Os autores agradecem a equipe da instalação animal (BRC) por seu apoio contínuo. Este trabalho foi financiado pelo National Health and Medical Research Council e pelo Australian Research Council.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética e Cuidados Animais da Universidade de Nova Gales do Sul. 1. Preparação do Transgene (Integração Aleatória) <ol><li> Eletroforese analítica em gel de agarose. <ol><li> Digite o plasmídeo para acelerar o transgene usando enzimas apropriadas (incubação de 1 hora) ou enzimas de rápida digestão (15 a 30 min de incubação) em um termociclador seguindo as recomendações do fabricante (veja a Figura 2A e sua legenda). </li><li> Juntar um gel de agarose de ácido tris-acetato-etilenodiaminotetraacetico a 1% (TEA), corado com 0,5-1,0 μg / mL de brometo de etidio (EtBr). NOTA: Tenha cuidado ao usar EtBr; É um mutagênico potente. Use o equipamento de proteção pessoal apropriado (consulte a folha de dados de segurança do material). </li><li> Carregar um marcador de peso molecular de 1 kb. </li><li> Carregue os fragmentos linearizados ( ie, transgene e espinha dorsal). </lI&gt; <li> Execute a eletroforese a 100 V por 45 min. </li><li> Visualize o gel em um transiluminador ultravioleta (UV) para verificar se a digestão está completa e para confirmar o tamanho correto do transgene ( ou seja, 7,338 pb, veja a Figura 2A ). </li></ol></li><li> Electroforese preparada em gel de agarose. <ol><li> Elimine um gel de agarose TAE a 1% corado com uma mancha de gel de baixa toxicidade. Carregar 8 alíquotas (1 μg cada) de transgene linearizado sem marcador de peso molecular e executar a eletroforese a 100 V durante 45 min. Use um bisturi para excluir todas as 8 bandas correspondentes ao transgene linearizado. </li><li> Extraia o DNA usando um kit de extração de gel seguindo as recomendações do fabricante (veja a Tabela de Materiais ). <ol><li> Derreta os fragmentos de gel a 50 ° C em tubos de 1,5 mL durante pelo menos 15 min. Precipitar com isopropanol e depois adicionar o tampão de ligação. </li><li> Combine todo o DNA, pipetando tudo em uma coluna. Eluir em tampão de microinjecção livre de nuclease (8 mM Tris-HCl e 0,15 mM EDTA). Filtrar através de um filtro de microcentrífuga de 0,22 μm e centrifugação por 60 s a 12 000 x g. </li></ol></li><li> Medir a concentração e a qualidade do DNA usando um espectrofotômetro. Verifique se a relação A260 / A280 é de cerca de 1,8 ( ou seja, nenhuma contaminação por proteínas) e a relação A260 / A230 é pelo menos 2,0 ( ou seja, não há contaminação por solventes orgânicos). Diluir até 3 ng / μL em tampão de microinjecção livre de nuclease, alíquota (20-50 μL) e congelar a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Síntese de Componentes CRISPR (Gene Targeting) <ol><li> Cas9 mRNA. <ol><li> Diluir o ARNm Cas9 (obtido a partir de uma fonte comercial, ver a Tabela de Materiais ) a uma concentração de 1 μg / μL em tampão de microinjeção livre de nucleases. </li><li> Alíquota em 2 μL e livre<html> Ze a -80 ° C. </li></ol></li><li> RNA de guia único (SgRNA). <ol><li> Identifique as seqüências genômicas desejadas de dois lados (guias) utilizando uma ferramenta de projeto computacional que permita o potencial mínimo de atividade fora do alvo 17 . <ol><li> Para o knockout de genes, selecione sistematicamente duas guias localizadas a poucas centenas de pares de bases (pb) separadas, em direções opostas, e incluem o codão de início do gene de interesse. Para reparo direto de homologia, selecione duas guias sobrepostas (sempre que possível), em direções opostas. NOTA: Como exemplo, os seguintes guias foram recentemente co-injetados com sucesso para interromper o primeiro exão do gene TPM4.2 : Guia 1: 5 &#39;CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3&#39;; Guia 2: 5 &#39;CAGAACGATTGAGCTATGGC 3&#39; </li></ol></li><li> Peça um conjunto de iniciadores conforme descrito na Tabela 1 . </li><li> Sintetizar um modelo de DNA linear. <ol><li> Diluir px330Ref &quot;&gt; 12 plasmídeo a 10 ng / μL em água livre de nucleases. </li><li> Prepare a mistura principal conforme indicado na Tabela 1 . Adicione a polimerase no final e mantenha a mistura principal no gelo. </li><li> Misture e divida isso em 8 tubos de PCR (19 μL / tubo). Adicione 1 μL de px330 por tubo e execute o PCR nas seguintes condições: 1 min a 98 ° C; 40 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 64 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 15 s; E um alongamento final a 72 ° C durante 5 min. Segure a 4 ° C. </li><li> Purifique os produtos de PCR usando um kit de purificação por PCR (veja a Tabela de Materiais ), um colector e uma fonte de vácuo (para um processamento mais rápido). Aplique a força máxima no vácuo ( ou seja, 8 mbar). <ol><li> Adicione 5 volumes (100 μL) de tampão de ligação a 1 volume da amostra de PCR e misture. </li><li> Coloque uma coluna de rotação de membrana de sílica (fornecida) em um tubo de coleta (fornecido) de 2 mL para centrifugação ou no colector para processo de vácuoIng. Para ligar o DNA, aplique sucessivamente todas as 8 amostras à coluna e vácuo ou centrifugadora por 60 s a 12.000 xg por cada carga. </li><li> Para lavar, adicione 0,75 mL de tampão de lavagem (PE tampão) à coluna e vácuo ou centrífuga por 60 s a 12.000 x g. Centrifugue a coluna por 60 s a 12.000 xg para eliminar o etanol residual. </li><li> Coloque a coluna em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL. Para eluir o DNA, adicione 30 μL de água livre de nuclease ao centro da membrana, deixe a coluna repousar durante 1 min e centrifugue por 60 s a 12 000 g. </li></ol></li><li> Medir a concentração usando um espectrofotômetro; Tipicamente, a concentração deve ser 100 ng / μL ou superior. Verifique se a relação A260 / A280 é de cerca de 1,8 ( ou seja, nenhuma contaminação por proteínas) e a relação A260 / A230 é pelo menos 2,0 ( ou seja, não há contaminação por solventes orgânicos). </li></ol></li><li> Transcrição in vitro usando um kit de síntese de RNA T7. <ol><li> Prepare tEle mestre mistura, como indicado na Tabela 1 , e incuba durante 3 h a 37 ° C num termociclador. Adicione 28 μL de água livre de nuclease e 2 μL de DNase I e incube durante mais 15 min a 37 ° C num termociclador. </li></ol></li><li> Purificação de ARN usando colunas de rotação. <ol><li> Dissolver o pó contido na coluna de rotação fornecida em 650 μL de tampão de microinjeção livre de nuclease, removendo cuidadosamente todas as bolhas de ar. Capte o tubo e hidrata durante 5 a 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Remova a tampa azul na parte inferior e coloque a coluna em um tubo de 2 mL. Centrifugar durante 2 min a 750 xg e temperatura ambiente. Coloque a coluna em um tubo fresco de 1,5 mL e aplique gota a gota 50 μL da solução de ARN no centro, sem tocar na parede da coluna. Gire a coluna durante 2 min a 750 x g. </li><li> Medir a concentração de ARN usando um espectrofotômetro (o rendimento típico de uma reação é de 30 a 50 μg). Verifique se a relação A260 / A280 é umaA ronda 2.0 ( ou seja, nenhuma contaminação por proteínas) ea relação A260 / A230 é de pelo menos 2,0 ( ou seja, não há contaminação por solventes orgânicos). Armazene os sgRNAs em -80 ° C até o uso. </li><li> Avalie a qualidade do RNA usando os géis de TAE de 1% rotineiramente utilizados para a eletroforese de DNA. Execute 200-400 ng do modelo de DNA e o sgRNA correspondente em paralelo. A banda de RNA (≈ 100 pb) deve ser ligeiramente maior que a banda de DNA (ver Figura 3A ). </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Modelo do doador <ol><li> Peça oligonucleótidos de cadeia simples sintetizados comercialmente (ssOligos, veja a Tabela de Materiais ) para mutações pontuais ou para a integração de pequenas sequências até 50 pb; Os braços de homologia são normalmente de 60 a 90 pb de comprimento. </li><li> Para inserções maiores, use um plasmídeo doador como modelo. Gerar um plasmídeo adequado usando o método clássico de clonagem ou síntese de novo a partir de umFonte comercial. NOTA: Recomenda-se um mínimo de 800 pb por braço de homologia. O tamanho da espinha dorsal não tem influência na eficiência do reparo direto de homologia (HDR). </li></ol> 4. Mistura por injeção <ol><li> Diluir o ARNm de Cas9 a 50 ng / μL e os sgRNAs para 12,5 ng / μL (25 ng / μL no total) usando tampão de microinjeção livre de nucleases para experiências de nocaute de genes. Adicione o modelo de doador (ssOligo ou plasmídeo) a uma concentração de 200 ng / μL para experiências de edição de genoma com base em reparo direto de homologia. NOTA: Os volumes de diluição podem ser facilmente determinados usando ferramentas on-line, como uma calculadora de ressuspensão 18 . </li><li> Mantenha cada alíquota no gelo durante a sessão de microinjeção e descarte depois (não re-congelar a mistura de injeção). </li></ol> 5. Vasectomia Scrotal NOTA: Dois tipos de vasectomia são comumente realizados em camundongos: abdominal e escrotal. O últimoÉ menos invasivo e já foi descrito anteriormente 15 . <ol><li> Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos de aço inoxidável. </li><li> Determine o peso do mouse usando uma escala de pesagem e anestesize os machos por injeção intraperitoneal (ip) com anestésicos injetáveis ​​(ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg). </li><li> Monitore a perda do reflexo de pitada do dedo do pé e, uma vez que o mouse é sedado, coloque-o sobre uma almofada de aquecimento. </li><li> Desinfecte a pele em torno dos testículos com toalhetes alternados de um anti-séptico tópico, como a clorhexidina e 70% de etanol. </li><li> Empurre os testículos no saco escrotal e faça uma incisão da pele com um bisturi. </li><li> Visualize o testículo, a cauda epidídima e o canal deferente. </li><li> Pegue o canal deferente com fórceps, segure-o e cauterize em cada lado da pinça para remover 3 mm do canal deferente. </li><li> Execute o mesmo procedimento no segundo testículo. </li><li> Feche as incisões da pele com clipes de ferida e monitore aMouse de perto até recuperação completa. </li></ol> 6. Superovulação (Doadores de Oócitos) e Time-Mating (Fêmeas Pseudo-grávidas) NOTA: A técnica para gerar um número adequado de oócitos fertilizados e fêmeas adotivas obstruídas para reimplante foi descrita em outro lugar 15 . <ol><li> Injectar 10 fêmeas ip com 5 UI de gonadotrofina sérica da égua grávida (PMSG em 100 μL) em torno de 12 horas no dia 1. </li><li> Injete as fêmeas ip com 5 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG em 100 μL) 46-48 h depois (cerca de 11 horas no dia 3). </li><li> Imediatamente mate as fêmeas com machos solteiros durante a noite. </li></ol> 7. Injeções Pronucleares (de integração aleatória) e citoplasmáticas (Gene-targeting) <ol><li> Retire os camundongos superovulados por deslocamento cervical, exponha o abdômen e acesse os ovários e ovidutos, conforme descrito anteriormente 15 . Dissecte o oViducos e colhe os complexos cumulus-oócitos (COCs) sob um estereomicorscópio 15 . Coloque-os em uma gota de meio de otimização de potássio simplex suplementado com aminoácidos (KSOMaa) seguindo o método tradicional 15 . </li><li> Purifique os oócitos adicionando aproximadamente 1 μL de hialuronidase (10 mg / mL) à gota do meio de KSOMaa usando uma bocal de aspirador e coloque o prato em uma incubadora de CO 2 de 37 ° C / 5% durante 30 s a 1 min. </li><li> Lave os oócitos com 4 gotas frescas de meio KSOMaa usando a boca da aspiradora e transfira-as para uma gota final de meio KSOMaa sobreposta com óleo mineral (cerca de 2 mL). Coloque o prato na incubadora de CO 2 de 37 ° C / 5% até que os oócitos estejam prontos para injeção. </li><li> Injeção pronuclear (integração aleatória). <ol><li> Visualize os ovos sob o microscópio estereoscópico e transfira aproximadamente 50 ovos para a câmara de injeção (uma droP de meio M2 coberto com óleo mineral) usando a peça de boca do aspirador. </li><li> Transfira a câmara de injeção para o microscópio invertido e injete os oócitos fertilizados (dois pronúcleos visíveis) com alguns picolitros da mistura de injeção, visando um pronúcleo (qualquer dos pronúcleos pode ser direcionado). Visualize uma injeção bem sucedida observando o inchaço do pronúcleo. </li></ol></li><li> Injeção citoplasmática (segmentação gênica). <ol><li> Transfira aproximadamente 50 ovos para uma gota de KSOMaa contendo 5 μg / mL de Citotinase B utilizando a peça bucal e incubar durante 5 min na incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2 . </li><li> Transfira os ovos para a câmara de injeção usando a peça da boca. </li><li> Injetar poucos picolitros da mistura de injeção no citoplasma a uma pressão muito baixa (50-100 hPa), usando a pressão de compensação do microinjetor automatizado sempre que possível. </li><li> Após a injeção, transfira os oócitos de volta para uma gota de KSOMaa (usando a peça de boca) e mantê-los na incubadora de CO 2 de 37 ° C / 5%, até serem carregados para reimplante no oviduto de fêmeas pseudo-grávidas. </li></ol></li></ol> 8. Reimplante <ol><li> Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos de aço inoxidável. </li><li> Determine o peso do mouse usando a escala de pesagem e anestesize as fêmeas por injeção intraperitoneal (ip) com anestésicos injetáveis ​​(ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg). </li><li> Monitore a perda do reflexo de pitada do dedo do pé e, uma vez que o mouse é sedado, coloque-o sobre uma almofada de aquecimento. </li><li> Inclua uma grande área da pele ao redor da linha média dorsal do mouse feminino. </li><li> Desinfecte a pele exposta com toalhetes alternados de um anti-séptico tópico, como a clorhexidina e 70% de etanol. </li><li> Exponha o trato reprodutivo seguindo o método tradicional 15 . Faça uma incisão de pele de 1 cm de comprimento paralela à linha média dorsal, corte o músculo e pegue a almofada de gordura.Uma pinça, depois puxe suavemente o ovário até que o seu oviducto e o útero sejam claramente visíveis. </li><li> Corrija a almofada gorda com um grampo de vaso. Visualize o oviduto sob o microscópio estereoscópico e usando um par de micro-tesouras faça uma incisão na parede do oviducto alguns milímetros a montante da ampola. </li><li> Sob o microscópio estereoscópico, carregue 25 ovos microinjetados no capilar de vidro conectado à boca (o diâmetro interno do capilar deve ter cerca de 120 um de largura). Introduza o capilar de vidro no tubo de ovidação e expulse até que uma bolha de ar seja visível dentro da ampola. </li><li> Remova cuidadosamente o capilar de vidro e coloque o trato reprodutivo no abdômen. Suturar a incisão com suturas cirúrgicas não absorvíveis 3-0, depois fechar com clipes de ferida. Monitore o mouse de perto até recuperar completamente. </li></ol> 9. Estratégias de Genotipagem / Seqüenciamento NOTA: Isolar o genômicoDNA de biópsias de cauda ou orelha de 2 mm, seguindo os regulamentos relevantes de ética animal. <ol><li> Extração rápida de DNA genômico (integração aleatória). <ol><li> Leve as amostras de tecido (~ 2 mm) a 95 ° C durante 1 h em 100 μL de reagente de lise alcalino (hidróxido de sódio 25 mM e EDTA 0,2 mM, pH = 12). </li><li> Adicionar 100 μL de reagente neutralizante (Tris-HCl 40 mM, pH = 5). </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 12.000 g e 4 ° C. </li></ol></li><li> Extração de DNA genômico de alta qualidade (segmentação de genes). <ol><li> Adicionar 500 μL de tampão de cauda (Tris 50 mM, pH = 8, EDTA 100 mM, pH = 8; NaCl 100 mM, SDS a 1% e 0,5% de proteinasa K, adicionada recentemente). </li><li> Incubar durante a noite a 55 ° C. </li><li> Misture por 5 minutos com a inversão (não vortex). </li><li> Adicione 250 μL de NaCl saturado (6 M) e misture durante 5 minutos invadindo (não vortex). </li><li> Girar por 5-10 min a 12.000 xg e 4 ° C e despeje o sobrenadante para o novo tubo. </lI&gt; <li> Adicione 500 μL de isopropanol e misture por 5 minutos com inversão (não vortex). </li><li> Gire durante 10 minutos a 12.000 xg e temperatura ambiente. </li><li> Decantar o sobrenadante (o pellet é invisível e fica com o tubo). </li><li> Lavar com 1 mL de etanol a 70%. </li><li> Rotação por 5-10 min a 12.000 xg e temperatura ambiente. Remova o sobrenadante com cuidado, já que o sedimento branco não é mais pegajoso e pode ser perdido. </li><li> Seque o ar por ~ 1 h. </li><li> Adicionar 400 μL de tampão TE (Tris 10 mM e EDTA 1 mM, pH = 8). </li><li> Dissolver o DNA a 55-60 ° C durante 2 h. </li></ol></li><li> Desenho inicial. <ol><li> Desenhe primers com um mínimo de 20 pb de comprimento usando uma ferramenta computacional 19 . NOTA: Para a integração aleatória, os primers devem se hibridizar com o transgene, gerando um fragmento distinto de 200-800 pb. Para a segmentação por genes, crie os primers para que eles hibridem com o DNA genômico, gerando um f distintoAumentando algumas centenas de bp em torno dos locais cortados. Para inserções grandes, os iniciadores podem se sentar no transgene, mas a confirmação da integração direcionada deve ser realizada subsequentemente usando uma caminhada de iniciador ou uma técnica similar. </li></ol></li><li> Genotipagem por PCR. <ol><li> Para cada modificação genômica, crie um novo protocolo de PCR e teste-o empiricamente. Considere o comprimento do fragmento gerado e a temperatura de fusão (Tm) de cada par de primers. </li></ol></li><li> Seqüenciamento. <ol><li> Para a segmentação por genes, envie produtos de PCR para um provedor de serviços de seqüestro Sanger. </li></ol></li></ol>

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L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+globin+messenger+RNA+by+the+mouse+ovum.">Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum.</a> Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).</li><li>Pinkert, C. A., Irwin, M. H., Johnson, L. W., Moffatt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+transfer+into+mouse+ova+by+microinjection.">Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection.</a> Transgenic Res. 6 (6), 379-383 (1997).</li><li>Biggers, J. D., Summers, M. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+tris+(HotSHOT).">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT).</a> Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li><li>Richardson, C. D., Ray, G., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+homology-directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA.">Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).</li><li>Delerue, F., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+Mice+Using+CRISPR/Cas9:+Achievements+and+Prospects.">Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects.</a> Clon. Transgen. 4, (2015).</li></ol>

Os autores fornecem serviços de transgênese acadêmica em camundongos através do Centro Analítico Mark Wainwright da Universidade de Nova Gales do Sul.

Passos críticos dentro do protocolo A geração de camundongos geneticamente modificados é conhecida por ser tecnicamente desafiadora. No entanto, o protocolo apresentado aqui é um método otimizado e simplificado que permite dominar e solucionar a técnica em tempo recorde. Há duas etapas necessárias para a conclusão bem-sucedida da técnica. Primeiro, a síntese de modelos de DNA linear (para a síntese de sgRNAs) pode ser conseguida sem cloreto de magnésio (MgCl2). No entanto, é altamente recomendado adicionar de forma sistemática MgCl 2 à mistura principal porque a hibridação parcial do iniciador direto é frequentemente evitada na ausência de MgCl2. Além disso, é fundamental que a sequência genômica alvo não esteja presente em nenhuma parte do modelo do doador (no caso de integração direcionada), caso contrário, a nuclease Cas9 irá cortá-la, evitando a ocorrência de HDR. ModificaçõesE solução de problemas Embora este protocolo para a geração de ratos geneticamente modificados tenha sido otimizado e simplificado ao longo dos anos, existem algumas considerações relacionadas ao rendimento de oócitos de boa qualidade para microinjeção e à taxa de conexão de fêmeas adotivas. A escolha da tensão de fundo é crítica em relação ao número de cachorros vivos resultantes de uma sessão de microinjeção. C57BL / 6 é o fundo mais utilizado para modelos de doenças de ratos. No entanto, é também um dos fundos menos eficientes em termos de resistência à microinjeção 20 . Além disso, a idade da fêmea também é crítica para produzir um grande número de oócitos; Recomenda-se evitar ratos 5-8 semanas de idade, independentemente do contexto, pois este é o período menos favorável de resposta à estimulação hormonal 21 . Na nossa experiência, ratinhos C57BL / 6 de 3 a 4 semanas de idade confiam em 20-30 ovos por fêmea. É importanteNote que uma nova técnica (referida como ultra-superovulação) produziu até 100 ovos por fêmea e recentemente foi usada para gerar oócitos para microinjeção 22 . No entanto, o uso de ultra-superovulação para microinjecção geralmente é dificultado pela necessidade de fertilizar artificialmente (fertilização in vitro ) como um grande número de ovos. Para obter fêmeas adotivas encapsuladas adequadas para o reimplante, os camundongos são acasalados com machos vasectomizados (o fundo desses ratos não é crítico). Para aumentar o número de receptores conectados, pode-se realizar um exame cuidadoso do estágio do estro e a seleção de fêmeas adequadas 23 . A sincronização dos ciclos das fêmeas também pode ser induzida pela exposição das fêmeas aos machos vasectomizados dois dias antes do acasalamento (o chamado &quot;efeito Whitten&quot;) 24 . Limitações da técnica <p clAss = &quot;jove_content&quot;&gt; Uma vez otimizado, o procedimento deve permitir confiavelmente a geração sistemática de camundongos geneticamente modificados durante cada sessão de microinjeção. No entanto, existem duas limitações principais para o procedimento que se correlaciona com o tamanho da tentativa de modificação genômica. Modificações genômicas muito pequenas, como mutações pontuais, são relativamente fáceis de gerar, mas são difíceis de identificar. Quando a genotipagem é realizada, os produtos de PCR são sequenciados diretamente pelo seqüenciamento de Sanger. No entanto, a microinjecção direta de componentes de CRISPR em oócitos de ratos geralmente gera animais de mosaico porque o Cas9 permanece ativo por algum tempo e diferentes modificações genômicas podem ocorrer após a primeira divisão do oócito. Esse efeito de confusão complica a identificação de mutações discretas entre vários alelos e a sequenciação da próxima geração (NGS) pode ajudar com leituras desafiadoras. Técnicas sensíveis, como o tetra-primerARMS-PCR, 25 também pode ajudar na genotipagem da colônia após a identificação dos fundadores por seqüência. Por outro lado, a inserção de grandes pedaços de DNA de forma direcionada continua sendo desafiadora. Quanto maior o DNA exógeno, menor a eficiência do HDR. Consequentemente, estão sendo desenvolvidas novas estratégias, como o uso de dadores de ssOligos longos (em vez de plasmídeos) 26 ou integração direta independente de HDR 27 . Significado do protocolo Este protocolo apresenta avanços significativos porque as quatro etapas principais ( ie, preparação do transgene ou componentes CRISPR, microinjeção, reimplantação e genotipagem) foram otimizadas, testadas e validadas em nosso laboratório. A integração aleatória de transgenes é amplamente utilizada para estudos de sobreexpressão por duas razões principais. Primeiro, para avoO potencial &quot;efeito de posição&quot;, a integração direcionada de um transgene usando CRISPR em loci &quot;safe harbor&quot;, como os loci Rosa26 28 e Col1a 29 , permanece notoriamente desafiador, uma vez que a eficiência do HDR é baixa. Estratégias para superar este problema são 26 , 27 , mas a integração aleatória até agora se mostrou mais eficiente. Além disso, a geração de múltiplas linhas transgênicas que sobre-expressam o mesmo transgene com diferentes níveis de expressão é de interesse em estudos envolvendo estratégias de tratamento para reverter um fenótipo 30 . Os transgenes à base de plasmídeo são gerados por meio de clonagem, utilizando enzimas de restrição ad hoc para reunir fragmentos essenciais para a expressão de uma proteína de interesse. Geralmente, um transgene é feito de pelo menos três elementos: um promotor adequado (as regiões de intensificador são por vezes adicionadas); A codificaçãoSequência (cDNA), com ou sem regiões intrónicas; E uma cauda PolyA para estabilizar a expressão de mRNA 31 . Uma vez montado, o transgene é inserido em um plasmídeo contendo elementos de replicação bacteriana e expandido em cultura após transformação (tipicamente baseado em choque de calor). O método de purificação dos transgenes para microinjecção é crítico. Este trabalho descreve o uso de manchas de DNA de nova geração (baixa toxicidade) para a visualização mais precisa do fragmento de interesse no gel (em comparação com a violeta de cristal tradicional) e de baixa exposição mutagênica (em comparação com o brometo de etidio). O método de não clonagem aqui descrito para segmentação gênica é muito rápido e permite a síntese de vários sgRNAs em apenas 5-6 h. São necessários apenas quatro passos: a identificação da sequência alvo, a síntese de um modelo de DNA linear contendo um promotor T7 e a sequência alvo escolhida, a síntese oF o sgRNA por transcrição in vitro (IVT), e a purificação do sgRNA usando colunas de rotação. Na idade precoce da edição do genoma do mouse CRISPR, o efeito potencial fora do alvo foi sistematicamente avaliado, embora tenha sido demonstrado que seja muito limitado em embriões de camundongos 32 e pode ser facilmente diluído por meio de um esquema de reprodução em que os ratos selecionados apenas carregam A modificação genômica desejada. A atividade no alvo também foi sistematicamente pré-avaliada in vitro , usando guias diferentes e selecionando a (s) mais ativa (s) 12 . Esta prática é agora menos comum, por vários motivos. Primeiro, a atividade no alvo é avaliada usando a transfecção de linhas de células de mouse imortalizadas (tipicamente N2a ou NIH3T3) com plasmídeos codificadores de CRISPR. Este é um método diferente do que a injeção de componentes CRISPR RNA em oócitos de ratos. Portanto, os resultados encontrados in vitro nem sempre se traduzem igualmenteAos oócitos. Além disso, experiências de alto rendimento mostraram que a maioria dos guias está ativa 33 . Conseqüentemente, a atividade no alvo não é avaliada e, até agora, não houve evidência de um guia que não mostre atividade em oócitos de rato. Juntamente com o método de não clonagem para sintetizar sgRNAs, apresentado aqui, isso simplifica e agiliza o fluxo de trabalho, e vários guias ativos podem ser sintetizados em um dia. O CRISPR é considerado uma &quot;tecnologia disruptiva&quot;, que é uma inovação que altera a maneira como as técnicas são realizadas. Quando a microinjecção foi estabelecida, Brinster et al. Mostraram que a transgênese citoplasmática, embora realizável, permaneceu na maior parte ineficiente 7 . Conseqüentemente, a microinjeção pronuclear permaneceu a única prática comum por quase 30 anos, até a primeira demonstração de um gene CRISPR bem sucedido visando em camundongos. Este estudo mostrou que o microinjetor citoplasmático<html> Ion poderia gerar um resultado semelhante ou superior em comparação com a entrega pronuclear 12 . Obviamente, porque os componentes CRISPR são tipicamente feitos de RNA, é evidente que o citoplasma é alvo. No entanto, mesmo quando injetados no citoplasma, os modelos de doadores também podem induzir HDR com sucesso. Uma alta concentração citoplasmática de modelos permite a sua difusão no núcleo. Além disso, o uso de microinjeção citoplasmática direcionada a piezo 16 não é um requisito. Uma pequena incubação dos oócitos com um inibidor do citoesqueleto, como a citocalasina B, aumenta a sobrevivência dos oócitos 34 , 35 , tornando-se suficiente para realizar injeções citoplasmáticas sem sistema de acionamento de impacto piezoelétrico. Do mesmo modo, o uso de um meio de cultura melhorado, como KSOMaa, diminui o bloqueio no estágio de duas células e melhora as capacidades de desenvolvimento dos embriões em comparação com o meio M16Xref &quot;&gt; 36. Os embriões de uma célula ou de duas células (quando cultivados durante a noite) podem ser transferidos para o oviduto. O procedimento convencional é bastante invasivo, pois requer quebrar a bursa que protege o ovário. Também é tecnicamente desafiador, porque o capilar de vidro precisa ser inserido no infundíbulo 15 . O método aqui apresentado é muito mais fácil de aprender, não induz o sangramento potencial e preserva a integridade do ovário. Baseia-se no trabalho desenvolvido na Universidade Kumamoto 37 . As estratégias de genotipagem e as técnicas de sequenciação são fundamentais para identificar potenciais fundadores. Para a integração aleatória, a extração de DNA genômico é baseada em um método simples, adaptado de Truett et al. 38 . Esse método de extração rápida é suficiente para identificar potenciais fundadores, uma vez que os primers são projetados para hibridar com o transgene (muitas vezes integradoComo múltiplas cópias). Por outro lado, o alvo de genes requer DNA genômico altamente purificado, uma vez que o produto de PCR engloba a região genômica modificada. Para o knockout de genes, o método tradicional de injetar um único sgRNA gera pequenas deleções (indels) ou inserções, eventualmente eliminando o gene de interesse 12 . Essas pequenas modificações são difíceis de identificar e, muitas vezes, exigem uma clonagem e seqüenciamento que consome tempo, dependendo da ligase, para confirmar a natureza dessas mutações. Neste protocolo, aproveitamos a multiplexação CRISPR para desenvolver a co-injeção sistemática de dois sgRNAs abrangendo o codão de início de um gene de interesse. Isso não só aumenta a probabilidade de um nocaute de genes, mas também a excisão de um pedaço de DNA genômico de um tamanho predefinido (100-300 pb), permitindo a identificação fácil dos fundadores por PCR simples. De notar, filhotes que não carregam o esperado genômico eA xcision ainda pode ser analisada para pequenas mutações de deslocamento de quadros, quando apenas um sgRNA se mostrou ativo. Da mesma forma, no caso da edição de genes, a co-injeção sistemática de dois sgRNAs sobrepostos em direções opostas deve aumentar a eficiência do HDR, uma vez que os mecanismos de reparo celular preferencialmente usam um dos dois fios 39 . Aplicações futuras O presente protocolo aproveita os últimos desenvolvimentos em embriologia de mouse e segmentação gênica 40 para simplificar e agilizar o processo de geração de vários modelos de mouse sofisticados de condições humanas. Esses modelos desempenham um papel fundamental para ajudar a desenvolver nossa compreensão dos mecanismos patogênicos, auxiliando, em última análise, no desenvolvimento de estratégias terapêuticas 2 . A otimização e racionalização dos reagentes necessários para a segmentação gênica ou a integração aleatória são amplamente e prontamente aplicáveis.Para outras espécies de mamíferos, como ratos, coelhos e até animais grandes, como o gado.

Os modelos animais, tanto em vertebrados quanto em invertebrados, têm sido fundamentais para examinar a fisiopatologia das condições humanas, como a doença de Alzheimer 1 , 2 . Eles também são ferramentas inestimáveis ​​para procurar modificadores de doenças e, em última instância, desenvolver novas estratégias de tratamento na esperança de uma cura. Embora cada modelo tenha limitações intrínsecas, o uso de animais como modelos sistêmicos inteiros é vital para a pesquisa biomédica. Isso ocorre porque o ambiente fisiológico metabólico e complexo não pode ser totalmente simulado na cultura de tecidos. Até à data, o rato continua a ser a espécie de mamífero mais comum usada para manipulação genética porque apresenta várias vantagens. Os processos fisiológicos e os genes associados a doenças são altamente conservados entre camundongos e seres humanos. O mouse foi o primeiro mamífero a ter seu genoma completo seqüenciado (2002), um ano antes do geno humanoEu (2003). Além dessa riqueza de informações genéticas, o mouse possui boas capacidades de criação, um ciclo de desenvolvimento rápido (6 semanas desde a fertilização até o desmame) e um tamanho razoável. Todas essas vantagens, juntamente com indicadores fisiológicos, como cores de revestimento distintas (necessárias para estratégias de cruzamento), fizeram do mouse um modelo atraente para manipulação genética. Notavelmente, na era mais precoce da genética moderna, Gregor Mendel começou a trabalhar em camundongos antes de se mudar para as plantas 3 . As técnicas de transferência de genes resultaram na geração do primeiro rato transgênico há mais de três décadas 4 , inicialmente criado usando a entrega viral. No entanto, os pesquisadores logo perceberam que um dos principais desafios da transgênese do mouse era a incapacidade de controlar o destino do DNA exógeno. Como a distribuição viral de transgenes em oócitos de ratos resultou em cópias múltiplas integradas aleatoriamente no genoma, o possibilitO estabelecimento de linhas transgênicas subsequentes foi limitado. Uma dessas limitações foi superada quando Gordon et al. Gerou a primeira linha de mouse transgênica por microinjeção 5 , 6 . Isso começou a era da tecnologia de DNA recombinante, e os parâmetros que influenciam o resultado de uma sessão de microinjeção foram amplamente estudados 7 . Embora a microinjeção não permita o controle sobre o site de integração do transgene (que eventualmente resulta em níveis de expressão específicos para cada mouse fundador), a principal vantagem da microinjeção pronuclear continua sendo a formação de concatemers ( ou seja, matrizes de múltiplas cópias do transgene, Ligado em série) antes da integração genômica 5 . Esta característica tem sido utilizada ao longo dos anos para estabelecer milhares de linhas de mouse transgênicas que sobre-expressam um gene de interesse. Desde então, a transgênese, aModificação artificial do genoma de um organismo, tem sido amplamente utilizada para identificar o papel de genes únicos na ocorrência de doenças. Uma outra conquista chave na manipulação do genoma do mouse foi alcançada quando o Mario Capecchi interrompeu com sucesso um único gene no mouse, abrindo a era da segmentação gênica 8 . No entanto, as principais desvantagens emergiram rapidamente da segmentação por células baseadas em células ES, incluindo os desafios de cultivar células ES, o grau de quimerismo um tanto variável e o comprimento do processo ( ou seja, 12-18 meses, mínimo, para obter o mouse) . Recentemente, os avanços nas novas tecnologias, tais como endonucleases de engenharia ( por exemplo, nucleases de zinco (ZFN), efetoras nucleas efectoras de transcrição (TALEN), e repetições palindrômicas curtas (CRISPR / Cas9) agrupadas regularmente foram emergentes como métodos alternativos para Acelerar o processo de segmentação de genes no microfoneE 9 , 10 . Estas endonucleases podem ser facilmente injetadas em oócitos de ratinho por microinjeção, permitindo a geração de camundongos alvo de genes em apenas 6 semanas. Desde o primeiro relatório sobre o uso do CRISPR para a edição do genoma 11 , este sistema imunológico adaptativo bacteriano substituiu ZFN e TALEN por suas muitas vantagens, incluindo a facilidade de síntese e a capacidade de segmentar múltiplos loci de uma vez (referido como &quot;multiplexação &quot;). O CRISPR foi utilizado pela primeira vez para segmentação gênica em camundongos 12 e desde então foi aplicado a inúmeras espécies, de plantas a seres humanos 13 , 14 . Até à data, não há relatório de uma única espécie resistente à edição do genoma CRISPR. Os dois principais passos limitantes da geração de camundongos transgênicos são a injeção de oócitos eo reimplanteDesses oócitos em fêmeas pseudo-grávidas. Embora esta técnica tenha sido descrita por nós 15 e outros 16 , as melhorias técnicas recentes em embriologia de ratos e técnicas de transferência de genes revolucionaram o processo de geração de camundongos geneticamente modificados. Essas melhorias serão descritas aqui.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Micropipette 0.1-2.5 ul</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">4920000016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Micropipette 2-20 ul</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td>4920000040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Micropipette 20-200 ul</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td>4920000067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Micropipette 100-1000 ul</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td>4920000083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular weight marker&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td>HyperLadder 1kb</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular weight marker&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td>HyperLadder 100 bp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">EDTA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93296</td>
			<td>10x - Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR Safe gel stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PCR purification kit (Qiaquick)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Vacuum system (Manifold)</td>
			<td style="width:147px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A7231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease-free microinjection buffer&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-095-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrafree-MC microcentrifuge filter&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cas9 mRNA</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CAS9MRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">CRISPR expressing plasmid (px330)</td>
			<td style="width:147px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 Quick High Yield RNA kit</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td>E2050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">RNA purification spin columns (NucAway)</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM10070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">ssOligos</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>OLIGO STANDARD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Donor plasmid</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">GeneArt</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hyaluronidase</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">KSOMaa embryo culture medium</td>
			<td>Zenith Biotech&#160;</td>
			<td>ZEKS-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Mineral oil</td>
			<td>Zenith Biotech&#160;</td>
			<td>ZSCO-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">M2 Medium</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Mouthpiece</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glass microcapillaries</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Proteinase K</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3830.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Vessel clamp</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">18374-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Wound clips&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">12040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Clips applier&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">12018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cauterizer</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>18000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1691H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">5% CO2 incubator</td>
			<td style="width:147px;">MG Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Galaxy 14S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">6321 000.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Electrophoresis set up</td>
			<td style="width:147px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1640300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">UV Transilluminator</td>
			<td style="width:147px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1708110EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td>6334000069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereoscopic microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">2x Micromanipulators</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5188000.012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Oocytes manipulator</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5176000.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microinjector (Femtojet)</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5247000.013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Mice C57BL/6J strain</td>
			<td style="width:147px;">Australian BioResources</td>
			<td>C57BL/6JAusb&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genetically modified mice through the microinjection of oocytes

O uso de camundongos geneticamente modificados tem contribuído significativamente para estudos em processos fisiológicos e patológicos in vivo . A injeção pronuclear de construções de expressão de DNA em oócitos fertilizados continua a ser a técnica mais utilizada para gerar camundongos transgênicos para superexpressão. Com a introdução da tecnologia CRISPR para segmentação gênica, a injeção pronuclear em oócitos fertilizados foi estendida à geração de camundongos knockout e knockin. Este trabalho descreve a preparação de DNA para injeção e a geração de guias CRISPR para segmentação gênica, com especial ênfase no controle de qualidade. Os procedimentos de genotipagem necessários para a identificação de potenciais fundadores são críticos. Estratégias inovadoras de genotipagem que aproveitam as capacidades de &quot;multiplexação&quot; do CRISPR são aqui apresentadas. Os procedimentos cirúrgicos também são delineados. Juntos, as etapas do protocolo permitirão a geração de genCamundongos eticamente modificados e para o estabelecimento subseqüente de colônias de ratos para uma infinidade de campos de pesquisa, incluindo imunologia, neurociência, câncer, fisiologia, desenvolvimento e outros.

Abaixo, descrevem-se os fluxos de trabalho para microinjecção no caso de integração aleatória e orientação de genes mediada por CRISPR ( Figura 1 ). <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig1v2.jpg" /> Figura 1: Fluxo de trabalho típico para a geração de ratos modificados genéticamente. Para a integração aleatória, o transgene purificado é injetado no pronúcleo de oócitos fertilizados antes da transferência de oviduto em fêmeas adotivas obstruídas. A análise da progênie é realizada por PCR após uma rápida extração de DNA genômico. Para o alvo de genes CRISPR, os sgRNAs são sintetizados usando o método de não clonagem descrito aqui e duas guias são co-injetadas (juntamente com o ARNm Cas9) no citoplasma de oócitos fertilizados. Esta estratégia é utilizada para análise subsequente baseada em PCR da progênie, que requer g altamente purificadoDNA enomático. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55765/55765fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Embora a microinjecção de oócitos e o reimplante destes ovos injetados sejam os dois principais passos limitantes que exigem habilidades técnicas e treinamento, a qualidade da mistura de injeção é de extrema importância para gerar com sucesso camundongos modificados. A qualidade da purificação de transgene ( Figura 2A ) e a síntese de sgRNAs ( Figura 3A ) devem ser avaliadas sistematicamente em géis de agarose analíticos. As contaminações potenciais da mistura também devem ser verificadas ao medir as concentrações com um espectrofotômetro, uma vez que os diferentes valores de absorção dependem diretamente do grau de pureza da solução (ver etapas 1.2.3, 2.2.3.5 e 2.2.5.3). <p class="jove_content"Fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Da mesma forma, a identificação de potenciais ratos fundadores depende fortemente de estratégias inovadoras de genotipagem. Este trabalho ilustra uma leitura típica de uma sessão de microinjeção, tanto para integração aleatória ( Figura 2B ) quanto para segmentação de genes ( Figura 3B ). Os protocolos de extração de DNA também são diferentes dependendo do tipo de experiências; PCRs subseqüentes dependem de iniciadores que se hibridam quer no transgene quanto no DNA genômico, respectivamente. As estratégias apresentadas aqui permitem a solução de problemas fácil e a racionalização de cada passo necessário para produzir camundongos geneticamente modificados. Embora o resultado quantitativo de uma sessão de microinjeção varie dependendo da experiência do experimentador, uma vez que cada etapa do protocolo é otimizada, a porcentagem de cachorros transgênicos obtidos geralmente deve atingir 10-25% para entérgio aleatórioComo ilustrado na Figura 2B (4 fundadores de 15 cachorros nascidos = 26,6%). Essa eficiência um pouco &quot;baixa&quot; contrasta com a capacidade confiável dos componentes CRISPR para editar o genoma do mouse. De fato, o número de fundadores gerados é geralmente maior quando se usa CRISPR para segmentação gênica e varia de 25-100% (ver Figura 3B ; 3 fundadores de 13 filhotes = 23%). Não é incomum obter uma progênie inteira que seja homozigoto com sucesso quando são editados usando CRISPR. <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig2.jpg" /> Figura 2: Estratégia de controle de qualidade e genotipagem para a produção bem sucedida de ratos transgênicos para superexpressão. ( A ) O plasmídeo é digerido durante 1 h com PvuI e NotI. Digestão completa e tamanhos corretos ( ou seja, transgene = 7,338 pb, espinha dorsal = 1,440+ 896 pb) são verificados em um gel analítico (1). A extração de vários produtos de digestão a partir do gel preparatório (2) gera uma concentração aumentada do transgene. A exposição prolongada a UV deve ser evitada e é recomendável o uso de uma luz azul em vez de um transiluminador UV. (B) Estratégia de genotipagem (1): Os iniciadores devem se sentar no transgene e devem ser projetados para gerar um fragmento de 200 a 800 pb. Quando a genotipagem é realizada (2), recomenda-se que inclua um controle positivo ( ou seja, a mistura de injeção usada para microinjeção) e um controle negativo ( ou seja, DNA genômico de um mouse WT). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55765/55765fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig3.jpg" /> Figura 3: Controle de Qualidade e Genotipagem StraPara a produção bem-sucedida de ratos geneticamente orientados (KO). ( A ) A qualidade dos sgRNAs produzidos por transcrição in vitro é avaliada executando o modelo de DNA e o ARN gerado em paralelo para cada guia. O tamanho do ARN é um pouco maior do que o DNA. Se a qualidade for satisfatória ( ou seja, sem bandas de esfregaço), as concentrações são medidas. ( B ) (1) Desenho das duas guias (direções opostas) abrangendo o codão Start em Exon 1. Os iniciadores são selecionados para hibridar com o DNA genômico fora da região eventualmente excisado pelos dois guias. Normalmente, esta estratégia permite a identificação direta de fundadores de KO heterozigotos (# 5 e 9) e homozigóticos (# 3) usando PCR (2). Os produtos de PCR de animais homozigotos não exibem qualquer banda WT. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55765/55765fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <tableBorder = &quot;1&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reação </td><td> Componentes </td><td> Volume </td><td> Nota </td></tr><tr><td rowspan="7"> Síntese de modelo de DNA linear (2.5) </td><td> Água livre de nuclease </td><td> 97,2 μL </td><td></td></tr><tr><td> 5x tampão HF </td><td> 36 μL </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 9 μL </td><td></td></tr><tr><td> DNTPs 10 mM </td><td> 9 μL </td><td></td></tr><tr><td> Iniciador Fwd 10 μM </td><td> 9 μL </td><td> 5&#39;TTAATACGACTCACTATAGN 20 Gttttagagctagaaatagcaagttaaaata Aggctagtc 3 &#39; </td></tr><tr><td> Iniciador de revolução 10 μM </td><td> 9 μL </td><td> 5 &#39;AAAAGCACCGACTCGGTGCC 3&#39; </td></tr><tr><td> PrPolimerase de leitura </td><td> 1,8 μL </td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"> IVT usando um kit de síntese de RNA T7 (2.6) </td><td> Água livre de nuclease </td><td> X μL </td><td> Faça até 20 μL de volume total </td></tr><tr><td> Mistura tampão NTP </td><td> 10 μL </td><td></td></tr><tr><td> DNA de modelo </td><td> ≈ 300 ng </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimerase </td><td> 2 μL </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1: Composição das diferentes misturas mestre usadas neste estudo. Síntese do modelo linear de DNA: a sequência mínima do promotor T7 (TTAATACGACTCACTATAG) é a montante da sequência de 20 pb (guia N, identificado usando a ferramenta de projeto CRISPR) e uma seqüência complementar ao vetor de expressão (gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtc). Em vitroTranscrição (IVT): Dependendo da concentração do modelo de DNA, o volume final deve ser ajustado para 20 μL com água livre de nuclease.

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Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

A microinjecção de oócitos de rato é comumente utilizada tanto para a transgênese clássica ( ou seja, a integração aleatória de transgenes) e a segmentação de genes mediada por CRISPR. Este protocolo analisa os últimos desenvolvimentos em microinjeção, com ênfase particular no controle de qualidade e estratégias de genotipagem.

Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

generation-genetically-modified-mice-through-microinjection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

20.4K visualizações.  University of New South Wales.  A microinjecção de oócitos de rato é comumente utilizada tanto para a transgênese clássica ( ou seja, a integração aleatória de transgenes) e a segmentação de genes mediada por CRISPR. Este protocolo analisa os últimos desenvolvimentos em microinjeção, com ênfase particular no controle de qualidade e estratégias de genotipagem. 

Vídeo: Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

Geração de adiposo humano Stem Cells através Dedifferentiation de adipócitos maduros em Culturas de teto

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Biologia do Desenvolvimento

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have no effective therapeutic options. Tools to study EHBD are very limited. Our purpose was to develop an organ-specific, versatile, adult stem cell-derived, preclinical cholangiocyte model that can be easily generated from wild type and genetically engineered mice. Thus, we report on the novel technique of developing an EHBD organoid (EHBDO) culture system from adult mouse EHBDs. The model is cost-efficient, able to be readily analyzed, and has multiple downstream applications. Specifically, we describe the methodology of mouse EHBD isolation and single cell dissociation, organoid culture initiation, propagation, and long-term maintenance and storage. This manuscript also describes EHBDO processing for immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and mRNA abundance quantitation by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol has significant advantages in addition to producing EHBD-specific organoids. The use of a conditioned medium from L-WRN cells significantly reduces the cost of this model. The use of mouse EHBDs provides almost unlimited tissue for culture generation, unlike human tissue. Generated mouse EHBDOs contain a pure population of epithelial cells with markers of endodermal progenitor and differentiated biliary cells. Cultured organoids maintain homogenous morphology through multiple passages and can be recovered after a long-term storage period in liquid nitrogen. The model allows for the study of biliary progenitor cell proliferation, can be manipulated pharmacologically, and may be generated from genetically engineered mice. Future studies are needed to optimize culture conditions in order to increase plating efficiency, evaluate functional cell maturity, and direct cell differentiation. Development of co-culture models and a more biologically neutral extracellular matrix are also desirable.

This protocol describes the production of a mouse extrahepatic bile duct 3-dimensional organoid system. These biliary organoids can be maintained in culture to study cholangiocyte biology. Biliary organoids express markers of both progenitor and biliary cells and are composed of polarized epithelial cells.

Geração de Organoids de vias biliares extra-hepáticas Mouse

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

Geração de um chip de barreira hematoencefálica baseada no iPSC humano

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

Vitrificação de Volume Mínimo de Oócitos Felinos Imaturos

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Separação de células foliculares e oócitos em folículos ovarianos de zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. Cardiac differentiation from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is modulated by defined signaling pathways that are essential for embryonic heart development. Numerous cardiac differentiation methods on 2-D and 3-D platforms have been developed with various efficiencies and cardiomyocyte yield. This has puzzled investigators outside the field as the variety of these methods can be difficult to follow. Here we present a comprehensive protocol that elaborates robust generation and expansion of patient-specific cardiomyocytes from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). We first describe a high-efficiency iPSC reprogramming protocol from a patient&#39;s blood sample using non-integration Sendai virus vectors. We then detail a small molecule-mediated monolayer differentiation method that can robustly produce beating cardiomyocytes from most human iPSC lines. In addition, a scalable cardiomyocyte expansion protocol is introduced using a small molecule (CHIR99021) that could rapidly expand patient-derived cardiomyocytes for industrial- and clinical-grade applications. At the end, detailed protocols for molecular identification and electrophysiological characterization of these iPSC-CMs are depicted. We expect this protocol to be pragmatic for beginners with limited knowledge on cardiovascular development and stem cell biology.

Here, we present a protocol to robustly generate and expand human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells.

Geração e Expansão de Cardiomiócitos Humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Microinjeção de zigoto para criação de alelos knock-in e flox de gênico em camundongos

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...