandage</td>
			<td>Dura-Tech</td>
			<td>17473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic Gel</td>
			<td>OptixCare</td>
			<td>006CLC-4256</td>
			<td>Antibiotic-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>000731-500-000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proper positioning and restraint of a rat hind limb for focused high resolution imaging of bone micro-architecture using in vivo micro-computed tomography

Die Verwendung von in Vivo Mikro-Computertomographie (µCT) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die zerstörungsfreie Darstellung der internen Strukturen bei hohen Auflösungen in live Tiermodellen beinhaltet. Dies ermöglicht eine wiederholte Bildgebung der gleichen Nager im Laufe der Zeit. Dieses Feature nicht nur reduziert die Gesamtzahl der Nagetiere in ein experimentelles Design benötigt und dadurch reduziert sich die Inter unterliegt Variation, die entstehen kann, sondern ermöglicht auch Forscher längs- oder lebenslange Antworten auf eine Intervention zu beurteilen. Um Bilder in hoher Qualität zu erwerben, die verarbeitet und analysiert, um die Ergebnisse der Knochen-Mikroarchitektur genauer quantifiziert werden können, müssen Benutzer in Vivo µCT-Scanner richtig die Ratte zu betäuben und position und zurückhalten der hinteren Extremität. Um dies zu tun, ist es unerlässlich, dass die Ratte auf eine Ebene der Entspannung betäubt werden und Pedal Reflexe verloren gehen. Diese Richtlinien können für jede einzelne Ratte geändert werden, da die Rate der Isofluran Stoffwechsel je nach Belastung und Körpergröße variieren kann. Richtige Technik für in Vivo µCT Bildaufnahme ermöglicht eine präzise und konsistente Messung des Knochen-Mikroarchitektur innerhalb und zwischen den Studien.

Diese Art der Narkose für die Ratte, und die Positionierung und Zurückhaltung der hinteren Extremität Bilder für in Vivo µCT-Bildgebung den Erwerb von qualitativ hochwertige erleichtert für die Analyse der Tibia Micro-Architektur geeignet. Das Bein wird gestreckt und gesamten Fuß und Sprunggelenk zurückhaltend in Schaum (Abbildung 1A), was eine erworbene Bild von ausreichender Qualität für die Analyse der trabekulären und kortikalen Mikro-Architektur (beinhaltet die richtige Positionierung der Ratte Hind Extremität Abbildung 1 b). Unzureichende Platzierung und Zurückhaltung der hinteren Extremität (Abbildung 1) können in Bildern mit Bewegungsartefakten (Abbildung 1), führen, während ein Endstück, das aus dem Scan Sehfeld (Abbildung 1E) nicht vollständig entfernt wurde mit Röntgen stören Dämpfung durch die gescannten Proben (Abb. 1F) und BMD und Gewebe Mineral (TMD) Dichtemessungen zu ändern. Entweder diese Platzierung Fehler führt einen Scan von schlechter Qualität, die nicht weiter analysiert werden sollte. Um Bilder von schlechter Qualität ändert die Quantifizierung der feinen trabekuläre Netzwerk und kortikalen Struktur der hinteren Gliedmaßen und unangemessen oder nicht schlüssig Daten14produzieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56346/56346fig1.jpg"> Abbildung 1. Repräsentative Bilder der Platzierung der Ratte Hind Gliedmaßen und entsprechenden aufgenommenen Bilder der proximalen Tibia im Querschnitt. (A) die richtige Platzierung der Ratte Hind Gliedmaßen mit der Knöchel, die vollständig im Schaum fixiert, Bein verlängert und Schweif der Tibia weggezogen bietet ausreichende Bildqualität im Querschnitt (B) der Tibia trabekulären und kortikalen Mikro-Architektur. (C) falsche Platzierung der Ratte Hind Gliedmaßen mit dem Bein nicht voll ausgefahren und Knöchel nicht vollständig fixiert im Schaum kann Bewegungsartefakte (D), als Schlieren im Querschnitt gesehen. (E) Objekte stören das Sichtfeld wie die Rute nicht weggezogen der Tibia (F) mischt sich mit x-ray Dämpfung aus der Tibia und führen zu veränderten BMD und TMD Messungen, obwohl nicht visuell erkennbar. Unten links im Bedienfeld " F " zeigt einen Teil der Rute in das Sichtfeld, das störte den Röntgenstrahl, die anschließend die Tibia durchlaufen. Roten gepunkteten Linien in den linken Panels zeigen den Querschnitt auf die richtigen Platten dargestellt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56346/56346fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Abbildung 1. Isofluran-Narkose-Einheit Isoflurane Narkose Einheit eingerichtet, um 3-4 % Isofluran in O2 bei kontinuierlichen Durchfluss von 1-2 L/min für die Induktion einer Vollnarkose gelöst. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_1.jpg">Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.</a>
Ergänzende Abbildung 2. Tiefe der Narkose zu gewährleisten. Maßnahme Pedal Reflexe durch Kneifen die Zehen der Ratte erhalten kontinuierliche eingeatmet Betäubung durch eine Gesichtsmaske oder Bugnase. Die Schmerz-Reaktion wird deutlicher, wenn das Bein etwas erweitert wird. Sehr starke Prisen oder den Einsatz von Pinzetten oder Klemmen kann Gewebeschäden verursachen und sollten daher nicht verwendet werden. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_2.jpg">Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.</a>
Ergänzende Abbildung 3. Screenshot von der live-Feed physiologische Überwachungs-Kamera-Ansicht. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_3.jpg">Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.</a>
Ergänzende Abbildung 4. Verlegung in die Rückenlage auf dem Scannerglas Kohlefaser-Ratte. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_4.jpg">Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.</a>
Ergänzende Abbildung 5. Rechter Fuß der Ratte in einem formbaren Schaum Rohr zurückgehalten. Rechten Fuß der Ratte ist zurückhaltend in einem formbaren Schaum-Rohr mit den Zehen Verlängerung aus der Tube (hier nicht abgebildet). Das Schaumstoff-Rohr ist in einem Kunststoffhalter zurückhaltend (siehe Tabelle der spezifischen Materialien/Geräte für ausführlichere Informationen). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_5.jpg">Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.</a>
Ergänzende Abbildung 6. Ratte mit dem rechten Bein gerade verlängert in Lage gesichert. Der Schweif und linken Fuß ist dem rechten Schenkel (in Richtung der Torso) aufgezeichnet, die Hüften sind gesichert und die Ratte Torso ist verpackt in Tierarzt-Wrap (blau), Wärmeverluste zu begrenzen. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_6.jpg">Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.</a>

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Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

Die richtige Positionierung und Zurückhaltung einer Ratte Hind Extremität für fokussierte hochauflösende Bildgebung von Knochen-Mikroarchitektur mit In Vivo Mikro-Computertomographie

Dieses Papier weist Benutzer in Vivo Mikro-Computertomographie (µCT) Scanner wie betäuben, richtig positionieren und zurückhalten der Hind Gliedmaßen einer Ratte für minimale Bewegung während der hochauflösenden Bildgebung des Schienbeins. Das Ergebnis sind qualitativ hochwertige Bilder, die bearbeitet werden können, um genau zu quantifizieren, Knochen-Mikroarchitektur.

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

proper-positioning-restraint-rat-hind-limb-for-focused-high

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

9.8K Aufrufe.  Brock University. Dieses Papier weist Benutzer in Vivo Mikro-Computertomographie (µCT) Scanner wie betäuben, richtig positionieren und zurückhalten der Hind Gliedmaßen einer Ratte für minimale Bewegung während der hochauflösenden Bildgebung des Schienbeins. Das Ergebnis sind qualitativ hochwertige Bilder, die bearbeitet werden können, um genau zu quantifizieren, Knochen-Mikroarchitektur.

Serie: Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Forschung

Biotechnik

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Hochauflösende 3D Imaging von Ex-Vivo Biologische Proben von Micro-CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An oscillatory motion is generated at the focus of a 93-element and 4.5 MHz center frequency HIFU transducer by applying a 25 Hz amplitude-modulated signal using a function generator. A 64-element and 2.5 MHz imaging transducer with 68kPa peak pressure is confocally placed at the center of the HIFU transducer to acquire the radio-frequency (RF) channel data. In this protocol, real-time monitoring of thermal ablation using HIFU with an acoustic power of 7 W on canine livers in vitro is described. HIFU treatment is applied on the tissue during 2 min and the ablated region is imaged in real-time using diverging or plane wave imaging up to 1,000 frames/second. The matrix of RF channel data is multiplied by a sparse matrix for image reconstruction. The reconstructed field of view is of 90&#176; for diverging wave and 20 mm for plane wave imaging and the data are sampled at 80 MHz. The reconstruction is performed on a Graphical Processing Unit (GPU) in order to image in real-time at a 4.5 display frame rate. 1-D normalized cross-correlation of the reconstructed RF data is used to estimate axial displacements in the focal region. The magnitude of the peak-to-peak displacement at the focal depth decreases during the thermal ablation which denotes stiffening of the tissue due to the formation of a lesion. The displacement signal-to-noise ratio (SNRd) at the focal area for plane wave was 1.4 times higher than for diverging wave showing that plane wave imaging appears to produce better displacement maps quality for HMIFU than diverging wave imaging.

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

This article describes real-time monitoring of HIFU ablation in canine liver with high frame rate ultrasound imaging using diverging and plane wave imaging. Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound is used to image the decrease of acoustic radiation force induced displacement in the ablated region.

Echtzeit-Überwachung von hochintensiven fokussierten Ultraschall (HIFU) Ablation<em&gt; In-vitro-</em&gt; Canine Livers Verwendung harmonische Bewegung Imaging für fokussierten Ultraschall (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo quantitative Bewertung der myokardialen Struktur, Funktion, Perfusion und Lebensfähigkeit Mit Herz Micro-Computertomographie

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A High-performance Compact Photoacoustic Tomography System for In Vivo Small-animal Brain Imaging

In vivo small-animal imaging has an important role to play in preclinical studies. Photoacoustic tomography (PAT) is an emerging hybrid imaging modality that shows great potential for both preclinical and clinical applications. Conventional optical parametric oscillator-based PAT (OPO-PAT) systems are bulky and expensive and cannot provide high-speed imaging. Recently, pulsed-laser diodes (PLDs) have been successfully demonstrated as an alternative excitation source for PAT. Pulsed-laser diode PAT (PLD-PAT) has been successfully demonstrated for high-speed imaging on photoacoustic phantoms and biological tissues. This work provides a visualized experimental protocol for in vivo brain imaging using PLD-PAT. The protocol includes the compact PLD-PAT system configuration and its description, animal preparation for brain imaging, and a typical experimental procedure for 2D cross-sectional rat brain imaging. The PLD-PAT system is compact and cost-effective and can provide high-speed, high-quality imaging. Brain images collected in vivo at various scan speeds are presented.

A High-performance Compact Photoacoustic Tomography System for In Vivo Small-animal Brain Imaging

A compact pulsed-laser diode-based photoacoustic tomography (PLD-PAT) system for high-speed in vivo brain imaging in small animals is demonstrated.

Ein leistungsstarkes kompaktes Fotoakustik-Tomographie-System für<em&gt; In vivo</em&gt; Kleintier Gehirn Bildgebung

In vivo small-animal imaging has an important role to play in preclinical studies. Photoacoustic tomography (PAT) is an emerging hybrid imaging modality ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.