Este estudo foi suportado pelo nacionais de investigação, desenvolvimento e inovação escritório da Hungria (grant 116912 ÁH), o escritório de custo (alimentação e agricultura custo ação FA1205: AQUAGAMETE), o programa de bolsas do Hungaricum (grant para ZM) e o novo Húngara nacional excelência Predoctoral Fellowship (grant Para EK).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela lei húngara de bem-estar Animal.
1. preparação do reagente
<ol><li>Soluções conservadas em estoque<ol>
<li>Prepare 1 M trealose adicionando 0,378 g de trealose di-hidratado em 1 mL de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente.</li>
		<li>Prepare-se 1 M de sacarose adicionando 0,342 g de sacarose em 1 mL de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente.</li>
		<li>Prepare 1 M HEPES adicionando 0,238 g de HEPES a 1 mL de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente.</li>
		<li>Prepare a colagenase 20 mg/mL (290 U/mg) pela adição de 100 mg para 5 mL de PBS. Misture bem até que se dissolva. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota de 50 μL em 0,2 mL PCR tubos e congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparar a tripsina de 15 mg/mL (~ 10000 U/mg) adicionando-se 75 mg a 5 mL de PBS. Misture bem até que se dissolva. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota de 50 μL em 0,2 mL PCR tubos e congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Prepare-se 1 mg/mL DNase eu (~ 3000 U/mg) pela adição de 5 mg a 5 mL de PBS. Misture bem até que se dissolva. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota de 50 μL em 0,2 mL PCR tubos e congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Prepare-se 0,4% trypan azul adicionando-se 40 mg de azul de Tripan a 10 mL de PBS. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota 1 mL em tubos de 1,5 mL.</li>
		<li>Preparar a 200 mg/L de MS-222 (sulfonato de metano tricaina) adicionando-se 200 mg de MS-222 em 1 L de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente. Além disso, o MS-222 tampão com bicarbonato de sódio para um pH neutro de 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluções para vitrificação<ol>
<li>Preparar a solução de equilíbrio (ES): preparar 2 mL de ES misturando 121.5 µ l de metanol (MeOH; 1,5 M), 220 µ l de propilenoglicol (PG; 1,5 M), 200 µ l de FBS (10%), 200 µ l da solução estoque de trealose (0,1 M), 50 µ l de solução-mãe de HEPES (25 mM) e 1208.5 µ l de L-15 em um 2 tubo mL.</li>
		<li>Preparar a solução de vitrificação (VS): preparar 2 mL de VS misturando 439 µ l de PG (3 M), 426 µ l de dimetil sulfóxido (Me2então; 3 M), 200 µ l de FBS (10%), 200 µ l de solução-mãe de trealose (0,1 M), 50 µ l de HEPES estoque solução (25 mM) e 685 µ l de L-15 em um tubo de 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluções para o aquecimento<ol>
<li>Preparar a solução de aquecimento 1 (WS1): preparar 1,5 mL de WS1 em um tubo de 2 mL misturando 150 µ l de FBS (10%), 450 µ l de solução de sacarose (3M) e 900 µ l de L-15.</li>
		<li>Preparar a solução de aquecimento 2 (WS2): preparar 1,5 mL de WS2 em um tubo de 2 mL misturando 150 µ l de FBS (10%), 150 µ l de solução de sacarose (1 M) e 1200 µ l de L-15.</li>
		<li>Preparar a solução de aquecimento 3 (WS3): preparar 1,5 mL de WS2 em um tubo de 2 mL por mistura de 150 µ l FBS (10%) e 1350 µ l de L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar a solução de digestão: para cada amostra prepare 500 µ l da solução de digestão, misturando-se 50 µ l de solução colagenase (2 mg/mL), 50 µ l de solução tripsina (1,5 mg/mL), 10 µ l de DNase I (20 µ g/mL) e 390 µ l de L-15 em um 2 mL do tubo.</li>
	<li>Obter ferramentas de dissecação: tesoura, micro-tesouras, pinças, pinças curvas e agulhas de acupuntura.</li>
</ol>2. testículos coleção
<ol><li>Eutanásia o peixe, colocando-o em um prato contendo 200 mg/L de MS-222 (pH = 7). Antes de continuar com a dissecação, certifique-se que as brânquias têm parou de se mexer e pelo menos 10 min se passaram desde aquele momento para garantir a morte por hipóxia.</li>
	<li>Seque o peixe, acariciando-o em uma toalha de papel e coloque-o de lado dorsal em uma esteira de dissecação.<ol>
<li>Em primeiro lugar, corte as barbatanas peitorais e pélvicas para dissecação mais fácil.</li>
		<li>Horizontalmente, cortar a pele na barriga do peixe entre as barbatanas peitorais e cortar a pele e o músculo subjacente ao longo da barriga até a nadadeira anal.</li>
		<li>Abra a cavidade do corpo do peixe e fixar a parede corporal esquerda e direita para o tapete de dissecação com agulhas. Nota: Os testículos estão localizados acima os órgãos gastrointestinais em ambos os lados da natação bexiga (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para evitar contaminação, não retire os órgãos gastrointestinais, mas suavemente empurrá-los para um lado e retire o testículo do lado oposto. Os testículos estão ligados à parede do corpo então remova-os cuidadosamente e cortar o ligação peritônio por micro-tesouras.</li>
	<li>Além disso, a fim de evitar a contaminação, em primeiro lugar esterilizar os testículos colocando-os em etanol a 70% por 2 s e depois coloque-os em L-15 em uma placa de 96 poços no gelo. Nota: Se for necessário, testículos limpos de tecido adiposo e grandes vasos sanguíneos precisamente sob o microscópio estereoscópico</li>
</ol>3. ultrarápido arrefecimento do tecido Testicular
<ol><li>Agulhas de Mark com Etiquetas apropriadas, dependendo do exemplo digite e preparem a equilibração (ES) e soluções de vitrificação (VS).</li>
	<li>Transferi os testículos para uma placa bem maior ou prato e pino dois ou três testículos (ou mais dependendo do tamanho da agulha) em uma agulha estéril de acupuntura.<ol>
<li>Em primeiro lugar, posição do testículo no topo curvas pinças. Coloque a ponta da agulha no meio do testículo e puxe cuidadosamente o testículo para cima, com a pinça.</li>
		<li>Após a punção do testículo, gentilmente puxe-o para cima em direção ao topo da agulha. Certifica-se de que os testículos são separados uns dos outros e que não estão caindo ou deslizar para baixo.</li>
		<li>Lugar cheio de agulhas com testículos fixados em um tubo de 2 mL com L-15 até vitrificação (em 25 ˚ c; tempo de armazenamento não deve exceder 1 h). Nota: Condecorando os testículos a agulha deve ser feito rapidamente para evitar que os testículos de secar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir a agulha com testículos para a solução de equilíbrio e incubar durante 5 min à 25˚C.</li>
	<li>Transferir a agulha para a solução de vitrificação e incube por 30 s em 25˚C.</li>
	<li>Retire a agulha a partir da solução de vitrificação, rapidamente e suavemente absorver o restante da solução do tecido por uma toalha de papel estéril. Tome cuidado para evitar os testículos degola para a toalha de papel ou cair.</li>
	<li>Rapidamente Coloque a agulha no nitrogênio líquido, colocado em uma caixa de isopor. Nota: Fazer este passo rapidamente para evitar a exposição do tecido para o vapor de nitrogênio líquido. Use volumes baixos de nitrogênio líquido para evitar a contaminação das amostras.</li>
	<li>Manter a agulha em nitrogênio líquido em uma caixa de isopor fechada por 5-10 min.</li>
	<li>Precool um criotubo abriu 4,5 mL e sua tampa na mesma caixa.</li>
	<li>Após 5-10 min, transfira cada agulha em um separado criotubo sob a superfície do nitrogênio líquido e fechar o criotubo. Atenção: Sempre use roupas de proteção (como luvas isoladas) quando trabalhar com nitrogênio líquido como exposição pode levar a graves queimaduras.</li>
	<li>Coloque o criotubo com um bastão de metal e colocá-lo no recipiente do cryobank mais rápido possível. Armazenar as amostras em um armazenamento de cilindro dewar até utilização posterior.</li>
</ol>4. procedimento de aquecimento
<ol><li>Cada agulha quente separadamente. Todas as soluções de aquecimento devem ser a 25 ° C.</li>
	<li>Desanexe o criotubo da cana-de-metal e mergulhá-lo no nitrogênio líquido armazenado em uma caixa de isopor.</li>
	<li>Abra o criotubo no vapor de nitrogênio líquido (usando fórceps) e liberar a agulha para o nitrogênio líquido.</li>
	<li>Transferir a agulha muito rápido para a primeira solução de aquecimento e incubar durante 1 min (a 25 ° C). Certifique-se de transferir a agulha rapidamente para evitar o seu aquecimento no ar durante a transferência.</li>
	<li>Transferir a agulha para a segunda solução de aquecimento e incube por 3 min (a 25 ° C).</li>
	<li>Transferir a agulha para a terceira solução de aquecimento e incubar durante 5 min (a 25 ° C).</li>
	<li>Libere os testículos da agulha deslizando-as para baixo com uma pinça curvada. Lugar cada testículo aquecido individualmente em um poço separado (placa de 96 poços) repleto de 250 µ l de L-15 suplementado com 10% FBS. Certifique-se que os poços são rotulados de acordo com a amostra. Manter a placa bem no gelo até que todas as amostras são aquecidas e até trabalhos futuros.</li>
</ol>5. tecido digestão
<ol><li>Prepare-se para cada amostra em tubos separados 2 mL 500 µ l da solução de dissociação. Etiquete os tubos de acordo com o código da amostra. Incube a solução preparada de dissociação por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione o tecido aquecido para a solução de digestão e corte em pedaços pequenos pelo menos 30 movimentos de tesoura pequena.</li>
	<li>Incube o tecido cortado em uma placa de agitação durante 90 minutos a 25 ˚ c.</li>
	<li>Parar o processo de digestão, adicionando a 400 µ l de L-15 e 100 µ l de FBS (FBS 10% v/v). Brevemente, agitar a solução e incubar durante 1 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Filtre a solução obtida através de 50 µm de filtros em um tubo de 1,5 mL. Rotule os tubos em conformidade.</li>
	<li>Centrifugue a solução filtrada em 200 × g por 10 min a 25 ˚ c.</li>
	<li>Retire o sobrenadante cuidadosamente e resuspenda o pellet em 20 µ l de L15 suplementado com 10% FBS. Manualmente, agite o tubo até a pelota é completamente dissolvida. Manter a suspensão de células no gelo ou no 4 ˚ c até nova utilização.</li>
</ol>6. viabilidade avaliação e contagem de células
<ol><li>Mistura de 5 µ l de suspensão de células e 5 µ l de solução de azul de Tripan 0,4% em um tubo PCR apropriadamente rotulado 0,2 mL. Se forem usados diferentes volumes, certifique-se de que a razão de diluição de 1:1 permanece.</li>
	<li>Incube a esta suspensão para 1 a 3 min à temperatura ambiente (25 ° C).</li>
	<li>Verifica a viabilidade de cada amostra em um hemocytometer sob o microscópio.</li>
	<li>Conte o número de células vivas (inocente por trypan blue) em 15 campos. Calcule o número total de células em 20 µm da suspensão celular. A suspensão está agora pronta para qualquer aplicação a jusante. Nota: Ao otimizar o procedimento para as outras espécies com maior tamanho corporal, use fragmentos de testículo de peso igual. Use os testículos de um indivíduo para todos os grupos experimentais a fim de evitar a variabilidade individual nos resultados. No caso de zebrafish, tiramos proveito do fato de que esquerda e direito testículo deve conter um número igual (ou muito semelhante) de células germinativas13 (Ver os resultados do representante). O testículo esquerdo foi mantido como um controle enquanto o testículo direito foi vitrificados/aquecido. Porcentagem de viabilidade foi calculada o número de células isoladas de testículo vitrificados/aquecido em relação ao número de células isoladas de testículos frescos.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research:+Importance,+impact,+status,+and+future+directions.">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li><li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center.">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li><li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio.">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li><li>Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N,N-dimethylacetamide.">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li><li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogonial+transplantation+in+fish:+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources.">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li><li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells.">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li><li>K&#225;sa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+(Eurasian+perch,+Perca+fluviatilis)+and+marine+fish+(European+eel,+Anguilla+anguilla).">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li><li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling.">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li><li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle+immersed+vitrification:+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation.">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+(Coturnix+japonica).">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology,+viability,+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+(Coturnix+japonica).">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li><li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+(Brachymystax+lenok).">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li><li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container.">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li><li>Luji&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue.">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li><li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., Garc&#237;a-Xim&#233;nez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods.">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li><li>Marinovi&#263;, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing.">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li><li>P&#353;eni&#269;ka, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells,+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells.">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li><li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes.">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso ultra rápido refrigeração procedimento desenvolvido para espécies de mamíferos e aviária10,11,12 para a criopreservação do testículo de peixe (zebrafish como modelo organismo). A maioria dos estudos anteriores sobre criopreservação dos recursos genéticos de zebrafish concentraram-se principalmente na criopreservação de esperma de zebrafish2,3,4. No entanto, não foram desenvolvidos protocolos para criopreservação de oócitos maduros e embriões ainda, apesar de alguns estudos recentes demonstram que criopreservação de ovócitos de estágio inicial é plausível14,15. Neste estudo, temos demonstrado sucesso criopreservação de zebrafish espermatogónias, que oferece novas possibilidades para o armazenamento dos valiosos recursos genéticos, especialmente desde que após transplante eles podem amadurecer em gâmetas masculinas e femininas5 .
O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a lidar com a refrigeração ultra rápida de zebrafish tecido pelo método NVI. Estudos semelhantes incluíam vitrificação de zebrafish testículos em 0,25 mL canudos de plástico16 e vitrificação de zebrafish ovários em recipientes fechados de metal14. A principal vantagem da NVI, em comparação com os dois recipientes mencionados é a exposição direta de testículos de nitrogênio líquido com volumes mínimos de crioprotectores sendo anexados a eles, portanto, maximizar a taxa refrigerando10. O aumento na taxa de resfriamento reduz a concentração necessária de crioprotectores, reduzindo assim a sua toxicidade. Além disso, todas as peças de tecido podem ser expostas ao crioprotectores e nitrogênio líquido sincronicamente. No entanto, a exposição direta de nitrogênio líquido pode ter uma desvantagem no que se refere a contaminação cruzada. É possível que bactérias ou vírus estão presentes no nitrogênio líquido, e que a exposição direta do tecido pode levar à contaminação. Portanto, sugerimos que se abstenham de reutilização nitrogênio líquido quando conduzindo NIV e para descartar o nitrogênio líquido utilizado após resfriamento. Proposto recipientes de metal oferecem vantagens a este respeito14, no entanto, eram personalizadas feitas e não são facilmente acessíveis a todos os laboratórios.
Ao comparar a refrigeração ultra rápida para lenta taxa de congelação, uma vantagem crucial de refrigeração ultra rápida é a ausência de espermatozoides após a digestão. Métodos de congelação lenta-taxa demonstraram em algumas espécies de peixes de carpa que protocolos semelhantes rendem comparável viabilidade de células germinativas de estágio inicial e espermatozoides17 resultando em número elevado de espermatozoides após a digestão do shipper tecido. Nossos resultados no zebrafish (presente estudo), carpa comum e peixinho (resultados não publicados) indicam que existem muito poucos espermatozoides após a digestão dos tecidos aquecidos e que eles não sobreviver a este procedimento e ficar digerido que simplifica a jusante aplicações, desde que não há procedimentos de enriquecimento adicionais são necessários.
Existem várias etapas críticas no âmbito do presente protocolo. O primeiro é para evitar qualquer contaminação durante o processo de isolamento, uma vez que pode levar a uma diminuição do número de células obtidas e pode impedir qualquer aplicações a jusante. Um dos passos cruciais é a excisão dos testículos onde a contaminação bacteriana pode ocorrer de danificado coragem (portanto é melhor para não ferir ou remover completamente os intestinos) ou da pele se usando a mesma ferramenta de dissecação para cortar a pele e remover a testículos. Em segundo lugar, cuide quando fixando testículos para a agulha de acupuntura, já que é possível que os testículos caiam ou escorregar. Atualmente, estamos testando diferentes métodos para impedir que os testículos do deslizamento durante o processo de vitrificação (temperaturas de nitrogênio líquido). Em terceiro lugar, preste atenção para o período de exposição para os crioprotectores. Exposição dos testículos (e, portanto, células) para altas concentrações crioprotetoras (especialmente na solução de vitrificação) por muito tempo pode levar a morte celular, devido à toxicidade crioprotetoras. Além disso, tome cuidado ao mergulhar as agulhas no nitrogênio líquido; Limpe o excesso de VS, uma vez que pode afetar o processo de arrefecimento e espetar as agulhas rapidamente para evitar a exposição ao vapor de nitrogênio líquido. Por último, transferi os testículos de nitrogênio líquido para a mídia aquecimento rapidamente para evitar aquecimento prematuro no ar durante a transferência.
No presente trabalho, apresentamos o procedimento para a criopreservação de testículos pertencentes a cinco estirpes de zebrafish usando MeOH, PG e Me2assim como permeando crioprotectores. O método produz resultados confiáveis para todas as cepas testadas zebrafish com uma viabilidade celular de acima de 50%. É possível usar esse método com modificações para as outras espécies, também. Em primeiro lugar, cada protocolo de criopreservação é espécie específica, e crioprotectores diferentes produzem diferentes eficiências em espécies diferentes (ou seja, o glicol de etileno rendeu a maior viabilidade em acipenserids18 enquanto Me2então rendeu a maior viabilidade em salmonídeos19 e ciprinídeos17). Além disso deve-se prestar atenção para as concentrações utilizadas também. O presente estudo e o estudo realizado com trutas Salmo trutta ovários15 demonstram que os melhores resultados são obtidos usando a mesma concentração de dois crioprotectores, porém isto pode variar em outras espécies. Por último, zebrafish testículos são muito pequenos, e é até possível culpar vários testículos de uma agulha. Quando se trabalha com espécies com maiores testículos, o tamanho das partes nos testículos, que são usados é um fator muito importante. Nós sugerimos para aumentar os tempos de exposição para pedaços maiores de tecido levando em conta crioprotetoras toxicidade e eficiência.

Novas tendências na ciência e biotecnologia levaram à criação de milhares de novas linhas de mutantes de camundongos, drosófila, zebrafish e outras espécies utilizadas como organismos modelo em biomédicas e outras ciências1. Além disso, como novas tecnologias são desenvolvidas e se tornam disponíveis, os números das linhas mutantes constantemente aumentam2. Isto leva à necessidade para um armazenamento seguro dos recursos genéticos, além de práticas comuns de manter colônias de reprodução. Como um método que permite a armazenagem segura dos recursos genéticos por um período indefinido de tempo, criopreservação oferece muitas vantagens, tais como extensão da temporada reprodutiva, contorna a necessidade de manutenção contínua dos reprodutores, e é mais custo - e eficiência do trabalho2.
Protocolos de criopreservação de espermatozoides desenvolvidos durante os últimos vários anos2,3,4 oferecem a oportunidade para armazenamento bem sucedida do zebrafish material genético masculino. No entanto, criopreservação de ovos ou embriões de peixe ainda não é possível devido à sua estrutura complexa e grandes quantidades de material de gema. Recentemente, a prática do transplante de células germinativas primordiais (PGCs) ou células-tronco das espermatogónias (SSCs) oferece um desvio para essa barreira, desenvolvendo-se em ovos e esperma funcional após transplante5. Portanto, a criopreservação de SSCs oferece uma nova fronteira na conservação dos recursos genéticos raros e valiosos.
Apesar de criopreservação oferece muitas vantagens, o processo de congelação lenta-taxa gera várias condições que podem levar a célula danos2. Estes incluem a formação de gelo intracelular e extracelular, desidratação, toxicidade crioprotetoras e outros. Gelo intracelular danifica as células, gelo extracelular pode levar ao esmagamento mecânico das células, enquanto a difusão de água das células durante a lenta taxa de congelamento pode levar a desidratação6. Recentemente, foi aplicada na criopreservação de gâmetas de peixe a7,8,9vitrificação como uma técnica que previne os efeitos negativos da formação de gelo. Apresenta uma técnica de resfriamento ultra rápida através do qual os meios de comunicação internos e externos se transformar em um estado amorfo/vítreo sem reveladores em gelo7,10. Bem sucedida vitrificação de tecido ovariano e testicular tem sido evidenciada na espécie aviária e mamíferos10,11,12, abrindo assim as possibilidades de sua aplicação em peixes, também.
Neste estudo, apresentamos o processo de vitrificação (NVI) agulha imergido para a criopreservação de testículos de zebrafish toda. Vamos demonstrar um método confiável para o isolamento do zebrafish estágio inicial de pilhas de germe sem contaminação e um processo de criopreservação que produz relativamente grandes quantidades de células germinativas de fase inicial com uma baixa presença de outras células, especialmente de espermatozoides. O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a demonstrar um protocolo detalhado visualizado para refrigeração ultra rápida de tecido gonadal de peixe e as células da linha germinal do zebrafish. Além disso, a repetibilidade do método é demonstrada no cinco estirpes diferentes zebrafish: AB tipo selvagem, casper (roy- / -; nácar- / -), leopardo (leo,t1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linha de transgénicos Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].

<table><tbody><tr><td>Leibovitz media (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Supplemented with L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Dihydrate</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Propylene glycol</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Reanal</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Phospate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tablets for preparation of 200 ml PBS solution</td></tr></tbody></table>

cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling

As tendências atuais na ciência e biotecnologia levam à criação de milhares de novas linhas em organismos-modelo, assim, levando à necessidade de novos métodos para o armazenamento seguro dos recursos genéticos, além de práticas comuns de manter colônias de reprodução. O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Criopreservação de células germinativas de fase inicial pelos testículos todo NIV oferece possibilidades para o armazenamento de zebrafish recursos genéticos, especialmente desde que após transplante eles podem amadurecer em gâmetas masculinas e femininas. Os testículos foram extirpados, preso em uma agulha de acupuntura, incubada em dois meios de cryoprotective (solução de equilibração contendo metanol de 1,5 M e 1,5 M propilenoglicol; e solução de vitrificação contendo o sulfoxide dimethyl 3M e 3M propileno glicol) e caiu em nitrogênio líquido. Amostras foram aquecidas em uma série de três soluções de aquecimento consequentes. As principais vantagens desta técnica são (1) a falta de espermatozoides após a digestão dos testículos aquecidos, facilitando assim a jusante manipulações; (2) ultra rápido resfriamento permitindo a exposição ideal dos tecidos ao nitrogênio líquido, portanto, maximizando o resfriamento e reduzindo a concentração necessária de crioprotectores, reduzindo assim a sua toxicidade; (3) síncrona exposição dos testículos vários crioprotectores e nitrogênio líquido; e (4) repetibilidade demonstrado pela obtenção de viabilidade de acima de 50% em cinco estirpes diferentes do zebrafish.

Em média, o número de células germinativas de fase inicial isolado de um testículo único zebrafish fresca variou entre 40.000 e 200.000 células dependendo do tamanho do peixe. Quando digerindo testículos zebrafish fresco em todas as 5 estirpes, células germinativas-início não eram as única células presentes nas suspensões celulares (Figura 2). Ao lado as células germinativas de estágio inicial, numerosos espermatozoides foram encontrados também. Por outro lado, havia muito menos espermatozoides após digestão dos testículos criopreservados. Isto indicou que espermatozoides não sobrevivem a este protocolo de arrefecimento ultra rápido, e que eles são mais propensos eliminada durante o processo de digestão, o que produz uma suspensão muito mais limpa de células germinativas de fase inicial.
Não havia diferenças significativas no número de células germinativas de estágio inicial entre os testículos direito e esquerdos (1 ± 0,5 × 105 vs 1,1 ± 0,7 × 105) de um único indivíduo demonstrado por digestão de testículos frescos de três machos de zebrafish AB (ANOVA One-Way ; F (1,4) = 0.04, p = 0,85). Em todas as linhas de zebrafish utilizadas neste estudo, o protocolo atual de resfriamento ultra rápido resultou em taxas de viabilidade média superior a 50% (tabela 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Tipo AB</td>
			<td>Casper</td>
			<td>Leopard</td>
			<td>Vasa transgênico</td>
			<td>Tumor de Wilms transgênico</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Número de células vivas (× 104)</td>
			<td>Testículo fresco</td>
			<td>14.5 ± 3,9</td>
			<td>9,5 ± 2,3</td>
			<td>12,7 ± 2,4</td>
			<td>14.5 ± 5,6</td>
			<td>4,8 ± 1,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Testículo vitrificado</td>
			<td>8.7 ± 2,8</td>
			<td>7.2 ± 3.0</td>
			<td>8,8 ± 1,7</td>
			<td>7,6 ± 3,7</td>
			<td>2.4 ± 0,7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Viabilidade (%)</td>
			<td></td>
			<td>58 ± 9</td>
			<td>72 ± 13</td>
			<td>69 ± 1</td>
			<td>50 ± 6</td>
			<td>53 ± 13</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Número de células vivas e percentagens de viabilidade (média ± DP) obtidas de testículo de zebrafish fresco ou vitrificados/aquecido. Os resultados são apresentados para as cinco linhas de zebrafish testado: AB tipo selvagem, casper (roy- / -; nácar- / -), leopardo (leo,t1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linha de transgénicos Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56118/56118fig1.jpg"> Figura 1. Dissecado zebrafish adulto demonstrando a posição de várias estruturas anatômicas. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56118/56118fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56118/56118fig2.jpg"> Figura 2. Células suspensões preparadas a partir de tecido testicular zebrafish fresco e vitrificados/aquecido de cinco linhas de zebrafish testado (AB tipo selvagem, casper (roy- / -; nácar- / -), leopardo (leo,t1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linha de transgénicos Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)]) fotografada com microscopia de contraste de fase. Barra de escala: 40 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56118/56118fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Criopreservação de Zebrafish espermatogónias por toda agulha testículos imersos refrigeração ultra rápida

O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Além disso, a repetibilidade do método em cinco estirpes diferentes zebrafish foi testada.

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K visualizações.  Szent István University. O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Além disso, a repetibilidade do método em cinco estirpes diferentes zebrafish foi testada.

Vídeo: Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

Manipulação de ploidia de embriões Zebrafish com choque térmico 2 Tratamento

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Biologia do Desenvolvimento

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Genética

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

Triagem de espermatozoides para o isolamento rápido de edições germinativas em peixes-zebra

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Um método de alta taxa de transferência para Zebrafish criopreservação de espermatozóides e In Vitro Fertilização

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Biologia

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

Fazendo Zebrafish Diplóide Gynogenetic por pressão inicial

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Produção de Haplóide embriões Zebrafish por<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilização

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recuperação de Zebrafish Adulto Corações para aplicações de alto rendimento

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

Colheita de sangue para testes repetidos de sangue em Zebrafish Adulto

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish embryo is an excellent tool for examining such interactions with an in vivo model. Whole-mount immunohistochemical and immunofluorescence assays are frequently applied in zebrafish embryos to assess protein expression. However, it can be difficult to achieve accurate mapping of co-localized proteins in three-dimensional space. In addition, some studies may require the use of two antibodies that are not compatible with the same technique (e.g., antibody 1 is only suitable for immunohistochemistry and antibody 2 is only suitable for immunofluorescence). The purpose of the method described herein is to perform sequential immunofluorescence and/or immunohistochemistry on individual cryosections derived from early-stage zebrafish embryos. Here we describe the use of sequential rounds of immunofluorescence, imaging, immunohistochemistry, imaging for a single cryosection in order to achieve precise identification of protein expression at the single-cell level. This methodology is suitable for any study in early-stage zebrafish embryos that requires accurate identification of multiple protein targets in individual cells.

This protocol demonstrates sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosections from early-stage zebrafish embryos enabling precise colocalization analyses in specific cell populations.

Imunofluorescência sequencial e imuno-histoquímica em embriões de zebrafish Crioseccionados

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...