The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Ab&#250;ndez, Jes&#250;s Padilla-Calder&#243;n, Jaime M. Uribe-Wiechers, N&#233;stor O. P&#233;rez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.

1. Preparação de Soluções <ol><li> Preparar a solução BGE. <ol><li> Preparação de 100 ml de uma solução composta de 0,05% (m / v) de celulose hidroxi propil metil celulose (HPMC), 200 mM de ε amino-n-capróico ácido (EACA) e acetato de lítio 30 mM. NOTA: Como HPMC é um polímero viscoelástico, despeje o pó para um copo de vidro, adicionar 80 ml de água e, finalmente, adicionar a barra de agitação. Continue a adicionar os restantes reagentes como normalmente. Use óculos de segurança ao manusear acetato de lítio, pois pode causar irritação nos olhos. </li><li> Ajustar o valor de pH para 4,8 ± 0,1 com 50% (v / v) de ácido acético. Permitir que a solução para estabilizar durante 5 min e ajustar se necessário. </li><li> Adiciona-se água para perfazer a um volume final de 100 ml em balão volumétrico. </li><li> Filtrar através de uma membrana hidrófila com um tamanho de poro de 0,2 um. </li><li> Armazenar de 2-8 ° C por até 7 dias. </li></ol></li><li> Prepara-se o padrão interno. <ol><li> Prepare 1 mLde uma solução composta de 1% (m / v) de histamina. </li><li> Filtrar através de uma membrana hidrófila com um tamanho de poro de 0,2 um. </li><li> Armazenar de 2-8 ° C por até 1 dia. </li></ol></li></ol> Preparação 2. Amostra <ol><li> Preparar 180 ul de amostra de mAb diluído com tampão Tris (50 mM de Tris (hidroximetil) aminometano, pH 8,0) a uma concentração final de 1 mg / ml. </li><li> Adicionar 20 ul de 1% (m / v) de histamina. </li><li> Misturar e centrifugar a 1000 xg por 5 s. </li><li> Coloque um micro frasco dentro de um frasco universal. </li><li> Transferir a amostra para o micro frasco e tampa do frasco universal. Dispense a amostra para cima, a fim de evitar a introdução de bolhas. </li><li> Armazenar de 2-8 ° C por até 1 dia. </li><li> Colocar o frasco universal (com micro frasco contendo a solução de amostra) na bandeja de entrada da amostra. </li></ol> 3. Preparação do sistema CE. <ol><li> Limpeza do sistema CE. NOTA: th Condutaé o procedimento, pelo menos, uma vez por semana, a fim de evitar a fuga de corrente eléctrica derivado de acumulação de poeira e detritos. No entanto, dependendo da aplicação (por exemplo, o uso de um BGE com o aumento da viscosidade ou com uma concentração elevada de sal, as amostras com o aumento da viscosidade) e eléctrodos alavanca de abertura pode necessitar de ser limpo mais frequentemente para evitar a contaminação cruzada e a mistura de amostras. <ol><li> Desligue o interruptor de alimentação do instrumento CE e abra a porta da frente. </li><li> Limpe a superfície da tampa da amostra, sistema de fixação da amostra (amostra e tampão bandejas), tampa do cartucho, bar braçadeira, bloco de interface e eletrodos com um não tecido umedecido em água limpe. Repita o procedimento com um limpe e seco antes do uso umedecido em etanol. </li><li> Lavar as alavancas de abertura abundantemente com água. Limpar sua superfície com um tecido não tecido wipe. Repita o procedimento com um limpar e secar antes da instalação umedecido em etanol. </li><li> Limpe as duas extremidades do cabo de fibra óptica cuidadoly com um pano de microfibra umedecido em água. Repita o procedimento com um pano umedecido em etanol. </li></ol></li><li> Do cartucho. <ol><li> Remover um novo capilar de ponto morto (50 um de diâmetro interno) da embalagem. </li><li> Fita para baixo uma extremidade do tubo de proteção capilar para a bancada. Desenrolar, endireitar e puxar o capilar para fora do tubo. </li><li> Cole um pedaço de fita adesiva ou papel para o ambiente de trabalho e adicionar marcas de medição como se segue: comprimento para o detector (30 cm), a janela capilar (0,2 cm) e o comprimento da extremidade de saída (10 cm) (isto é, comprimento 40,2 cm total 30,0 cm de comprimento eficaz). </li><li> Alinhar janela de capilar para a marca de medição de 0,2 cm de papel de referência. Fixar o capilar com fita e marcar o capilar termina 2 mm fora as marcas de medição. </li><li> Cortar a tampa de protecção na extremidade de entrada capilar (a extremidade mais afastada da janela) num movimento linear utilizando a extremidade de descarga da pedra de clivagem.<ol><li> Mergulha-se o final capilar para um frasco tapado universal enchido com água, a fim de evitar danos permanentes para o revestimento interior capilar. Repetir este procedimento cada vez que a extremidade capilar é exposto ao ambiente, durante mais de 1 minuto. </li></ol></li><li> Inserir a extremidade de entrada capilar para o lado de saída do cartucho. </li><li> Empurrar e puxar o capilar através do cartucho conforme necessário até que a janela do capilar está centrada à janela do cartucho. </li><li> Insira a ficha de abertura (100 mm x 200 mm) na janela do cartucho. NOTA: Confirmar que a luz branca passa através da janela, quando expostos a uma fonte de luz branca. Se a luz que passa através tem um aspecto acastanhado, ajustar, conforme necessário. </li><li> Inserir o capilar para dentro do tubo pré-formado do líquido de arrefecimento para um comprimento total de 40,2 cm capilar (com a porca de tubagem pré-instalados, virola e o O-ring em ambas as extremidades nessa ordem). </li><li> Empurrar o capilar através da coolantubo T, conforme necessário até que o capilar exibida no outro lado do tubo. </li><li> Inserir a extremidade da tubagem de fluido de arrefecimento no lado da saída do cartucho e aperte a porca de tubagem. </li><li> Inserir a extremidade de entrada capilar no lado de entrada do cartucho. </li><li> Empurrar e puxar o capilar através do cartucho conforme necessário até que o capilar exibida no lado de entrada do cartucho. </li><li> Inserir a extremidade do tubo de refrigerante no lado de entrada do cartucho e aperte a porca de tubagem. </li><li> Cortar a tampa de protecção na extremidade de saída capilar (a extremidade mais próxima da janela) num movimento linear utilizando a extremidade de descarga da pedra de clivagem. </li><li> Inserir os clipes de vedação-retentor sobre as extremidades capilares e pressione para encaixar na posição. Inspecione visualmente o capilar termina. Se eles não são ainda, repita o procedimento. </li><li> Coloque o modelo capilar de comprimento na borda da bancada. </li><li> Coloque o cartucho voltado para baixo against o molde capilar de comprimento e alinhar o capilar termina com as linhas de referência no modelo. Se as marcas de medição capilar (ver 3.2.4) não se alinham com as linhas de referência, ajustar conforme necessário. </li><li> Segurar o capilar contra o molde capilar de comprimento e cortar ambas as extremidades do capilar utilizando a extremidade de descarga da clivagem de pedra 2 mm abaixo das linhas de referência no modelo. </li><li> Inspecione visualmente o capilar termina com uma lupa. Se extremidades capilares não são suaves, polir-los usando o rosto suave da pedra clivagem. </li><li> Insira a abertura O-ring no orifício da vela abertura usando a ferramenta de inserção O-ring. </li><li> Instale frascos universais cobertas cheias de água no caso do cartucho eo cartucho lugar em caso imediatamente com extremidades capilares inseridos em frascos. Para armazenamento de curto e longo prazo manter a 2-8 ° C. </li></ol></li><li> Preparação de tampão de bandejas. <ol><li> Preencher e coloque univers tampadasfrascos de Al na entrada do tampão e os tabuleiros de saída (Figura 1). posições dos frascos de repetição em pistas 2, 3, 4 e 5, de acordo com o número de amostras a serem analisadas, colocando uma pista para cada seis injecções de amostra. NOTA: Evite molhar as tampas dos frascos, a fim de evitar a fuga de corrente. </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig1.jpg" /> Figura 1: Posição e nível de enchimento de frascos universais nas bandejas de entrada e saída de buffer. Encha níveis: 1/1 = 1,400 mL, 3/4 = 1300 mL e 1000 mL = 1/2. Abreviaturas: W = água, HCl = ácido clorídrico 0,1 M. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="4"><li> Sistema CE montagem de componentes. <ol><li> Instalar o detector UV. </li><li> Instalar a alavanca de aberturapressionando-se no bloco de interface. </li><li> Instalar o cabo de fibra óptica. Insira a extremidade correspondente à barra de fixação e, mantendo ambas as extremidades, girar no sentido horário. Ligue a outra extremidade ao detector UV. NOTA: Lidar com o cabo de fibra óptica com cuidado durante este procedimento desde flexão poderia causar sua fratura. </li><li> Colocar a amostra e as bandejas de buffer para o sistema de retenção de amostra e encaixe na posição. </li><li> Coloque o cartucho capilar no bloco de interface e, enquanto pressiona a barra de fixação em ambas as extremidades, apertar os botões. </li></ol></li></ol> 4. Métodos Instrumento Set-up <ol><li> Criar o condicionamento, correndo e métodos instrumento desligamento de acordo com os seguintes parâmetros e Tabela 1: Tensão, max: 30,0 kV; Corrente, máx: 300.0 mA; temperatura do cartucho: 20,0 ° C; temperatura de armazenamento da amostra: 10,0 ° C; Detector de UV condições iniciais: Comprimento de onda: 214 nm; Taxa de dados: 4 Hz; Filtro: Normal; largura do pico (pontos): 16-25; sinal de absorbância: Direct. NOTA: taxa de aquisição de dados pode ser aumentada até 25 Hz, a fim de melhorar a cobertura das zonas de separação estreitas. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="8"> programa de tempo método de condicionamento </td></tr><tr><td> Tempo (min) </td><td> Evento </td><td> Valor </td><td> Duração </td><td> frasco de entrada </td><td> frasco de saída </td><td> Resumo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> - </td><td> Lavar - Pressão </td><td> 2068 mbar </td><td> 1,0 min </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> para a frente </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Lavar - Pressão </td><td> 2068 mbar </td><td> 2,0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> para a frente </td> &lt;td&gt; Água </td></tr><tr><td> - </td><td> Lavar - Pressão </td><td> 2068 mbar </td><td> 10,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> para a frente </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 0.00 </td><td> Separado - Tensão </td><td> 15,0 KV </td><td> 10,0 min </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0,17 rampa Min, polaridade normal, </td><td> Separado </td></tr><tr><td> 10.00 </td><td> Lavar - Pressão </td><td> 2758 mbar </td><td> 10,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> para a frente </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 20.01 </td><td> Esperar </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> dicas de enxaguamento </td></tr><tr><td colspan="8"> Correndo método de programa de tempo </td></tr><tr><td> Tempo (min) </td><td> Evento </td><td> Valor </td><td> Duração </td><td> frasco de entrada </td><td&gt; frasco de saída </td><td> Resumo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> - </td><td> Lavar - Pressão </td><td> 2068 mbar </td><td> 1,0 min </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> Adiante, In / Out inc frasco 6 </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Lavar - Pressão </td><td> 2068 mbar </td><td> 2,0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Adiante, In / Out inc frasco 6 </td><td> água </td></tr><tr><td> - </td><td> Lavar - Pressão </td><td> 2068 mbar </td><td> 4,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Adiante, In / Out inc frasco 6 </td><td> BGE </td></tr><tr><td> - </td><td> Injectar - Pressão </td><td> 34 mbar </td><td> 20,0 seg </td><td> SI: A1 </td><td> BO: B1 </td><td> Substituir, Avançado </td><td> injecção da amostra </td></tr><tr><td> - </td><td> Esperar </td><td> - </td><td> 0,4 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> In / Out inc frasco 6 </td><td> dicas de lavagem </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Separado - Tensão </td><td> 15,0 KV </td><td> 30,0 min </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0,17 Min rampa, polaridade normal, In / Out inc frasco 6 </td><td> Separação amostra </td></tr><tr><td> 0,5 </td><td> autozero </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.01 </td><td> pare de dados </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.02 </td><td> Lavar - Pressão </td><td> 2068 mbar </td><td> 2,0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Adiante, In / Out inc frasco 6 </td><td> água </td></tr><tr><td> 32.03 </td><td> Esperar </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> In / Out inc frasco 6 </td><td> dicas de enxaguamento </td></tr><tr><td> 32.04 </td><td> Fim </td><td> -</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Fim </td></tr><tr><td colspan="8"> programa de tempo método de desligamento </td></tr><tr><td> Tempo (min) </td><td> Evento </td><td> Valor </td><td> Duração </td><td> frasco de entrada </td><td> frasco de saída </td><td> Resumo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> - </td><td> Lavar - Pressão </td><td> 2068 mbar </td><td> 1,0 min </td><td> BI: E6 </td><td> BO: E6 </td><td> para a frente </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Lavar - Pressão </td><td> 2068 mbar </td><td> 6,0 min </td><td> BI: F6 </td><td> BO: F6 </td><td> para a frente </td><td> água </td></tr><tr><td> - </td><td> Lamp - Off </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Esperar </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> dicas de enxaguamento </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Condicionado, correndo e programas de tempo de desligamento. 5. Aquisição de Dados e Processamento <ol><li> Programar o conjunto de amostras. <ol><li> Programar o capilar para o condicionamento usando o método de condicionamento instrumento. Quando o capilar é usado pela primeira vez, o programa de quatro repetições; caso contrário programar apenas duas repetições do método de condicionamento. </li><li> Programar as amostras a serem analisadas utilizando o método do instrumento em execução. </li><li> Programar o capilar para armazenamento, utilizando o método instrumento desligamento e repita o procedimento indicado no ponto 3.2.22. </li></ol></li><li> Executar o experimento. </li><li> Exportar os eletroferogramas. </li><li> Calcule o tempo de migração e o teor percentual de base, um dos principaisisoformas ácidas nd usando integração linha de queda vertical do perfil electrofograma. </li></ol>

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	<li>Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advent+of+monoclonal+antibodies+in+the+treatment+of+chronic+autoimmune+diseases.">The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases.</a> Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).</li><li>Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+monoclonal+antibodies.">Heterogeneity of monoclonal antibodies.</a> J. Pharm. Sci. 97 (7), 2426-2447 (2008).</li><li>Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+analysis+of+therapeutic+proteins+by+capillary+and+microchip+electrophoresis.">Recent advances in the analysis of therapeutic proteins by capillary and microchip electrophoresis.</a> Anal. Methods. 6 (15), 5427-5449 (2014).</li><li>Fekete, S., Guillarme, D., Sandra, P., Sandra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic,+Electrophoretic,+and+Mass+Spectrometric+Methods+for+the+Analytical+Characterization+of+Protein+Biopharmaceuticals.">Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals.</a> Anal. 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The authors Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, N&#233;stor O. P&#233;rez, Luis F. Flores-Ortiz and Emilio Medina-Rivero are employees of Probiomed S.A. de C.V., which is developing, manufacturing and marketing biosimilar products. All authors are involved in the development of biosimilar products for Probiomed.

Neste tutorial, destacamos a importância de práticas adequadas na condução CZE análises de mAbs, a fim de aumentar a probabilidade de sucesso. No entanto, quando CZE é usado de forma rotineira, questões surgem inevitavelmente 12. Para melhores resultados, é importante seguir as notas que foram incluídos ao longo do protocolo, como eles vão ajudar o analista a superar e resolver problemas difíceis passos. Uma consideração importante para obter uma melhor resolução a um dado conjunto de condições, é a preparação da solução correcta BGE. Este processo requer ter um controle rigoroso sobre a força iónica de agentes tamponantes, concentração de aditivos não-tampão e pH. No geral, o sistema CE exige cuidado e atenção aos detalhes. Ele pode ser facilmente danificadas se qualquer passo de limpeza, relativa ao sistema de montagem ou é ignorado. O presente método considera a utilização de um capilar de ponto morto. Ao contrário de capilares de sílica fundida descalços,capilares neutros reduzir a adsorção de proteína sobre a parede interna capilar, melhorando assim a eficiência de separação, precisão e repetibilidade 9. No entanto, a sua utilização é limitada pela quantidade de injecções que podem ser executadas. Na nossa experiência, 120 a 150 injectáveis ​​pode ser levada a cabo sem efeito sobre a resolução devido à degradação progressiva do revestimento interior. Uma vez que o capilar atingiu esse limite, será necessário um novo capilar. Outros protocolos têm sido relatados para a análise físico-química da heterogeneidade de mAbs por CZE, que incluem a utilização de capilares permanently- e dinamicamente-revestidas 13,14. No entanto, estes estudos propõem a utilização de um conjunto fixo de condições para analisar a grande diversidade de mAbs. Em contraste com os métodos existentes, acreditamos que a performance óptima só pode ser conseguida através da adaptação condições experimentais. Por exemplo, o protocolo aqui apresentado tem sido utilizado e ajustado nopassado para analisar a heterogeneidade isoforma de quatro outros mAbs diferentes e um fragmento de Acm 10. A fim de adaptar este protocolo para avaliar outros mAbs, recomenda-se a modulação de BGE força iónica e de pH de acordo com a diversidade e variantes ponto isoeléctrico da molécula a ser analisado. Novas medidas depois de dominar esta técnica deve incluir a avaliação do desempenho do método. Parâmetros tais como a selectividade e a repetibilidade (em termos do desvio padrão relativo de tempo de migração e a percentagem de área) deve ser testada a fim de confirmar que o método é adequado para o uso pretendido.

Os anticorpos monoclonais (mAbs) são proteínas bioterapêuticos com crescente interesse devido à sua capacidade de agir contra várias doenças crónicas e degenerativas 1. Como outras biomoléculas, os mAbs são propensos a sofrer várias alterações físico-químicos em todas as fases do seu ciclo de vida (ou seja, a partir de biossíntese para o produto final). Tais modificações incluem, mas não estão limitados a: desamidação, glicosilação, oxidação, ciclização, isomerização, a agregação e a clivagem proteolítica 2. Assim, técnicas analíticas capazes de resolver isoformas intrínsecas são necessários para monitorar mAbs heterogeneidade e estabilidade a fim de estabelecer especificações de qualidade. A electroforese capilar (CE) é uma tecnologia de separação de alta performance realizada outinside de um tubo de sílica fundida estreita (gama uM) cheio com um electrólito de fundo (BGE). Após a aplicação de um campo eléctrico (até 30.000 V), molécula carregadas migrar para o eletrodo com carga oposta (ie, separação orientada por electro). O uso de altas tensões no CE permite análises rápidas e uma maior eficiência, que são superiores a electroforese em gel clássica. Eletroforese capilar de zona (CZE) é uma técnica baseada CE rotineiramente utilizado na indústria biofarmacêutica para a avaliação da qualidade do produto 3-9. Ao contrário de outros modos de Ce (por exemplo, electroforese capilar em gel, isoeléctrica capilar de focagem) ou métodos baseados em cromatografia, CZE pode ser realizado sem a utilização de agentes desnaturantes ou interfaces de fase sólida, permitindo a análise da heterogeneidade inerente de mAbs próximo ao seu estado nativo 10 . CZE separação de isoformas de mAb ocorre dentro de um capilar de sílica fundida coberta com um polímero hidrofílico (capilar neutro) e baseia-se na sua mobilidade electroforética diferente, que é regida por carga, massa, tamanho e forma (ou volume hidrodinâmico) 11. porções de mAb são detectados quandoeles são mobilizadas e passe através da janela de detecção, que é detectada por um detector de ultravioleta (UV) a absorvância a 214 nm de 4. O sucesso da implementação desta técnica analítica dependerá a devida atenção aos detalhes antes e durante o experimento. Agindo de outra forma vai aumentar o custo eo tempo para realizar a análise, levando a falha constante e frustração. Aqui, apresentamos um guia passo-a-passo para realizar uma análise bem-sucedida de mAb heterogeneidade por CZE através da explicação detalhada sobre a preparação de soluções e amostras, a preparação do sistema CE, os métodos instrumento criado, a aquisição de dados e o processamento. Para o propósito deste tutorial, um factor alfa de necrose anti-tumoral totalmente humano recombinante (anti-TNF) é o mAb usado como modelo de proteína; no entanto, este protocolo pode ser facilmente customizado para a análise de outras proteínas considerando breves modificações. UMAdditionally, várias recomendações para mitigar possíveis problemas são propostos. O leitor é encorajado a seguir rigorosamente o protocolo proposto, como a probabilidade de sucesso irá aumentar.

<table><tbody><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Tecsiquim</td><td>AT0035-7</td><td></td></tr><tr><td>ACS grade hydrochloric acid</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-05</td><td></td></tr><tr><td>Histamine dihydrochloride</td><td>Fluka</td><td>53300</td><td></td></tr><tr><td>(Hydroxypropyl) methyl cellulose&amp;nbsp;</td><td>Fluka</td><td>09963</td><td></td></tr><tr><td>Lithium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>6-Aminocaproic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,&amp;nbsp; pH 8</td><td>Beckman Coulter</td><td>477427</td><td></td></tr><tr><td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66528</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Neutral capillary&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>477441</td><td></td></tr><tr><td>Vial, Micro, 200 &amp;micro;l</td><td>Beckman Coulter</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>Universal Vial Caps</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62250</td><td></td></tr><tr><td>Universal Vials</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62251</td><td></td></tr><tr><td>Cable, Optics, UV/Vis</td><td>Beckman Coulter</td><td>144093</td><td></td></tr><tr><td>UV/Vis Detector Module</td><td>Beckman Coulter</td><td>144733</td><td></td></tr><tr><td>Cartridge Assembly Kit, Blank</td><td>Beckman Coulter</td><td>144738</td><td></td></tr></tbody></table>

capillary electrophoresis separation of monoclonal antibody isoforms using a neutral capillary

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.

A Figura 2 mostra o perfil de corrente eléctrica típica de um EACA 200 mM, 30 mM de acetato de lítio, pH 4,8 com BGE amostra anti-TNFa mAb diluído com tampão Tris (50 mM, pH 8,0). Como pode ser observado, a corrente é estável durante toda a análise e pode oscilar entre os valores de 30 a 35 uA. A Figura 3 mostra o electroferograma CZE de uma amostra em branco onde o pico detectado corresponde ao padrão interno de histamina. Espera-se para a histamina para ter um tempo de migração de 3,7 a 4,1 min. A Figura 4 mostra o electroferograma CZE de TNFa anti-mAb. Como pode ser observado, o pico principal é precedido e seguido por picos de menor intensidade. Uma vez que a separação é conduzida sob polaridade normal (ou seja, de positivo para negativo), a análise revela isoformas básicas (mAb variantes com carga positiva) que migram mais rapidamente e isoformas ácidas (mAb variantes com carga negativa)<html> migração mais lenta do que a isoforma principal. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig2.jpg" /> Figura 2: perfil da corrente eléctrica de uma típica corrida CZE. A corrente BGE é estável a cerca de 30 uA, quando a amostra é diluída de mAb com tampão Tris (50 mM, pH 8,0). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55082/55082fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig3.jpg" /> Figura 3: CZE electrofograma da amostra em branco. Note-se que não há picos são detectados para além do que o padrão interno de histamina. UA = unidades de absorvência. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55082/55082fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> tenda &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig4.jpg" /> Figura 4: heterogeneidade físico-química de anti-TNF mAb determinado por CZE. Esta amostra é composta por isoformas básicas, principais e ácidas. Inserção mostra uma visão expandida das variantes resolvidos por CZE. UA = unidades de absorvência. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55082/55082fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Electroforese Capilar Separação de Anticorpo Monoclonal isoformas utilizando um capilar de ponto morto

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.6K visualizações.  Unidad de Investigación y Desarrollo, Probiomed S.A. de C.V.. Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Vídeo: Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides an alternative strategy, capillary isoelectric focusing (cIEF), with many advantages compared to conventional immunoblotting. This is an antibody-based, automated, rapid, and quantitative method in which a complete western blotting procedure takes place inside an ultrathin capillary. This technique does not require a gel to transfer to a membrane, stripping of blots, or x-ray films, which are typically required for conventional immunoblotting. Here, proteins are separated according to their charge (isoelectric point; pI), using less than a microliter (400 nL) of total protein lysate. After electrophoresis, proteins are immobilized onto the capillary walls by ultraviolet light treatment, followed by primary and secondary (horseradish peroxidase (HRP) conjugated) antibody incubation, whose binding is detected through enhanced chemiluminescence (ECL), generating a light signal that can be captured and recorded by a charge-coupled device (CCD) camera. The digital image can be analyzed and quantified (peak area) using software. This high throughput procedure can handle 96 samples at a time; is highly sensitive, with protein detection in the picogram range; and produces highly reproducible results because of automation. All of these aspects are extremely valuable when the quantity of samples (e.g., tissue samples and biopsies) is a limiting factor. The technique has wider applications as well, including screening of drugs or antibodies, biomarker discovery, and diagnostic purposes.

Capillary isoelectric focusing is an antibody-based, ultrasensitive, high throughput technique, enabling detailed characterization of proteins and their isoforms from extremely small biological samples. The following describes a protocol for detection and quantification of specific proteins and their isoforms in an automated and robotized manner.

Detecção altamente sensível e quantitativa de proteínas e suas isoformas pelo método isoeléctrica capilar

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Bioquímica

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using affinity chromatography.&#160;While affinity chromatography using porous protein A agarose beads packed in columns is arguably the most common method of laboratory scale isolation of antibodies and recombinant proteins expressing Fc fragments of IgG, it can be a time consuming and expensive process.&#160;Time and financial constraints are especially daunting in small basic science labs that must recover hundreds of micrograms to milligram quantities of protein from dilute solutions, yet lack access to high pressure liquid delivery systems and/or personnel with expertise in bioseparations. Moreover, product quantification and characterization may also excessively lengthen processing time over several workdays and inflate expenses (consumables, wages, etc.).&#160;Therefore, a fast, inexpensive, yet effective protocol is needed for laboratory scale isolation and characterization of antibodies and other proteins possessing an Fc fragment.&#160;To this end, we have devised a protocol that can be completed by limited-experience technical staff in less than 9 hr (roughly one workday) and as quickly as 4 hr, as opposed to traditional methods that demand 20+ work hours. Most required equipment is readily available in standard biomedical science, biochemistry, and (bio)chemical engineering labs, and all reagents are commercially available.&#160;To demonstrate this protocol, representative results are presented in which chimeric&#160;murine galectin-1 fused to human Fc (Gal-1hFc) from cell culture supernatant was isolated using a protein A membrane adsorber.&#160;Purified Gal-1hFc was quantified using an expedited Western blotting analysis procedure and characterized using flow cytometry. The streamlined workflow can be modified for other Fc-expressing proteins, such as antibodies, and/or altered to incorporate alternative quantification and characterization methods.

Compared with traditional affinity chromatography using protein A agarose bead-packed columns, protein A membrane adsorbers can significantly speed laboratory-scale isolation of antibodies and other Fc fragment-expressing proteins.&#160;Appropriate analysis and quantification methods can further accelerate protein processing, allowing isolation/characterization to be completed in one workday, instead of 20+ work hours.

Isolamento e caracterização de proteínas quimricas que expressam fc humanos usando adsorbers de membrana de proteína e um fluxo de trabalho simplificado

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

Bioengenharia

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Imunologia e Infecção

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Purificação e análise de um anticorpo monoclonal de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. However, similar to other antibody-based protein assays, optimization of capillary-based immunoassay parameters, such as protein concentration, antibody dilution, and exposure time is an important prerequisite to the generation of meaningful and reliable data. Measurements must fall within the linear range of the assay where changes in signal are directly proportional to changes in lysate concentration. The process of choosing appropriate lysate concentrations, antibody dilutions, and exposure times in the human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B, is demonstrated here. Assay linearity is shown over a range of whole cell extract protein concentrations with p53 and &#945;-tubulin antibodies. An example of signal burnout is seen at the highest concentrations with long exposure times, and an &#945;-tubulin antibody dilution curve is shown demonstrating saturation. In addition, example experimental results are reported for doxorubicin-treated cells using optimized parameters.

A capillary-based immunoassay using a commercial platform to measure target proteins from total protein preparations is demonstrated. In addition, assay parameters of exposure time, protein concentration, and antibody dilution are optimized for a cell culture model system.

Procedimento e estratégias de otimização de chave para um método automatizado capilar imunoensaio eletroforética com base em

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

Biologia

Capillary Electrophoresis (CE)

Source: Laboratory of Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Capillary electrophoresis (CE) is a separation technique that separates molecules in an electric field according to size and charge. CE is performed in a small glass tube called a capillary that is filled with an electrolyte solution. Analytes are separated due to differences in electrophoretic mobility, which varies with charge, solvent viscosity, and size. Traditional electrophoresis in gels is limited in the amount of voltage that can be applied because Joule heating effects will ruin the gel and the separation. Capillaries have a large surface area-to-volume ratio and thus dissipate heat better. Therefore, the voltages applied for a capillary electrophoresis experiment are quite large, often 10,000&#8211;20,000 V.
Capillary electrophoresis is useful for high-performance separations. Compared to liquid chromatography, CE separations are often faster and more efficient. However, capillary electrophoresis works best to separate charged molecules, which is not a limitation of liquid chromatography. CE has a greater peak capacity than high-performance liquid chromatography (HPLC), meaning the separations are more efficient and more peaks can be detected. The instrumentation can be very simple. However, HPLC is more versatile and many stationary and mobile phases have been developed for different types of molecules.

Capillary Electrophoresis: Principle, Procedure and Applications

Eletroforese Capilar (CE)

Source: Laboratory of Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Capillary electrophoresis (CE) is a separation technique that separates molecules in an ...

Education

JoVE Science Education

Química

Química Analítica

An Affinity Chromatography Technique for the Purification of Monoclonal Antibodies

Source: Elgundi, Z., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/55153">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique for purifying monoclonal antibodies from the culture supernatant obtained from an antibody-producing cell culture. The process involves using a matrix of crosslinked agarose beads with conjugated Protein A, which immobilizes the antibodies in the supernatant on the beads, allowing for effective separation from contaminants. By applying an elution buffer with low pH, the protein A-antibody interaction is loosened, facilitating the collection of antibody-containing fractions.

Uma técnica de cromatografia de afinidade para a purificação de anticorpos monoclonais

1. Antibody Purification by Affinity Chromatography Using an Automated Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System
NOTE: The following procedure can ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunologia

Antibody-Based Technologies

Production and Purification

DFE-Based Affinity Chromatography: A Technique for Purification of 2F5 Monoclonal Antibodies from a Crude Sample Using High Ionic Strength-Based Elution Conditions

Source: Kn&#246;dler, M. et al., <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/59933">Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes an affinity chromatography technique for purifying 2F5 monoclonal antibodies using the DsRed-2F5-Epitope or DFE ligands. The purified 2F5 monoclonal antibodies are essential drugs in immunotherapy.

Cromatografia de afinidade baseada em DFE: uma técnica para purificação de anticorpos monoclonais 2F5 de uma amostra bruta usando condições de eluição baseadas em alta força iônica

Source: Kn&#246;dler, M. et al., Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case ...

Técnicas Biológicas

Técnicas de Cromatografia

A Capillary Electrophoresis Immunoassay for Protein Biomarker Detection

Source: Sage, J. M., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/60638">Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates a capillary electrophoresis immunoassay protocol for detecting a protein biomarker associated with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human blood platelets. Confirmation of the presence of the ALS biomarker protein is achieved through size-based separation of the platelet proteins followed by chemiluminescent detection.

Um imunoensaio de eletroforese capilar para detecção de biomarcadores de proteínas

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of buffers and ...

Characterization and Functional Analysis

Electrophoresis: Overview

Electrophoresis is a powerful analytical separation technique that relies on the differential migration of charged species when subjected to an electric field. The core strength of electrophoresis lies in its ability to separate high-molecular-weight species in complex mixtures. It has found widespread use in biochemistry, molecular biology, and analytical chemistry, allowing the separation of compounds like amino acids, nucleotides, carbohydrates, and proteins with excellent resolution.
There are two main formats for electrophoretic separations: slab electrophoresis and capillary electrophoresis. Slab Electrophoresis uses a gel matrix, such as agarose or polyacrylamide, which acts as a sieve, allowing molecules to move through the pores. Capillary electrophoresis employs a narrow capillary tube filled with a buffer solution, providing high-resolution separation with rapid analysis time and minimal sample requirements. Although slab electrophoresis is widely used in biochemistry and biology to separate high-molecular-mass species, capillary electrophoresis is a more recent development with several advantages.
Capillary electrophoresis is a separation technique used to analyze complex mixtures of analytes based on their differential migration rates in an applied electric field. In this method, a sample is injected into a narrow capillary tube filled with a buffered solution, and an electric field is applied to facilitate separation. The migration rate of the analyte depends on its charge and size. The smaller, more highly charged ions migrate faster than the larger, less charged ones. In capillary electrophoresis, the migration of sample components is influenced by two types of mobility: electrophoretic mobility and electroosmotic mobility. Electrophoretic mobility is the solute&#39;s response to the applied electric field, with cations moving toward the negatively charged cathode, anions moving toward the positively charged anode, and neutral species remaining stationary. Electroosmotic mobility occurs when the buffer solution moves through the capillary in response to the electric field, typically toward the cathode.
Under normal conditions, capillary electrophoresis separates cations first, followed by neutral species, and finally, the anions. This separation is based on their respective electrophoretic mobilities and electroosmotic flow velocities. Notably, all separated species are eluted from the same end of the capillary, allowing their detection using quantitative detectors. The detector signals produce an electropherogram resembling a chromatogram but feature narrower peaks.
Capillary electrophoresis is a powerful tool for qualitative and quantitative analysis of complex mixtures. It provides information similar to that obtained from other separation techniques, such as gas chromatography (GC) or high-performance liquid chromatography (HPLC).

Eletroforese: Visão geral

Electrophoresis is a powerful analytical separation technique that relies on the differential migration of charged species when subjected to an electric ...