Os autores gostariam de agradecer QuinXell Technologies e CellD, particularmente Lothar Grannemann e Dominique Ghozlan por sua ajuda com o biorreator. Agradecemos Catherine Le Visage, que forneceu-nos com pululano / andaimes polissacarídeos dextrano. Este trabalho foi apoiado pela União Europeia (projecto ERC-2014-CG Matisse 648.779) e pela AgenceNationalede la Recherche (ANR), França (projeto MagStem ANR-11 SVSE5).

1. Construção dos dispositivos magnéticos NOTA: Os dispositivos usados para a sementeira de células variam dependendo da aplicação (Figura 1). Para formar agregados, o número de células é limitado a 2,5 x 10 5 / agregado, de modo que as pontas magnéticos devem ser muito fina (750 um de diâmetro). Para semear as andaimes 1,8 centímetros 2/7 mm de espessura, os ímans devem ser maiores (3 mm de diâmetro) e vai garantir a migração de células através dos poros do andaime. <ol><li> Construção de um dispositivo com micro-imans para a formao de agregados (Figura 1A) <ol><li> Fazer micro-furos com uma broca de 0,8 mm através de placas de alumínio (3 cm de diâmetro e 6 mm de espessura). </li><li> Inserir uma ponta magnética (750 um de diâmetro) em cada orifício da placa. </li><li> Coloque este disco durante um ímã de neodímio permanente, o que garante a magnetização de saturação. </li></ol></li><li> Construção de um dispositivo para a semeadura andaime ( <strong&gt; Figura 1B) <ol><li> Cortar poliestireno disco em 2,4 cm 2 quadrados. </li><li> Inserir pequenos ímans 9 (3 mm de diâmetro, 6 mm long) a uma distância igual ao longo de uma área de superfície de 1,6 cm2. </li><li> Coloque este dispositivo sobre um ímã de neodímio permanente. </li></ol></li></ol> 2. Stem Rotulagem celular NOTA: As células estaminais foram marcadas com 0,1 mM de nanopartículas magnéticas durante 30 min (de ferro 2,6 ± 0,2 pg / célula) para formar agregados, enquanto que foram marcadas com 0,2 mM nanopartículas magnéticas durante 30 min (5 ± 0,4 pg de ferro / célula) para semear andaimes. Estas concentrações de nanopartículas e tempos de incubação foram usadas anteriormente e publicado por MSC e outras células 18, 19, e determinou-se que as nanopartículas impactado nem a viabilidade celular, nem capacidade de diferenciação MSC. A massa de ferro incorporado pelas células estaminais foi medida através de um único cell magnetoforese 19, 20. <ol><li> Culturas de células humanas estaminais mesenquimais (MSC) em meio de crescimento de células estaminais mesenquimais completo (MSCGM) a 37 ° C e 5% de CO 2 até próximo da confluência (~ 90%). </li><li> Preparar a solução de marcação magnética, misturando mM maghemite óxido de ferro revestido de citrato de 0,1 ou 0,2 (γFe 2 O 3; núcleo: 8 nm de diâmetro) em meio 5A de McCoy isento de soro modificado no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) sem glutamina e contendo cinco citrato de sódio mM. </li><li> Descartar o meio, lavar as células com meio RPMI isento de soro, sem glutamina, e adicionar 10 ml de solução de nanopartículas de óxido de ferro por frasco de cultura de 150 cm 2, o volume mínimo necessário para cobrir todas as células. </li><li> Incubar durante 30 min a 37 ° C e CO2 a 5% e, em seguida, descartar a solução de nanopartículas. Lavar durante 5 minutos com meio RPMI isento de soro, sem glutamina para internalizar o nanoparticles ainda ligada à membrana plasmática. </li><li> Descartar o meio RPMI e adicionar 25 mL de meio completo MSCGM por frasco. Incubar durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 3. semeadura de células Magnetic <ol><li> Recentemente preparar a forma condrogénica através de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) alto teor de glucose com L-glutamina por adição de 50 uM de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 0,1? M de dexametasona, piruvato de sódio 1 mM, 0,35 mM de L-prolina, 1% de cultura universal suplemento contendo insulina, transferrina humana e ácido selenoso (ITS-Pré-mistura), e 10 ng / mL de factor de crescimento transformante-beta 3 (TGF-β3). </li><li> Separe as células magnéticas utilizando 8 mL de 0,05% de tripsina-EDTA por frasco de cultura de 150 cm 2 e centrifuga-se as células dissociadas a 260 × g durante 5 min. Aspirar o meio e contar as células ressuspensas. </li><li> Coloque uma cultura de células com fundo de vidro de Petri (35 mm) na parte superior de ambos os dispositivos magnéticos. </li><li> para magnetically formar agregados, adicionar 3 ml de meio de condrogénica para a placa de Petri e suavemente depositar o menor volume possível (não mais do que 8 mL) contendo 2,5 x 10 5 culas marcadas por agregado (até 16 agregados pode ser depositado). Deixar a placa de Petri durante 20-30 minutos sem movê-lo, permitindo-lhe formar esferóides, e, em seguida, colocar o dispositivo completo, incluindo a placa de Petri contendo os 16 agregados, na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> agregados de controlo de forma a seguir o mesmo protocolo e substituir o meio completo com meio condrogénica sem TGF-β3. <ol><li> Para gerar a construção de agregado 3D, colocar em contacto os agregados 2 no dia 8 de modo a formar 8 dupletos e iniciar a fusão. No dia 11, mesclar 2 dobletes para formar 4 quadrigêmeos. Finalmente, fundir as 4 quádruplos no dia 15 para se obter a estrutura final. </li><li> Ao mesmo tempo, formar agregados por centrifugação de 2,5 x 10 5 marcado com células estaminais a 26015; g durante 5 min em 15 ml de tubos com 1,5 mL de meio de condrogénica com ou sem TGF-β3 (por amostra e de controlo, respectivamente). </li></ol></li><li> Para magneticamente andaimes de sementes, colocar cada andaime seco em uma placa de Petri. Use de polissacáridos matrizes porosas feitas de pululano / dextrano 21. Para cada andaime, dilui-se 2 x 10 6 culas estaminais marcadas em 350 uL de meio de condrogénica sem TGF-β3 e cuidadosamente pipetar as células sobre o andaime. <ol><li> Incubar durante 5 min a 37 ° C para permitir a penetração de células total dentro do andaime e, em seguida, cuidadosamente adicionar 3 mL de meio condrogénica com ou sem TGF-β3 (por amostra ou de controlo, respectivamente) para a placa de Petri. </li><li> Incubar o andaime celularizado no seu dispositivo magnético a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 4 dias para permitir a migração de células através dos poros de andaime e confinamento. </li></ol></li><li> Ao mesmo tempo, semear andaimes com 2 x 10 6 </saté&gt; células estaminais marcados seguindo o mesmo método e incubar sem o íman para obter andaimes semeados uniformemente como controlos positivos. </li></ol> 4. Diferenciação em condrócitos NOTA: Após 4 dias de incubação, remove os ímans e continuar a maturação condrogénica, quer numa placa de Petri (condições estáticas) ou num biorreactor (condições dinâmicas). amostras de controlo negativo são envelhecidos em condições estáticas com meio condrogénica sem TGF-β3. <ol><li> Em condições estáticas, manter os andaimes celularizados ou agregados na mesma placa de Petri. Mudar o meio condrogênica duas vezes por semana durante 21 dias. </li><li> Em condições dinâmicas, preparar o biorreator. <ol><li> Cortar tubagem de silicone com o comprimento adequado de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Autoclave todos os materiais: da câmara de 500 mL de cultura, de tubos, de rotadores de 2 vias, e gaiolas. </li><li> Colocar as peças de biorreactor em um MicroBio estérilestação de segurança lógica. Ligar a tubagem para as duas vias rotadores e para a câmara de cultura de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> transferir cuidadosamente os andaimes celularizados em gaiolas esterilizados utilizando uma espátula esterilizada. Coloque 2 andaimes por gaiola. Quando as gaiolas estão prontos, inseri-los nas agulhas da tampa para mantê-los de se mover durante a rotação adicional. Encher a câmara de cultura com meio condrogénica e fechá-lo com a tampa contendo as gaiolas. </li></ol></li><li> Ligar a bomba peristáltica para encher o tubo com o meio condrogénica e para eliminar as bolhas de ar. </li><li> Coloque e prenda a câmara cheia no motor do biorreator e ligar o computador, que controla as rotações tanto do braço e da câmara. </li><li> Aplicar uma velocidade de rotação de 5 rotações por minuto (rpm) em ambos o braço e a câmara. Ajustar a bomba peristáltica a um caudal de 10 rpm para uma alimentação contínua dos andaimes celularizados. </li></ol> NOTA: Antes da extracção de RNA, digerir os andaimes com uma solução enzimática. <ol><li> Prepare 1 ml de solução enzimática pela adição de 100 uL de pululanase (40 U / mL) e 50 uL de dextranase (60 mg / mL) a 850 mL de meio DMEM isento de soro. </li><li> Lavar os andaimes duas vezes com meio DMEM isento de soro, descartar o meio e adicionar 800 uL da solução enzimática por andaime. Incubar durante 15-30 min a 37 ° C sob agitação suave. </li><li> Quando o andaime esteja completamente dissolvido, transferir a solução contendo as células para um tubo de 1,5 mL, centrifugar a 300 x g durante 10 min, aspirar cuidadosamente o meio, lavar duas vezes com estéril 1 × solução salina tamponada com fosfato (PBS), centrifugar a 300 × g durante 10 min, e re-suspender as células na solução de isolamento de ARN. </li><li> Para extrair o ARN a partir de agregados, colocar os esferóides na solução de isolamento de ARN ecompletamente esmagar-los utilizando um homogeneizador antes de realizar a extraco de ARN. </li><li> Isola-se o ARN utilizando um kit de extracção de ARN total de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Sintetizar ADN complementar a partir de 400 ng de ARN total utilizando a transcriptase inversa de acordo com as instruções do fabricante, utilizando 250 ng de iniciadores aleatórios, 1 uL de mistura de dNTP (10 mM cada), e 40 U / ml de RNase inibidor; o volume final da reacção é de 20 pL. No final da reacção, adicionar 80 mL de água destilada para obter um volume final de 100 uL. </li><li> Para quantitativa da reacção em cadeia da polimerase (PCR), utilizar uma mistura de PCR contendo um reagente fluorescente para quantificar a expressão relativa de genes de interesse, tais como agrecano (AGC) e colagénio II (Col II), com 10 × de cDNA diluído. Normalizar os níveis de expressão do gene com a proteína ribossómica do gene de referência, Grande, P0 (RPLP0). Executar os cálculos com o 2 - fórmula ΔΔCT, Onde ΔΔCT =? Ct de condição diferenciada - significa? Ct de condição de controlo, e cada um de? Ct representa a CT do gene de interesse - a CT do gene de referência (RPLP0). </li><li> Determinar medidas estatísticas como os valores médios ± o erro padrão da média (SEM). Realizar a análise com n ≥ 2 experimentos independentes. Utilização do teste t de Student para analisar as diferenças estatísticas entre os peletes centrifugadas e fuss magnéticos (* p &lt;0,05). Determinar o significado com um teste de Kruskal-Wallis (ANOVA de uma via não paramétrico) para analisar as diferenças estatísticas entre os suportes diferenciados e com o andaime de controlo (* p &lt;0,05). </li></ol> 6. Análise histológica <ol><li> Lavar os andaimes celularizados ou agregados com estéril 1 x PBS, corrigi-los em solução de formalina a 10% durante 1 h à temperatura ambiente, e lavar com 1 x PBS. </li><li> Remover o PBS, incorporar as amostras em cuttin óptimag composto de temperatura (OCT), e congelá-los num banho de isopentano imerso em azoto líquido. Armazenar a amostra a -20 ° C. Corte as amostras com um criostato para obter criocortes 8-M para os agregados ou de 12 mm para os andaimes celularizados. </li><li> Manchar os criocortes com solução de azul de toluidina a 0,5% durante 2 minutos, enxaguar com água da torneira, desidratar com 100% de etanol, clarificar usando tolueno, e montar as lâminas com um meio de montagem para a microscopia de luz. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+compressive+strain+influences+chondrogenic+gene+expression+in+human+mesenchymal+stem+cells.">Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells.</a> Biorheology. 43, 455-470 (2006).</li><li>Vunjak-Novakovic, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+cultivation+conditions+modulate+the+composition+and+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage.">Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage.</a> J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Primeiro, porque as técnicas aqui apresentadas dependem da internalização de nanopartículas magnéticas, uma questão importante é o resultado das nanopartículas, uma vez que localizar dentro das células. É verdade que as nanopartículas de ferro pode provocar potencial toxicidade ou a capacidade de diferenciação prejudicada dependendo do seu tamanho, de revestimento, e tempo de exposição de 19, 22. No entanto, vários estudos têm demonstrado nenhum impacto sobre a fisiologia celular quando nanopartículas de ferro encapsulados foram usadas 23 sob a forma de magnetoferritin, uma nanopartícula magnética biológico 24, ou foram usadas com um revestimento de citrato simples e concentrações adequadas 18. Além disso, quando as nanopartículas de óxido de ferro foram usadas em condições semelhantes às descritas no presente documento (com MSC e para condrogénese), demonstramos recentemente que uma degradação rápida e quase total da nanopartiCiclos ocorre dentro dos endossomas em cerca de 10 dias após a incorporação celular e a formação de esferóides MSC. Curiosamente, esta degradação massiva foi associada com o armazenamento eficiente do ferro livre no interior da proteína ferritina e resultou em um impacto muito limitado sobre o metabolismo do ferro celular, bem boding para futuras aplicações clínicas 25. Outro ponto crítico é a exigência de compactação celular para iniciar chondrogenesis. Normalmente, a condensação de células é conseguida por meio de centrifugação; no entanto, este método é limitado por um baixo número de células (não mais do que 2,5 x 10 5 culas). Passado este número, os nutrientes e gás não pode difundir para o centro dos agregados, provocando necrose celular. Aqui, a condensação magnética de células estaminais marcadas em agregados aparece como um método significativo para formar 3D constrói para a regeneração do tecido da cartilagem. Tal procedimento magnética tem sido utilizada por outros autores paraconstruir esferóides 3D: por levitação magnética com um íman colocado no topo da placa após a dissociação de células de 23 ou com dentes de ferro para localizar o campo magnético 26. No entanto, levitação magnética não parece ser adequado para as fases posteriores de fusão agregado. Por contraste, com o método proposto aqui magnético, que pode controlar todas as etapas de fus para se obter uma construção de tecido de cartilagem passo-a-passo. Em resumo, este processo de vários passos começa com confinamento de células estaminais em blocos de construção de agregação e é seguida pela fusão destes blocos para uma estrutura maior. Os passos críticos do presente procedimento de agregação de células-tronco isento de andaime são as seguintes: em primeiro lugar, deve-se formar cada agregado com um volume tão pequeno de células quanto possível e em segundo lugar, deve-se controlar as etapas de fusão, para evitar a formação de uma única, grande agregar. O tecido obtido aqui era rico em colagénio II e agrecan. Ele também apresentou o advantages de ter geometria e tamanho flexível e de estar livre de andaime. A abordagem magnético também foi utilizado para orientar células estaminais dentro de andaimes de espessura e grandes; Outra alternativa para o projeto de várias formas e tamanhos. O passo crítico aqui é para semear os andaimes com um volume adequado de células: nem muito pouco para ter uma distribuição homogênea total de células, nem muito para evitar qualquer perda de células. Forças magnéticas foram previamente utilizados para atrair e reter células dentro de andaimes e para melhorar semeadura de células 27, 28. Aqui, a condensação de células suficientes dentro dos poros dos andaimes polissacarídeos levou a chondrogenesis bem sucedido. A produção de matriz extracelular foi marcadamente melhorado quando os suportes magneticamente celularizados foram submetidas aos estímulos de stress / cisalhamento de transdução fornecidas pelo bioreactor, graças à sua rotação bi-axial. Tem sido demonstrado em outros estudos que Mulcondições de carga ti-axial melhorado a qualidade de tecidos formados a partir de condrócitos 29. Este conceito biorreator romance apresenta um ganho real quando comparado com as técnicas existentes, onde apenas as forças de compressão são aplicadas 30, 31, 32. Em conclusão, para a diferenciação condrogénica, o uso de confinamento magnético de células estaminais marcados para formar e manipular agregados, bem como para semear andaimes permitidos para a criação de construes celulares milímetros de tamanho de cartilagem. Além disso, combinando semeadura de células magnético com diferenciação dinâmica fornece uma nova ferramenta valiosa para aplicações de medicina regenerativa.

nanopartículas magnéticas já são utilizados na clínica como agentes de contraste para ressonância magnética (MRI), e suas aplicações terapêuticas continuar expandindo. Por exemplo, recentemente, tem sido mostrado que as células marcadas podem ser manipuladas in vivo, utilizando um campo magnético externo e podem ser dirigidas e / ou mantido a um sítio definido de implante 1, 2, 3. Na medicina regenerativa, eles podem ser utilizados para manipular tecidos organizados in vitro 4, incluindo tecido vascular 5, 6, 7, 8, osso, cartilagem e 9. A cartilagem articular é imersa num ambiente avascular, fazer reparações dos componentes da matriz extracelular muito limitada quando ocorrerem danos. Por esta razão, research está atualmente focada na engenharia de substituições de cartilagem hialina que podem ser implantados no local do defeito. A fim de produzir um substituto autólogo, alguns grupos de pesquisa estão explorando o uso de condrócitos autólogos como fonte de células 10, 11, enquanto outros enfatizam a capacidade das células-tronco mesenquimais (MSC) para se diferenciar em condrócitos 12, 13. Em estudos anteriores retomados aqui, foram selecionados MSC, como sua amostragem de medula óssea é bastante simples e não requer o sacrifício de condrócitos saudáveis, que correm o risco de perder o seu fenótipo 14. Um passo inicial essencial para iniciar a diferenciao condrogica de células estaminais é a sua condensação. Agregados celulares são normalmente formados usando centrifugação ou cultura de micromassa 15; no entanto, estes métodos de condensação neither apresentam o potencial de criar agrupamentos de células dentro de andaimes espessas nem o potencial para controlar a fusão de agregados. Neste artigo, descrevemos uma abordagem inovadora para condensar as células-tronco usando rotulagem magnético MSC e atração magnética. Esta técnica tem sido provada para formar construções de 3D livre de andaime através da fusão de agregados um com o outro para se obter um tecido cartilaginoso-escala milimétrica 9. semeadura magnético de andaimes de espessura e grandes também permitiu a possibilidade de aumentar o tamanho da engenharia de tecidos, desenhando uma forma mais facilmente útil para a implantação, e diversificar o potencial para aplicações clínicas de reparação da cartilagem. Aqui, nós detalhe do protocolo para a semeadura magnético de MSC em matrizes porosas compostas de polissacáridos naturais, pululano e dextrano, andaimes anteriormente utilizado para confinar células estaminais 16, 17. diferenciao condrogica foi finally realizada num biorreactor para garantir contínua de nutrientes e de difusão de gás para o núcleo da matriz dos andaimes semeados com uma alta densidade de células. Além de fornecer nutrientes, factores de crescimento condrogénicas, e gás às células, o biorreactor oferecido estimulação mecânica. Em geral, a tecnologia magnético utilizado para confinar células estaminais, combinada com a maturação dinâmico num biorreactor, podem melhorar acentuadamente a diferenciação condrogénica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Iron&#160; oxide (maghemite) nanoparticules ( &#947;-Fe2O3)</td>
			<td>PHENIX - University Paris 6</td>
			<td>Made and given by C. M&#233;nager</td>
			<td>Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds</td>
			<td>LIOAD - University Nantes</td>
			<td>Made and given by C. Le Visage</td>
			<td>Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10M NaOH). Porosity: 185-205&#181;m; Thickness: 7mm; Surface area: 1.8cm2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TisXell Regeneration System</td>
			<td>QuinXell Technologies</td>
			<td>QX900-002</td>
			<td>Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage for scaffolds: Histosette II M492&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal Stem Cell (MSC)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td>Three independant batches have been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM BulletKit medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td>For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Glutamax I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>No sodium pyruvate, no HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640, no Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31870-025</td>
			<td>No sodium pyruvate, no HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000&#181;g/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate solution 100mM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td>Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5607</td>
			<td>Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td>Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-beta 3 protein 10&#181;g</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>30R-AT028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>33615.268</td>
			<td>Prepare the 1M stock solution diluted in distilled water and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextranase from Chaetomium erraticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA Extraction Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primer - Hexamer&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td>500 &#181;g/mL: Use diluted 1/2 and put 1 &#181;L per sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNAsin ribonuclease inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>40 U/&#181;L: put 1 &#181;L per sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR nucleotide dNTP mix (10mM each)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10842321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SyBr Green PCR Master Mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4368708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step One Plus Real-Time PCR System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4381792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution 10% neutral buffered</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.15930.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.08323.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Pertex</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLP0 Primer for qPCR</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-TGCATCAGTAC 
			CCCATTCTATCAT-3&#39; ; 
			5&#39;-AAGGTGTAATC 
			CGTCTCCACAGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrecan Primer for qPCR</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3&#39; ; 3&#39;-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen II Primer for qPCR</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3&#39; ; 3&#39;-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5&#39;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d magnetic stem cell aggregation and bioreactor maturation for cartilage regeneration

Engenharia cartilagem permanece um desafio devido às dificuldades de criação de um implante funcional in vitro semelhante ao tecido nativo. Uma abordagem recentemente explorada para o desenvolvimento de substitutos autólogos envolve a diferenciação de células estaminais em condrócitos. Para iniciar este condrogénese, um grau de compactação das células estaminais é necessário; Assim, foi demonstrada a viabilidade de células magneticamente de condensação, tanto dentro de andaimes espessas e livres de andaime, utilizando as fontes de campo magnico em miniatura como atractores de células. Esta abordagem também magnética foi usada para guiar fusão agregado e para construir livre de andaime, organizada, tridimensional (3D) tecidos vários milímetros de tamanho. Além de ter um tamanho aumentado, o tecido formado pela fusão magnética-driven apresentou um aumento significativo na expressão de colagénio II, e observou-se uma tendência similar para a express de agrecano. Como a cartilagem nativa foi submetido a forças tchapéu influenciado sua estrutura 3D, a maturação dinâmica também foi realizada. Um bio-reactor que fornece estímulos mecânicos foi utilizado para a cultura dos andaimes magneticamente semeadas ao longo de um período de 21 dias. Biorreactor maturação largamente melhorada condrogénese nos andaimes celularizados; a matriz extracelular obtida sob estas condições era rico em colagénio II e agrecan. Este trabalho descreve o potencial inovador de condensação magnética de células estaminais marcados e maturação dinâmico num biorreactor para uma melhor diferenciação condrogénica, ambas isentas de andaime e dentro de suportes de polissacáridos.

Em primeiro lugar, os agregados podem ser formados individualmente usando micro-imans através do depósito de 2,5 x 10 5 culas estaminais marcados (Figura 2A). Estes agregados individuais (~ 0,8 mm de tamanho) pode, então, ser fundidos em estruturas maiores, graças à fusão sequencial, induzida magneticamente. Por exemplo, no dia oito de maturação condrogénica, os agregados foram colocados em contacto aos pares para formar dupletos; quádruplos foram montados no dia 11 através da fusão de 2 dupletos; e, finalmente, em 15 dias, os 4 quádruplos foram fundidas para formar uma construção de 3D contendo 16 dos agregados formados inicialmente, com um total de 4 x 10 6 culas (~ 4 mm de tamanho) (Figura 2B). Em segundo lugar, a mesma técnica de atracção magnética tem sido utilizada para formar agregados de células dentro de andaimes. Andaimes foram semeadas sobre o dispositivo magnético e mostrou células densamente condensado no interior dos poros do andaime, em locais exactos micro-íman (Figura 2C). Em contraste, quando as células foram semeadas dentro de uma estrutura de suporte, sem atracção magnética (sementeira passiva), eles foram encontrados para ser distribuído uniformemente. Andaimes celularizados foram então inseridos em gaiolas (Figura 3A) ligados à câmara de biorreactor para realizar o processo sob condições de maturação condrogénica dinâmicas (Figura 3B). Tal biorreactor melhora as trocas de nutrientes e de gás e fornece estimulação mecânica através de transdução. A velocidade de rotação de ambos o braço e a câmara foi ajustado para 5 rpm, tal como recomendado pelo construtor para a regeneração do tecido macio 3D. Uma bomba peristáltica que fornece um suprimento contínuo de meio foi fixada em 10 rpm. Para todas as condições de organização celular (agregados fundidos e sementeira dentro de andaimes) e maturação do tecido (dentro ou fora de um bio-reactor), a expressão do gene foi analisada no dia 25. O tecido formado por fusão magnética mostraram uma signiaumento ficant na expressão de colagénio II em comparação com o sedimento obtido por centrifugação (Figura 4A), em conjunto com um aumento da tendência de expressão agrecano. Para andaimes celularizados, obteve-se um aumento em agrecano e colagénio II-II, quando foi utilizado semeadura magnético expressão significativa de colagénio, em comparação com os andaimes semeados sem forças magnéticas. Além disso, a expressão de ambos os genes foi muito maior (importante para Col II) quando semeadura magnética foi combinado com diferenciação dinâmico (Figura 4B). As análises histológicas também foram realizadas, por exemplo, utilizando uma mancha azul de toluidina para revelar os glicosaminoglicanos (GAG). A fusão magnético sequencial de 16 agregados exibiu abundantes deposição de GAG, como evidenciado pela cor azul-púrpura (Figura 5A). Para os andaimes, apenas aqueles magneticamente semeadas foram coradas com azul de toluidina. conten GAGt foi maior quando os andaimes foram diferenciadas num bioreactor (Figura 5B) em vez de estaticamente (Figura 5C). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram o potencial de agregação magnética e semeadura magnético dentro andaimes para melhorar chondrogenesis. Ele também indica que as condições de maturação dinâmicas dentro do biorreactor são muito mais favoráveis ​​para a diferenciação eficiente. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55221/55221fig1.jpg" /> Figura 1. Construo dos dispositivos magnéticos. (A) Exemplo de um dispositivo magnético para a formação de agregados: a placa de alumínio foi perfurado (0,8 buracos? M de diâmetro) e dicas foram inseridos em cada orifício e, em seguida, colocado sobre um íman de neodímio permanente, o que assegurou a magnetização de saturação. (B) dispositivo magnético para semear o andaime: poliestireno disco (24 mm2) com 9 buracos feitos manualmente eracolocado em um ímã de neodímio permanente, o que garantiu a magnetização de saturação. Pequenos ímans (3 mm de diâmetro) foram, em seguida, inserida em cada furo para formar o dispositivo. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55221/55221fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55221/55221fig2.jpg" /> Figura 2. marcação magnética de células-tronco e a sementeira. (A) As células-tronco foram marcadas com nanopartículas de óxido de ferro durante 30 min a 37 ° C. (B) Os esferóides foram formados a partir de células marcadas atraídos por uma rede de 16 micro-imans. Os agregados foram fundidos em quádruplos no dia 11 por meio da fusão dos dupletos formadas 3 dias antes. Os quádruplos foram então fundidos no dia 15 para a construção da engenharia de tecidos final. (C) Um andaime, colocada em um prato de vidro de fundo, foi semeada com ou comforças magnéticas para fora. No dia 4, os pontos de células estaminais compactadas foram observados no andaime magneticamente semeado, enquanto as células apareceu uniformemente distribuído no andaime semeadas sem um íman. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55221/55221fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55221/55221fig3.jpg" /> Figura 3. maturação dinâmico de andaimes celularizados. (A) após a sementeira magnético ou passiva, andaimes celularizados foram colocados em gaiolas de evitar a ruptura. (B) as gaiolas fixas, utilizando as agulhas da tampa, foram colocados dentro do vaso do bioreactor preenchido com meio condrogénica. O bioreactor aplicada rotação biaxial com uma velocidade controlada de forma independente (1-12 rpm e 1-35 rpm para o braço e a câmara, respectivamente). Uma bomba peristáltica fornecida continuamente medium. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55221/55221fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55221/55221fig4.jpg" /> Figura 4. Expressão de genes específicos condrogênicos no dia 25. (A) A fusão induzida magneticamente de esferóides MSC demonstraram um aumento significativo em colagénio II em comparação com o sedimento formado por centrifugação. * Indica uma diferença estatística utilizando o teste t de Student (p &lt;0,05). (B) A expressão de agrecano e colagénio II foram claramente aumentada em andaimes diferenciadas com uma combinação de semeadura magnético e maturação dinâmico num biorreactor. a expressão do gene foi normalizado para ARNm RPLP0 e expressa em unidades arbitrárias em relação ao controlo (~ 1 ± SEM). Os resultados são apresentados como médias ± SEM de duas a quatro experiências independentes. * denoTES uma diferença estatística usando o teste de Kruskal-Wallis (unidirecional teste não paramétrico ANOVA) (valor de p &lt;0,05). (-): semeadura sem ímã; (+): Semear com forças magnéticas. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55221/55221fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55221/55221fig5.jpg" /> Figura 5. histológica coloração de glicosaminoglicanos no dia 25. Os glicosaminoglicanos (GAG) depósitos são evidenciados por coloração azul-púrpura. (A) Uma mancha azul de toluidina positiva foi observada nos criocortes 8 mícrons da estrutura cartilaginosa final obtido a partir da fusão sequencial de 16 agregados. Os criocortes de 12 ^ m de andaimes semeados após magneticamente estático (B) ou as condições dinâmicas (C) mostrou claramenteque o conteúdo GAG foi maior nos andaimes diferenciados em um biorreator. As setas indicam agregados de células diferenciadas. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55221/55221fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Condrogênese a partir de células-tronco requer ajuste fino as condições de cultura. Aqui, apresentamos uma abordagem magnética para células de condensação, um passo essencial para iniciar chondrogenesis. Além disso, mostramos que a maturação dinâmico num biorreactor aplica estimulação mecânica para as construes celulares e aumenta a produção de matriz extracelular cartilaginosa.

3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

3d-magnetic-stem-cell-aggregation-bioreactor-maturation-for-cartilage

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.7K visualizações.  UMR 7057 CNRS and University Paris Diderot.  Condrogênese a partir de células-tronco requer ajuste fino as condições de cultura. Aqui, apresentamos uma abordagem magnética para células de condensação, um passo essencial para iniciar chondrogenesis. Além disso, mostramos que a maturação dinâmico num biorreactor aplica estimulação mecânica para as construes celulares e aumenta a produção de matriz extracelular cartilaginosa. 

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Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Bioengenharia

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Preparação de fibrina Andaimes 3D para aplicações de cultura de células-tronco

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Usando Adhesive Padronização Construir 3D de papel microfluídicos

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting da cartilagem e Analogs de tecido de pele utilizando um romance passiva unidade técnica de mistura para Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Padronização da geometria de colônias de células-tronco embrionárias humanas em substratos compatíveis para controlar a mecânica de nível de tecido

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...