Agradecemos Oriya Vardi de assistência na geração de números. Trabalho no grupo IS foi apoiado pelo Israel Science Foundation (concessão No. 567/10) e do Conselho Europeu de Investigação Começando Grant (# 281306).

Nota: ToR pode ser avaliada apenas com o crescimento de células, não sincronizadas. O procedimento deve começar com pelo menos 1 - 2 x 10 6 células de crescimento rápido, que geralmente resultam na ~ 1 x 10 5 células em fase S (o passo limitante da velocidade). Recomenda-se para conduzir cada experiência utilizando-se dois ou três repetições. Todo o processo de CNR-ToR pode ser concluída dentro de uma semana - dois dias deve ser dedicado a todas as etapas até a preparação biblioteca, um a dois dias são necessários para sequenciamento e um dia adicional é necessário para a análise de dados inicial. 1. Recolha de Células de Cultura NOTA: O protocolo é escrito para as células que crescem em cultura em placas de 10 cm (contendo cerca de 2 - 5 x 10 6 células), mas pode ser facilmente ajustado para outras plataformas. <ol><li> Para as células que foram cultivadas em suspensão, proceder à fixação (seção 2). </li><li> Para células aderentes, aspirar e lavar o plcomeu com 3 mL PBS, sem Ca 2+ e Mg 2+. </li><li> Descartar o PBS e incubar as células durante 5 min a 37 ° C com 1 ml de tripsina-EDTA comercial até separar células. NOTA: A duração do tratamento com tripsina deve ser ajustado para cada tipo de célula. </li><li> Adicionar 3 mL meios de cultura para neutralizar a tripsina e recolher as células num tubo cónico de 15 mL ou um tubo de poliestireno de 5 ml. Manter em gelo. </li></ol> 2. Fixação NOTA: Para esta parte, todas as etapas devem ser feitas a 4 ° C. <ol><li> Centrifugar as células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar e lavar as células duas vezes com 1 mL de PBS frio. </li><li> Ressuspender as células em 250 mL (total) PBS frio. </li><li> Enquanto o tubo suavemente vortex, adiciona-se lentamente gota a gota 800 uL de -20 ° C, 100% de etanol. Isto leva a uma concentração final de etanol de 70 - 80%. NOTA: alta pureza etanol é recomendado nesta etapa. </li><li> Incubar as células em gelo foR 30 min. Nota: Neste células estágio pode ser mantido por alguns dias a 4 ° C ou durante alguns meses a -20 ° C. </li></ol> 3. PI Coloração <ol><li> Centrifugar as células a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante cuidadosamente e lavar as células duas vezes com 1 mL de PBS frio. </li><li> Aspirar e ressuspender cada amostra com a seguinte mistura: 1 mL de PBS, 5 uL de 10 mg / ml de ARNase, 50 uL de 1 mg / mL de iodeto de propídio (PI; misturar frasco antes de usar). Ajustar a concentração até aproximadamente 2 x 10 6 células / ml). NOTA: Mantenha fora da luz - PI é sensível à luz. </li><li> Filtrar através de 35 mm de malha a um tubo de poliestireno 5 mL, e fechar com Parafilm. </li><li> Incubar à temperatura ambiente no escuro, durante 15 - 30 min. NOTA: As células estão prontas para análise FACS. Se necessário, as células coradas podem ser armazenados durante pelo menos 24 h a 4 ° C no escuro. </li></ol> 4. Organizar <ol><li> Ordenação de células utilizando uma máquina FACS. NosÊ O laser de 561 nm para diferenciar células com base na sua intensidade PI. Outros lasers perto do máximo de excitação de 535 nm, tal como 488 nm ou 532 pode ser utilizado, dependendo da configuração da máquina de FACS. </li><li> Para obter resultados óptimos, utilize o menor bocal recomendado para o tamanho de célula específico (para a maioria das células 85 uM). Priorizar modos de pureza mais rendimento. Use um fluxo lento constante, geralmente até 300-500 eventos / s, com uma pressão do invólucro de 45 psi. </li><li> Usando gating, discriminar as células mortas e detritos subcelular (baixa FCS e alto SSC) traçando FCS vs SSC. A partir das células viáveis discriminar dupletos locando SSC-largura (W) vs SSC-altura (h), seguido por um FSC-W vs lote FSC-H e por PI-W vs PI-H (dupletos terá o mesmo valor H- mas maior W-valor). Para as células individuais viáveis ​​desenhar um histograma da intensidade de PI-área (A), que representa o teor de ADN das células. </li><li> Ordenação de células em fases G1 e S, como mostrado na Figura 1. Gating para S devem ser largas e invadir as fases G1 e G2, G1 enquanto gating deve ser estreita e, na medida do possível S. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55157/55157fig1.jpg" /> Figura determinação fase do ciclo 1. celular baseado na intensidade PI. Histograma que mostra a distribuição do conteúdo em ADN celular (medido por PI-Área) de rato embrionário de fibroblastos (MEF) população. O conteúdo de DNA é usada para classificar a população em duas sub-populações de i) células G1 (conteúdo de DNA 2N) e ii) as células em fase S (2N - conteúdo de DNA 4N), usando as regiões marcadas. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55157/55157fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> NOTA: A finalidade da recolha de células G1 é para explicar desvios na eficiência sequenciamento entre diferentes regiões genômicas. Um aplicativo alternativabarata é a utilização de células paradas G1 a partir do mesmo tipo de célula. Esta abordagem dá resultados mais limpos (uma vez que minimiza a contaminação fase S), mas podem introduzir vieses decorrentes de diferenças genéticas entre as células presas e as células medidos. <ol start="5"><li> Classificar em condições de frio e recolher células ordenadas em 1,5 / 2 tubos mL. Mantenha os tubos no gelo após a ordenação. NOTA: De modo a melhorar a recuperação de ADN, é preferível utilizar tubos de ligação baixa ou o uso de tubos revestidos com 4-5% de BSA durante 1-3 horas a 4 ° C 18. </li></ol> 5. Purificação de DNA <ol><li> Para cada amostra (G1 e S) purificar o ADN utilizando um kit de purificação de ADN. NOTA: Quando utilizando o kit comercial, elui-se com 400 ul de tampão de eluição para um tubo de 2 mL para um rendimento elevado, tal como recomendado pelo fabricante. </li><li> Verificar concentração de DNA usando fluorómetro. NOTA: A partir de 100.000 células de mamíferos coletados pelo FACS, deve-se obter ~ 1 mg de DNA. UMAt esta fase ADN pode ser mantido durante alguns dias a 4 ° C ou a -20 ° C para armazenamento a longo. </li></ol> 6. sonicação <ol><li> Transferência de ADN para um tubo de 1,7 ml, que é compatível com o suporte magnético utilizado. </li><li> Concentra-se o ADN utilizando pérolas 2x SPRI de acordo com as instruções do fabricante, utilizando um suporte magnético, e elui-se em 50 ul de tampão de eluição. </li><li> DNA de cisalhamento com um ultrasonicator focada para um tamanho médio de pico alvo de 250 pb. Utilize as seguintes definições para uma amostra de DNA de 50 mL: 50 W, factor de utilização de 20%, 200 ciclos por explosão, 20 ° C, 120 s. </li><li> Verificar o tamanho do ADN cortado por electroforese. A distribuição de tamanho recomendado é de 200-700 bp com um pico em ~ 250 pb. NOTA: Nesta fase o ADN pode ser mantido durante alguns dias a 4 ° C ou a -20 ° C para armazenamento a longo. </li></ol> 7. Biblioteca Preparação e Sequencing NOTA: Muitos kits de preparação biblioteca e diferemplataformas de sequenciamento ent deve funcionar de forma semelhante aos utilizados por nós e mencionados na seção materiais. Na realidade, no passado, foram gerados mapas TdR usando um método muito semelhante com plataformas de microarray 2. <ol><li> Prepare bibliotecas usando qualquer kit de preparação biblioteca comercial. </li><li> No final de preparação da biblioteca, selecionar o tamanho usando esferas magnéticas para 300-800 pb. </li><li> Depois de preparar bibliotecas, medir a concentração de DNA usando fluorômetro. </li><li> Medir o Tamanho do ADN utilizando electroforese. </li><li> Execute sequenciamento em qualquer plataforma. NOTA: Sequencing pelo menos 10 M leituras por amostra é recomendado. Esta profundidade é equivalente a uma leitura aproximadamente em cada 300 pb (para ~ 3 genomas de tamanho Gb), e é suficiente para medições ToR com uma resolução de 50 - 100 kb. Aumentando a profundidade irá resultar numa diminuição no tamanho das janelas e, assim, vai permitir aumentar a resolução com maior certeza. Emparelhado sequenciamento final não é necessáriaeste protocolo já que a informação única cobertura é coletado. É, no entanto, pode ajudar a resolver o local de leituras que contêm sequências repetitivas. </li></ol> 8. Análise NOTA: A análise dos dados baseia-se no método usado por A. Koren et ai. 19. <ol><li> Os dados do mapa de sequenciamento para o genoma correspondente utilizando bowtie2 ou qualquer curto-alinhador de leitura confiável. Definir variando-size, janelas cromossômicas igual de cobertura como segmentos cobertos por 200 lê na fração G1 e contar fase S lê nas mesmas janelas. </li><li> Calcula-se a relação S / G1 para cada janela. Isto deve gerar um mapa com grandes flutuações da razão S / G1 ao longo do genoma (Figura 3). Um bom controle para a confiabilidade das medidas ToR é comparar este mapa para a relação G1 / G1 (de duas medidas separadas do G1), que deve ser muito mais plana. </li><li> Normalizar os dados para 0 média e 1 SD subtraindo cada value o valor médio de todas as janelas (excluindo o cromossoma X), e dividindo o resultado pelo desvio padrão do S / G1 de todas as janelas. Isto é feito, a fim de converter-se ao escore z e permitir a comparação entre os diferentes experimentos. </li><li> Remover todas as regiões constantes de hiato pelo navegador genoma do UCSC, bem como entre cada fragmento diferença remanescente contendo menos de 15 janelas de dados. </li><li> Suavizar os fragmentos restantes com uma spline suavização cúbico através da função csaps Matlab com um parâmetro de 10 - 16 e interpolar em pontos fixos cada 100 kb. NOTA: Parâmetros de alisamento e a interpolação deve ser ajustada com base na profundidade dos dados. Existem outros métodos de suavização adequados e as funções e pode ser usado. </li><li> Depois de confirmar visualmente a fiabilidade de cada réplica, mesclar todas as leituras e calcular um perfil mais profunda resolução realizando o mesmo processo descrito acima nesta dados. </li></ol>

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	<li>Farkash-Amar, S., Simon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+replication+program+in+mammals.">Genome-wide analysis of the replication program in mammals.</a> Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).</li><li>Yaffe, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+DNA+replication+timing+reveals+conserved+large-scale+chromosomal+architecture.">Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture.</a> PLoS Genet. 6 (7), e1001011 (2010).</li><li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+replication+domains+during+embryonic+stem+cell+differentiation.">Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS Biol. 6 (10), (2008).</li><li>Rivera-Mulia, J. 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No conflicts of interest declared.

CNR-TdR pode ser realizado, em princípio, em qualquer população de células em proliferação eucariótica que pode ser dividida por FACS para fases G1 e S (revisto por Rhind N. e Gilbert 20 DM). O método aqui descrito foi adaptado para células de mamífero com um tamanho de genoma de ~ 3 Gb, tais como humano e de ratinho. Pequenas mudanças no protocolo CNR-ToR (em preparação celular e profundidade sequenciamento) são necessários, a fim de ajustá-lo para outros eucariotas. Deve ser dada atenção à recolha de uma quantidade suficiente de células em fase S, uma vez que é o passo limitante da velocidade. Assim, num FACS preliminares para ciclo celular devem ser realizados para confirmar que a experiência pode ser feita e para validar a quantidade de células em fase S. Para as células que apresentam ciclos celulares irregulares, recomenda-se a prestain as células com BrdU para detectar as células em divisão, e seguir o protocolo do fabricante Anti-BrdU até que o passo de FACS. Normalmente, as células são coradas com BrdU de 10-20 uM durante 30 min. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; é recomendada a realização de cada experiência em triplicado biológicos para detectar inconsistências que podem resultam de diferenças no crescimento celular e no processo de triagem. Isto é especialmente importante para a identificação de pequenas alterações nos mapas ToR entre os tipos de células e condições. Para as células de crescimento rápido, uma única 10 centímetros placa de cultura de tecidos / frasco (contendo cerca de 2-5 x 10 6 células) é recomendado para cada réplica, a fim de obter 1&gt; 5 x 10 células em fase S. Esta quantidade deve ser aumentada quando se trabalha com células de crescimento lento, uma vez que a percentagem de células na fase S é mais baixo e, portanto, tem de se separar mais células a fim de obter uma quantidade suficiente de células em S. Ao classificar as células, é importante para conseguir a melhor separação possível da das células de acordo com o seu conteúdo em ADN e, portanto, uma taxa de fluxo baixo é recomendada. A fim de maximizar a resolução temporal, é importante recolher célulasa partir de toda a fase S. Isto é conseguido por gating S tão larga quanto possível (Figura 1). Por outro lado, G1 gating deve ser estreito (a partir do pico G1 e para a esquerda; Figura 1), a fim de evitar tanto a sub-G1 e contaminações em fase S precoce. A sonicação pode ser efectuada por vários métodos, mas recomenda-se a utilização de um ultrasonicator focado o que permite uma sonicação robusto e fácil, sem a necessidade de calibração de cada experiência. No entanto, quando pela primeira vez, que estabelece o protocolo no laboratório, recomenda-se para calibrar os parâmetros para a obtenção de uma distribuição de tamanho de 200-700 pb. Como explicado na introdução, há dois métodos principais para o mapeamento ToR genome-wide - BrdU-IP e CNR-ToR. Ambos os métodos dão mapas ToR semelhantes (dados não mostrados), apesar das diferenças entre eles. O método CNR-ToR é limitado em sua gama de enriquecimento desde o betwe máximo de diferençaen regiões precoces e tardias é dupla, enquanto que com a BrdU-IP muito maior enriquecimento é conseguido, uma vez que as regiões de replicação precoce vai conter BrdU quase exclusivamente na fracção inicial. Por outro lado, a resolução do método de BrdU-IP é limitado pelo número de fracções de fase S recolhidos. Na sua aplicação mais comum, apenas duas fracções (precoce versus tardia S) são comparados, o que resulta num compromisso da resolução temporal fina. O método CNR-TdR, no entanto, dá um sinal contínuo ao longo de toda a fase S. Além disso, o método de BrdU-IP é baseado na técnica de imuno-precipitação que geralmente dá um fundo muito mais elevada do que o método CNR-TdR. Outra vantagem do método CNR-TdR é que ele pode ser usado para extrair informação retrospectivamente TdR a partir dos dados de sequenciação de culturas não sincronizado como recentemente descrito 21. Finalmente, o método CNR-ToR é preferível devido à sua simplicidade e devido ao fato de que ele pode ser down-escalado, uma vez que não se baseia em imunão-precipitação. O papel do ToR na complexa rede de características genômicas e epigenômicos continua a ser decifrado. A relativa facilidade do método CNR-TdR permite a expansão dos dados ToR existentes para incluir muitas das condições naturais que as células experiência e deve ser completamente exploradas e genoma de largura. Isto inclui várias situações de estresse replicação, endorreduplicação, bem como várias transformações cancerosas. A utilização de dados de SNP e maior profundidade de sequenciamento também permitirão medir o ToR de cada alelo separadamente. Além disso, a redução ainda maior no custo sequenciamento possibilitará o aumento da resolução dos mapas Tor, que pode ajudar ainda mais em permitir a identificação de mudanças sutis entre as condições. Outras aplicações futuras pode ser conseguido melhorando os actuais métodos de aplicação e de medição TdR num pequeno número de células que permitam medir TdR in vivo.

replicação de ADN de mamífero é estritamente regulada para assegurar a replicação precisa de cada cromossoma apenas uma vez durante o ciclo celular. A replicação ocorre de acordo com uma ordem altamente regulado - várias regiões genômicas grandes (~ Mb) replicar no início da fase S (início de replicar domínios), enquanto que outras regiões genômicas replicar mais tarde em (domínios médio e replicar tarde) médio ou fase S tardia 1. A maior parte do genoma replica ao mesmo tempo em todos os tecidos (domínios ToR constitutivos), enquanto que 30% - 50% do genoma, muda a sua TdR entre tecidos 2, durante a diferenciação 3, 4 e, em menor medida, também durante a transformação do cancro 5 . Além disso, certas regiões genómicas replicar de forma assíncrona 6, 7, 8, ou seja, existe uma diferençana especificação técnica entre os dois alelos. ToR correlaciona com muitas características genômicas e epigenômicos incluindo os níveis de transcrição, conteúdo GC, estado de cromatina, a densidade gene, etc. 1, 9. Tor também está associada a taxas de mutação e tipos 10, 11 e, portanto, sem surpresa, perturbações do programa de replicação estão ligados ao câncer 12, 13. A relação causal entre ToR e estrutura da cromatina ainda não é compreendido. É possível que a cromatina aberta facilita a replicação inicial. No entanto, um modelo alternativo sugere que a cromatina é montada durante a replicação e os diferentes reguladores da cromatina presentes no início e no fim do avanço de fase S para embalagem diferencial de regiões de replicação precoce e tardio 1, 14 </sup&gt;. Mostrámos recentemente que o TdR molda o teor de GC ao afectar o tipo de mutações que ocorrem em diferentes regiões genómicas 11. Hibridização fluorescente in situ (FISH) é o método principal para a medição TdR em loci individuais. Ela é realizada simplesmente por meio da contagem da percentagem de células em fase S que exibem sinais de FISH individuais contra a percentagem de dupletos para um determinado alelo 15, 16. Um método alternativo, é constituído por impulsos marcação do ADN com BrdU, as células de apartação de acordo com o seu conteúdo em ADN para vários pontos de tempo ao longo S, imunoprecipitação ADN contendo BrdU, e verificando a abundância de ADN precipitado com 17 qPCR. TdR mapeamento genómico pode ser alcançada através de dois métodos. O primeiro método é uma versão genómica do método baseado em IP BrdU descrito acima, em que a quantificação da quantidadede ADN foi precipitado em cada fracção é feito, simultaneamente, para a totalidade do genoma por meio de hibridação com micromatrizes ou por sequenciação de profundidade. O segundo método, CNR-TdR, baseia-se na medição do número de cópias de cada região genómica de células em fase S e normalizando pelo conteúdo em ADN em células G1. Neste método, as células são classificadas por FACS em não-replicante (fase G1) e replicação (fase S) grupos (Figura 1). As células em G1 tem o mesmo número de cópias em todas as regiões genómicas e, assim, o seu conteúdo de ADN deve ser o mesmo. Por outro lado, o número de cópias de ADN em S depende da TdR, uma vez que regiões replicadoras iniciais foram submetidos a replicação na maioria das células e, por conseguinte, o seu conteúdo de ADN é duplicada, enquanto que as regiões de replicação final ainda não replicado na maioria das células e, por conseguinte, o seu conteúdo de ADN serão ser semelhante ao de células G1. Daí a S à relação de G1 de conteúdo de DNA é indicativo do ToR. A quantidade de ADN para cada região genómica é medido quer por hibridação commicroarrays ou por uma profunda sequenciamento 2, 8. As vantagens do método CNR-TdR será discutido. Este artigo descreve o método CNR-ToR para mapeamento genômico ToR como descrito na Figura 2. O artigo discute os detalhes de todo o processo a partir de células coleta até a análise básica dos resultados ea criação de mapas ToR genômicos. O protocolo descrito no presente trabalho foi realizado com sucesso em vários tipos de células cultivadas em cultura. Futuras melhorias deste protocolo pode levar ao mapeamento dos TdR in vivo e em tipos de células raras.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">PBS</td>
			<td style="width:157px;">BI (Biological Industries)</td>
			<td style="width:119px;">02-023-1A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>BI (Biological Industries)</td>
			<td>03-052-1B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15ml conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430790</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5ml Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap&#160;</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td align="right">352235</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>64-17-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse-A 10mg/ml</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4875</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidiom iodide 1mg/ml</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">parafilm</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-996</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5ml DNA LoBind Eppendorf tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">22431021</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.7ml MaxyClear tube&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic beads - Agencourt AMPure XP&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>M-series&#160; -530092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 &#181;l microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td align="right">520096</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrophoresis.2200 Tape station system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seqeuncing - Illumina NextSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dneasy kit for DNA purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">69504</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureProteom Magnetic Stand</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LSKMAGS08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-BrdU/FITC</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>F7210</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSARIA III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS software</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSDiva v 8.0.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide determination of mammalian replication timing by dna content measurement

A replicação do genoma ocorre durante a fase S do ciclo celular em um processo altamente regulado que assegura a fidelidade de duplicação de ADN. Cada região genómico é replicada em um momento diferente durante a fase S através da activação simultânea de múltiplas origens de replicação. Tempo de replicação (ToR) correlaciona-se com muitas características genômicas e epigenéticos e está ligada a taxas de mutação e câncer. Compreender o ponto de vista genômica completa do programa de replicação, na saúde e na doença é uma importante meta para o futuro e desafio. Este artigo descreve em detalhes o &quot;Número Taxa de cópia de S / G1 para mapear Tempo genômico de replicação&quot; método (aqui chamado: CNR-ToR), uma abordagem simples para mapear o genoma ampla ToR de células de mamíferos. O método baseia-se nas diferenças no número de cópias entre as células em fase S e células em fase G1. O método CNR-TdR é realizado em 6 passos: 1. Preparação de células e a coloração com iodeto de propídio (PI); 2. SorTing G1 e células em fase S utilizando células activadas por fluorescência (FACS); 3. purificação de ADN; 4. sonicação; 5. preparação e sequenciamento da biblioteca; e 6. A análise bioinformática. O método CNR-Tor é uma abordagem fácil e rápido que resulta em mapas de replicação detalhadas.

Um mapa típico TdR é mostrado na Figura 3 para fibroblastos de rato embrionários (MEFs). Esta figura demonstra o processo de análise, uma vez que mostra ambos os pontos, que são a razão E / S para G1 normalizada janelas individuais (passo 8.3), bem como a linha que resulta da interpolação e alisamento cúbico (passo 8.5). Tais mapas capturar a organização do programa de replicação, que é uma colcha de retalhos de dois tipos de domínios Tor: i) grandes regiões (na ordem de um megabase) que reproduzem simultaneamente (CTRs = regiões ToR constantes) no início, meio ou final de S ; e ii) as regiões de transição temporais (TTRS) em que o ToR muda gradualmente. CTR são ligados uns aos outros por TTRS e em conjunto, estes dois tipos de organização replicação cobrir o genoma inteiro. Apesar da relativamente baixa sequenciação c<html> excesso (uma leitura a cada 300 pb) utilizado para o mapeamento ToR, os mapas resultantes são bastante robusto. A Figura 4 mostra a reprodutibilidade dos mapas ToR entre triplicados de células MEF comparação com triplicados de células de rato pré-B na mesma região. Comparação entre estes mapas permite a identificação de regiões com diferencial TdR que são definidas como as regiões em que as diferenças nos mapas ToR entre os tecidos são significativamente maiores do que as diferenças entre as réplicas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55157/55157fig2.jpg" /> Figura 2: esquema de protocolo. Diagrama esquemático descrevendo o procedimento do método CNR-ToR. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55157/55157fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 57 / 55157fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Representante genômicas mapas TOR. É mostrado o ToR de todo o cromossomo 1 de células MEF e um olhar mais atento em uma região ~ 50 Mb. São mostradas as pontuações Z dos valores S / G1 em diferentes janelas de tamanho (pontos) e os dados suavizados (linha contínua). Valores elevados de S / G1 correspondem à replicação do início ao passo que valores baixos correspondem a replicação tardia. Setas apontam para exemplos de regiões constantes do TOR (CTRs; vermelho) e regiões de transição temporais (TTRS; verdes). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55157/55157fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55157/55157fig4.jpg" /> Figura 4: Reprodutibilidade das repetições. (A) com suavização ToR de triplicados MEF (azul) em relação ao pré-B triplicados (vermelho) em uma região de 18 Mb no tapete do cromossomo 1. Setas alaranjadasapontar para exemplos de regiões diferenciais entre as linhas de células. (B) mapa de calor das correlações de Spearman entre as 6 amostras. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55157/55157fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Determinação do genoma de sincronismo Replication Mammalian por DNA Medição conteúdo

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

genome-wide-determination-mammalian-replication-timing-dna-content

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

8.4K visualizações.  Hebrew University of Jerusalem. We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Vídeo: Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ Rotulagem de replicação de DNA mitocondrial em Drosophila Adulto Ovários por Edu Coloração

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Genética

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Cinética da Síntese da Fita Atrasada de DNA  In Vitro pelas Proteínas de Replicação do Bacteriófago T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

Mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos T humana primária pela ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ours, have demonstrated that quiescence is associated with widespread changes in gene expression. Some of these changes occur through changes in the level or activity of proliferation-associated transcription factors, such as E2F and MYC. We have demonstrated that mRNA decay can also contribute to changes in gene expression between proliferating and quiescent cells. In this protocol, we describe the procedure for establishing proliferating and quiescent cultures of human dermal foreskin fibroblasts. We then describe the procedures for inhibiting new transcription in proliferating and quiescent cells with Actinomycin D (ActD). ActD treatment represents a straightforward and reproducible approach to dissociating new transcription from transcript decay. A disadvantage of ActD treatment is that the time course must be limited to a short time frame because ActD affects cell viability. Transcript levels are monitored over time to determine transcript decay rates. This procedure allows for the identification of genes and isoforms that exhibit differential decay in proliferating versus quiescent fibroblasts.

We describe a protocol for generating proliferating and quiescent primary human dermal fibroblasts, monitoring transcript decay rates, and identifying differentially decaying genes.

Determinação das taxas de decaimento transcrição de todo o genoma em quiescentes e proliferação de fibroblastos humanos

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Geração de todo o genoma da cromatina conformação captura bibliotecas de firmemente encenado embriões adiantados da drosófila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Promotor captura Oi-c: Alta resolução, todo o genoma caracterização das interações do promotor

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

Um ensaio simples, rápido e quantitativo para medida de reparação de ADN-proteína ligações cruzadas em plasmídeos transfectadas em células de mamíferos

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...