Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, o Instituto Eunice Kennedy Shriver Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (HD008913 subvenção para C.-HL) e do Centro de Tecnologia da Informação (PGM, NP, ESM e MM).

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Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, vamos mostrar como imagem e analisar mandris dendríticas dos neurônios da medula Drosophila. A primeira seção, dual-view de imagem, descreve a deconvolução e combinação de duas pilhas de imagens em uma pilha de imagens de alta resolução. A segunda seção, o rastreamento dendrite e registro, descreve a detecção e registo das dendrites dos neurónios da medula para a matriz coluna de referência. A terceira seção, a análise dendrítica, descreve o uso de scripts personalizados para analisar os padrões dendríticas. Juntos, esses protocolos fornecem um fluxo de trabalho completo para extrair informações sobre os padrões dendríticas no que diz respeito às camadas e colunas e determinar ramificação dendrítica e frequências de terminação. O método de imagem dual-view aqui apresentado é conceitualmente similar às técnicas de imagem multi-vista implementadas com microscópios de luz folha, em que duas ou mais pilhas de imagens coletadas ortogonal são recombinados para alcançar um elevado Resolução axialn 17, 18. No entanto, é tecnicamente desafiador para ortogonalmente implementar as duas altas NA (abertura numérica) lentes objetivas que são necessárias para geração de imagens dendrites finas. Assim, o método de dupla vista requer imagiologia do cérebro mesma amostra em dois passos consecutivos e re-orientar a amostra entre imagiologia. Falhas na combinação de imagens são provavelmente causado por movimento da amostra durante o exame ou esmagamento da amostra durante a manipulação. Além disso, embora o processo de recombinação imagem atenua o problema de distorção axial e resulta na resolução de quase-isotrópica, as imagens são recombinados ainda sob um limite de difracção. O nosso método de imagem dual-view precisa apenas de microscopia confocal padrão, que é amplamente disponível. No entanto, a microscopia de super-resolução, tais como iluminação STED ou estrutura, se disponível, seria uma excelente alternativa para o método de imagem dual-view aqui presentes. oseção de rastreamento e registro dendrite aqui apresentado traça árvores dendríticas e registra árvores dendríticas para a matriz coluna de referência. Neste protocolo, o Imaris programa comercial é usado para rastreamento de semi-automatizado dendrite e para a atribuição de pontos de referência. Tarefas similares poderia ser realizada utilizando uma série de alternativas livres, tais como NeuronJ 19, 20 e 21 de neurites Tracer. Nosso protocolo de registro usa um plugin personalizado implementado no MIPAV programa de código aberto para registrar os traços dendríticos para a matriz coluna de referência. Para nosso conhecimento, este método de registo é o único método que registra traços neurite para colunas e camadas. Este procedimento usa regularmente organizadas axônios fotorreceptoras como marcos para o registo. Os vestígios dendríticas geradas pelo método de registo não-linear são ideais para a extracção de informação sobre os padrões dendríticas, relativamente às colunas e camadas. No outrolado, o método de registo de corpo rígido alinha os eixos cartesianos de vestígios dendríticas aos eixos cardinais do neuropil sem alterar os comprimentos dendriticas ou outras propriedades geométricas locais. Portanto, o corpo rígido registrados traços dendríticas são adequados para análises morfométricas padrão. Análises morfométricas dendrítica tradicional, tais como L-medida 22, caracteriza propriedades dendríticas locais e globais sem fazer referência tecido circundante. Temos anteriormente mostrado que muitos neurônios da medula compartilhar propriedades geométricas dendríticas e que tais medidas são insuficientes para diferenciar medula tipos de neurônios 12. Em vez disso, atributos dendríticas específicos do tipo estão diretamente associados com as camadas e colunas onde residem dendrites. Em particular, diferentes tipos de neurónios de medula projectar dendritos em direcções planas distintas para terminar em camadas específicas da medula. Estes dois atributos dendríticas reflect a função dendrítica de neurônios da medula para receber aferentes retinotopically dirigidos organizados em camadas e colunas. Para facilitar a extração dessas propriedades, desenvolvemos a caixa de ferramentas árvore dendrítica que contém uma série de funções personalizadas para o cálculo de propriedades dendríticas. Na secção de análise dendrítica, que mostra como estas funções pode ser aplicada aos vestígios dendríticas registrados para calcular a distribuição de terminação específica de camada e instruções de projecção planar de dendritos. A caixa de ferramentas árvore dendrítica fornece uma plataforma para adicionar outras funções personalizadas para análise dendrítica. Na seção de análise dendrítica, também descrevem o processo para derivar estimativas para terminação dendrítica aparente e frequências de ramificação. Em particular, estas funções calcular a ramificação e terminadas com base em frequências de um estimador não paramétrico de Kaplan-Meier para a probabilidade de que um segmento dendrítica vai estender-se a uma certa length sem ramificação ou cessação 12, 23. É importante notar que o corpo rígido registado (mas não os não-linearmente registadas) traços dendríticas deve ser usada para este cálculo, porque o processo de registo não linear altera comprimentos de segmento dendríticas. A ramificação e terminação frequências dendríticas são a primeira derivada (a inclinação) das curvas KM e pode ser calculada utilizando o método de ajuste de função. Além disso, o cálculo preciso da ramificação e frequências que terminam muitas vezes requer um conjunto de dados de tamanho considerável (&gt; 10 neurônios para neurônios TM) porque os neurônios individuais têm apenas um número relativamente pequeno de segmentos dendríticas. Nos exemplos fornecidos, Tm2 e TM20 tem ramificação semelhante frequências e de terminação, mas a frequência de ramificação Tm2 não é homogénea em toda a ramificação comprimento, um traço característico de Tm2 dendrites 12. Enquanto os nossos protocolossão concebidos para neurónios de medula de Drosophila, que pode ser adaptado para analisar outros neurónios que dendritos elaborados em camadas e colunas, tais como outros lobos ópticos de Drosophila e a retina de vertebrados e no córtex. Essas adaptações exigiria a construção de uma nova matriz coluna de referência com base no sistema de interesses 12, bem como pequenas modificações do plugin MIPAV. Nós fornecemos todos os nossos programas como software de código aberto para promover a colaboração e partilha.

Durante o desenvolvimento, os neurônios dendritos elaborados em complexos mas estereotipados padrões ramificados para formar sinapses com os seus parceiros pré-sinápticos. padrões de ramificação dendríticas correlacionar com a identidade e as funções neuronais. Os locais de mandris dendríticas determinar o tipo de entradas pré-sinápticos que recebem, enquanto o dendríticas ramificação tamanhos de complexidade e de campo governar o número de entrada. Assim, as propriedades morfológicas dendríticas constituem factores determinantes para a conectividade sináptica e computação neuronal. Em muitas regiões do cérebro complexas, tais como os lóbulos óptica da mosca e a retina dos vertebrados, circuitos sinápticos são organizadas em colunas e camadas para facilitar o processamento de informação 1, 2. Em tal organização coluna e camada, os neurónios pré-sinápticos de distintos axónios projecto modalidade para terminar numa camada específica (os chamados direccionamento específico de camada) e para formar uma matriz bi-dimensional ordenada (de modo-Called mapa topográfico), enquanto os neurônios pós-sinápticos estender dendritos de tamanhos adequados em camadas específicas para receber entradas pré-sinápticas dos tipos e números corretos. Enquanto axonal direcionamento para as camadas e colunas tem sido bem estudada 3, 4, muito menos se sabe sobre como dendritos são encaminhadas para camadas específicas e expandir adequadamente dimensionada campos receptivos para formar conexões sinápticas com os parceiros pré-sinápticos corretos 5. A dificuldade de imagem e quantificar dendrítica direcionamento para as camadas e colunas tem dificultado o estudo do desenvolvimento dendrítica em estruturas cerebrais colunar e laminados. Drosophila neurônios da medula é um modelo ideal para o estudo de roteamento dendrítica e montagem de circuito em colunas e camadas. O neurópilo mosca medula é organizado como uma estrutura 3D de 10 camadas e aproximadamente 750 colunas. Cada coluna é inervado por um conjunto de fibras aferentes, incluindo photoreceptors R7 / R8 e neurônios da lâmina L1 - L5, cujos terminais axonal formar mapas topográficos de uma forma específica de camada 6. Cerca de 38 tipos de neurônios da medula estão presentes em cada coluna de medula e dendrites elaboradas em camadas específicas e com tamanhos de campo adequados para receber as entradas a partir destes aferentes 7. Os circuitos sinápticos na medula foram reconstruídos no nível do microscópio electrónico; Assim, as parcerias sinápticas estão bem estabelecidos 7, 8. Além disso, as ferramentas genéticas para a marcação de vários tipos de neurónios de medula são disponíveis 9, 10, 11. Ao examinar três tipos de transmedulla (TM) neurônios (Tm2, Tm9 e TM20), já anteriormente identificados dois atributos específicos de células do tipo-dendríticas: (i) neurônios Tm projetam dendrites quer na direcção anterior ou posterior (proj planardirecção exão), dependendo dos tipos de células e (ii) dendrites dos neurónios de medula terminam em camadas específicas da medula de uma forma específica de célula do tipo-(terminação específica de camada) 12. Planar direção de projeção e terminação específica camadas são suficientes para diferenciar estes três tipos de neurônios Tm, enquanto que mutações que perturbam respostas TM para camada e coluna pistas prejudica aspectos distintos desses atributos. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho completo para examinar o padrão dendrítica de neurônios da medula Drosophila em colunas e camadas (Figura 1). Em primeiro lugar, vamos mostrar um método de imagem dual-view, que usa software personalizado para combinar dois imagem confocal pilhas para gerar imagens isotrópicas de alta qualidade. Este método necessita apenas de microscopia confocal convencional para gerar imagens de alta qualidade que permitem o rastreio de confiança de ramos dendríticos, sem recorrer à microscopia de super-resolução, tals STED (Emissão Estimulada de Esgotamento) ou iluminação estrutural. Em segundo lugar, apresentamos um método para rastrear mandris dendríticas e para registrar os traços neurite resultantes para uma matriz coluna de referência. Em terceiro lugar, podemos mostrar os métodos computacionais para a extracção de informação sobre a direcção de projecção planar e terminação específica de camada de dendritos, bem como para derivar estimativas para a ramificação e de terminação frequências dendríticas. Juntos, estes métodos permitem a caracterização dos padrões dendríticas em 3D, a classificação de tipos de células com base em morfologias dendríticas, e a identificação de possíveis defeitos em mutantes.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huygens Professional</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td>version 16.05</td><td>for image deconvolution (https://svi.nl).&amp;nbsp; commercial software</td></tr><tr><td>MIPAV</td><td></td><td>version 7.3.0</td><td>for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware</td></tr><tr><td>MIPAV plugin: PlugInDrosophila&lt;br/&gt;RetinalRegistration.class</td><td></td><td></td><td>freeware</td></tr><tr><td>MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard&lt;br/&gt;ColumnRegistration.class</td><td></td><td></td><td>freeware</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software</td></tr><tr><td>Vaa3D</td><td></td><td></td><td>for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>R2014b</td><td>for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software</td></tr><tr><td>Matlab toolbox: TREES1.14</td><td></td><td>v1.14</td><td>for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware</td></tr><tr><td>Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox</td><td></td><td>v1.0</td><td>For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sample files&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SWC file definition</td><td></td><td></td><td>http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html</td></tr><tr><td>The codes and sample files for image combination and registration</td><td></td><td></td><td>https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration</td></tr><tr><td>Reference point example&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&amp;amp;modificationDate=&lt;br/&gt;1471880596000&amp;amp;api=v2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Computer system&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later</td><td></td><td></td><td>3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal)</td></tr><tr><td>Optional: Quadro4000&amp;nbsp; (or above) graphic card</td><td>Nvidia</td><td></td><td>for stereographic visualization of dendrites.</td></tr><tr><td>Optional: NVIDIA 3D vision2</td><td>Nvidia</td><td></td><td>http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html</td></tr><tr><td>Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2</td><td></td><td></td><td>http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for imaging&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24B10 antibody</td><td>The Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Antibody</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>G10362</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A21124</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mounting&amp;nbsp;Clay&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>S04179</td><td></td></tr><tr><td>70% glycerol in 1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover glasses, high performance, D = 0.17&amp;nbsp;mm</td><td>Zeiss</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing dendritic morphology in columns and layers

Em muitas regiões do sistema nervoso central, tais como os lóbulos óptica da mosca e do córtex vertebrado, circuitos sinápticos são organizados em camadas e colunas para facilitar a conexão cerebral durante o desenvolvimento e processamento da informação nos animais desenvolvidos. neurônios pós-sinápticos dendritos elaborados nos padrões específicos do tipo em camadas específicas para sinapse com terminais pré-sinápticos apropriados. O neurópilo mosca medula é composta de 10 camadas e cerca de 750 colunas; cada coluna é enervado pelo dendritos de mais de 38 tipos de neurônios da medula, que combinam com os terminais axonal de cerca de 7 tipos de aferentes de uma forma específica do tipo. Este relatório detalha os procedimentos para a imagem e analisar dendrites dos neurónios da medula. O fluxo de trabalho inclui três seções: (i) a secção de imagem dual-view combina duas pilhas de imagens confocal coletadas em orientações ortogonais em um de alta resolução de imagem 3D de dendrites; (Ii) a dendrite rastreamento e secção de registo traça dendríticamandris em 3D e registra traços dendríticas para a matriz coluna de referência; (Iii) a secção de análise dendrítica analisa padrões dendríticas em relação às colunas e camadas, incluindo terminação e de projecção planar direcção específica da camada de mandris dendríticas, e obtém estimativas de ramificação e de terminação frequências dendríticas. Os protocolos utilizam plugins personalizados construídos na MIPAV open-source (Medical Imaging processamento, análise e visualização) da plataforma e personalizadas caixas de ferramentas na linguagem laboratório matriz. Juntos, estes protocolos de fornecer um fluxo de trabalho completo para analisar o encaminhamento dendríticas de medula neurónios de Drosophila em camadas e colunas, para identificar os tipos de células, e para determinar defeitos de mutantes.

Usando o procedimento de imagem dupla vista aqui apresentado, uma mosca contendo neurónios do cérebro TM20 escassamente marcado foi fotografada em duas direcções ortogonais. Antes da imagem, o cérebro foi corado com anticorpos primários e secundários apropriados para visualizar GFP e fotorreceptoras axônios membrana-tethered. Para imagiologia, o cérebro foi montado pela primeira vez na orientação horizontal (Figura 2A, B). Um neurónio TM20 marcado com GFP e os axónios fotorreceptoras circundantes foram fotografadas usando um microscópio confocal (Figura 3A). O cérebro foi então re-alinhadas (Figura 2A, B) e o mesmo neurónio TM20 foi re-fotografada na orientação frontal (Figura 3B). Durante o processo de imagem, a localização do neurónio TM20 foi identificado como na metade ventral da medula neurópilo direito (RV configuração). Estas duas pilhas de imagens foram deconvolved usando o software de imagem deconvolução e recombined usando MIPAV (Figura 3C) para gerar uma imagem da pilha recombinante (Figura 3C). A pilha de imagem recombinante mostrou uma redução significativa da deformação axial, em comparação com qualquer pilha de entrada (Figura 3A &#39;, B&#39;). Usando o software de visualização de imagem, o axônio e dendritos do neurônio TM20 foram rastreados (Figura 3D) e salva como um arquivo inventor (iv). 27 pontos de referência sobre os axônios fotorreceptoras que cercam o neurônio TM20 foram atribuídos (Figuras 3E - H) e salvo como um arquivo de valores separados por vírgulas (CSV). Os arquivos dendríticos traçadas e arquivo de ponto de referência foi posteriormente aplicado ao plug-in personalizado em MIPAV para gerar traços dendríticos de corpo rígido registrados e não-registrados de forma linear em formato de arquivo SWC. Os traços dendríticas registrados foram convertidos para a configuração padrão RV usando o script &quot;RV_standardization.m&quot;. Tele registrou e arquivos de rastreamento dendríticas padronizados foram visualizadas utilizando Vaa3D para validar os processos de registro e de normalização (Figura 3I). Para a análise dendrítica, registrado vestígios dendríticas por 15 neurônios TM20 e 15 neurônios TM2 foram recolhidos. Usando o script &quot;Branch_term_P.m&quot;, a ramificação e que encerra probabilidade de esses neurônios foram analisados utilizando o de corpo rígido vestígios dendríticas registrados (Figura 4A, B). As curvas de Kaplan-Meier mostram que ambos os tipos neuronais têm ramificação semelhante e frequências de terminação. No entanto, Tm2 tem uma frequência de terminação inferiores para segmentos mais longos (&gt; 4 mm; Figura 4A) 12. Para analisar as propriedades associadas com camadas dendríticas e colunas, foram utilizados os vestígios dendríticas registados pelo método de registo não-linear. Usando o costume script &quot;Layer_term_P.m&quot;, a distribuiçãos de terminação dendrítica específica para neurónios da camada de TM2 e TM20 foram calculados (figura 4C, D). As distribuições distintas de terminações específicas da camada de TM2 e TM20 dendritos são consistentes com os seus parceiros sinápticos específicos em diferentes camadas: dendrites TM2 receber entradas de L2 e L4 terminais axonais em M2 e M5, respectivamente, enquanto dendrites TM20 receber contribuições das R8 e L3 no M3 camada 8, 15, 16. Usando o script &quot;Planar_proj.m&quot;, as instruções de projecção planar de TM2 e dendritos TM20 foram analisados e verificou-se ser distintos um do outro: Tm2 projecto dendritos posteriormente enquanto TM20 projecto dendritos anterior 12 (Figura 4E, F). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55410/55410fig1.jpg" /> Figura 1. O fluxo de trabalho. </strong&gt; A coluna central mostra três secções método: dual-view de imagem, traçando dendrite e de registo e análise dendrítica. Cada secção contém método de três passos. A coluna da esquerda indica o software utilizado em cada passo. A coluna da direita mostra os arquivos de entrada e saída para cada etapa, com o fluxo de dados indicado como setas laranja. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55410/55410fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55410/55410fig2.jpg" /> Figura 2. Preparação de Amostras para Dual-view Imaging and a simetria da coluna matriz Drosophila Medulla. (A, B) Amostra de montagem para a imagem de dupla-vista. (A) A vista é mostrado como se estivesse olhando para o cérebro através de uma lamela. (B) diagramas esquemáticos para montagem da amostra. Para o horizonte de imagemtal pilhas, o cérebro manchado de imuno está montado pela primeira vez na posição ventral-up. Depois de adquirir a primeira pilha, o cérebro é reposicionada na posição antero-se para imagiologia da pilha frontal. A: anterior; P: posterior; D: dorsal; V: ventral; R: right; L: esquerda. (C - E) A simetria e organização do neurópilo medula, visto na posição frontal. (C) axónios fotorreceptoras, marcadas pelo anticorpo 24B10 (vermelho), foram usadas para visualizar a organização do neuropil medula. A imagem é mostrada como se estivesse olhando de fora para dentro do cérebro. Ant: anterior; Pos: posterior; Dor: dorsal; Ven: ventral; Eq: equador. (D) Uma vista de alta ampliação de (C) em quatro quadrantes do neurópilo medula ao nível da camada R7. Os terminais centrais R7 são marcados por pontos amarelos. O anterior e equatorial R7s são marcados com pontos verdes e ciano, respectivamente. (E) Uma representação esquemática do processo de co medulaorganização lumnar. Note-se que os neuropils medula esquerdo e direito são imagens de espelho, e os dorsais e ventrais metades de cada neurópilo também são imagens no espelho, separados por o equador. Os pontos vermelhos indicam R7s equatoriais, que são os primeiros pontos de referência. Números (1 - 9) e as setas indicam a ordem de trabalhos de ponto de referência. Barra de escala: 15 mm em C; 5 mm em D. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55410/55410fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55410/55410fig3.jpg" /> Figura 3. A recombinação imagem e Ponto de referência de classificação. (A - C) As imagens confocais de um único neurónio TM20 adquirido em relação à horizontal (A) e frontais instruções (B). As imagens são mostradas como projeções de intensidade máxima. axônios fotorreceptoras e um único TM20 neuron são marcadas com anticorpo Mb24B10 (vermelho) e preso à membrana GFP (verde), respectivamente. (C) recombinado imagem de (A, vermelho) e (B, ciano). Para maior clareza, apenas fotorreceptores são mostrados. (A &#39;- C&#39;) Dual-imaging melhora a resolução axial. A imagem recombinado (A &#39;) tem uma resolução melhor do que aqueles da horizontal-view (A&#39;) e frontal-view (B &#39;) imagens. painéis inferiores: visualizações de alta ampliação das áreas em caixas nos painéis superiores. (D) Seguindo o axônio (branco) de um único neurônio TM20. O ponto de início foi indicada como um ponto ciano. (E) Os 27 pontos de referência (pontos brancos) sobre os 9 axônios fotorreceptoras que cercam os neurônios TM20 são usados como pontos de referência. Os pontos de referência são em três camadas: Top, R8 e R7. Atribuição de ponto (F) de referência em cada camada. A atribuição de pontos de referência segue a fol<html> ordem indicada: equador (EQ), ântero-equador (AE), anterior (A), ântero-ventral (AV), ventral (V), póstero-ventral (PV), posterior (P), póstero-equador (PE) e centro (C). (G) Uma representação esquemática da matriz de coluna medula utilizado para o registo. Um neurônio TM20 é mostrado (verde). As camadas medula (M1-6) são como indicado. (H) Um exemplo de camada e atribuição de ponto de referência para uma única coluna. Três camadas são utilizados para definir cada coluna: Topo, R8, e R7 (a junção de camadas M5 / 6). (I) A registada e trace neurite padronizado visualizada usando Vaa3D. Barra de escala: 5 um de A para AC; 5 um de A &#39;para A&#39;-C&#39;; 5 mm em D, E, F e G. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55410/55410fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 410fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Exemplos de resultados de análises dendríticas. (A, B) As estimativas de Kaplan-Meier (eixo dos y) de ramificação dendrítica (A) e de terminação (B) foram traçados em escala logarítmica, no que diz respeito ao comprimento de segmento (eixo x). As linhas sólidas e pontilhadas denotam médias ± SDs. TM2 (vermelho) e TM20 (preto) compartilham ramificação semelhante e frequências de terminação para os segmentos menos do que 4 mm. (C, D) histogramas que mostram a proporção média de nodos dendríticas terminais em cada camada medula (M). A percentagem de nós terminais numa dada camada é primeiro medula calculada para cada neurónio de um determinado tipo e, em seguida, em média, em todos os neurónios desse tipo. As barras verticais mostram o desvio padrão da proporção. Note-se que para os neurónios TM2 (C), a distribuição de nós terminais dendríticas é concentrada na camada medula 2, com um pico menor na camada 5, enquanto que para os neurónios Tm 20(D), a distribuição é centrada em torno das camadas M2 e M3. (E, F) parcelas polar da direcção de projecção planar de dendritos. A proporção de nós terminais projetados dentro de um bin angular (20 °) foi calculado pela primeira vez para cada neurônio de um determinado tipo e, em seguida, em média, em todos os neurônios desse tipo. As curvas vermelhas e azuis mostram a percentagem média ± desvio padrão. Os cantos sobre as curvas são os pontos médios das caixas angulares. Os círculos pretos mostram os valores proporção indicada pelo numeral de preto para o seu lado. Note-se que, em média, as duas classes de neurónios são orientados em direcções quase opostas. A: anterior; P: posterior; D / V: dorsal / ventral; Eq: equador. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55410/55410fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Aqui, mostramos como analisar roteamento dendrítica de neurônios da medula Drosophila em colunas e camadas. O fluxo de trabalho inclui uma técnica de imagem dual-vista a melhorar a qualidade de imagem e ferramentas computacionais para a detecção, registrar mandris dendríticas para a matriz coluna de referência e para analisar as estruturas dendríticas no espaço 3D.

Analisando dendríticas Morfologia em Colunas e Camadas

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K visualizações.  National Institutes of Health (NIH).  Aqui, mostramos como analisar roteamento dendrítica de neurônios da medula Drosophila em colunas e camadas. O fluxo de trabalho inclui uma técnica de imagem dual-vista a melhorar a qualidade de imagem e ferramentas computacionais para a detecção, registrar mandris dendríticas para a matriz coluna de referência e para analisar as estruturas dendríticas no espaço 3D. 

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Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Análise Sholl automatizado de Morfologia Neuronal Digitized em múltiplas escalas

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Neurociência

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Avaliação de dendríticas Arborização no giro dentado do hipocampo em Ratos Região

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Avaliação da complexidade dendrítica do hipocampo em ratos idosos usando o método de Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Análise quantitativa da arborização dendrítica Neuronal complexidade em Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Rotulagem Balística de Neurônios Piramidais em Fatias Cerebrais e na Cultura Celular Primária

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the morphology of processes and substructures within these neurons. As such, much of what is known about brain function has arisen alongside developments in imaging technologies that allow further insight into how neurons are organized and connected in the brain. Improvements in tissue clearing have allowed for high-resolution imaging of thick brain slices, facilitating morphological reconstruction and analyses of neuronal substructures, such as dendritic arbors and spines. In tandem, advances in image processing software provide methods of quickly analyzing large imaging datasets. This work presents a relatively rapid method of processing, visualizing, and analyzing thick slices of labeled neural tissue at high-resolution using CLARITY tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis. This protocol will facilitate efforts toward understanding the connectivity patterns and neuronal morphologies that characterize healthy brains, and the changes in these characteristics that arise in diseased brain states.

Neuronal dendritic morphology often underlies function. Indeed, many disease processes that affect the development of neurons manifest with a morphological phenotype. This protocol describes a simple and powerful method for analyzing intact dendritic arbors and their associated spines.

Imagem e quantificação de dendritos neuronais intactos via clareza de tecido

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Automatic Identification of Dendritic Branches and their Orientation

The structure of neuronal dendritic trees plays a key role in the integration of synaptic inputs in neurons. Therefore, characterization of the morphology of dendrites is essential for a better understanding of neuronal function. However, the complexity of dendritic trees, both when isolated and especially when located within neuronal networks, has not been completely understood. We developed a new computational tool, SOA (Segmentation and Orientation Analysis), which allows automatic measurement of the orientation of dendritic branches from fluorescence images of 2D neuronal cultures. SOA, written in Python, uses segmentation to distinguish dendritic branches from the image background and accumulates a database on the spatial direction of each branch. The database is then used to calculate morphological parameters such as the directional distribution of dendritic branches in a network and the prevalence of parallel dendritic branch growth. The data obtained can be used to detect structural changes in dendrites in response to neuronal activity and to biological and pharmacological stimuli.

Presented is a computational tool that allows simple and direct automatic measurement of orientations of neuronal dendritic branches from 2D fluorescence images.

Identificação Automática de Ramos Dendráticos e sua Orientação

The structure of neuronal dendritic trees plays a key role in the integration of synaptic inputs in neurons. Therefore, characterization of the morphology ...

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial prefrontal cortex. This technique is a marked improvement over previous methods of Golgi impregnation because the premixed chemicals are safer to use, neurons are consistently well impregnated, there is far less background debris, and for a given region, there are extremely small deviations in spine density between experiments. Moreover, brains can be accumulated after a certain point and kept frozen until further processing. Using this method any brain region of interest can be studied. Once stained and cover slipped, dendritic spine density is determined by counting the number of spines for a length of dendrite and expressed as spine density per 10 &#181;m dendrite.

The protocol describes a modification of the rapid Golgi method, which can be adapted to any part of the nervous system, for staining neurons in the hippocampus and medial prefrontal cortex of the rat.