We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.

Todos os protocolos experimentais com animais foram aprovados pelo comitê de cuidados com os animais e uso institucional do Instituto de Ciências da Nutrição, Instituto Xangai de Ciências Biológicas, da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). 1. DIO Modelo rato <ol><li> alimentação HFHS <ol><li> Alimente a oito semanas de idade, do sexo masculino camundongos C57BL / 6 com um HFHS que contém 40 kcal% de gordura e 40 kcal% de sacarose. Abrigá-los em 12 h condições do ciclo escuro de luz. </li><li> Mantenha os ratos em estado dieta de alimentação HFHS de quatro a 16 semanas. Verifique semanalmente o peso corporal. </li></ol></li><li> Análise de composição corporal e análise de imagem pseudo-color <ol><li> Sujeitar os ratos para uma análise de composição corporal analisador. <ol><li> Fixar ratos conscientes, não anestesiados num tubo de plástico no. Medir a massa de gordura corporal, massa magra, e fluidos usando um sistema de RMN, conforme descrito anteriormente 2. </li></ol></li><li> Digitalizar todo o corpo de cada rato utilizando um sistema de ressonância magnética. <ol><li> Anestesiar os ratos com 1% Avertin através de injecção intraperitoneal (25 mL / g) e realizar a análise de imagens em tubos de vidro especializados. NOTA: O processo de imagiologia tem a duração de cerca de 0,5 h para cada rato. Quando a medição está concluída, retornar os ratos às suas gaiolas. </li></ol></li><li> Verificar todo o corpo dos ratos no dorsal, médio e camadas ventral; digitalizar o fígado na direcção vertical. Use um ímã 0,55 T e os seguintes parâmetros instrumentais: Espaço K = 192 x 256 mm, espessura de corte = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, e o número de scans = 8. Digitalizar usando a mesma condição magnética para todos os grupos de camundongos. </li><li> Mapear a imagem em tons de cinza em uma imagem pseudo-cor de acordo com a intensidade do sinal 9. </li></ol></li><li> rato eutanásia <ol><li> esterilizar dissectiferramentas Ng, tais como pinça e tesouras. </li><li> Despeje isoflurano suficiente sobre uma toalha de papel e deixar que o isoflurano volatilizar em um frasco de vidro. Assegure-se que os ratos são sacrificados pelo isoflurano. </li><li> Corrigir os ratos numa mesa de operação. Spray de cada abdômen com 75% de etanol, fazer uma incisão na derme do apêndice xifóide usando uma tesoura, e desgaste da derme longitudinalmente através da linha média com as mãos para expor o peritônio. </li><li> Prender o processo xifóide com uma pinça e cortar o peritoneu da largura através do fundo das nervuras para expor as vísceras. </li><li> Recolha de sangue em tubos revestidos com EDTA por punção cardíaca. </li><li> Cortar o diafragma ao longo do fígado e remova cuidadosamente o fígado dos enterocoelia usando uma tesoura fina. Corte três pedaços de tecido de fígado para as seguintes medições de lipidos: a) 6 x 3 x 3 mm para a coloração de H &amp; E, b) 6 x 3 x 3 mm de Oil Red O coloração, e c) 20-40 mg de fígado de clorofórmio / extracção de metanol. </li></ol></li><li> Coloração H &amp; E <ol><li> Corrigir o fígado em 4% de acetato de formalina tamponada com fosfato a 4 ° C durante a noite e, em seguida, incorporá-lo em cera de parafina. </li><li> Cortar secções de parafina (5 uM) e montá-los em lâminas de vidro para coloração com H @ E, conforme anteriormente descrito 3, 10. </li></ol></li><li> Oil Red O coloração <ol><li> preparação Regent <ol><li> Preparar solução de trabalho Oil Red O com formalina a 10%, isopropanol a 60%, de hematoxilina, e gelatina de glicerol. Dissolve-se 0,5 g de Oil Red O pó com 100 ml de isopropanol e aquecê-lo em um banho de 60 ° C para produzir uma solução stock a 0,5%. </li><li> Dilui-se com água bidestilada (ddH2O), a uma proporção de 3: 2 (3 mL de uma solução de estoque e 2 ml de ddH2O). Filtra-se a solução de trabalho e deixar em repouso durante pelo menos 10 min à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Incorporar o fígado na temperatura ideal de corte composto (OCT) em apcaixa de encaixe lastic. Congelá-lo a -20 ° C durante 30 min. Corte-o em seções 8 mícrons em micrótomo de congelação, montar o tecido em um slide, e colocá-lo à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Coloque uma toalha de papel no fundo de uma banheira de coloração e derramar uma pequena quantidade de formalina a 10% para molhar a toalha de papel. Coloque o slide na banheira de coloração e corrigir os cortes congelados em vapores de formaldeído por 5 min a 4 ° C. </li><li> Mergulhe a lâmina em 60% isopropanol na banheira de coloração por 3 s; repetir uma vez. </li><li> Adicionar algumas gotas de solução de trabalho de Oil Red O para o deslizamento para cobrir todos os tecidos e incubar durante 15 min. Proteger o tecido da luz à temperatura ambiente. </li><li> Lave o slide na nova isopropanol 60% na banheira de coloração por 3 s; repetir duas vezes. </li><li> Lave o slide através de água destilada duas vezes e remover a água em torno do tecido. Não se esqueça de secar o tecido. </li><li> Coloque o slide em hematoxilina durante 1 min e lavar cuidadosamente com água da torneira durante 5-10min. Lave o slide em água destilada duas vezes e manter o que em água destilada até que esteja pronto para colocar sobre a lamela. </li><li> Aquece-se a gelatina glicerol no micro-ondas e colocar várias gotas na parte superior do tecido. Delicadamente, coloque a lamela em cima e tomar cuidado para não formar bolhas. </li><li> Observe a mancha sob um microscópio e capturar imagens característicos usando 20X e 40X objectivos. </li></ol></li><li> Medição de lipidos do fígado <ol><li> Colocar o tecido de fígado dissecado em um novo tubo de centrífuga de plástico de 2 ml. Homogeneizar em 1 ml de PBS com um homogeneizador e transferir o lisado para um novo tubo de vidro de 15 ml. </li><li> Adicionar 5 mL de clorofórmio / metanol (2:, 1 v / v) de solução, de vórtice a mistura vigorosamente durante 1 min, e deixar em repouso durante 2 horas em gelo. </li><li> Centrifugar a 1.650 xg durante 10 min a 4 ° C; a mistura deve separar em 3 camadas: a camada superior de metanol, o disco proteína meio, eo clorofórmio fundo e lipídios. </li><li> Tran<html> sfer a fase inferior para um tubo de vidro de novo usando uma pipeta de Pasteur de vidro; não há necessidade de obter cada gota da fração inferior. Definir o tubo de lado no gelo. </li><li> Adicionar 600 mL de 4 mM de MgCl2 e 1,5 ml de clorofórmio para a fracção do sobrenadante a esquerda no tubo anterior e vortex vigorosamente. Incubar em gelo durante 30 minutos e centrifugar a 1650 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Combine a fase de fundo com o tubo primeira fase inferior usando Pasteur pipeta. Descartar as camadas média e alta. </li><li> Evapora-se o clorofórmio sob atmosfera de azoto num banho de 37 ° C. Lavar os lados dos tubos de vidro cuidadosamente com 200 uL de 1% de Triton X-100 / clorofórmio (v / v). Evaporar sob atmosfera de azoto. Dissolve-se o lípido com 200 uL de ddH2O e vórtice bem para tornar a emulsão final. </li><li> Medir a triglicéridos totais (TG) e colesterol (TC) níveis usando um kit de triglicéridos ou de colesterol de acordo com o protocolo do fabricantexref &quot;&gt; 3. NOTA: Os valores são normalizados de lípidos aos das concentrações de proteína no homogenato inicial, tal como determinado por quantificação de proteínas 3. </li></ol></li></ol> 2. principal do mouse Hepatócito Modelo <ol><li> O isolamento de hepatócitos primários de rato <ol><li> Anestesiar cada rato com 6% de hidrato de cloral (10 mL / g por via intraperitoneal). </li><li> Isolar hepatócitos primários, como previamente descrito 10. Cresça as células em lamelas de vidro revestidas com colagénio de uma placa de 6 poços para Oil Red O coloração. Para extracção de lípidos, semear as células numa placa de cultura celular de 10 cm 10. </li></ol></li><li> Tratamento com células e Oil Red O coloração <ol><li> Substituir o meio com 2 ml de meio de privação e incubar a 37 ° C durante 24 h. Trate-o com glucose 30 mM e 100 nM de insulina. Incubar em que uma temperatura de 37 ° C incubadora de cultura durante 24 h. </li><li> Aspirar o meio. Adicionar 2 mL de PBS e agite cuidadosamente para lavar o material; repetir uma vez. </li><li> Fixar a lamela para o slide com um elástico. Expor as células aderentes à superfície do lado de fora. Realizar a coloração de Vermelho de Óleo O, conforme descrito acima (passo 1.5). NOTA: Os níveis basais de acumulação de lípidos são estimuladas com um elevado teor de glucose, mais tratamento com insulina após privação de soro. As gotas de lípidos são visualizadas por coloração com Oil Red O. </li></ol></li><li> Medição de lípidos <ol><li> Tratar os hepatócitos com alto teor de glucose e insulina no mesmo estado (passo 2.2.1). Adicionar 1 mL de PBS a cada placa de cultura celular de 10 cm. Raspar as células e colhem-los para novos tubos de vidro de 15 ml, a partir do qual se alíquotas de 100 ul são transferidos para tubos frescos de 1,5 ml para a quantificação de proteína. </li><li> Adicionar 4 ml de clorofórmio / metanol (2: 1, v / v) para os restantes 900 ul de células. Sonicate por aproximados 20 sinais sonoros e, em seguida, vortex vigorosamente para liberaro lípido nas células. Incubar a mistura em gelo durante 2 h. Realizar a extração de lipídios (passo 1.6). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Angulo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+progress+-+Nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease.</a> New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+ATF6+Increases+Fatty+Acid+Oxidation+to+Attenuate+Hepatic+Steatosis+in+Mice+through+Peroxisome+Proliferator-Activated+Receptor+Alpha.">Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha.</a> Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+phosphorylates+and+inhibits+SREBP+activity+to+attenuate+hepatic+steatosis+and+atherosclerosis+in+diet-induced+insulin-resistant+mice.">AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice.</a> Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+SIRT1+attenuates+hepatic+steatosis+and+controls+energy+balance+in+mice+by+inducing+fibroblast+growth+factor+21.">Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21.</a> Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).</li><li>Esau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+regulation+of+lipid+metabolism+revealed+by+in+vivo+antisense+targeting.">miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting.</a> Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).</li><li>Kanda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCP-1+contributes+to+macrophage+infiltration+into+adipose+tissue,+insulin+resistance,+and+hepatic+steatosis+in+obesity.">MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).</li><li>Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fatty+liver+disease:+old+questions+and+new+insights.">Human fatty liver disease: old questions and new insights.</a> Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).</li><li>Hebbard, L., George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Animal models of nonalcoholic fatty liver disease.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+effective+inhibition+of+lung+cancer+growth+and+metastasis+by+systemic+delivery+of+siRNA+via+multimodal+mesoporous+silica-based+nanocarrier.">Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier.</a> Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).</li><li>Gong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+21+improves+hepatic+insulin+sensitivity+by+inhibiting+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+in+mice.">Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice.</a> Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).</li><li>Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+NAFLD+to+diabetes+mellitus,+cardiovascular+disease+or+cirrhosis.">Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Financiamento: Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (No. 81270930, 31471129 e 31671224) e os cem talentos Programa da Academia Chinesa de Ciências (2013OHTP04) para YL

Esteatose hepática é uma série de doenças do fígado progressivas que está associado com o síndrome metabólico, a obesidade, resistência à insulina, ou diabetes mellitus tipo 2 (DM2) 11. A marca da DHGNA é esteatose, a acumulação de lípidos nos hepatócitos. Aqui, um espectro de métodos é apresentada para caracterizar os fenótipos e parâmetros de esteatose hepática utilizando ratinhos DIO e hepatócitos primários de rato. Este procedimento pode ser útil para elucidar os mecanismos moleculares da esteatose hepática e outras doenças metabólicas relacionadas. Combinando in vivo e ensaios in vitro, estes métodos fornecem análises e avaliações de esteatose hepática abrangentes. Actualmente, os modelos animais de EHNA consistem principalmente em modelos genéticos e nutricionais. A dieta HFHS utilizada aqui destina-se a imitar o estilo dieta moderna e é suficiente para induzir a obesidade e esteatose hepática em ratos. No entanto, para estudar os mecanismos moleculares para o desenpamento de desregulação lipídica, o ensaio baseado em células contém vantagens óbvias sobre estudo em animais, incluindo manipulação fácil por mutação genética ou tratamento farmacológico, bem como a custos relativamente baixos e compromissos de tempo. Para gerar esteatose hepática em hepatócitos primários de rato, altas concentrações de glucose e insulina são utilizados para induzir a acumulação de lípidos, que é um processo novo e eficiente modelo in vitro para imitar in vivo hiperglicemia induzida por dieta e hiperinsulinemia. Este tratamento é também aplicável a outras linhas de células hepáticas, tais como as células HepG2. Dado que os hepatócitos geneticamente modificados são acessíveis a uma variedade de tratamentos farmacêuticos, o modelo in vitro descrito aqui esteatótica supera a limitação e passos que consomem tempo para a geração de modelos animais usando abordagens gain- e perda de função. A composição corporal análises, incluindo NMR e MRI, fornecer os dados não-invasivas e em tempo real sobrelipídico em todo o corpo e do fígado. É um não-invasivo, economia de tempo, visualizável, e medição semi-qualitativa. Além disso, a precisão da análise da composição do corpo pode ser significativamente melhorado através da combinação de outras medições histológicas e bioquímicas. É essencial e necessário para determinar esteatose hepática in vivo e in vitro utilizando coloração H &amp; E, Oil Red O coloração, e a medição de lípidos, todos os quais são medidas padrão-ouro para o diagnóstico e classificação de esteatose hepática. Uma das limitações do presente método é a sua incapacidade de medir a inflamação e deposição de colagénio quando simples esteatose progride para a hepatite, fibrose, e, finalmente, cirrose e cancro do fígado. Dado que os ratinhos com obesidade induzida por dieta tem um baixo risco para o desenvolvimento de Nash, o protocolo de corrente é suficiente para avaliar esteatose hepática em ratinhos DIO. No entanto, na condição de Nash, outras medidas bioquímicas, tais como plasma alaniníveis de aspartato aminotransferase (AST) NE-aminotransferase (ALT) e, deve ser utilizada.

A obesidade é um problema de saúde crescente em países desenvolvidos e em desenvolvimento. Tem sido relatada como sendo uma das condições coexistentes frequentemente associadas com doença hepática não-alcoólica (EHNA), com uma prevalência que varia entre 30 e 100 por cento em pacientes NAFLD 1. Devido à forte correlação entre o fígado gordo e obesidade, obesos (DIO) modelos de rato induzida por dieta são amplamente usadas para estudar os mecanismos moleculares complexas associadas com o desenvolvimento de EHNA 2, 3, 4, 5, 6. A esteatose hepática é o primeiro estágio de DHGNA, e pode evoluir para esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose, e, finalmente, câncer de fígado 7. Portanto, o objetivo geral deste método é gerar modelos animais e celulares de condições com esteatose hepática e ao PROvide protocolos detalhados para a medição de lípidos eficiente e preciso. Estes modelos e medições são também úteis para a investigação de outros distúrbios metabólicos, tais como a resistência à insulina e diabetes tipo 2. Como a obesidade é identificado como sendo um dos principais factores de risco para EHNA, um alto teor de gordura, alta-sacarose dieta (HFHS) que imita a dieta de alta gordura de estilo ocidental é utilizado para induzir obesidade em ratos. Subsequentemente, o grau de esteatose hepática pode ser avaliada utilizando métodos diferentes. Primeiro, o peso corporal e análise de composição corporal com ressonância magnética nuclear (RMN) mostra a acumulação de lípidos durante a alimentação. A massa de gordura e massa magra pode ser quantificado de um modo não-invasivo e em tempo real. Além disso, a imagem por ressonância magnética (MRI) é usado para mostrar tanto a todo o organismo e a distribuição de gordura no fígado. O sinal de escala de cinzentos da análise de ressonância magnética pode ser convertido numa imagem de pseudo-cor legível, e a intensidade dea escala de cinza e cor é hemi-quantificáveis. Esta tecnologia proporciona vantagens únicas para a medição da acumulação de lípidos nos animais vivos. Segundo, a análise histológica do fígado é o método mais comummente utilizado para determinar a esteatose hepática. Hematoxilina e Eosina (H &amp; E) Coloração histológica fornece informações, tais como a morfologia dos hepatócitos e infiltração de macrófagos, enquanto Oil Red O coloração mostra o tamanho e a posição das gotículas lipídicas em hepatócitos. Em terceiro lugar, a análise do conteúdo de lípidos utilizando extracção com clorofórmio / metanol é uma medida precisa e quantitativa de lípidos hepática. Os níveis totais de triglicérides e colesterol pode ser medido com métodos bioquímicos. Mais importante, a análise de extracção lipídica e Oil Red O coloração pode também ser usado em geneticamente manipuladas ou tratadas farmaceuticamente hepatócitos. A vantagem do presente método é a sua utilização de várias abordagens optimizadas para gerar modelos de esteatose hepáticae caracterizar exaustivamente os fenótipos tanto in vivo como in vitro. Os modelos de ratos DIO pode recapitular a patologia e metabólicas fenótipos de doença hepática gordurosa humano. Outros parâmetros metabólicos em seres humanos pode ser replicado neste modelo bem 8. A geração do modelo de hepatócitos esteatótica em resposta ao alto teor de glucose e insulina é eficiente, útil, e supera a limitação do trabalho caro e demorado rato. Tomados em conjunto, estes métodos são suficientes e é essencial para o estudo da disfunção lípidos hepática e resistência à insulina durante a sobrecarga de nutrientes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="728">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">O.C.T compound</td>
			<td style="width:183px;">SAKURA</td>
			<td style="width:163px;">4583</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">O0625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Infinity Triglycerides kit</td>
			<td style="width:183px;">Fisher&#160;Scientific</td>
			<td style="width:163px;">TR22421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Infinity Cholesterol kit</td>
			<td style="width:183px;">Fisher&#160;Scientific</td>
			<td style="width:163px;">TR13421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Collagen type I, Rat tail</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:163px;">08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">DMEM (low glucose)</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">11885-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Penicillin / Streptomycin</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:183px;">cellgro</td>
			<td style="width:163px;">R21-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">HBSS</td>
			<td style="width:183px;">cellgro</td>
			<td style="width:163px;">20-021-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:183px;">TOCRIS Bioscience</td>
			<td style="width:163px;">3435</td>
			<td>dissolve in PBS, 1mM for stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:163px;">BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:183px;">Longerpump</td>
			<td style="width:163px;">BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">10cm cell culture dish</td>
			<td style="width:183px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">420167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">6-well-plate</td>
			<td style="width:183px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">BCA assay</td>
			<td style="width:183px;">Beyotime</td>
			<td style="width:163px;">P0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Nuclear Magnetic Resonance</td>
			<td style="width:183px;">Niumag technology</td>
			<td style="width:163px;">MiniQMR23-060H-I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">High fat high surcose diet(HFHS)</td>
			<td style="width:183px;">Research Diets</td>
			<td style="width:163px;">D12327</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized analysis of in vivo and in vitro hepatic steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Como mostrado na Figura 1A, o peso do corpo do rato foi aumentada para 45 ± 1,2 g depois de 16 semanas de alimentação HFHS, que é aproximadamente 1,5 vezes maior do que o grupo de dieta de comida de alimentação. A análise de RMN da composição corporal que mostra a massa de gordura e massa magra de ratos são indicados (Figura 1B). As distribuições de gordura do corpo inteiro e do fígado foram determinados por ressonância magnética e imagens de pseudo-cor representativos em ratos vivo, consciente são mostrados na Figura 1C-D. A composição do peso corporal e do corpo foram medidos e visualizados durante o processo de alimentação dieta HFHS. Para dissecar ainda mais os fenótipos esteatóticos, os ratos foram sacrificados e uma análise histológica do fígado. A coloração de H &amp; E e Oil Red O dos fígados são mostrados na Figura 2A-B, em que gotículas lipídicas crescer e ocupar os espaços em maishepatócitos após 4 meses de HFHS alimentação dieta. O grau de esteatose hepática de ratos dieta alimentado HFHS é facilmente visualizado através da comparação com os ratos alimentados com ração. Os principais componentes do lípido, tais como triglicéridos e colesterol, foram medidos com extracção com clorofórmio / metanol (Figura 2C). Em ratinhos DIO, o excesso de nutrientes sobrecarga causada anormal acumulação de triglicéridos no fígado. Com os dados de RMN, ressonância magnética, e para análise histológica, o grau de deposição de lípidos pode ser determinada com precisão e eficientemente. Como mostrado na Figura 3, os níveis de lípidos em hepatócitos primários foram induzidos pelo alto teor de glucose e insulina durante 24 h. As gotículas de lípidos acumulados foram determinadas por coloração com Oil Red O (Figura 3A), e a análise quantitativa de lípido foi utilizado subsequentemente para medir os níveis de triglicéridos e de colesterol em hepatócitos (Figura 3B). Com base nissomodelo, os efeitos de modificação genética ou tratamento farmacêutico na homeostase de lípidos em hepatócitos podem ser investigadas de uma forma eficiente e rápida. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55178/55178fig1.jpg" /> Figura 1. Alto teor de gordura, dieta rica em sacarose (HFHS) aumenta a obesidade e esteatose hepática em ratos. C57BL machos de oito semanas de idade / 6 murganhos foram alimentados com uma dieta de comida ou HFHS durante 8 semanas e 16 semanas, respectivamente. Peso (A) do corpo dos ratos. A composição (B) do corpo dos ratos. (C - D) Ressonância magnética Representante do mouse e fígado. A área branca na imagem em escala de cinza indica o teor de gordura, enquanto a área vermelha na imagem pseudo-cor indica a gordura. Os dados estão representados como a média ± o erro padrão (SEM), n = 5-8. * P &lt;0,05 em relação os ratos alimentados com ração. As barras de erro representam o SEM. Statisticaanálise l foi realizada utilizando o teste t não pareado um, de Student bilateral. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55178/55178fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55178/55178fig2.jpg" /> Figura 2. Análise de esteatose hepática em ratos alimentados com uma dieta HFHS. C57BL machos de oito semanas de idade / 6 murganhos foram alimentados com uma dieta de comida ou HFHS durante 8 semanas e 16 semanas, respectivamente. (A) Morfologia bruto representativas de enterocoelia e fígado. (B) Representante H &amp; E e Oil Red O coloração (barras de escala: 50 mm). Oil Red O mancha a gordura e gordura neutra e pontos vermelhos indicam gotículas lipídicas acumulados em hepatócitos. (C) Total de triglicérides e colesterol níveis das extrações de lipídios no fígado, utilizando o método clorofórmio / metanol. Os dados foram normalizados para tque o peso do fígado, e são representados como a média ± o erro padrão (SEM), n = 5-8. * P &lt;0,05 contra os ratos alimentados com dieta padrão. As barras de erro representam o SEM. A análise estatística foi realizada utilizando o teste t não pareado um, de Student bilateral. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55178/55178fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55178/55178fig3.jpg" /> Figura 3. esteatose hepática é induzida em hepatócitos primários de rato expostos a elevado teor de glucose e insulina. (A) Oil Red O coloração de hepatócitos primários em cultura tratadas com ou sem glicose e insulina, conforme indicado (barras de escala: 50 mm). (B) o nível de triglicéridos no hepatócitos primários foi medida e normalizada para a concentração de proteína. Os dados estão representados como a média ±o erro padrão (SEM). * P &lt;0,05 versus o grupo de controlo. As barras de erro representam o SEM. A análise estatística foi realizada utilizando o teste t não pareado um, de Student bilateral. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55178/55178fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Análise otimizada de<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; A esteatose hepática

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

15.8K visualizações.  Chinese Academy of Sciences. Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described. 

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Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of the hepatic blood supply is poorly oxygenated portal vein blood derived from the gastrointestinal tract and spleen. Oxygen is delivered to hepatocytes by blood flowing from a terminal branch of the portal vein to a central venule via sinusoids, and this makes an oxygen gradient in hepatic lobules. The oxygen gradient is an important physical parameter that involves the expression of enzymes upstream and downstream in hepatic microcirculation, but the lack of techniques for measuring oxygen consumption in the hepatic microcirculation has delayed the elucidation of mechanisms relating to oxygen metabolism in liver. We therefore used FITC-labeled erythrocytes to visualize the hepatic microcirculation and used laser-assisted phosphorimetry to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels there. Noncontact and continuous optical measurement can quantify blood flow velocities, vessel diameters, and oxygen gradients related to oxygen consumption in the liver. In an acute hepatitis model we made by administering acetaminophen to mice we observed increased oxygen pressure in both portal and central venules but a decreased oxygen gradient in the sinusoids, indicating that hepatocyte necrosis in the pericentral zone could shift the oxygen pressure up and affect enzyme expression in the periportal zone. In conclusion, our optical methods for measuring hepatic hemodynamics and oxygen consumption can reveal mechanisms related to hepatic disease.

An optical system was developed to visualize hepatic microcirculation with FITC-labeled erythrocytes and to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels with laser-assisted phosphorimetry. This method can be used to investigate physiological and pathological mechanisms by analyzing microvascular structure, diameter, blood flow velocity, and oxygen tension.

Visualização e análise do fluxo sangüíneo e consumo de oxigênio na microcirculação hepática: aplicação para um modelo Hepatite Aguda

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Medicina

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Infusões artéria carótida para farmacocinéticas e farmacodinâmicas Análise de taxanos em Ratos

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Monitoring of Systemic and Hepatic Hemodynamic Parameters in Mice

The use of mouse models in experimental research is of enormous importance for the study of hepatic physiology and pathophysiological disturbances. However, due to the small size of the mouse, technical details of the intraoperative monitoring procedure suitable for the mouse were rarely described. Previously we have reported a monitoring procedure to obtain hemodynamic parameters for rats. Now, we adapted the procedure to acquire systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice, a species ten-fold smaller than rats. This film demonstrates the instrumentation of the animals as well as the data acquisition process needed to assess systemic and hepatic hemodynamics in mice. Vital parameters, including body temperature, respiratory&#160;rate&#160;and heart&#160;rate were recorded throughout the whole procedure. Systemic hemodynamic parameters consist of carotid artery pressure (CAP) and central venous pressure (CVP). Hepatic perfusion parameters include portal vein pressure (PVP), portal flow rate as well as the flow rate of the common hepatic artery (table 1). Instrumentation and data acquisition to record the normal values was completed within 1.5 h. Systemic and hepatic hemodynamic parameters remained within normal ranges during this procedure.
This procedure is challenging but feasible. We have already applied this procedure to assess hepatic hemodynamics in normal mice as well as during 70% partial hepatectomy and in liver lobe clamping experiments. Mean PVP after resection (n= 20), was 11.41&#177;2.94 cmH2O which was significantly higher (P&#60;0.05) than before resection (6.87&#177;2.39 cmH2O). The results of liver lobe clamping experiment indicated that this monitoring procedure is sensitive and suitable for detecting small changes in portal pressure and portal flow rate. In conclusion, this procedure is reliable in the hands of an experienced micro-surgeon but should be limited to experiments where mice are absolutely needed.

This film demonstrates how to acquire systemic and hepatic hemodynamics in mice. The whole monitoring includes acquisition of vital parameters, systemic blood pressure, central venous pressure, common hepatic artery flow rate, and portal vein pressure as well as the portal flow rate in mice.

Monitoramento da sistêmicas e hepática Hemodinâmica em Ratos

The use of mouse models in experimental research is of enormous importance for the study of hepatic physiology and pathophysiological disturbances. ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetria Intrauterine medir Rato contrátil Pressão<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depleção de células do rato de xenoenxertos de tumor humano Melhora Significativamente Análise Downstream de células alvo

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang (GSK) granules, a marketed prescription in China, have bone-protective effects in treating POP. Before administration to the body, one standard preparation procedure is commonly required, which aims to promote the release of active constituents from raw herbs and enhance the pharmacological effects as well as therapeutic outcomes. This study proposes a detailed protocol for using GSK granules in in vivo and in vitro experimental assays. The authors first provide a detailed protocol to calculate the animal-appropriate dosages of granules for in vivo investigation: weighing, dissolving, storage, and administration. Second, this article describes protocols for micro-CT scanning and the measurement of bone parameters. Sample preparation, protocols for running the micro-CT machine and quantification of bone parameters were evaluated. Third, serum-containing GSK granules are prepared, and drug-containing serum is extracted for in vitro osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. GSK granules were intragastrically administered twice per day to rats for three consecutive days. Blood was then collected, centrifuged, inactivated, and filtered. Finally, serum was diluted and used for performing osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. The protocol described here can be considered a reference for pharmacological investigations of herbal prescription medicines, such as granules.

Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

This article provides a detailed protocol for preparing a working solution of Gushukang granules for animal studies and GSK granule containing serum for in vitro experiments. This protocol can be applied to pharmacological investigations of herbal medicines as well as prescriptions for both in vivo and in vitro experiments.

Preparação de grânulos de Gushukang (GSK) para experimentos in vivo e in vitro

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

Ensaio de migração de riscos e câmara de dobras cutâneas dorsal para análise in vitro e in vivo da cicatrização de feridas

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...