Este trabalho foi apoiado por uma concessão piloto sob o NIH P20 GM109005 (ARA) e pelo prêmio do Centro de Tradução de Neurociências IDEA P30 GM110702.

As experiências foram realizadas de acordo com os padrões éticos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais na UAMS. 1. Paradigma de animais e 5-Fu Injection <ol><li> Compre ratinhos de tipo selvagem C57Bl6 / J de 6 meses de idade e abrigue-os sob um ciclo constante de 12 h luz / escuridão até atingir o 1 ano de idade. </li><li> Diluir o 5-Fu em solução salina estéril a 0,9%. Use 60 mg / kg como a dose necessária por mouse. </li><li> Dê as injeções intraperitoneais do 5-Fu (uma vez por semana durante três semanas). <ol><li> Dê as injeções intraperitoneais ao mesmo tempo em cada dia. Por exemplo, entre 0900-1200 h. </li></ol></li><li> Eutanizar os animais e extrair os cérebros 30 dias após a injeção final. </li></ol> 2. Procedimento de Eutanásia e Extração de Cérebro <ol><li> Conduza o roedor e agarre a base da cauda. Por outro lado, coloque o polegar ou o primeiro dedo no thE base do pescoço do roedor. Pressione rapidamente o pescoço do roedor e empurre para a frente enquanto a outra mão segurando a cauda puxa para trás. </li><li> Segure o roedor com uma mão e a grande tesoura cirúrgica com a outra. Coloque o pescoço do roedor entre as duas lâminas e rapidamente decapite a cabeça. </li><li> Pegue a cabeça do mouse cortada e use a tesoura fina para cortar a pele acima do crânio, até os olhos. Em seguida, coloque as pontas das tesouras em cada soquete do olho e feche a tesoura com pouca força. </li><li> Use a tesoura de mola para cortar o crânio para a esquerda e para a direita do cerebelo. </li><li> Use fórceps para levantar a parte do crânio em torno do cerebelo diretamente para cima e para fora. </li><li> Use a tesoura de mola para cortar a linha midsagittal do crânio. </li><li> Use a pinça para levantar a parte restante do crânio do cérebro. </li><li> Use uma espátula e uma sonda para colher o cérebro no recipiente desejado. Usando um aço inoxidávelLâmina de corte, corte cada cérebro ao longo do plano midsagital. Execute o seguinte método de Golgi-Cox nos hemisférios direitos. </li></ol> 3. Mancha de Golgi e Preparação de Tecidos <ol><li> Mergulhe os meia-cérebros recém-colhidos em 5 mL de solução à base de cloreto de mercúrio (solução A do kit) em um tubo cônico de 10 mL. A solução de cloreto de mercúrio é sensível à luz; Cubra o tubo com papel alumínio. Armazene a amostra no escuro à temperatura ambiente. NOTA: A solução A é fornecida no kit que está listado na tabela de materiais. Cuidado! A solução A (também chamada de solução de cloreto de mercúrio) contém reagentes tóxicos, como dicromato de potássio, cloreto de mercúrio e cromato de potássio. Use luvas de proteção e trabalhe com uma aspiradora. </li><li> Após 1 dia, decanta lentamente a solução em um recipiente temporário (como um barco de pesagem grande) e descarte-o em um recipiente de resíduos de risco biológico. Mergulhe os cérebros (ainda nos tubos cônicos originais de 10 mL) com 5 mL deA solução de cloreto de mercúrio e devolver a amostra ao escuro a temperatura ambiente por mais 13 dias. </li><li> Adicione 30 g de tampão pós-impregnação a 90 mL de água destilada ou desionizada (dH2O). Preencha cada poço de uma placa de 6 poços com 6,5 mL do tampão pós-impregnação, um poço por cérebro NOTA: O buffer pós-impregnação é fornecido no kit que está listado na tabela de materiais. <ol><li> Após 14 dias (no total) na solução de cloreto de mercúrio, enxágue o tecido com dH 2 O e, em seguida, transfira-os para placas de 6 poços com tampão pós-impregnação. Cubra os pratos com papel alumínio e guarde-os à temperatura ambiente no escuro. </li></ol></li><li> Pipetar o buffer de pós-impregnação após 1 dia de imersão e renovar com tampão pós-impregnação fresco; Armazene por 1 dia no escuro à temperatura ambiente. Se necessário, armazene isto a 4 ° C por até 1 mês 22 . </li></ol> 4. Seção <ol><li> Rotule as placas de 12 poços em suas tampas com números em ordem crescente da esquerda para a direita e para cima para baixo. </li><li> Prepare duas ou três placas de 12 poços por cérebro, se estacionar todo o cérebro. <ol><li> Rotule a parte superior de cada tampa da placa de 12 poços com o número de identificação do cérebro seccionado. </li><li> Pipetar 2 mL de 1x PBS em cada poço de cada placa. </li></ol></li><li> Configure o palco e ative o vibratome; Certifique-se de que haja 1x PBS no recipiente para cobrir o tecido. <ol><li> Corte dois pedaços de película de parafina de plástico e dobre-os duas vezes. Coloque-os sobre os orifícios para os botões do suporte do espécime para evitar que 1x PBS vaze no contador. </li><li> Coloque a fita no bloco de tecido do suporte do espécime e coloque em seguida cola adesiva de cianoacrilato (ver tabela de materiais). </li></ol></li><li> Retire o cérebro da placa de 6 poços e coloque-o sobre um prato de plástico ou de vidro. Use o aço inoxidávelLâmina de aço de dois gumes para cortar cerca de metade do cerebelo. <ol><li> Corte o cerebelo caudalmente. Certifique-se de que a porção do cerebelo restante é uniforme. </li></ol></li><li> Coloque imediatamente a superfície plana do cerebelo restante na cola. NOTA: A parte dorsal do tecido (o córtex cerebral) deve estar voltada para a esquerda ou para a direita em relação à lâmina. A extremidade rostral que anteriormente continha a lâmpada olfativa em anexo deve virar para cima. <ol><li> Espere pelo menos alguns minutos para se certificar de que a cola seca completamente. </li></ol></li><li> Enquanto a cola que segura o cérebro no lugar é a secagem, despeje 1x PBS no banho do espécime. Após a cola estar seca, coloque o suporte do espécime com o tecido no banho da amostra. <ol><li> Se a amostra de tecido não estiver totalmente coberta, despeje mais 1x PBS no banho da amostra. </li></ol></li><li> Anexe a lâmina ao suporte da lâmina do vibratome e lentamente lColoque a lâmina no banho do espécime até ficar completamente submersa em 1x PBS. Continue abaixando a lâmina até ficar ligeiramente abaixo da parte superior do tecido. </li><li> Ajuste a velocidade do vibratoma para 7, a amplitude para 6 e o ​​ângulo de corte para 12 ° (ver tabela de materiais para o modelo vibratome). Comece a vibração e corte as seções de 200 μm 23 . <ol><li> Use um grande pincel para mover as seções de tecido do banho da amostra em cada poço designado das placas de 12 poços. </li></ol></li><li> Continue a cortar o tecido até atingir o número desejado de seções de tecido. </li></ol> 5. Pós-coloração <ol><li> Para cada uma das seguintes etapas de coloração e enxaguamentos, use 2 mL da solução indicada por poço. Use um enchimento de pipeta motorizado (veja tabela de materiais) para transferir as soluções para os poços. Use uma pipeta de transferência (veja tabela de materiais) para transferir soluções para fora dos poços e para dentro dos resíduos adequadoscontainers. </li><li> Enxaguar as secções em uma lavagem de 30 min de PBS-T 0,01 M (adicionar 3,0 mL de detergente (ver tabela de materiais) a 1.000 mL de PBS 0,01 M). </li><li> Diluir a solução de hidróxido de amônio (precaução) 3: 5 em volume com dH 2 O imediatamente antes da utilização. Manchar as secções na solução diluída de hidróxido de amónio durante 19-21 min. <ol><li> Proteja a solução de hidróxido de amônio sensível à luz com papel alumínio. NOTA: O hidróxido de amônio na solução tem uma concentração de ~ 10% e é classificado como &quot;perigoso&quot;. A solução de hidróxido de amônio pode produzir queimaduras se entrar em contato com a pele. Pode causar irritação das vias respiratórias se inalado. Use luvas de proteção e trabalhe com uma aspiradora. </li></ol></li><li> Manchar as secções no tampão pós-coloração (adicionar 90 g de reagente D em 500 mL de dH2O) durante 19-21 min. O buffer de pós-coloração é sensível à luz; Proteja-o com papel alumínio 22 . </li><li> Enxaguar as secções em três, 5-10 min lavagens de 0,01 M de PBS-T. </li></ol> 6. Montagem, limpeza e cobertura <ol><li> Monte as seções em 1% de lâminas revestidas de gelatina com o grande pincel. Deixe secar durante 20 a 30 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, coloque-os em um frasco de Coplin durante a noite. </li><li> Remova as lâminas com as mãos enluvadas da jarra Coplin e coloque-as em uma prateleira de plástico (ver tabela de materiais). Coloque a prateleira de plástico no prato de coloração (ver tabela de materiais) contendo 100% de etanol. Desidratá-los com três lavagens de 5 min. </li><li> Lave as lâminas duas vezes por 5 min cada em 99% de xileno. Coloque os slides em uma prateleira de vidro e abaixe a cremalheira em um prato de coloração de vidro contendo xileno com uma alça metálica (ver tabela de materiais). NOTA: Cuidado, o xileno é prejudicial se inalado e causa irritação se ele tocar a pele. É altamente inflamável em estados de líquido e vapor. Use luvas de proteção e trabalhe com uma aspiradora. </li><li> Remova as lâminas do xilEne uma por vez e cobrir rapidamente o tecido com ~ 0,25 mL de mídia de montagem (ver Tabela de materiais). Em seguida, pegue as capas deslizantes e coloque-as sobre a mídia. <ol><li> Empurre as bolhas de ar presas debaixo das tampas deslizantes para a borda com um objeto contundente, como o fim de um pincel. </li></ol></li><li> Coloque os slides em uma área longe da luz solar e deixe secar por 2-3 dias. </li><li> Proceda à aquisição de imagens usando um microscópio e analise com o software apropriado. </li></ol> 7. Adquira pilha de imagens <ol><li> Abra o programa de imagem (consulte a Tabela de materiais ). Coloque o slide no palco do microscópio. No menu no topo do programa, clique em &quot;Aquisição&quot; e, em seguida, clique em &quot;Imagem ao vivo&quot;. </li><li> Coloque o microscópio em 10X. Identifique o neurônio de preferência e depois traga o cursor, que aparece como um X vermelho, no centro do soma. Clique com o botão esquerdo para definir o ponto de referência. </li><li> Coloque o microscópio em 40X. Clique em &quot;Mover&quot; no menu na parte superior do programa e depois clique em &quot;Para Ponto de Referência&quot;. </li><li> Comece a criar a pilha de imagens, deslocando manualmente com o objetivo fino acima do tecido até ficar um pouco fora de foco. <ol><li> Clique em &quot;Set Top&quot; no canto inferior direito do programa sob o título &quot;Aquisição de imagens&quot;. </li><li> Desloque-se ligeiramente sob o tecido até ficar ligeiramente fora de foco e depois clique em &quot;Definir fundo&quot; em &quot;Aquisição de imagens&quot;. Em seguida, clique em &quot;Adquirir pilha de imagens&quot;. </li></ol></li><li> Após a aquisição da pilha de imagens, digite o nome desejado para o arquivo de imagem na janela que aparece. Salve como &quot;arquivo MBF Ascii&quot;. <ol><li> Quando solicitado, selecione o tipo de arquivo como &quot;arquivo de pilha JPEG 2000 MBF&quot; e clique em &quot;Salvar&quot;. </li></ol></li></ol> 8. Rastreamento neuronal <ol><li> Na ferramentaSob o menu, clique na caixa intitulada &quot;Nome do contorno&quot;. Selecione &quot;Soma&quot; no menu suspenso. </li><li> Trace manualmente o soma. Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione &quot;Finalizar o corpo da célula&quot; quando o rastreamento estiver completo. </li><li> Selecione &quot;AutoNeuron&quot; para exibir outra guia intitulada &quot;AutoNeuron Workflow&quot;. </li><li> Em &quot;Tipo de configuração&quot;, selecione &quot;Novo&quot;. Defina os parâmetros e, em seguida, clique em &quot;Próximo passo&quot; para exibir a subposição &quot;Soma Detection&quot;. <ol><li> Para definir os parâmetros, selecione &quot;Brightfield&quot;. Em seguida, em &quot;Diâmetro máximo do processo&quot;, clique em &quot;Iniciar medição&quot;. Usando o cursor, vá para a base do dendrite e ajuste manualmente o diâmetro. </li></ol></li><li> Clique em &quot;Sim&quot; na janela que pede ao usuário que rastreie toda a imagem. Trace manualmente o soma. Desmarque e clique em &quot;Próximo passo&quot; para exibir a subposição &quot;Colocação de sementeira&quot;. </li><li> Clique em &quot;Validar semente&quot;S &quot;e, em seguida, clique em&quot; Próximo passo &quot;para exibir a subposição&quot; Neuron Reconstruction &quot;. </li><li> Em &quot;Neuron&quot;, clique em &quot;Interactive&quot;. Execute o rastreamento interativo seguindo a direção do programa dos dendritos e clique com o botão direito do mouse para completar a área destacada rastreada pelo programa. Depois de rastrear todos os dendritos, clique em &quot;Próximo passo&quot;. </li><li> Depois que uma nova janela aparecer, salve a nova configuração com o título desejado. Clique em &quot;Salvar&quot;. </li></ol> 9. Análise <ol><li> Abra o programa de análise (veja a tabela de materiais). </li><li> Clique em &quot;Arquivo&quot; no menu superior e depois clique em &quot;Abrir arquivo de dados&quot;. Selecione o arquivo de interesse. </li><li> Sob a subposição de análise, selecione &quot;Análise Sholl&quot;. </li><li> Na janela &quot;Análise Sholl&quot;, ajuste o raio de partida para 10 μm. Em &quot;Análise&quot;, clique nas caixas &quot;Dendritas&quot; e &quot;Ordens de Ramificação&quot;. </li><li> Direito clIck na janela recém-inaugurada e clique em &quot;Exportar Excel&quot;. Clique em &quot;Salvar&quot;. </li><li> Sob a análise, clique em &quot;Análise de Estrutura Ramificada&quot;. Selecione &quot;Todas as análises possíveis&quot;. </li><li> Clique com o botão direito na janela recém-inaugurada e clique em &quot;Excel Export&quot; 24 . </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Comparado com técnicas mais modernas, o método de Golgi-Cox tem várias vantagens que o tornam o método preferido para examinar a morfologia da coluna: 1) A coloração pode ser usada para essencialmente qualquer tecido, 2) Uma configuração básica de microscópio de luz é tudo o que é necessário para Adquirir imagens baseadas em Golgi, 3) A imagem de Golgi-Cox é mais rápida do que a imagem confocal, e 4) As secções coradas de Golgi são viáveis ​​por vários meses a anos mais do que as amostras que sã...

<html> Os dendritos são a maior parte dos neurônios que recebem e processam a entrada pré-sináptica 1 . Seus processos dendríticos têm uma geometria complexa, onde os ramos proximais têm um diâmetro maior do que os ramos distal. À medida que os dendritos se desenvolvem, eles formam várias conexões com outros neurônios em um processo conhecido como arborização dendrítica. A extensão eo padrão dessa ramificação determinam a quantidade de entradas sinápticas que um dendrite pode processar adequadamente 2 . A arborização dendrítica é um processo necessário para a plasticidade dependente da atividade e o desenvolvimento adequado dos circuitos neuronais. Extensão, retração, ramificação e sinaptogênese são processos intrincados que incluem programas genéticos intrínsecos e influências de fatores extrínsecos. As variações morfológicas e ramificantes dos dendritos neuronais dentro do hipocampo estão implicadas na cognição e na formação da memória.As alterações na complexidade dendrítica estão associadas a alterações fisiopatológicas e comportamentais 5. As anormalidades estão relacionadas a vários estados patológicos, incluindo síndrome de X frágil e síndrome de Down 6 . As espinhas dendríticas são os compartimentos subcelulares especializados dos corredores dendríticos que recebem entrada excitatória no sistema nervoso central. Existem três classes morfológicas de espinhas dendríticas, com o nome de cada classe com base no tamanho e na forma: 1) espinhas de cogumelo, que apresentam densidades pós-sinápticas complexas com mais receptores de glutamato do que outras espinhas 7 ; 2) espinhos espinhosos, que não possuem tronco; E 3) espinhas finas, que consistem em uma haste prolongada e estreita e uma cabeça globular 8 . O volume da coluna dendrítica é usado em parte para defini-los, com espinhas finas geralmente menores (0,01 μm 3 </sup&gt;) Em comparação com as espinhas dos cogumelos (0,8 μm 3 ) 9 , 10 . As espinhas se estabilizam com a maturação. Por exemplo, as espinhas finas se retraem após alguns dias ou se desenvolvem em espinhos de cogumelo. Alternativamente, as espinhas dos cogumelos são relativamente estáveis ​​e podem sobreviver durante um período prolongado. A força das conexões neuronais é pensada para ser baseada no número de espinhas e / ou seu volume 11 , 12 , 13 . O método clássico de coloração de Golgi e suas variações mais modernas têm sido úteis para examinar a morfologia e a densidade da coluna dendrítica. Um aspecto único da coloração de Golgi é que ele mancha aleatoriamente cerca de 5% dos neurônios totais, o que permite o rastreamento de neurônios individuais 14 , 15 . Embora o mecanismo exato em que a metanfeta de GolgiNão há ainda desconhecidos os neurônios individuais, o princípio do método é baseado na cristalização do cromato de prata (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Existem três tipos principais do método de Golgi: o Golgi rápido, o Golgi-Cox e o Golgi-Kopsch 18 , 19 . Todos os três métodos começam com uma fase inicial de incubação em sais de cromo durante vários dias a meses, mas existem certas diferenças fundamentais entre eles. O Golgi rápido usa o tetróxido de ósmio no primeiro passo, enquanto o Golgi-Kopsch inclui paraformaldeído. A coloração tanto no Golgi quanto no Golgi-Kopsch é seguida por uma incubação em uma solução de nitrato de prata a 1% a 2% durante cerca de 7 dias. O método de Golgi-Cox usa cloreto de mercúrio e dicromato de potássio em vez de nitrato de prata e tem um tempo de impregnação de 2-4 semanas. Os tecidos são então seccionados e colocados rapidamente em amônia diluídaSolução, seguida por um fixador fotográfico para remover os sais. Dos três tipos, pensa-se que o método de Golgi-Cox é o melhor na coloração dos corredores dendríticos sem muita interferência de fundo, em parte, porque os artefatos de cristal não ocorrem na superfície do tecido (ao contrário do método rápido de Golgi) 17 , 20 , 21 . O presente método é uma pequena variação do protocolo fornecido com um kit comercial de coloração de Golgi e foi projetado para avaliar como uma dose relativamente baixa de 5-Fu afetaria as características morfológicas dendríticas e a densidade da coluna vertebral. Qualquer informação adquirida pode fornecer informações adicionais sobre como o tratamento quimioterapêutico afeta os circuitos neuronais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">superGolgi Kit&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Bioenno Lifesciences</td>
			<td style="width:119px;">30100</td>
			<td style="width:216px;">&#160;Contains hazardous materials.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 10X powder concentrate</td>
			<td style="width:207px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Permount&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SP 15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Slide cover&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">12-546-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7mL Transfer pipette&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Globe Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 mL Falcon tubes&#160;</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Foil&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">01-213-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">12-well plate&#160;</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200 proof Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Pharmco-AAPER</td>
			<td style="width:119px;">111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Acros Organics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1330-20-7</td>
			<td>Hazardous.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Permabond 200</td>
			<td style="width:207px;">Permabond LLC</td>
			<td style="width:119px;">GF2492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">25 mL serological pipette</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">SIAL1489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:207px;">Midsci</td>
			<td style="width:119px;">HS234526C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vibratome&#160;</td>
			<td style="width:207px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NVSLM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57Bl/6 Male Mice&#160;</td>
			<td style="width:207px;">The Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td style="width:119px;">000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Axio Imager 2</td>
			<td style="width:207px;">ZEISS</td>
			<td style="width:119px;">Multiple components, see website for details.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AxioCam MRc Camera</td>
			<td style="width:207px;">ZEISS</td>
			<td style="width:119px;">426508-9902-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining Dish , Green</td>
			<td style="width:207px;">Tissue-Tek</td>
			<td>62541-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining Dish Set&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>70312-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Motorized Pipet Filler&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">03-692-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurolucida&#160;</td>
			<td style="width:207px;">mbf Bioscience&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurolucida Explorer&#160;</td>
			<td style="width:207px;">mbf Bioscience&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prism&#160;</td>
			<td style="width:207px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of hippocampal dendritic complexity in aged mice using the golgi-cox method

As espinhas dendríticas são as protuberâncias dos eixos dendríticos neuronais que contêm sinapses excitatórias. As variações morfológicas e ramificantes dos dendritos neuronais dentro do hipocampo estão implicadas na cognição e na formação da memória. Existem várias abordagens para a coloração de Golgi, todas as quais foram úteis para determinar as características morfológicas dos corredores dendríticos e produzir um fundo claro. O presente método de Golgi-Cox, (uma pequena variação do protocolo que é fornecido com um kit de coloração Golgi comercial) foi projetado para avaliar como uma dose relativamente baixa do medicamento quimioterápico 5-flurouracil (5-Fu) afetaria a morfologia dendrítica , O número de espinhas e a complexidade da arborização dentro do hipocampo. O 5-Fu modificou significativamente a complexidade dendrítica e diminuiu a densidade da coluna em todo o hipocampo de uma maneira específica da região. Os dados apresentados mostram que o método de coloração de Golgi efManchou os neurônios maduros no CA1, o CA3 e o giro dentado (DG) do hipocampo. Este protocolo relata os detalhes de cada passo para que outros pesquisadores possam manchar de forma confiável tecido em todo o cérebro com resultados de alta qualidade e solução de problemas mínima.

Os efeitos do tratamento com 5-Fu sobre a arborização dendrítica e a complexidade no hipocampo das seções cerebrais manchadas de Golgi foram quantificados e rastreados usando um software de imagem comercialmente disponível. Após o rastreamento, a arborização dendrítica, a densidade da coluna vertebral e a morfologia da coluna vertebral foram analisadas através da análise de Sholl e do índice de complexidade dendrítica (DCI). A análise de Sholl é um método analítico quan...

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Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Aqui apresentamos um protocolo Golgi-Cox com detalhes detalhados. Este método de mancha de tecido confiável permite uma avaliação de alta qualidade da citoarquitetura no hipocampo e em todo o cérebro, com solução de problemas mínima.

Avaliação da complexidade dendrítica do hipocampo em ratos idosos usando o método de Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

assessment-hippocampal-dendritic-complexity-aged-mice-using-golgi-cox

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.9K visualizações.  University of Arkansas for Medical Sciences.  Aqui apresentamos um protocolo Golgi-Cox com detalhes detalhados. Este método de mancha de tecido confiável permite uma avaliação de alta qualidade da citoarquitetura no hipocampo e em todo o cérebro, com solução de problemas mínima. 

Vídeo: Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Assessment of Motor Balance and Coordination in Mice using the Balance Beam

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice. Fine motor coordination and balance can be assessed by the beam walking assay. The goal of this test is for the mouse to stay upright and walk across an elevated narrow beam to a safe platform. This test takes place over 3 consecutive days: 2 days of training and 1 day of testing. Performance on the beam is quantified by measuring the time it takes for the mouse to traverse the beam and the number of paw slips that occur in the process. Here we report the protocol used in our laboratory, and representative results from a cohort of C57BL/6 mice. This task is particularly useful for detecting subtle deficits in motor skills and balance that may not be detected by other motor tests, such as the Rotarod.

Deficits in fine motor coordination can be assessed with the balance beam test. Performance on the beam is quantified by the speed at which the beam is traversed and the number of times the mouse slips on the beam.

Avaliação do Equilíbrio e Coordenação Motor em camundongos usando o feixe de equilíbrio

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice.  Fine motor coordination and ...

Neurociência

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetic Perturbação da atividade neural com Iluminação Laser no Semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile stimulation is a positive early experience that mimics maternal licking and grooming in the rat. Exposing rat pups to this positive experience can be completed easily and cost-effectively by using highly accessible materials such as a household duster. Using a cross-litter design, pups are either stroked or left undisturbed, for 15 min, three times per day throughout the perinatal period. To measure the neuroplastic changes related to this positive early experience, Golgi-Cox staining of brain tissue is utilized. Owing to the fact that Golgi-Cox impregnation stains a discrete number of neurons rather than all of the cells, staining of the rodent brain with Golgi-Cox solution permits the visualization of entire neuronal elements, including the cell body, dendrites, axons, and dendritic spines. The staining procedure is carried out over several days and requires that the researcher pay close attention to detail. However, once staining is completed, the entire brain has been impregnated and can be preserved indefinitely for ongoing analysis. Therefore, Golgi-Cox staining is a valuable resource for studying experience-dependent plasticity.

This paper describes the procedures for tactile stimulation of rat pups and subsequent Golgi-Cox staining of neuronal morphology. Tactile stimulation is a positive experience that is administered in the perinatal period by stroking pups with a household duster. Golgi-cox staining is a reliable procedure permitting the visualization of entire neurons.

Visualizar os Efeitos de uma experiência precoce positiva, Tátil Estimulação, em dendríticas Morfologia e Synaptic conectividade com Golgi-Cox Coloração

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imagiologia espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo de rato primária usando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Avaliação de dendríticas Arborização no giro dentado do hipocampo em Ratos Região

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Um método simples e barato para a determinação da sensibilidade Fria e Adaptação no Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Aged em neurônios do hipocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...