Reconhecemos que o financiamento pelo DFG (1116/17-1) e da escola de Leipzig de ciências naturais "BuildMoNa" (GSC 185). Este trabalho foi apoiado através do projeto de Fraunhofer atrair 601 683. T. H. reconhece que o financiamento do Fundo Social Europeu (FSE-100077106).

1. preparação de n HTs Nota: aqui, n denota o número de diferentes cadeias de DNA simples envolvidos na formação dos tubos de um determinado tamanho de hélice. Para n = 8, oito diferentes cadeias de DNA simples compõem um anel unidade.
<ol><li>Sequências de DNA de compra (grau de pureza HPLC ou superior) de uma síntese de DNA adequada para o serviço ou realizar a síntese de alta qualidade e purificação (sequências exemplares indicadas na tabela 1).</li>
	<li>Oligonucleotides Ressuspender liofilizado em água purificada e siga a ressuspensão mais passos indicados no manual correspondente da companhia. Ajustar a quantidade de água para obter uma concentração final de 200 µM.</li>
	<li>Determinar concentrações do DNA único vertentes para verificar os valores indicados pelo distribuidor (por exemplo, através de espectroscopia de UV-Vis em 260 nm) desde a estequiometria exata é crucial para o processo de montagem. Calcular a concentração dos oligonucleotides, tendo em conta o peso específico molar e coeficiente de extinção para cada single-stranded do oligonucleotide de DNA. 
	Nota: Os valores do coeficiente de extinção inerentemente variam para as sequências diferentes e são demonstrados na documentação do DNA adquirido comercialmente. Eles também podem ser calculados de acordo com o modelo de vizinho mais próximo, usando uma série de ferramentas on-line disponíveis gratuitamente. Para garantir a conformidade com a escala linear do espectrómetro, considerar-se diluir a amostra utilizada para determinação de concentração.</li>
	<li>Utilizando uma micropipeta, misturar o DNA vertentes-cada na mesma concentração-em um recipiente apropriado para o thermocycler (por exemplo, um tubo PCR de 200 µ l) formar o desejado n HTs (condições de buffer final: 1xTE (10 mM Tris e 1 mM EDTA, pH 8) e 12.5 mM MgCl 2). 
	Nota: Amostras de DNA Final n HT consistem em n - 1 fios, U 1 &#8722; U n &#8722; 1 e um fio de n T. A concentração por fio pode variar de sub-micromolar para mais de 10 µM, dependendo das necessidades do usuário (por exemplo, &#60; 1 µm por vertente para a diluição subsequente observar filamentos simples ou concentrações mais elevadas para o exame de mecânica de rede densa).</li>
	<li>Cruzar o n HTs em um thermocycler (desnaturação por 10 min a 90 ° C, com uma queda rápida subsequente a 65 ° C; temperatura lenta diminuição de 65 ° C a 55 ° C, com emparelhamento base complementar em 20 passos de temperatura de-0,50 K por 30 min cada; e uma rápida queda de 55 ° C a 20 ° C); Ver Figura 2A. 
	Nota: Os passos de diminuição lenta de 65 ° C podem ser alongados para aumentar o comprimento médio do tubo; no entanto, a subsequente queda rápida a 20 ° C é fundamental para evitar a agregação dos tubos polimerizados.</li>
	<li>Armazenar o hibridizadas n HTs por até 3 semanas a 4 ° C, sem degradação detectável. 
	Nota: Para fluorescência microscopia, rotulada n HTs são hibridizados substituindo (parcialmente) U1 com o U1-Cy3 modificado (tabela 1). Para tempos mais longos de observação, a adição de agentes antibranqueamento estabelecidas é aconselhável.</li>
	<li>Cuidadosamente diluir a amostra para a concentração final desejada (por exemplo, 4 µM para redes ou 20 nM para observações de filamento único) usando o buffer de amostra, se necessário. Para minimizar as fontes de erro possível, montar amostras na concentração final desejada.</li>
</ol> 2. Reologia de cisalhamento geometria <ol><li>escolher um apropriado (placa-placa ou cone-placa) para o rheometer cisalhamento dinâmico. Para volumes pequenos (ou seja, abaixo de 200 µ l), use a geometria cone-placa.</li>
	<li>Carregar a amostra sobre o cisalhamento dinâmico rheometer.</li>
	<li>Passivate interface ar-água da amostra e do ambiente, usando as seguintes etapas para evitar os efeitos de evaporação potencial.
	<ol><li>Cercam a amostra com 2,5 mL do banho de tampão de amostra.</li>
		<li>Adicionar um surfactante apenas abaixo da concentração micelle.</li>
		<li>Usar uma seringa Hamilton para cercar a amostra com um lipídio para evitar contato direto da amostra com ar.</li>
	</ol></li> <li>Selar a câmara de amostra com um boné equipado com esponjas molhadas e, se possível, com um banho de água adicionais (não em contato com a amostra) para mais suprimir evaporação.</li>
	<li>Iniciar a medição usando o software de rheometer específicos à temperatura ambiente; em alternativa, realizar a medição em temperaturas diferentes, tais como a 37 ° C (se são necessárias condições fisiológicas). 
	Nota: Refrigerar a amostra é muitas vezes acompanhada pela condensação do vapor de água do ar circundante, enquanto o aquecimento leva a maior evaporação. Ambos os efeitos incontrolavelmente podem alterar a concentração da amostra, para que todas as medições em uma série devem ser executadas a uma temperatura constante.</li>
	<li>Permitir a amostra equilibrar para 2 h à temperatura ambiente. A evolução temporal pode ser monitorizada com uma varredura de tempo (dados de um ponto por minuto; tensão γ = 5 %); frequência f = 1 Hz).</li>
	<li>Mede as propriedades mecânicas com os protocolos do teste desejado. Comece com uma série de varreduras de frequência (f-varre) porque eles deixam a amostra intacta e permitir mais medições. 
	Nota: Além disso, curto f-varreduras devem ser efectuadas antes e após as medições mais (tais como longo f-varre com uma resolução muito maior) para verificar que a amostra permaneceu inalterada durante todo o protocolo de medição completo.
	<ol><li>Realizar um curto f-varredura (e.g., γ = 5%; f = 0,01 Hz a 30 Hz; pontos de 5 dados por década).</li>
		<li>Realizar um longo f-varredura (e.g., γ = 5%; f = 0,001 Hz a 30 Hz; 21 pontos de dados por década); o regime de baixa frequência pode ser omitido se não for necessário para reduzir o tempo de medição.</li>
		<li>Realizar um curto f-varredura.</li>
		<li>Executar uma varredura-γ (por exemplo, f = 1 Hz; γ = 0,0125% a 100%; pontos de 20 dados por década). 
		Nota: Utilize o curto f - varrer primeiro, como é geralmente inconsistente com anterior f - varre porque redes geralmente ruptura durante a varredura-γ ou separar as chapas. Como alternativa, use o γ-rampa (por exemplo, = 0.025 s -1, t = 60 s); no entanto, as rampas normalmente requerem alterando o modo de motor, então subsequentes curto f-varreduras iria ser falsificadas.</li>
	</ol></li> <li>Bin e/ou liso, os dados brutos com um kernel Gaussian.</li></ol>
 3. análise da fluorescência-assistida de DNA recozimento <ol><li>8 preparar alíquotas de 12 µ l de cada amostra usando 1-4 µM DNA por vertente e 12,5 mM MgCl 2 em 1 x tampão TE 1x gel de ácido nucleico mancha de DMSO um 10.000 x estoque. Fazer um controle negativo sem DNA, mas incluem ácido nucleico gel mancha.</li>
	<li>Transferir as alíquotas para um prato PCR em tempo real e selar com película adesiva (por exemplo, uma placa de 96 poços de reação). 
	Nota: As altas temperaturas, utilizadas em protocolos de recozimento térmico evaporará amostras. Assim, certifique-se que os poços são hermeticamente fechados com película adesiva para evitar o aumento de concentração e evaporação de água, particularmente durante as experiências a longo prazo.</li>
	<li>Centrifugar a placa a 100 x g por 1 min à temperatura ambiente para remover as bolhas de gás; se expandem as bolhas de gás, os poços não podem ser analisados.</li>
	<li>Carregar a placa selada em um sistema PCR quantitativo em tempo real.</li>
	<li>Executar um programa de recozimento. Desnaturar o DNA a 90 ° C por 10 min. soltar a temperatura rapidamente a 72 ° C. Então, diminua a temperatura lentamente por 0,5 ° C cada 30 min. Depois que o sinal está estragada, acelerar a rampa de temperatura. 
	Nota: 72 ° C é suficientemente acima da temperatura real da hibridação; assim, o sinal é gravado sobre uma escala de temperatura larga apropriada para determinar a escala de temperatura necessário.</li>
	<li>Certifique-se de que a tampa do reciclador aquece a pelo menos 100 ° C para evitar a condensação da amostra evaporada sobre a película adesiva.</li>
	<li>Durante a montagem, excitar as amostras com um laser de argônio-íon em 488 nm e detectar a fluorescência em 550 nm quando usando uma mancha de gel de ácido nucleico (ou espectralmente semelhantes). Para outros corantes, escolha uma combinação adequada de excitação/emissão. Medir o sinal de fluorescência, sempre que possível para aumentar a total qualidade do sinal usando a built-in câmera. 
	Nota: Aqui, as medidas foram tomadas todas as 9 s.</li>
	<li>Se derretendo predefinidos e recozimento programas são aplicados, use o software fornecido para analisar os dados. Se não, subtrair o valor médio anterior do valor médio para cada etapa de temperatura obter a mudança relativa do sinal fluorescente.</li>
</ol> 4. AFM Imaging <ol><li>Cleave mica (por exemplo, mica &#34; V1 &#34;) anexando comercialmente disponível de fita adesiva e rasgá-lo fora; a camada superior da mica deve ser removida.</li>
	<li>Utilizando uma micropipeta, depositar pré-formado n HT em Mg 2 + com solução tampão dobrável sobre a mica clivada fresco e deixá-lo resolver durante 10 min.</li>
	<li>Girar as amostras em intervalos curtos 3 s a 2.000 x g em uma centrífuga de mesa pequena para remover o líquido restante. Vários n HTs ainda deve ser anexado à superfície de mica.</li>
	<li>Use uma ponta de cantilever com uma rigidez elevada (por exemplo, 54 Nm -1) e determinar a sua frequência de ressonância com o software interno do AFM.</li>
	<li>Registro do perfil de altura com o AFM no ar na batida modo de varredura baixas taxas (por exemplo, 1 linha/s) para evitar danificar ou deslocando o n HTS</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Para obter corretamente formadas redes, reunir os nanotubos de DNA é um passo crucial. Erros durante o processo de síntese impactar negativamente a qualidade do tubo; Portanto, é recomendável que ser usado para purificar os oligonucleotides HPLC ou um processo mais rigoroso. Desde que a formação de discretos ao invés de agregados nanotubos de DNA, bem como sua distribuição de comprimento, depende da estequiometria equimolar dos oligonucleotides constituintes n dentro do conjunto, é necessário para remeasure as concentrações de fios comprados, desde dado valores pode variar substancialmente a concentração real. Isso pode ser realizada, por exemplo, por espectroscopia de UV-Vis em um comprimento de onda de absorbância de 260 nm. Gostaríamos de salientar que os pesos moleculares e coeficientes de extinção variam entre as diferentes sequências; Portanto, os valores para traduzir a absorvância em concentração devem ser determinados para cada do oligonucleotide DNA. Quando utilizar equipamento otimizado para volumes de amostra pequena, como um NanoDrop, cada ponto de medição deve ser tomado várias vezes e em média. Estar em conformidade com a escala linear da deteção do espectrómetro. Dilua a fração utilizada para a determinação da concentração, se necessário. Imprecisões ligeiras podem ter um grande impacto sobre a estequiometria correta e a qualidade da formação do tubo; Portanto, a pipetagem das vertentes única deve ser tão precisa quanto possível. Posteriormente, a solução da amostra final deve ser misturada completamente pipetando lentamente a amostra acima e para baixo antes de colocá-lo no thermocycler. Se os fios foram modificados com corantes fluorescentes para visualização, todas as etapas devem ser executadas em um ambiente protegido da luz direta e a posterior adição de agentes antibranqueamento estabelecidas (i.e., oxigénio eliminação sistemas, tais como glicose oxidase/catalase) é recomendado. Depois que as únicas costas foram misturadas nas condições certa reserva, uma rampa de temperatura é aplicada para cruzar as estruturas (Figura 2A). Este padrão de temperatura segue a temperatura previamente determinado crítico hibridização, onde o DNA dupla forma de hélices. Vários métodos foram desenvolvidos para analisar a cinética de hibridização de DNA (ou seja, nativos DNA UV absorvância31, Calorimetria32ou corantes fluorescentes33). No último método, corantes intercalam em DNA dupla hélices, formando complexos altamente fluorescentes mais brilhante do que as tinturas não acopladas. Eles se ligam parcialmente double-stranded, mas não single-stranded DNA34. Portanto, tais corantes foram aplicadas para monitorar DNA nanostructure Self-assembly no sistema35 e podem ser usados para identificar as condições de montagem ideal.
Inicialmente, qualquer DNA dupla-hélice dentro da amostra, tais como duplex predefinidos e imprevisíveis, são desnaturadas em alta temperatura (90 ° C) para evitar o emparelhamento de base não intencionais. Uma posterior diminuição gradual da temperatura (semelhante a Figura 2A) reduz o movimento térmico dos fios de DNA, permitindo eventos base emparelhamento. Devido a minimização da energia livre, de DNA preferencialmente cruzar em suas sequências complementares. Quando é aplicado um corante intercalante dsDNA específica, o brilho aumenta com a formação de complexos altamente fluorescentes, que por sua vez é uma medida quantitativa para recém-formado double-stranded DNA34. A mudança relativa do sinal de fluorescência para a formação de 4HTs e 8HTs é plotada na Figura 2B. Esta mudança relativa é calculada pela média da intensidade de fluorescência para cada temperatura e posteriormente, subtraindo o valor médio da temperatura anterior. Com a diminuição da temperatura, uma elevada fluorescência pode ser detectada (Figura 2B), e o pico desta curva destaca a temperatura onde ocorrem eventos de hibridação massiva. A queda das curvas refere-se a valores de intensidade atingindo um platô. Dependendo da construção de DNA e sua complexidade (por exemplo, um conjunto de pequeno ou grande de DNA costas), o pico pode ser afiado (Figura 2B, curva azul) ou largo (Figura 2B, curva verde). Quando possível, esta deve ser testada para cada estrutura recentemente projetada assegurar que a porção gradualmente decrescente da rampa de temperatura contém o intervalo onde a formação de tubos através da formação dos segmentos de dsDNA hibridizadas está ocorrendo. Após a temperatura apropriada é determinado regime, nanoestruturas podem ser montadas com êxito em intervalos de temperatura muito estreita (Figura 2B, curva azul), ou até mesmo isothermally35. Note-se que a hibridação de DNA várias vertentes em grades periódicas induz cooperativa recozimento efeitos35,36, que suportam mais DNA recozimento. É preciso considerar que corantes intercalante esticar hélices de DNA, além de seus pares de base padrão 10,5 por curva helicoidal configuração, alterando assim a geometria global dos tubos. Portanto, não é aconselhável aumentar a concentração de corante ao longo de uma molécula por 900 pares de bases de DNA35. Além disso, a temperatura de montagem de pico pode desviar a real temperatura do recozimento ideal. Para alcançar alta precisão e para determinar a melhor condição para a formação do tubo, hibridização de DNA deve ser investigada durante muitas etapas de temperatura mudando lentamente, que devem ser verificação dupla com eletroforese em gel de agarose. Para o caso dos nanotubos de DNA, estabelecemos um protocolo de três passos. Primeiro, a amostra é aquecida a 90 ° C para desnaturar o ADN em cadeias simples. Posteriormente, uma escala de temperatura larga (em volta do pico de montagem do sinal de fluorescência) é coberta. No nosso caso, um intervalo de 10 ° C é coberto, variando de 65 ° C a 55 ° C, com um passo de-0,50 ° C cada 30 min. Na etapa final, a temperatura deve cair rapidamente à temperatura ambiente - ou, como no nosso caso, a 20 ° C - para evitar quaisquer interacções desfavoráveis em temperaturas intermediárias (Figura 2A). Geralmente, thermocyclers aquecer as amostras de temperaturas mais frias. Portanto, é importante ajustar a temperatura da tampa de acordo para limitar a evaporação do líquido da amostra durante a montagem, o que aumenta a concentração da amostra final.
Se o nHTs é formados adequadamente, organizam em redes puramente emaranhadas (Figura 3), sem interações, causando efeitos de reticulação entre tubos distintos. As referências cruzadas presumivelmente resultaria de segmentos de DNA não pareados estendendo-se de defeitos ao longo de um tubo ou nas extremidades pegajosas, que estariam livres para emparelhar com segmentos de single-stranded complementares nos tubos vizinhos. Estes efeitos induziria Propriedades não-lineares, tais como o endurecimento de estirpe (aumento de G' para tensões maiores), mas estão ausentes no emaranhado de redes (Figura 4). As γ-varreduras exibidas também revelam os regimes de tensão linear adequado para medições reológicas em geral. Acima de um certo limite, a rede rompe ou perde o contato com as placas do rheometer, que danifica irreversivelmente o sistema. Portanto, as tensões aplicadas devem ser no regime linear para obter dados fiáveis. Normalmente, uma tensão de 5% é suficiente para produzir dados bem acima do regime de ruído. Cepas maiores podem ser aplicadas; no entanto, que facilmente se aproximam do limite de ruptura, e os resultados podem ser falsifiEd devido a medição no regime não-linear.
Medições reológicas requerem uma preparação cuidadosa, consistente da amostra e cuidadosamente considerados protocolos de medição para obter resultados reprodutíveis e interpretáveis. O ponto central é estabelecer uma rede completamente aleatória, isotrópica entre as placas rheometer desde que estas redes são principalmente a estrutura só pode ser reproduzida. Assim, tempos de equilibração bastante longo (normalmente por volta das 2h, às vezes até mais) são necessários para dispersar qualquer ordenação efeitos que ocorrem devido ao alinhamento induzida por cisalhamento durante a pipetagem da amostra. Pré-teste experimentos são recomendados para gravação a evolução temporal (varredura de tempo) do sistema durante a equilibração, a fim de determinar o período de tempo necessário. Uma vez que os sinais atingir platôs sem mais alterações, o sistema é equilibrado. Uma vez equilibração condições foram determinadas, os testes desejados, tais como uma estirpe rampa ou f - ou γ-varre, pode ser executado. Testar um amplo espectro de cepas, finalmente, pode destruir a rede ou a conexão para as placas. No entanto, se os testes limitam-se a tensões abaixo do limite de ruptura, rampas de tensão e varre pode ser iterativamente repetido investigar potenciais efeitos de envelhecimento ou histerese. No caso do f-varre, tempos de medição podem variar substancialmente. Testes de baixas frequências dramaticamente prolongam as experiências, desde que uma oscilação pode levar alguns minutos. Note-se que, no caso de nHTs, f-varreduras revelam que o módulo de elasticidade G' excede o módulo viscoso G' por aproximadamente uma ordem de magnitude, que ilustra a resposta elástica predominante destes sistemas ( Figura 5). Geralmente, os diferentes tipos de experimentos podem ser acompanhados de curto f-varreduras antes e após a experiência principal para verificar que o sistema permaneceu intacta pela medição em si. No entanto, algumas máquinas têm que mudar o modo de motor subjacente para os diferentes tipos de medições, especialmente quando se muda de experimentos dinâmicos (por exemplo, oscilações para f-varre) para uma rampa de tensão estática. Esta mudança é muitas vezes acompanhada por cepas grandes espontâneas, destruindo a rede e medições posteriores de têmpera. Assim, é aconselhável verificar as especificações do rheometer usado.
Experiências de reologia em sistemas baseados em actina revelam um efeito dramático de desnaturação de proteínas que ocorrem na interface ar-água do sistema. Proteínas desnaturadas aderirem unspecifically uns aos outros, formando um gel denso que altamente pode dominar as propriedades mecânicas de todo o sistema. Para evitar o contato direto da amostra com o ar circundante, técnicas de passivação que também suprimem a evaporação do teor de água da amostra podem ser usadas. Três métodos possíveis são: (i) em torno da câmara de amostra com a mesma reserva como a amostra; (ii) utilização de surfactantes para cobrir a interface devido a seus domínios hidrofílicos e hidrofóbicos (deve ter cuidado, pois alguns surfactantes interferem com conformações de polímero); ou (iii) empregando lipídios mais biologicamente compatíveis, com efeitos semelhantes, como surfactantes. Deve notar-se que nHTs não estavam a ser sujeitas a efeitos de desnaturação na interface, e os resultados são independentes do método do passivation (Figura 6), que elimina uma importante fonte potencial de erro. Geralmente, a câmara de amostra sempre deve ser selada com um tampão, que pode ser equipado com esponjas úmidas para aumentar a umidade na câmara, suprimindo a evaporação.
Como brevemente descrito anteriormente, uma potencial fonte de erro em sistemas baseados em DNA é unhybridized DNA, tais como DNA de cadeia simples não pareado saliências em defeitos ou nas extremidades dos nanotubos, que podem causar efeitos adicionais de reticulação. Para investigar e/ou eliminar esta possibilidade, costas complementares curtas podem ser usadas para tampar essas extremidades pegajosas. No entanto, nossas próprias investigações mostraram que a adição de tampar vertentes teve nenhum efeito sobre o introduzido nHTs e o comportamento das redes emaranhados permaneceu inalterado (Figura 7). No entanto, tampar extremidades pegajosas com sequências complementares pode ser útil para outros sistemas baseados em DNA (e mais complexos) suprimir as interações indesejáveis. Além disso, amostras de HTs ndevem ser pipetadas cuidadosamente (por exemplo, para as etapas de diluição e preparação da amostra) para evitar qualquer quebrando ou outros danos aos tubos. Se a solução é pipetada demasiado aproximadamente, os tubos quebrar incontrolavelmente, expondo-se um grande número de extremidades pegajosas em pontos de defeito, levando a indesejada interações entre os tubos e reticulação potencial no sistema. Isto interfere com o sinal e conduz a efeitos de reforço, bem como efeitos não-lineares tais como endurecimento de estirpe, que se torna visível em varreduras de γ (Figura 8). Assim, pipetar a emaranhados solução só deve ser feita lentamente e usando pontas de pipetas com um diâmetro bastante grande (corte a extremidade de uma ponta da pipeta é aconselhável) para reduzir a distorcer as forças nos tubos.
Em conclusão, DNA nHTs são um sistema de modelo apropriado e altamente adaptável para estudar os polímeros semiflexível e redes formadas a partir destes filamentos, que representa uma nova classe de hidrogel mecanicamente ajustáveis a granel. Se os tubos são preparados cuidadosamente, eles podem ser usados para testar o impacto do lp dos filamentos em vários casos. A medição reológica granel do emaranhado de redes, por exemplo, revela que as dependências teoricamente previstas o módulo elástico com concentração e lp de são inconsistentes com a escala derivada experimentalmente legislação (Figura 9)9. Este estudo enfatiza que a elasticidade de uma rede pode ser aumentada, aumentando a rigidez dos polímeros subjacentes. Tradicionalmente, aumentando a rigidez de um hidrogel foi conseguido pela adição de polímeros mais para a solução ou através da indução de ligações cruzadas (físicas ou químicas) entre vizinhos polímeros37,38. No entanto, um maior teor molecular também está associado com uma malhagem reduzida, que pode limitar aplicações tais como a cultura de células 3D. As referências cruzadas, por outro lado, podem induzir mudanças morfológicas complexas dentro a arquitetura de rede subjacente, o que complica ainda mais o ajuste preciso das propriedades mecânicas de39. Usando redes de nHTs, entretanto, permite uma dissociação total desses parâmetros, segundo a qual os efeitos de enrijecimento podem ser induzidos por unicamente mudando a rigidez dos filamentos subjacentes, deixando a malhagem inalteradas. Além disso, as arquiteturas de tubo podem ser alteradas especificamente para integrar seletivamente efeitos adicionais tais como de reticulação, que, da mesma forma nas redes emaranhadas, cria novas possibilidades para testar experimentalmente predições teóricas para parâmetros tais comol tamanho p ou crosslink e força para as redes. Em geral, a arquitetura programável amplia o escopo das aplicações, permitindo o estudo de lp-efeitos dependentes não só no volume, mas também no nível único-molécula. Tubos etiquetados podem ser incorporados na rede para estudar, por exemplo, a dependência de lp no movimento unidimensional de um filamento em confinamento de tubo, comumente referido reptation (Figura 10)9. Se este movimento difusiva é visível, ele também verifica a natureza emaranhada da rede, desde que isso iria ser suprimido por efeitos de reticulação. Analisando a dinâmica subjacente também revela a malhagem da rede. Além disso, estes tubos podem ser usados para investigar a dependência entre a rigidez e quiralidade dos tubos subjacentes sobre a formação de feixes40,41,42,43, 44 , estruturas de 45 ou de ordem superior, tais como estrela como ásteres46,47,48,49,50, que pode ser induzida por efeitos de reticulação ou através ambientes aglomerados molecularmente27.

Devido os comportamentos complexos habilitados por suas propriedades mecânicas únicas, semiflexível polímeros são blocos de construção fundamentais da matéria viva. Em contraste com polímeros flexíveis, polímeros semiflexível adotam uma configuração estendida devido a sua rigidez de espinha dorsal não desaparecendo enquanto ainda permanecem sujeitas a fortes flutuações térmicas1. Assim, modelos estocásticos puramente não podem ser aplicados a seus comportamentos, como com os extremos de polímeros totalmente flexíveis ou rígidos. A cadeia de tipo worm chamado modelo2,3,4 foi desenvolvido para quantificar essa rigidez através a lp, que é a constante de decaimento da correlação tangente-tangente ao longo do filamento de4. Se lp é comparável ao comprimento de contorno (l.c) do filamento, o polímero é considerado semiflexível1. Análogo aos polos de uma tenda, seus arranjos em redes ou feixes estabiliza todo o sistema coletivo em frações de baixo volume, levando a incomum viscoelástico propriedades5,6,7, 8,9. Essas estruturas fornecem altas elasticidades em grande malha tamanhos10, mantendo a integridade mecânica enquanto ainda facilitando difusiva e processos de transporte ativo. Esta propriedade é especialmente indicada para sistemas biológicos, tais como o citoesqueleto ou a matriz extracelular, mas é também amplamente utilizado na engenharia de alimentos1,11,12.
Indo além da sua importância com a matéria viva, é fundamental examinar exaustivamente as propriedades físicas destas estruturas a fim de ter as ferramentas para desenvolver materiais biomimético ou hidrogel romance. Em termos de polímeros semiflexível, isto implica a determinação sistemática das propriedades coletivas de redes resultantes de filamento único propriedades como lp e o desenvolvimento de um quadro teórico descritivo. Em estudos pioneiros, a actina biopolímero celular foi estabelecida como um sistema modelo para polímeros semiflexível e é ainda considerada o padrão-ouro5,13,14,15 , 16 , 17. no entanto, estudos exaustivos são limitados com este sistema, desde que eles são obrigados às propriedades inerentes desta proteína. Diversas abordagens teóricas têm visa construir uma descrição dos comportamentos não-trivial mecânicas a nível de filamento único e conduziram a notavelmente diferentes previsões dimensionamento para a dependência o módulo de cisalhamento do planalto elástica linear, G de 0 (ou seja, a "elasticidade" da rede), no que diz respeito a concentração (c) e lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Enquanto o dimensionamento de concentração é prontamente acessível em experimentos com actina-based ou outros sistemas modelo e enquanto predições teóricas têm sido rigorosamente verificados13,16,24, 25, o dimensionamento em relação ao lp manteve-se experimentalmente inacessível. Isto, porém, é uma limitação principal desde lp também é uma variável independente que é a definição quantidade de polímeros semiflexível.
Esta central, natural limitação imposta pelo fixo lp de actina ou outros polímeros derivados biologicamente como colágeno recentemente foi resolvida empregando tubos telha-baseado de DNA, que são ajustáveis em suas propriedades mecânicas 9 , 26 , 27 , 28. ligeiras variações nas arquiteturas dos tubos (por exemplo, números diferentes do DNA constituinte vertentes dentro do anel de unidade) produzem valores distintos para lp, que pode ser avaliada através de microscopia de fluorescência, analisando um tubo flutuante ou avaliando as configurações curvas de vários tubos aderidas, como descrito anteriormente9,28. Essas análises revelaram que valores dep ldas populações diferentes de tubo variam ao longo de mais de uma ordem de magnitude e que técnicas de avaliação diferentes produzem resultados consistentes9,28.
Surpreendentemente, a escala global do planalto elástica linear cisalhamento módulo G0 em relação à concentração e lp foi relatada para ser inconsistente com todas as abordagens teóricas anteriores 9, em particular, demonstrando um muito mais forte do que o previsto dependência lp. Esses achados enfatizam o valor de um novo sistema de modelo para estudar as propriedades centrais de polímeros semiflexível. Empregando n-tubos de DNA de hélice dramaticamente amplia o escopo destas investigações. Não só pode lp ser variado livremente sem alterar o material básico, mas a natureza inerente programável do DNA pode permitir o exame sistemático dos elementos adicionais, tais como as referências cruzadas ou processos cinéticos de comutação. Além disso, estes tubos são solúveis em água e, em contraste com a maioria das proteínas, estável em pH adequado e condições iônicas por várias semanas, sem degradação detectável9.
Para montar estes tubos, é utilizado um conjunto de oligonucleotídeos de DNA, cada uma das quais contém dois domínios que compartilham sequências base complementares às duas vertentes vizinhas (devido as sequências específicas, um único fio não pode formar estruturas como pinos de cabelo). As sequências complementares cruzam de forma cíclica, formando anéis fechados, metade-sobreposição de dupla-hélice segmentos n interligados (figura 1A e B). Estes formam anéis em um discreta de diâmetro (Figura 1) e sua configuração de meia-sobreposição expõe axiais extremidades pegajosas complementares às extremidades pegajosas de outro anel. Esta adição seletiva de correspondência oligonucleotides desencadeia um empilhamento dos anéis, levando à polimerização eficaz de filamentosas tubos de hélice de DNA de tamanho n (n-HT). Seus comprimentos contornos tipicamente medem vários microns de comprimento, e sua distribuição de comprimento é comparável de actina filamentos9,26,,27,28. Tem sido demonstrado para nanotubos de DNA semelhantes que eles de fato apresentam cinética de polimerização semelhante dos microtúbulos e filamentos de actina<su></su>classe p = "xref" > 29. Dependendo o número n de cadeias de ADN individuais que compõem a estrutura básica do anel, a arquitetura nHT, bem como a sua circunferência e diâmetro, podem ser botija variados. Usar mais de DNA aumenta a circunferência dos tubos/anéis, e a correspondente alteração arquitetônica desloca as propriedades mecânicas para valores mais elevados dep l(Figura 1), correspondente a uma maior rigidez. Na escala mesoscópica, estes grandes valores dep ltraduzem em conformações menos dobradas devido a rigidez superior (Figura 1 e E).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="667">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:169px;">AFM cantilever ACTA</td>
			<td style="width:196px;">AppNano</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">AFM - NanoWizard 3</td>
			<td style="width:196px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">CCD camera</td>
			<td style="width:196px;">Andor</td>
			<td style="width:123px;">iXon DV887</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">DMSO</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D2650</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">DNA oligonucleotides</td>
			<td style="width:196px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;">For sequences see Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:169px;">DNA Cy3-labeled oligonucleotides</td>
			<td style="width:196px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;">For sequence see Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">EDTA</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">E-9884</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">Epi-fluorescence micro-scope</td>
			<td style="width:196px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">DM-IRB</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:169px;">MgCl2</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M-8266</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">Mica &#34;V1&#34;, 12 mm round</td>
			<td style="width:196px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:123px;">50-12</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">MicroAmp&#174; Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;">4346907</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">MicroAmp&#174; Optical Adhesive Film</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;">4306311</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">100x objective</td>
			<td style="width:196px;">Leica5</td>
			<td style="width:123px;">506168</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">Purified water</td>
			<td style="width:196px;">Merk Millipore - Milli-Q &#38; Elix</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Sapphire PCR tubes</td>
			<td style="width:196px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">683271</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">TProfessional Standard PCR Thermocycler</td>
			<td style="width:196px;">Core Life Sciences Inc.</td>
			<td style="width:123px;">070- Standard</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:196px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">4351405</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Rheometer</td>
			<td style="width:196px;">TA Instruments</td>
			<td style="width:123px;">ARES</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">SYBR&#174; Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;">S7567</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Tris</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T4661</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:169px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td style="width:123px;">X-100</td>
			<td style="width:180px;">Suppresses evaporation of sample at air-water interface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna nanotubes as a versatile tool to study semiflexible polymers

Propriedades mecânicas da matéria mole complexa, à base de polímero, tais como células ou redes de biopolímero, podem ser entendidas em nem o quadro clássico de polímeros flexíveis nem de hastes rígidas. Filamentos subjacentes permanecem estendidos devido a sua rigidez de espinha dorsal não desaparecendo, que é quantificada através do comprimento de persistência (l.p), mas eles também estão sujeitos a fortes flutuações térmicas. Sua rigidez de flexão finito leva a mecânica coletiva única, não-trivial de redes em massa, permitindo a formação de andaimes estáveis em frações de baixo volume, proporcionando grande malha tamanhos. Este princípio subjacente é prevalente na natureza (por exemplo, em células ou tecidos), minimizando o alto teor molecular e facilitando difusiva ou transporte ativo. Devido a suas implicações biológicas e potenciais aplicações tecnológicas em hidrogel biocompatível, semiflexível polímeros têm sido objecto de estudo considerável. No entanto, investigações compreensíveis permaneceram desafiadoras desde que eles dependiam de polímeros naturais, tais como os filamentos de actina, que não são livremente ajustáveis. Apesar dessas limitações e devido à falta de polímeros sintéticos, mecanicamente ajustáveis e semiflexível, filamentos de actina estabeleceram-se como sistema comum de modelo. Uma grande limitação é que a quantidade central lp não pode ser livremente ajustado para estudar seu impacto nas estruturas macroscópicas em massa. Esta limitação foi resolvida empregando estruturalmente programáveis nanotubos de DNA, permitindo a alteração controlada de rigidez do filamento. Eles são formados por projetos baseados em azulejo, onde um conjunto discreto de costas parcialmente complementares cruzar em uma estrutura em anel com uma circunferência discreta. Estes anéis apresentam extremidades pegajosas, permitindo a efetiva polimerização em filamentos vários microns de comprimento e exibir semelhante cinética de polimerização como biopolímeros naturais. Devido à sua mecânica programável, estes tubos são ferramentas versátil, a novela para estudar o impacto da lp a único-molécula, bem como a escala em massa. Em contraste com os filamentos de actina, eles permanecem estáveis durante semanas, sem degeneração notável, e sua manipulação é comparativamente simples.

A montagem dos nanotubos de DNA através de uma rampa de temperatura (Figura 2) é um método muito confiável para formar estes polímeros semiflexível artificiais. Estes polímeros têm características comparáveis aos seus homólogos naturais, tais como os filamentos de actina, mas fornecem um quadro experimental muito mais amplo, uma vez que suas propriedades mecânicas podem ser botija alterado9,27 . Como biopolímeros, eles podem ser dispostos em redes (Figura 3) e permitem especificamente testar o impacto da rigidez do filamento em massa das estruturas e propriedades. Como mostrado na Figura 4, estas redes exibem um regime de tensão linear para tensões até 10%, que se assemelha as características das redes de filamentos de actina. Dentro deste regime, reologia de cisalhamento linear pode ser facilmente aplicada, por exemplo, para determinar a resposta elástica e viscosa do DNA nanotubo redes analisados em diferentes frequências9. Estes testes revelam que essas redes predominantemente se comportam elasticamente (Figura 5). Em contraste com as medições com proteínas, esses tubos não desnaturar na interface ar-água da amostra e, portanto, sofisticados passivação são estratégias necessárias (Figura 6). Portanto, a manipulação das amostras é bastante simples e tem provado para ser muito robusto, gerando resultados consistentes com baixas variações de amostra-de-amostra.
No entanto, a questão de se a enciclopédia "extremidades pegajosas" de desirmanada single-stranded DNA em ambas as extremidades de cada tubo pode induzir hibridização indesejada, estocástica eventos permaneceram. Para resolver esta preocupação, sequências "acabar cap" complementares, cobrindo as extremidades do tubo foram adicionadas à amostra após o processo de hibridização estava completo. No entanto, a Figura 7 ilustra que tampar as extremidades dos filamentos não tem nenhuma influência detectável e que as extremidades do tubo não provocar qualquer efeito de reticulação transientes na rede9. Degola eventos só desempenham um papel significativo, quando a amostra é tratada demasiado aproximadamente e os tubos quebrar devido a pipetagem dura. Estes pontos de ruptura na verdade parecem induzir efeitos de reticulação, levando a respostas não-linear do sistema, tais como tensão de reforço (Figura 8).
Se as amostras são cuidadosamente preparadas, eles podem ser usados para testar o impacto que a concentração de filamentos (Figura 9A) ou o filamento rigidez (Figura 9B)9 nas propriedades mecânicas das redes consistindo de semiflexível polímeros. Pela primeira vez, a conexão quantitativa entre o filamento rigidez e a elasticidade da rede foi estudada experimentalmente e sistematicamente, produzindo um comportamento de lei de alimentação linear, que contradiz as previsões teóricas predominantes. Esses resultados ilustram que nanotubos de DNA são uma nova ferramenta versátil para estudar os efeitos de polímeros semiflexível, que eram anteriormente experimentalmente inacessíveis9,,27. Agora, várias teorias podem ser experimentalmente testadas, envolvendo declarações sobre dependências sobre a persistência de comprimento lp dos filamentos. Além disso, efeitos muito fundamentais, tais como reptation (Figura 10), podem ser investigados de várias perspectivas empregando tubos que variam de rigidez.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nome</td>
			<td colspan="3">Sequência de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U1: a1 *-b1 *-a2-b2</td>
			<td colspan="3">GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U1-Cy3: a1 *-b1 *-a2-b2</td>
			<td colspan="3">Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U2: a2 *-b2 *-a3-b3</td>
			<td colspan="3">GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U3: a3 *-b3 *-a4-b4</td>
			<td colspan="3">GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U4: a4 *-* b4-a5-b5</td>
			<td colspan="3">GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U5: a5 *-b5 *-a6-b6</td>
			<td colspan="3">GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6: a6 *-b6 *-a7-b7</td>
			<td colspan="3">GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U7: a7 *-* b7-a8-b8</td>
			<td colspan="3">GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U8: a8 *-b8 *-a9-b9</td>
			<td colspan="3">TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U9: a9 *-b9 *-a10-b10</td>
			<td colspan="3">GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U10: a10 *-b10 *-a11-b11</td>
			<td colspan="3">TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U11: a11 *-* b11-a12-b12</td>
			<td colspan="3">AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U12: a12 *-b12 *-a13-b13</td>
			<td colspan="3">ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U13: a13 *-* b13-a14-b14</td>
			<td colspan="3">GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4: a4 *-b4 *-a1-b1</td>
			<td colspan="3">GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5: a5 *-b5 *-a1-b1</td>
			<td colspan="3">GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T6: a6 *-b6 *-a1-b1</td>
			<td colspan="3">GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7: a7 *-* b7-a1-b1</td>
			<td colspan="3">GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T8: a8 *-b8 *-a1-b1</td>
			<td colspan="3">TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T9: a8 *-b8 *-a1-b1</td>
			<td colspan="3">GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T10: a10 *-b10 *-a1-b1</td>
			<td colspan="3">GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T14: a14 *-b14 *-a1-b1</td>
			<td colspan="3">TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tampão de extremidade A1</td>
			<td colspan="3">CCTAATCGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tampão de extremidade A2</td>
			<td colspan="3">CCTTTAGATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tampão de extremidade A3</td>
			<td colspan="3">CCACTCTTCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tampão de extremidade A4</td>
			<td colspan="3">CCGTGAGAACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tampão de extremidade A5</td>
			<td colspan="3">CCGCACGACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tampão de extremidade A6</td>
			<td colspan="3">CCAACGATGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tampão de extremidade A7</td>
			<td colspan="3">ATGCACCTCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tampão de extremidade A8</td>
			<td colspan="3">AACGGTAACTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tampão de extremidade B1 *</td>
			<td colspan="3">ACGCTAAGCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tampão de extremidade B2 *</td>
			<td colspan="3">ACCAGATACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tampão de extremidade B3 *</td>
			<td colspan="3">ACAAGATGTCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tampão de extremidade B4 *</td>
			<td colspan="3">ACGCATTGCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tampão de extremidade B5 *</td>
			<td colspan="3">ACTGTCGAACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tampão de extremidade B6 *</td>
			<td colspan="3">ACTTCTATCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tampão de extremidade B7 *</td>
			<td colspan="3">CATTCAAAGCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tampão de extremidade B8 *</td>
			<td colspan="3">TCCCAAGTCA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Exemplo de DNA sequências para a hibridização do nHTs exibidos em Figura 1, que também foram usados em estudos anteriores sobre nHTs9, classe = "xref" > 26,27,28. Um determinado conjunto de sequências permite a montagem de sete arquiteturas de tubo diferentes (por exemplo, a1 se com a sequência complementar a1 *). Outras arquiteturas de tubo não dadas aqui também podem ser formadas pela adição ou subtração de vertentes acompanhado pela de acordo com ciclização de vertente n com U1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56056/56056fig1.jpg"> 
Figura 1: tubo de montagem e arquitetura. (A) esquemático do assembly de um 4HT formado de quatro distintas 42-mers. Adjacentes de single-stranded DNA cruzar através de domínios alternados contínuos das bases de 10-11, indicados por carrapatos pretos longo (os carrapatos pretos curtos indicam unhybridized bases). Este motivo meia-cambaleou apresenta extremidades pegajosas em ambos os lados ao longo do eixo, permitindo o crescimento axial, indicado pela seta. As vertentes de limite U1 e T4 também apresentam domínios complementares e, portanto, formam um anel fechado, conforme indicado pela seta para a direita. Note que este desenho é uma representação 2D; no estado hibridizado, os fios formam Hélices duplas e todas as bases estão emparelhadas. (B) esquema de Quasi-3D de um tetrâmero 4HT com duas hélices dobro coberto na camada sombreada distante. Hélices duplas formam para domínios complementares e estão ligados a ambas as hélices duplo adjacentes do tubo uma vez por elemento de comprimento de unidade. Uma vertente do U2 é desenhado mais grosso para maior clareza. (C) exemplos de sete tubo diferentes arquiteturas são dadas, com números de vertente que variam de 4 HT para 14 HT e lp variando de 1,2 a 26 µm. (D e E) imagens de Epi-fluorescente de Cy3-rotulados, adsorvido 5 HT e 10 HT ilustram as diferentes stiffnesses através de contornos curvos de forma diferente. A cobertura vermelha é o contorno de filamento encontrado através de análise de imagem, com distância de-to-end R e l comprimento do contornoC. Figura adaptada de Schuldt et al.9. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56056/56056fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56056/56056fig2.jpg"> 
Figura 2: rampa de temperatura e assembly correspondente de DNA nanotubos. (A) DNA nanotubos são montados em um thermocycler através de um protocolo contendo que temperatura distinta vários passos sobre aproximadamente 11 h. (B) em um sistema PCR quantitativo em tempo real, a mudança relativa do sinal fluorescente de fios manchados é uma medida para DNA de cadeia dupla recém formada ao atravessar a rampa de temperatura. Dependendo do tipo de nanotubos de DNA, pode diferir da taxa de montagem. O mais complexo, o formando estrutura, a mais ampla assembleia, presumivelmente desde vertentes mais (e, portanto, de mais segmentos com sequências distintas e temperaturas de recozimento locais) precisa cruzar as posições adequadas, um processo que é conduzido por flutuações térmicas estocásticas. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56056/56056fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56056/56056fig3.jpg"> 
Figura 3: imagem de AFM representante de uma rede de emaranhados de 8HTs a 4 µM. O perfil de altura de uma rede pré-formadas de 8HTs absorvida a uma superfície de mica foi gravado usando o modo de bater no ar. Imagens AFM Visualizar uma projeção 2D da rede, mas não permitem a extração confiável de dados (por exemplo, o tamanho de engranzamento) para o caso 3D desde os tubos, bem como as redes são compactadas em uma configuração 2D. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56056/56056fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56056/56056fig4.jpg"> 
Figura 4: gama Linear. Medições de tensão (G' = 1 Hz) revelam um amplo platô elástico linear, sem sinais de reticulação efeitos tais como o comportamento não-linear, manifestando como estirpe endurecimento. Acima de uma tensão característica (diferente para cada nHT), o módulo elástico planalto rompe irreversivelmente. As barras de erro cada representam o desvio padrão da média das medições realizadas. Figura adaptada de Schuldt et al.9. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56056/56056fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56056/56056fig5.jpg"> 
Figura 5: dependência de frequência típica de uma rede de emaranhados 6HT. Redes de tubos de DNA mostram um platô amplo elasticidade durante quatro ordens de magnitude, dependendo da frequência aplicada. Conforme o esperado para uma rede de polímero, a parte elástica (G') a distorcer complexo módulo é significativamente maior do que a parte viscosa (G'). Figura adaptada de Schuldt et al.9. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56056/56056fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56056/56056fig6.jpg"> 
Figura 6: Sem efeitos de interface líquido-ar. Varreduras de frequência (f-varreduras; γ = 5%) de 8HT amostras em 8 µM revelaram que a influência dos efeitos da evaporação e da gelificação na interface ar-água são negligenciáveis. Vezes de equilibração diferentes, bem como dois métodos conhecidos para reduzir drasticamente a proteína de clustering na interface (surfactantes e lipídios), foram utilizados. Independente do método, nenhuma indicação de influências drásticas por evaporação ou superfície elasticidade foram gravadas. Aqui, G' representa o módulo de elasticidade e G ' representa o módulo viscoso (linhas tracejadas). Figura adaptada de Schuldt et al.9. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56056/56056fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56056/56056fig7.jpg"> 
Figura 7: nenhuma influência da modificação final. O módulo elástico planalto permanece constante quando tampando as extremidades livres pegajosas da 8HTs com suas respectivas sequências complementares. Figura adaptada de Schuldt et al.9. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56056/56056fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56056/56056fig8.jpg"> 
Figura 8: redes de influência dos procedimentos de manipulação do DNA pré-formada na medição. Dependendo de como as redes pré-formados são tratadas após a hibridização, as medições podem ser diferentes. Neste exemplo, o fluxo de cisalhamento durante a pipetagem de nanotubos o DNA tem sido variado drasticamente e tubos quebraram se tratado demasiado aproximadamente. Ruptura leva a interações indesejáveis entre expostos, single-costas complementares, correlacionando a segmentos quebrados ou danificados, que leva a um aumento na elasticidade e induz efeitos não-lineares, such como tensão de endurecimento (aumento da elasticidade para curva de grandes tensões, verde). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56056/56056fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56056/56056fig9.jpg"> 
Figura 9: Nanotubos de DNA permitem o estudo de lp dependências. (A) estudar redes de polímeros semiflexível com nHTs permite a investigação da resposta mecânica do sistema com o aumento da concentração (varredura de concentração), análoga aos estudos baseados em biopolímeros tais como actina. (B) além disso, as diferentes arquiteturas dos tubos facilitam a determinação da resposta mecânica com relação a variação de lp dos filamentos subjacentes, que é inviável com ocorrência natural semiflexível polímeros. Para este efeito, os dados de A é replotted para abordar o dimensionamento do módulo elástico do Planalto em relação a lp. As barras de erro cada representam o desvio padrão da média das medições realizadas. Figura adaptada de Schuldt et al.9. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56056/56056fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56056/56056fig10.jpg"> 
Figura 10: tamanho de engranzamento e Reptation. Imagens de fluorescência gravação de filamentos reptating (com rótulo único DNA 8HT incorporado em uma rede sem rótulo; c = 14 µM) pode ser usado para verificar a natureza emaranhada de filamentos na rede. Quaisquer efeitos de reticulação impediria esta difusão unidimensional. Baixo-relevo: Análise de Reptation pode ser usado para determinar o tamanho de engranzamento dimensionamento com concentrações, que compara bem com medições de actina e de acordo com predições teóricas30. As barras de erro cada representam o desvio padrão da média das medições realizadas. Figura adaptada de Schuldt et al.9. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56056/56056fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Polímeros semiflexível exibem propriedades mecânicas únicas que são aplicadas extensivamente por sistemas de viver. No entanto, estudos sistemáticos sobre biopolímeros são limitados desde propriedades tais como a rigidez do polímero são inacessíveis. Este manuscrito descreve como esta limitação é contornada por nanotubos de DNA programáveis, permitindo estudos experimentais sobre o impacto da rigidez do filamento.

Nanotubos de DNA como uma ferramenta versátil para estudar semiflexível polímeros

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

dna-nanotubes-as-a-versatile-tool-to-study-semiflexible-polymers

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K visualizações.  Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology. Polímeros semiflexível exibem propriedades mecânicas únicas que são aplicadas extensivamente por sistemas de viver. No entanto, estudos sistemáticos sobre biopolímeros são limitados desde propriedades tais como a rigidez do polímero são inacessíveis. Este manuscrito descreve como esta limitação é contornada por nanotubos de DNA programáveis, permitindo estudos experimentais sobre o impacto da rigidez do filamento.

Vídeo: DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent shape upon the application of a stimulus such as heat1-5. In a typical shape memory cycle, the SMP is first deformed at an elevated temperature that is higher than its transition temperature, Ttrans [either the melting temperature (Tm) or the glass transition temperature (Tg)]. The deformation is elastic in nature and mainly leads to a reduction in conformational entropy of the constituent network chains (following the rubber elasticity theory). The deformed SMP is then cooled to a temperature below its Ttrans while maintaining the external strain or stress constant. During cooling, the material transitions to a more rigid state (semi-crystalline or glassy), which kinetically traps or "freezes" the material in this low-entropy state leading to macroscopic shape fixing. Shape recovery is triggered by continuously heating the material through Ttrans under a stress-free (unconstrained) condition. By allowing the network chains (with regained mobility) to relax to their thermodynamically favored, maximal-entropy state, the material changes from the temporary shape to the permanent shape.
Cells are capable of surveying the mechanical properties of their surrounding environment6. The mechanisms through which mechanical interactions between cells and their physical environment control cell behavior are areas of active research. Substrates of defined topography have emerged as powerful tools in the investigation of these mechanisms. Mesoscale, microscale, and nanoscale patterns of substrate topography have been shown to direct cell alignment, cell adhesion, and cell traction forces7-14. These findings have underscored the potential for substrate topography to control and assay the mechanical interactions between cells and their physical environment during cell culture, but the substrates used to date have generally been passive and could not be programmed to change significantly during culture. This physical stasis has limited the potential of topographic substrates to control cells in culture.
Here, active cell culture (ACC) SMP substrates are introduced that employ surface shape memory to provide programmed control of substrate topography and deformation. These substrates demonstrate the ability to transition from a temporary grooved topography to a second, nearly flat memorized topography. This change in topography can be used to control cell behavior under standard cell culture conditions.

A method for developing cell culture substrates with the ability to change topography during culture is described. The method makes use of smart materials known as shape memory polymers that have the ability to memorize a permanent shape. This concept is adaptable to a wide range of materials and applications.

Forma Polímeros Memória da Cultura célula ativa

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Bioengenharia

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

A Pele Tridimensional Humanos Reconstruir Modelo: uma Ferramenta para o Estudo da Pele Normal e Progressão Melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the engineered pDNA is administered to the vaccines, it is transcribed and translated into immunogen proteins that can elicit responses from the immune system. Many ways of delivering DNA vaccines have been investigated; however each delivery route has its own advantages and pitfalls. Skin tattooing is a novel technique that is safe, cost-effective, and convenient. In addition, the punctures inflicted by the needle could also serve as a potent adjuvant. Here, we a) demonstrate the intradermal delivery of plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein (pCX-EGFP) in a mouse model using a tattooing device and b) confirm the effective expression of EGFP in the skin cells using confocal microscopy.

Skin tattooing is a potent and safe way to delivery DNA vaccine intradermally. Here, a DNA plasmid encoding EGFP is delivered by tattooing to the skin of a laboratory mouse, and the expression of EGFP in the skin cells is then inspected by confocal microscopy.

Pele a tatuagem como uma nova abordagem para a Campanha de Vacinação de DNA

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

A plataforma automatizada versátil para experiências de estimulação Micro escala celulares

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para<em&gt; In Vivo</em&gt; Imageamento óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

A Síntese de hidrogéis RGD-funcionalizado como uma ferramenta para aplicações terapêuticas

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Reconhecimento Molecular de engenharia com Polymers Bio-mimético em únicos Walled nanotubos de carbono

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Um método versátil de padronização proteínas e células

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...