Gostaríamos de agradecer o apoio financeiro dado a este projecto, a Mariana Di Doménico pela sua assistência técnica com microscopia confocal; CSIC para José Leonardo Báez para correções seu manuscrito; para Luciano Correa por sua dedicação para a criação do vídeo; a Natalia Rosano por emprestar sua voz para o vídeo e o centro de estoque de drosófila de Bloomington para fornecer os estoques utilizados neste estudo. O Apa1 anticorpo monoclonal anti-Ptc desenvolvido por Isabel Guerrero foi obtido do banco do desenvolvimento de hibridoma estudos (DSHB) sob os auspícios dos FORMULADORES e mantido pelo departamento de ciências biológicas, da Universidade de Iowa, Iowa City, IA 52242.

Dia 1
1. coleta e cultivo de pupas.
<ol>
	<li>Remover 0 h após a formação do casulo (APF) ou pré-pupa usando um pincel molhado de frascos culturas e colocá-los em frascos novos quase completar o período de desenvolvimento (ver 2.1 e 2.2). 
	Nota: Uma população saudável de moscas deve ser mantida usando protocolos padrão de cultivo. Depois de três ou quatro dias em que os ovos são postos, os adultos podem ser removidos de frascos para permitir um desenvolvimento ideal dos indivíduos. Eles são mantidos a uma temperatura constante, até as terceiro ínstar larvas iniciar pupa. A transição larval/pupa é marcada pela formação da prepupa, considerado o h 0 APF. O prepupa é uma larva branca imóvel que tem um oblongo, redondo forma com salientes espiráculos anteriores.</li>
</ol>
Dia 2
2. transferência, dissecção e fixação.
<ol>
	<li>Transferir as pupas (2 h antes do tempo de desenvolvimento completo) com um pincel, a lâmina de microscópio com fita dupla-face adere a ele. Posicione as pupas para formar que uma linha com os lados dorsais acima e cefálicas acaba enfrentando a mesma direção.</li>
	<li>Retornar o microscópio para temperatura constante e permitir que as pupas completar o tempo de desenvolvimento adequado (ou seja, 24-30 h APF). 
	Nota: A lâmina de microscópio com a fita dupla-face será uma plataforma de dissecação transitória para remover o caso pupal (veja abaixo). O lapso de tempo do slide de microscópio (fora do frasco) ajuda a secar o caso pupal, tornando-o facilmente quebrável com fórceps.</li>
	<li>Remova o opérculo do caso pupal usando fórceps.</li>
	<li>Resolver o caso com fórceps (como mostrado no vídeo) fazendo uma linha ao longo do lado da pupa à extremidade caudal do mesmo. Com a iluminação apropriada é possível detectar a forma interna da pupa evidenciando um espaço logo acima da articulação da ala pupal. Este espaço serve como um guia para realizar a abertura sem danificar a pupa.</li>
	<li>Remova partes do caso, buscá-los pela fronteira aberta e carregando-os para o lado oposto, onde a fita dupla-face irá detê-los. No final da dissecação as pupas será quase "peladas", que apenas um pequeno pedaço do caso estará cobrindo a ponta posterior. Nota: O propósito de deixar uma pequena quantidade de caso na extremidade caudal superior é garantir uma versão suave do caso a lâmina com a fita dupla-face. O raciocínio por trás desta ação é porque se você remover muito do caso você grandemente o risco de danificar a pupa. Por outro lado se você remover muito pouco, a pupa não facilmente virá livre do caso.</li>
	<li>Empurre para baixo (com fórceps) o restante do processo. Este movimento irá disparar a extremidade anterior da pupa, permitindo que a cabeça e o tórax de permanecer em uma posição preferencial de aderir e ser transferido na etapa subsequente.</li>
	<li>Pegue um novo slide com fita dupla-face e invertê-lo na linha de pupas ou crisálidas. Recomendamos realizar esta abordagem, observando os movimentos com o auxílio do microscópio estereoscópico para evitar quebra das pupas.</li>
	<li>Pressione ligeiramente para fazer as pupas, ficar com a fita e deslizar suavemente o slide a fim de remover as pupas do resto dos casos. Inverter o microscópio: as pupas vão ser preso no lado dorsal ao nível da sua cabeça / área do tórax.</li>
	<li>Cobrir todas as pupas nuas com paraformaldeído 4% e esperar 10 min. Em nossa experiência, este lapso de tempo com o fixador ajuda a mudar a consistência da cutícula, tornando-se firme, menos pegajoso e fácil de manusear. 
	Nota: Para realizar a extração do ácido ribonucleico (RNA), substituto paraformaldeído para tampão fosfato salino (PBS) feito com RNase livre água e remover as asas pupal, fazer um corte (com o auxílio de tesouras) perto do ponto de articulação de cada membro. Usando fórceps, transferi a pupa asa para um tubo de microcentrifugadora com 1 mL de reagente de tiocianato e fenol de guanidínio. Depois de coletar um total de 50-80 asas, armazene o tubo microcentrifuga a-80 ° C até realizar a extração de RNA10,11.</li>
	<li>Faça uma pequena incisão na região da dobradiça da ala ou perto dele. Permitem que o fixador alcançar o epitélio da asa. Usando uma pipeta (p200) flush fixador sobre a asa. Quando rubor substituir o contaminado se fixam com o novo. Após o enxaguamento, manter a asa em fixador por 5 min. 
	Nota: Embora esta manobra ajuda a limpar a maioria do tecido contaminante, alguns hemócitos e gotículas de gordura podem permanecer presas entre as camadas epiteliais dorsais e ventrais da asa (ver figura 1A).</li>
	<li>Arrancar com a pinça de fronteiras a cutícula (como mostrado no vídeo) expandindo o orifício e permitindo a liberação do epitélio asa do sac a cutícula. Uma vez que o tecido da asa é liberado, deixá-lo na solução de paraformaldeído para completar 30 min de fixação.</li>
	<li>Transferir as asas fixas para um 4-jorrava prato plástico preenchido com PBST (Triton X-100 0,05%). Loja durante a noite a 4 ° C.</li>
</ol>
Dia 3
3. incubação do anticorpo primário.
<ol>
	<li>Permeabilize o tecido incubar as asas pupal em PBST (Triton X-100 0,2%) por 15 min, usando uma plataforma oscilante para facilitar um movimento médio líquido suave. 
	Nota: Até as amostras de montagem, as etapas devem ser executadas utilizando uma plataforma de balanço.</li>
	<li>Bloquear as amostras usando PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) por 1h.</li>
	<li>Use a mesma reserva para diluir o anticorpo primário (rato anti-Ptc, 1: 100) e incube as asas pupal durante a noite a 4 ° C.</li>
</ol>
Dia 4
4. incubação do anticorpo secundário.
<ol>
	<li>Lavagem de amostras 4 x 10 min cada com PBST (Triton X-100 0.05%)</li>
	<li>Incube com anticorpo secundário (por exemplo, anti-rato conjugado com fluorocromo) diluído a concentração apropriada em PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) à temperatura ambiente no escuro, durante 2 h. 
	Nota: Se for apropriado, use 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e/ou faloidina para counterstain o tecido. Adicione estas sondas com o anticorpo secundário, tendo em conta o comprimento de onda de emissão dos fluorochromes para evitar a sobreposição de sinais.</li>
	<li>Lavagem de amostras 4 x 10 min cada com PBST (Triton X-100 0.05%)</li>
</ol>
5. montagem
<ol>
	<li>Prepare um slide de amostra colocando 4 pontos de esmalte transparente sobre o microscópio como se fossem os vértices de um quadrado.</li></ol>Eles serão os pontos onde as lamelas descansará, ajudando a evitar o esmagamento do tecido.
	<li>Lugar de 30 µ l de mídia (80% de glicerol/Tris-HCl) no centro da Praça dos pontos feitos com esmaltes sem tocar em qualquer um dos cantos (pontos) de montagem. Tira uma pipeta com uma ponta cortada amarelo, carregar alguns meios de montagem e desenha em várias asas pupal.</li>
	<li>Transferi as asas pupal para o ponto de montagem de mídia sobre a lâmina de microscópio. Com o auxílio de uma ponta, espalhar a mídia de montagem e afundar as asas pupal para impedi-los de flutuante. A morfologia do tecido será mantida se as asas permanecem inalteradas quando o vidro é colocado em. Antes de colocar o tampa de vidro, remova as bolhas de ar.</li>
	<li>Abaixe a lamela sobre as amostras, tentando evitar a geração de bolhas de ar. Este movimento pode ser feito com o auxílio de fórceps.</li>

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O método de dissecação descrito neste vídeo pode ser usado para preparar amostras de alta qualidade da drosófila asas pupal de diferentes estágios de desenvolvimento para muitos tipos de técnicas (por exemplo, imunofluorescência, síntese de cDNA para ensaios PCR, in vitro desenvolvimento de asa). Em termos deste método o cientista envolvidos usaram 24-30 h APF. No entanto, não deve haver nenhum obstáculo dentro as etapas essenciais na dissecação da pupa mais jovem ou mais velho. Mudanças podem ter que ser feitas para acomodar crisálidas de palco menor.
O protocolo pode ser realizado para dissecar uma pupa ou pupas vários ao mesmo tempo. Isso ajuda a acelerar o processo, tornando mais fácil para chegar a um grande número de asas dissecados. Neste caso, há a opção de remover uma linha de pupas de 4-5 ao mesmo tempo. Você pode remover as pupas juntos ou se não for possível, continuar a remover individualmente para o mesmo slide (consulte a secção III do vídeo: "Dissecação de pupas múltiplas"). Para remover a pupa nua da caixa aberta, é importante que a ponta posterior é pequena o suficiente. É possível remover o caso inteiramente; embora mais rápido seria a transferência, a remoção de todo o caso é um desafio e há um maior risco de danificar a pupa.
Experiência dita que uma manobra importante a considerar é deixar (a última 2 h para completar o tempo de desenvolvimento previsto) a pupa anexado para o slide de microscópio dentro da incubadora, mas fora do frasco. Este lapso de tempo ajuda a secar o caso tornando mais fácil de quebrar. Outro passo crítico durante a dissecção para imuno-histoquímica, é descascar fora a cutícula que cobre o epitélio de asa, desse modo, concedendo acesso do anticorpo para a superfície da asa inteira. Esta etapa deve ser feita após a fixação por vários minutos (pelo menos 5 min depois de fazer a incisão no ponto de articulação) porque o fixador estabiliza os tecidos e altera a consistência de cutícula, tornando mais fácil de descascar.
Durante a execução de todas as etapas de imuno-histoquímica, certifique-se de que as asas estão em constante movimento (plataforma de balanço). O movimento ajuda a melhorar o intercâmbio e a penetração das soluções durante lavagens e incubação do. No entanto, é importante para realizá-las com cuidado, evitando a ocorrência de distorções indesejadas na morfologia dessa estrutura frágil (ou seja, é suficiente que as oscilações da plataforma mova ligeiramente o líquido médio contendo as amostras).
Esse procedimento fornece uma abordagem complementar e alternativa para os métodos já publicados para dissecação asa pupal.

Asas de drosófila são desenvolvidas a partir dos discos de imaginária de asa. O primordial destes discos de asa são colocadas de lado durante o desenvolvimento embrionário como pequenos grupos de 20-30 células imaginária que invaginate do epitélio embrionário. Quando a larva está crescendo para a terceira fase de instar, mitose ocorre nas células imaginária em horários específicos característicos, aumentando seus números (cerca de 50000 células) e formando a ala disco1,2,3, 4. Como as células proliferam, elas forme um epitélio tubular, resultando em uma espiral Self dobrável compacta. Durante a pupa, o epitélio de disco telescópios para fora a forma que as duas camadas de asa e as veias longitudinais começam como lacunas entre eles, que ocorre duas vezes durante a asa do desenvolvimento5,6.
O arranjo das veias sempre tem um padrão idêntico; a capacidade de facilmente identificar cada alteração no âmbito da formação de veias faz mutações extremamente visíveis (por exemplo, faltando ou extra veias, mudanças nas posições de veia, etc.). Curiosamente, as variações do fenótipo são geralmente as provas de mutações em componentes conhecidos ou novela de sinalização de caminhos que são relevantes para o desenvolvimento da asa. Um dos caminhos que desempenha um papel na determinação da posição e mantendo a veia e territórios intervein é o Hedgehog (Hh) via6,7,8.
Dada a importância da ala pupal como um sistema modelo, será importante obter amostras de boa qualidade para trabalhar com. No passado, os cientistas que publicaram protocolos para dissecar Drosophila asas não deram um guia adequado para obter amostras viáveis. Sem a orientação de um pesquisador se claramente não pode visualizar o processo. Essas abordagens alternativas de dissecação a pupa é dividida em dois, separando a asa do tecido circundante e repetidamente lavada para remover os detritos. Este tipo de abordagem pretende deixar a folha livre de contaminantes, mas devido a experiência anterior, o processo é mais lento e há uma maior chance de comprometer a estrutura do frágeis asas9.
O procedimento descrito aqui foi desenvolvido pela demanda para encontrar um método rápido e eficiente para obter amostras de asa pupal apropriadas detectar proteínas específicas ou transcrições usando protocolos de immunodetection ou polimerase ensaios de reação em cadeia (PCR). Para ilustrar isso, a expressão e a localização de Patched (Ptc ou o receptor canônico da via Hh) é detectado em amostras de asa pupal, fornecendo um protocolo que inclui detalhes relevantes para executar com êxito o completo procedimento.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope with cool light illumination</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Rocking platform</td><td>Biometra (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>StarFrost</td><td>8037/1</td><td></td></tr><tr><td>Cover glasses (24 x 32 mm)</td><td>Deltalab</td><td>D102432</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Lawton</td><td>63-1400</td><td></td></tr><tr><td>Multi-well plastic dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>p100 or p200 pipette</td><td>Finnpipette (Labsystems)</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bio Basic INC.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Mallinckrodt</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DEPC treated water</td><td>MO.BIO</td><td>17011-200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/800)</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &amp;mu;g/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/100)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td></td><td>By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI, 1 mg/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/5000)</td><td>Invitrogen</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol&lt;br/&gt; (1/600 working dilution)</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Canton S (fly stock)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

Desenvolvimento de asa em Drosophila melanogaster é um modelo ideal para o estudo de morfogênese a nível do tecido. Estes apêndices desenvolvem a partir de um grupo de células chamado discos imaginária de asa formados durante o desenvolvimento embrionário. Na fase larval os discos imaginária crescem, aumentando seu número de células e formando estruturas epiteliais monolayered. Dentro da pasta pupal, os discos imaginária brote para fora e dobram em bilayers ao longo de uma linha que se torna a futura margem da asa. Durante este processo, as veias primodia longitudinal se originam células veia nas potenciais superfícies dorsais e ventrais da asa. Durante a fase de pupa as listras de veia células da superfície de comunicam para gerar tubos apertados; ao mesmo tempo, as Cruz-veias começam a sua formação.
Com a ajuda de marcadores moleculares apropriadas, é possível identificar os principais elementos que compõem a ala durante seu desenvolvimento. Por esta razão, a capacidade de detectar com precisão as transcrições ou proteínas nesta estrutura é fundamental para estudar a sua abundância e localização relacionadas com o processo de desenvolvimento da asa.
O procedimento descrito aqui centra-se na manipulação de asas pupal, fornecendo instruções detalhadas sobre como dissecar a ala durante a fase de pupa. A dissecção de tecidos pupal é mais difícil de executar do que suas contrapartes em larvas de terceiro instar. É por isso que esta abordagem foi desenvolvida, para obter amostras de rápida e eficiente de alta qualidade. Detalhes de como delgados e montagem destas amostras de asa, para permitir a visualização de proteínas ou componentes celulares, são fornecidas no protocolo. Com pouco conhecimento, é possível coletar 8-10 asas pupal de alta qualidade em um curto espaço de tempo.

O protocolo oferece um método simples para a obtenção de amostras de asa pupal que retêm a morfologia familiar da asa. Partir dessas preparações, é possível obter pilhas de imagens que podem ser projetadas como 2-D ou 3-d, para investigar a distribuição e/ou o enriquecimento das proteínas durante a diferenciação da ala. Um protocolo semelhante (veja a nota em 2.9) pode ser usado para coletar a amostra de grandes asas pupal (envolvendo asas pupal de 50-80) necessária para sintetizar ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA), o modelo usado em reações de PCR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55854/55854fig1.jpg"> 
Figura 1 : Gene de hedgehog caminho em Drosófila asas pupal 
(A) remendado, o receptor canônico do percurso do ouriço, foi visualizado a 24-30 h APF usando mouse anti - Ptc. núcleos foram counterstained com DAPI Considerando que os filamentos de actina são visualizados usando uma faloidina verde-fluorescente. Distribuição de actina ajuda a localizar as veias da asa e sua relação com a expressão remendado . Ao mesmo tempo, a mancha faloidina revela a presença de alguns hemócitos e gotículas de gordura (círculos grandes) como contaminar o tecido. ampliação de 20 x, anterior acabou. Escala da barra, 100 µm (B) Amplicons de actina (faixa 1, 280 bp) e ptc (pista 2, 236 bp) foram obtidos usando o synthetized do cDNA de RNA mensageiro (mRNA) asa amostra gerada por um protocolo similar de dissecação. MW, peso molecular. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55854/55854fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

A capacidade de detectar com precisão as transcrições ou proteínas em Drosophila tecidos é fundamental para estudar a sua abundância e relacionadas com o processo de desenvolvimento de localização. Aqui está a descrição de um procedimento simples para dissecar as asas pupal. Estas asas podem ser usadas como amostras em várias técnicas (imuno-histoquímica, ensaio PCR, etc.).

Um método rápido e eficiente para dissecar asas Pupal de Drosophila apropriado para Immunodetections ou ensaios PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

a-rapid-efficient-method-to-dissect-pupal-wings-drosophila-suitable

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

8.0K visualizações.  Laboratorio de Biología del Desarrollo. A capacidade de detectar com precisão as transcrições ou proteínas em Drosophila tecidos é fundamental para estudar a sua abundância e relacionadas com o processo de desenvolvimento de localização. Aqui está a descrição de um procedimento simples para dissecar as asas pupal. Estas asas podem ser usadas como amostras em várias técnicas (imuno-histoquímica, ensaio PCR, etc.).

Vídeo: A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Dissecção de músculos de vôo de Drosophila melanogaster para abordagens Omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genética

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualização de Propriocepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas e pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Neurociência

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Dissecção e coloração dos ovários Pupal drosófila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Biologia do Desenvolvimento

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

Preparando a desenvolver tecido olfativo periférico para Molecular e análise imuno-histoquímica em Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Dissecação da Retina Pupal drosófila para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in multicellular organisms. The TGF-&#946; superfamily includes TGF-&#946;, bone morphogenetic protein (BMPs), Activins, Growth and Differentiation Factors, and Nodals. It has long been known that the amount of ligand exposed to cells is important for its effects. It was thought that long-range concentration gradients set up embryonic pattern. However, recently it has become clear that the timing of exposure to these ligands is also important for their downstream transcriptional consequences. A TGF-&#946; superfamily ligand cannot have a developmental consequence until it is released from the cell in which it was produced. Until recently, it was difficult to determine when these ligands were released from cells. Here we show how to measure the release of a Drosophila BMP called Decapentaplegic (Dpp) from the cells of the wing primordium or wing disc. This method could be modified for other systems or signaling ligands.

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The timing of exposure to ligands may impact their developmental consequences. Here we show how to image release of a Drosophila bone morphogenetic protein (BMP) called Dpp from cells of the wing disc.

Imagem Dpp Liberação de um disco de asa drosophila

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila Imunohistoquímica Abdomen Pupal

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Biologia

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

A longo prazo no Vivo controle da dinâmica celular inflamatória dentro drosófila pupas

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Imunologia e Infecção

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

Análise do Ciclo de células vivas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos usando o acústico Attune Focando Cytometer e Vybrant DyeCycle Violeta DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Dissecando, consertando e visualizando o Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

Um método rápido e eficiente para dissecar asas Pupal de Drosophila apropriado para Immunodetections ou ensaios PCR

Resumo

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