Os autores gostaria de agradecer Keith Tarpley nos EPA escritório da equipe de pesquisa e desenvolvimento-Research Triangle Park (ORD-RTP) gráfico e mídia para o desenvolvimento, gravação e edição de vídeo instrucional. Também gostaríamos de agradecer a Deborah Pritchett de ProteinSimple útil conversas sobre otimização de nossos dados,. JM Guynn foi apoiado pelo Instituto de Oak Ridge para ciência e educação programa de pesquisa/participação nos Environmental Protection Agency.

Nota: Certifique-se de que todos os reagentes e amostras são preparadas de acordo com o fabricante &#39; protocolo de s, descrito abaixo. Por favor, use equipamento de proteção pessoal adequada durante este procedimento, que inclui luvas de nitrilo, jaleco, sapatos fechados e óculos de segurança. Uma tabela de materiais específicos, reagentes e equipamentos necessários é fornecida separadamente. Concentração de proteínas totais das amostras deve ser determinada previamente usando metodologias estabelecidas que são compatíveis com o lisado buffer usado, tais como o ensaio de Bradford 11.
 1. preparação de amostras e reagentes o pacote padrão, como fornecido pelo fabricante <ol><li>para preparar a solução de trabalho de 400 milímetros de ditiotreitol (DTT), adicionar 40 µ l de água deionizada água para o tubo transparente que contém o fornecido pelo estoque do fabricante. É importante evitar a introdução de bolhas para a solução, misturando a solução com lenta e suave pipetagem.</li>
	Amortecedor da amostra <li>Adicionar 20 µ. L 10x e 20 µ l da solução preparada 400 mM DTT ao tubo rosa contendo fluorescente 5 X master mix (veja a Tabela de materiais). 
	Nota: O Master Mix (MM) é selada pelo fabricante com uma tampa de folha e deve ser perfurado por uma ponta da pipeta. Misture suavemente pipetando lento para evitar salpicos TDT na pipeta.</li>
	<li>, Em seguida, adicione 16 água µ l de água deionizada, 2 µ l de fornecido 10 X amortecedor da amostra e 2 µ l da solução preparada 400 mM DTT ao biotinylated branco escada tubo fornecido pelo fabricante. Misture delicadamente e transfira para um tubo de 0,6 mL de desnaturação.</li>
	<li>Preparar 0,1 x amortecedor da amostra diluindo o fornecido 10 X solução 1: 100 com água. Preparar o suficiente 0.1 x amortecedor da amostra para diluir as amostras.</li>
	<li>Calcular a quantidade de tampão de amostra x 0.1 é adicionado a uma amostra, o que dependerá da concentração final desejada da proteína total. Misturar 1 parte 5 x fluorescente MM com 4 peças diluído amostra para obter a concentração de proteína final desejada.
	<ol><li>Calcular volumes da seguinte forma: (i) Volume 5 x fluorescente MM = (concentração de proteína final desejado) / 5; (ii) volume de estoque de proteína = (concentração de proteína final desejado x volume Total necessário) / proteína estoque concentração; (iii) volume 0,1 x amortecedor da amostra = volume Total - 5 x volume de MM - proteína estoque volume.</li>
	</ol></li></ol> 2. Desnaturação de amostras e escada <ol><li>lugar preparado amostras e biotinilado escada em um bloco de calor de 95 ° C para os tubos de vórtice de 5 min. imediatamente após a incubação, executar um giro por ~ 5 s em uma centrífuga de mesa e um lugar na Ice. 
	Nota: Algumas proteínas podem exigir condições de desnaturação mais suaves (por exemplo, 70 o C por 10 min) para prevenir a agregação da proteína e melhorar a migração na matriz capilar. Considere essa opção se houver manchas pesadas no mais alto peso molecular (Veja o vídeo por exemplo).</li>
</ol> 3. Preparação de anticorpos <ol><li>, conforme determinado pela otimização (ver Resultados de representante e vídeo), preparar o dilution(s) desejado do anticorpo primário (por exemplo, 01:50, 1: 100) no anticorpo fornecido 2 diluente. 
	Nota: Os anticorpos são geralmente utilizados em altas concentrações para imunoensaio capilar-baseado do que para a mancha ocidental tradicional. O anticorpo secundário fornecido está pronto para usar sem diluição.</li>
</ol> 4. Preparação de S de Luminol e peróxido de <ol><li>preparar uma mistura 1:1 de S de luminol e peróxido de.</li>
	<li>Vortex para misturar e armazenar na Ice. 
	Nota: É importante que esta mistura está preparada fresco para cada ensaio experimental. 250ul mistura total é necessária para executar um prato cheio.</li>
</ol> 5. Preparação da placa de ensaio <ol><li>, como mostrado na Figura 1, carregar as amostras e reagentes preparados acima na placa de ensaio. Consulte as instruções detalhadas abaixo para cada linha. Para minimizar a evaporação dos poços, certifique-se de que a tampa da placa é substituída entre adições reagente.</li>
	<li>Na linha A, pipetar 5 µ l de Biotinylated escada no poço A1. Para a linha restante, pipetar preparou amostras (5 µ l cada) em poços A2-A25. 
	Nota: É imperativo que o A1 contém bem sempre a escada, como o primeiro capilar no cartucho é otimizado para a execução desta norma.</li>
	<li>Na linha B, pipeta de 10 µ l de diluente 2 anticorpo em cada poço (B1-B25).</li>
	<li>Na linha C, pipetar 10 µ l de diluente 2 anticorpo em C1 bem. Na linha restante C poços, pipetar 10 µ l de anticorpo primário (poços C2-C25).</li>
	<li>Na linha D, pipetar 10 µ l de Streptavidin HRP em D1 bem. Na linha restante poços D, pipetar 10 µ l de anticorpo secundário (poços D2-D25).</li>
	<li>Em linha E, pipetar 10 µ l da mistura preparada na hora luminol-peróxido em cada poço (E1-E25).</li>
	<li>Finalmente, adicionar o tampão de lavagem 500 µ l por compartimento para cada uma das 3 principais linhas dos poços reserva. 
	Nota: É importante minimizar a formação de bolhas por pipetagem suavemente e não expulsando o volume final da ponta como bolhas podem interferir com o capilar de carregar e executar.</li>
	<li>, Uma vez que todos os poços são carregados, centrifugar a placa a ~ 1000 x g por 5 min à temperatura ambiente para remover bolhas e garantir que o líquido é no fundo dos poços. Pop qualquer visíveis bolhas com uma agulha limpa ou ponta da pipeta pequena (por exemplo, calibre 25 estéril &#34; top rep &#34; agulha).</li>
</ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig1.jpg" /> Figura 1 . Modelo para a placa de ensaio de pipetagem. A codificação de cores representa adequados reagentes e amostras (total até 24) adicionadas à placa de ensaio. Adicionar biotinilado escada para poço A1 (laranja), preparou amostras de poços A2 até A25 (azul claro), anticorpo diluente 2 poços B25-B1 e C1 (verde claro), anticorpo primário para poços C2 até C25 (azul), streptavidin-HRP para bem D1 (rosa escuro), anticorpo secundário para poços de D2 até D25 (verde escuro) e mistura de luminol-peróxido de poços E1 até E25 (roxo). Tampão de lavagem é adicionado para as três primeiras fileiras da placa mid maior poços (azul escuro). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55911/55911fig1large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
 6. começando o instrumento capilar imunoensaio <ol><li>certifique-se de que o instrumento e o computador que acompanha são ativados. Não aquecer o tempo é necessário.</li>
	<li>Abra o software de instrumentação no computador. Primeiro, selecione o &#34; ensaio &#34; guia no canto direito da janela e &#34; novo ensaio &#34; sob o &#34; Menu arquivo &#34; à esquerda. Selecione o tamanho e escala do tamanho (por exemplo, 12-230 kDa) cartucho tipo (por exemplo, 25 capilar) que foi usado para o ensaio especial. 
	Nota: Um maio também entrado parâmetros de ensaio, incluindo a concentração de proteína, tipo de anticorpo e diluição, se desejado, mas estes não são necessários para iniciar o ensaio.</li>
	<li>Abrir a porta no instrumento pressionando o botão na parte superior do painel laranja.</li>
	<li>Cuidadosamente remova o refil capilar da embalagem. Sem tocar os capilares de vidro, coloque o cartucho no suporte do cartucho. Verifique se o assento do cartucho, observando a luz interior muda de laranja para azul.</li>
	<li>Segure a placa no banco e cuidadosamente Retire o selo de evaporação da parte inferior da placa. Pop bolhas de qualquer vistas estes poços de matriz de separação com um smtodos a ponta da pipeta ou agulha limpa (por exemplo, calibre 25 estéril &#34; top rep &#34; agulha).</li>
	<li>Coloque a placa de ensaio sobre o suporte da placa, garantindo que é totalmente encaixado e feche a porta do instrumento.</li>
	<li>Clique o &#34; iniciar &#34; botão no software. 
	Nota: Se nenhum botão iniciar aparece, a conexão com o instrumento foi perdido. Escolha o instrumento no menu superior esquerdo e, em seguida, conectar-se. Um pop-up aparecerá com o número de série do instrumento; Selecione essa opção e, em seguida, clique em conectar. Botão iniciar deverá aparecer agora.</li>
	<li>Quando a execução é concluída, descartar a placa. Remova o cartucho e coloque em um recipiente de objectos cortantes para descarte, junto com agulhas que pode ter sido usado para pop bolhas. Deixe o poder ligada para evitar problemas de conexão, se o instrumento estiver sendo usado regularmente (por exemplo, pelo menos semanalmente).</li>
</ol> 7. Experimento de análise <ol><li>antes da análise, assegurar que são realizadas as seguintes verificações de qualidade.
	<ol><li>Verificar padrões fluorescentes, selecionando o &#34; mostrar padrões &#34; ícone. Verifique se os padrões são corretamente identificados no &#34; gráfico de &#34; guia. Se eles estiverem incorretos, vá para o &#34; única exibição &#34; ícone, clique com o botão direito no pico correto e selecione &#34; força padrão &#34;, ou clique com o botão direito no pico incorreto e selecione &#34; não é um padrão &#34;. Executar esta verificação para cada capilar novo.</li>
		<li>Verify biotinilado escada clicando sobre o &#34; amostras &#34; e &#34; única exibição &#34; ícones. Selecione a escada na guia experiência. Se um pico é identificado incorretamente, clique direito em &#34; gráfico de &#34; e selecione &#34; pico de remover &#34;. 
		Nota: por exemplo, a escada biotinilado usada para o kit de kDa 12-230 deve mostrar 12, 40, 66, 116, 180 e 230 kDa picos de dimensionamento. Se esta etapa não é executada, o dimensionamento dos picos da amostra será calculado incorretamente, produzindo resultados espúrios.</li>
		<li>Vista e analisar picos de amostra. Derivar os dados da tabela de picos, incluindo peso molecular, a área do pico, altura do pico e sinal de ruído (S/N), conforme necessário para cálculos experimentais.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bradley, H. L., Sabnis, H., Pritchett, D., Bunting, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hematopoietic stem cell protocols. 1185, (2014).</li><li>Guo, L., Eldridge, S., Furniss, M., Mussio, J., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+(hiPSC-CMs)+to+Monitor+Compound+Effects+on+Cardiac+Myocyte+Signaling+Pathways.">Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs) to Monitor Compound Effects on Cardiac Myocyte Signaling Pathways.</a> Curr Protoc Chem Biol. 7 (3), 141-185 (2015).</li><li>Chen, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitation+of+endogenous+proteins+with+precision+and+accuracy+using+a+capillary+Western+system.">Absolute quantitation of endogenous proteins with precision and accuracy using a capillary Western system.</a> Anal Biochem. 442 (1), 97-103 (2013).</li><li>Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+nano-immunoassays:+advancing+quantitative+proteomics+analysis,+biomarker+assessment,+and+molecular+diagnostics.">Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics.</a> J Transl Med. 13, 182 (2015).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Application+of+a+Novel+Nanovolume+Capillary+Electrophoresis-+Based+Protein+Analysis+System+in+Personalized+&amp;+Translational+Medicine+Research.">The Application of a Novel Nanovolume Capillary Electrophoresis- Based Protein Analysis System in Personalized &amp; Translational Medicine Research.</a> J Bioanal Biomed. S3 (004), (2013).</li><li>ProteinSimple Western. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Size Assay Development Guide, Revision 1. , (2014).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western++blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fastest+Western+in+town:+a+contemporary+twist+on+the+classic+Western+blot+analysis.">The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis.</a> J Vis Exp. (84), e51149 (2014).</li><li>Thorn, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+pathways:+pharmacodynamics+and+adverse+effects.">Doxorubicin pathways: pharmacodynamics and adverse effects.</a> Pharmacogenet Genomics. 21 (7), 440-446 (2011).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+bradford+protein+assay.">Linearization of the bradford protein assay.</a> J Vis Exp. (38), (2010).</li><li>Taira, N., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+p53+tumor+suppressor:+determinants+of+its+functional+targets.">Post-translational modifications of p53 tumor suppressor: determinants of its functional targets.</a> Histol Histopathol. 27 (4), 437-443 (2012).</li><li>Thompson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+p53+on+key+serines+is+dispensable+for+transcriptional+activation+and+apoptosis.">Phosphorylation of p53 on key serines is dispensable for transcriptional activation and apoptosis.</a> J Biol Chem. 279 (51), 53015-53022 (2004).</li><li>Currier, J. M., Cheng, W. Y., Menendez, D., Conolly, R., Chorley, B. 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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente. Este manuscrito foi revisado pelo nacional de saúde e laboratório de pesquisa de efeitos ambientais e aprovado para publicação. O conteúdo não reflete necessariamente as opiniões do US EPA nem faz menção de nomes comerciais ou produtos comerciais constituem endosso ou recomendação para o uso.

Por décadas, tem havido interesse sustentado no desenvolvimento de métodos de imunoensaio baseado em eletroforética capilar por causa da baixa amostra e reagente despesas, diminuída de processamento tempo quando comparado aos métodos tradicionais e alta compatibilidade para Automatize o procedimento4,15. Há um número de diferentes protocolos para a separação de proteínas que utilizaram capilares, incluindo polímero eletroforético, electrokinetic, peneirar e métodos isoelétrico que isolar proteínas pelas propriedades diferentes (respectivamente, carga eletrostática, equilíbrio de partição, peneirando Propriedades da matriz da separação e pH)16. Aqui, descrevemos um método de eletroforese capilar baseado em anticorpos (ou imunoensaio), usando um polímero peneirando a separação, que foi automatizada e comercialmente adotado3. As vantagens deste sistema incluem facilidade de uso e operação, padronizados e comercialmente disponíveis reagentes e medições confiáveis, sensíveis que exigem menos reagentes e amostras em comparação com ensaios de proteína tradicionais tais como borrão ocidental, ligado à enzima imunoensaio e outros formatos de4,3,5. Tem-se observado nas avaliações anteriores desta tecnologia que a escala do tamanho da proteína que pode ser avaliada tem sido limitada pela separação disponível matriz4, ofertas no entanto recentes têm expandido o mensurável variam de 2 a 440 kDa17 . Além disso, alguns buffers lisados são conhecidos por serem incompatíveis com o ensaio18, portanto seleção dos reagentes experimentais utilizado deve ser considerada antecipadamente.
Uma grande vantagem de um procedimento automatizado com componentes disponíveis comercialmente é a consistência dos resultados através de métodos padronizados e reagentes. Isso minimiza as chances de fracasso de ensaio, automatizando etapas críticas dentro do procedimento. No entanto, é importante notar que certas práticas devem ser respeitadas durante o protocolo para minimizar problemas com o imunoensaio baseado em eletroforética capilar. Em primeiro lugar, é fundamental que a mistura de luminol-S/peróxido é preparada fresco e imediatamente antes placa de carregamento. Sincronismo consistente irá resultar em luminescência consistente após o agente oxidante é adicionado, o que resultará em medições consistentes para um ensaio de anticorpo específico depois do ensaio. Além disso, é importante que os reagentes não-expirado são usados, que afeta principalmente a potência do agente oxidante. Além disso, é importante que a ordem de carregamento de amostras, anticorpos e outros reagentes ser rigorosamente seguidas (ver Figura 1). Qualquer reagente pipetado fora do lugar irá resultar em falha de ensaio e executar um desperdício.
Além desses passos críticos, principais questões experimentados com a técnica geralmente podem ser superados através de otimização. Com efeito, estas condições são específicas para cada combinação de sistema/anticorpo de modelo e, portanto, devem ser determinadas empiricamente para cada novo ensaio. Neste artigo, enfocamos três procedimentos comuns de otimização: tempo de exposição, titulação lisada e diluição do anticorpo primário. A capacidade de gerar resultados mensuráveis depende da análise de um tempo de exposição quando o substrato de luminol não é ser rapidamente esgotado, como resultado de depleção de substrato em perda de sinal. Lisado titulação determina a gama dinâmica linear de cada ensaio, que pode diferir com sistemas de modelo diferente, bem como anticorpos diferentes, mesmo para o mesmo destino de proteína. Diluições de anticorpo escolhidas em ou perto de saturar as concentrações garantir mudanças no sinal não serão afetadas por uma escassez de anticorpo livre, mas apenas por diferente quantidade de proteína disponível alvo epítopo. Outras considerações durante o processo de otimização podem incluir o tempo de incubação do anticorpo e empilhamento/amostra tempo de carregamento. Na maioria dos casos, as configurações padrão para o instrumento oferecem o melhor equilíbrio de resolução e sensibilidade. No entanto, em alguns casos, pobre resolução ou sensibilidade pode ser melhorada por ajustar esses parâmetros.
Capilar de imunoensaio eletroforética com base em métodos fornecem medições de proteína rápida, eficiente e reprodutível. Enquanto esses métodos têm sido utilizados principalmente em configurações de pesquisa e desenvolvimento, a coerência destas tecnologias tem potencial utilidade em aplicações clínicas e regulamentares. Por exemplo, a identificação de subpopulações sensíveis a tóxicos ambientais ou pacientes com progressão da doença pode basear-se nos biomarcadores de proteína medidos em matrizes acessíveis, como sangue, urina e saliva. Como reagente e queda de custos de operação e o número de amostras e alvos que podem ser avaliadas simultaneamente aumenta, provavelmente veremos métodos de imunoensaio baseado em eletroforética capilar usados para esses tipos de aplicativos.

Os imunoensaios electroforese capilares medem a expressão da proteína em lisados celulares usando sistemas de separação de tamanho ou carga e oferecem várias vantagens sobre os tradicionais imunoensaios. Por exemplo, quando comparado ao borrão ocidental, o procedimento automatizado baseado em capilar Elimina a necessidade de géis, dispositivos de transferência, e manual de lava. Além disso, a quantidade absoluta de proteína necessária é aproximadamente 10 vezes menor, tornando a sistemas baseados em capilar ideal para uso com tipos de células raras ou amostra limitada1,2. Os resultados são obtidos em menos de 3 h, usando sistemas automatizados e anteriormente tenha sido demonstrados mais quantitativa e reprodutível do que ocidental convencional borre procedimentos3,4,5. O processo para ensaios baseados em tamanho consiste em carregar amostras contendo sulfato dodecyl de sódio (SDS), ditiotreitol (DTT) e fluorescente etiquetado marcadores de peso molecular em colunas capilares contendo matrizes de empilhamento e separação. Tensão aplicada aos capilares separa as proteínas nas amostras de acordo com o tamanho, e a luz UV imobiliza as proteínas separadas na parede capilar. O capilar é então imuno-sondado com alvos primário anticorpo e horseradish peroxidase (HRP)-anticorpo secundário conjugado. Luminol e peróxido de catalisam a geração de luz quimioluminescente que é medida por uma câmera do dispositivo acoplado (CCD) de carga e analisada para dosar proteínas.
Apesar da relativa facilidade e velocidade de uma plataforma automatizada baseada em capilar eletroforética imunoensaio, otimização das condições de ensaio, tais como a concentração de proteína, anticorpo diluição e tempo de exposição é importante para a obtenção de precisas, reprodutíveis resultados. Em geral, os procedimentos a seguir devem ser executados para otimizar um ensaio para estes sistemas:
1) uma tela deve ser realizada para avaliar e escolher os anticorpos para o sinal e especificidade para o destino de proteína. Se disponível, a proteína purificada ou epítopo alvo pode ser usado para avaliar a especificidade; no entanto, ainda é importante avaliar o potencial sinal específico em proteínas totais provenientes do sistema de modelo.
2) em seguida, a gama dinâmica do ensaio precisa ser determinado. Em uma situação ideal, duplicação de sinal (medido usando a área do pico) é observada como a concentração da amostra é duplicada; no entanto, na prática, uma mudança proporcional no sinal de entrada de forma previsível (por exemplo, linear caber) é suficiente para quantificação de proteína. Além disso, essa otimização irá definir a concentração de proteína com sinal elevado, mas ainda dentro da escala linear para o modelo experimental.
3) determine a concentração de anticorpo usando a concentração de proteína fixo escolhida na etapa de otimização 2. À medida que aumenta a concentração de anticorpos, o sinal aumenta até que platôs na saturação. Uma concentração de anticorpo perto deste nível de saturação é necessária para a medição da concentração da proteína.
O processo usado para otimizar as concentrações de proteína, diluições de anticorpo e tempos de exposição para um ensaio de automatizado baseado em capilar tamanho6 é demonstrado utilizando extratos de células inteiras isolados de BEAS-2B, um humano transformado SV-40 brônquico linhagem de células epiteliais. Isolamento da proteína de extratos de células ou tecidos pode ser realizado usando um número de protocolos publicados7,8,9 e não será coberto aqui. Resultados de um experimento experimental usando as condições otimizadas são também relatados para total e fosforilados (serina 15, serina 20) p53 em culturas expostos a doxorrubicina (um comum agente quimioterapêutico que induz a apoptose de células10) em 1.2, 1.8, e mídia de 2,4 µ g/mL para 4 h antes da colheita. As áreas de pico de p53 são normalizadas para ɑ-tubulina, que é usado como um controle de carregamento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wes instrument</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td>004-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P53 DO-1 primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-tubulin primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873</td>
			<td>used as a loading control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass Software</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td></td>
			<td>provided with the Wes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-230 kDa Master kit</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)&#160;</td>
			<td>PS MK02 (since replaced by a new kit #)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</td>
			<td>INCLUDES PART NO: 
			Wash Buffer (60 mL) 042-202 
			10X Sample Buffer (440 &#956;L) 042-195 
			Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 
			Capillary Cartridges (8) PS-CC01 
			Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 
			Luminol-S (1.5 mL) 042-233 
			Peroxide (1.5 mL) 042-234 
			Streptavidin-HRP (132 &#956;L) 042-414 
			Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 
			Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 
			or 
			Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte growth medium, KGM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192152</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte basal medium, KBM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192151</td>
			<td>serum free medium for chemical dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue Bradford Assays</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>23200</td>
			<td>for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Extract kit</td>
			<td>Active Motif (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D1515</td>
			<td>used to prepare whole cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>INCLUDES:</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lysis Buffer AM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M dithiothreitol (DTT)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X PBS&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method

Novas tecnologias que utilizam os imunoensaios baseados em capilar prometem avaliação mais rápida e mais quantitativa de proteínas em comparação com os imunoensaios tradicionais. No entanto, semelhante a outros ensaios de proteína baseada em anticorpos, otimização dos parâmetros de imunoensaio baseado no capilar, tais como a concentração de proteína, anticorpo diluição e tempo de exposição é um requisito importante para a geração de significativos e confiáveis dados. Medições devem cair dentro da escala linear do ensaio onde as alterações no sinal são diretamente proporcionais às mudanças na concentração de lisado. O processo de escolha de concentrações adequadas de lisado, diluições de anticorpo e tempos de exposição na linha de células epiteliais brônquicas humanas, BEAS-2B, é demonstrado aqui. Ensaio de linearidade é mostrada em um intervalo de concentrações de proteína de extrato celular com anticorpos p53 e α-tubulina. Um exemplo de burnout sinal é visto as concentrações mais elevadas com longos tempos de exposição, e uma curva de diluição do anticorpo de α-tubulina é mostrada demonstrando a saturação. Além disso, resultados experimentais de exemplo são relatados para células tratados com doxorrubicina usando parâmetros otimizados.

Tempo de exposição - Neutralização de sinal de determinação
Neutralização de sinal pode ocorrer quando o substrato de luminol e peróxido é esgotado muito rapidamente. Isto pode ser determinado examinando-se os dados em tempos de exposição diferentes de quimioluminescência. O software de análise, vá para "Editar – &#62; análise – &#62; imagens". As exposições variam de 5 a 480 s. O eixo y em um electroferograma relata sinal/hora, assim que os dados de cada exposição devem ter um coeficiente de sinal/hora semelhante. Este coeficiente diminui com exposições sequencialmente mais longas se luminol torna-se empobrecido, como pode ser visto com o anticorpo DO-1 de p53 (Figura 2). Por causa da depleção de substrato, este ensaio pode ser considerado mensurável até a 0,2 µ g / µ l concentração somente em exposições de s o 5-30. Portanto, no presente exemplo, 15 s estava determinado a ser o tempo de exposição de análise de dados ideal para p53.
Lisado titulação - Determinar a gama dinâmica linear
É importante que medidas sejam tomadas dentro do intervalo dinâmico linear de cada ensaio, onde as alterações no sinal medido pela área do pico são proporcionais às mudanças na quantidade de proteína na amostra. Usando o tempo de exposição ideal dos 15 escolhidos s na seção anterior, o ensaio de linearidade é demonstrada para p53 e ɑ-tubulina sobre maior do que um 15-fold intervalo de concentração (Figura 3). Em nossa experiência, um valor de2 R de &#62; 0.9 de uma regressão linear caber é considerado de aceitável para uma escala de diluição da proteína purificada de uma quantidade conhecida (se o ensaio é uma medida quantitativa absoluta) ou amostra a lisado de proteína alvo desconhecido (se ensaio é uma medida quantitativa relativa).
Otimização de diluição de anticorpo
Usando anticorpos em concentrações de impregnação ajuda a garantir que quaisquer alterações de sinal medidas são devidas somente às mudanças na quantidade de proteína. Como demonstração, duas linha de celular BEAS-2B toda célula extrai (0,2 µ g / µ l da proteína total carregado no ensaio) foram analisados com concentrações de anticorpos ɑ-tubulina serialmente diluída que variam de 01:25 - 1:800 (Figura 4). Sinal quimioluminescente (aqui, medida como a área do pico) foi plotada contra a diluição do anticorpo. Observou-se a saturação perto as 01:50 diluição onde a curva começa um platô perceptível.
Julgamento experimental - tratamento de doxorrubicina em células de BEAS-2B
Usando as condições de ensaio otimizado, cultura de células de BEAS-2B foi tratada com três diferentes concentrações de doxorrubicina (1.2, 1.8 e 2.4 µ g/mL) para 4h (Figura 5, tabela 1). Ativação de p53 através de modificações borne-translational Medeia diversas respostas celulares, incluindo a detenção do ciclo celular, senescência e apoptose12. Especificamente, a fosforilação da serina 15 tem sido atribuída a ativação transcricional de p53, resultando na apoptose depois de doxorrubicina tratamento13. Nesta demonstração, ɑ-tubulina normalizado pico áreas são apresentadas como dobra de controle. Curiosamente, 3.5 a 4-fold um aumento da fosforilação de p53 em serina aumentos de 15 e 2 vezes no nível de p53 phosphorylated em serina 20 foram observados após exposição de 4h a doxorrubicina. Estes resultados indicam que a ativação do p53; no entanto, nenhuma dose-resposta é visto para as concentrações escolhidas (por outro lado, a menor dose testada suscitou a resposta mais alta). P53 total não demonstrou uma resposta clara de tratamento neste sistema de modelo. Observamos anteriormente ativação da fosforilação de p53 na ausência de aumento dos níveis de p53 total em condições similares em zinco-Tratado de células 2B BEAS14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3.jpg"> 
Figura 2 . Comparação de imagens de exposição para detectar o sinal de estresse. Lane exibições mostrar diminuindo as concentrações de proteína para BEAS-2B lysates sondado com p53 DO-1 anticorpo a uma diluição de 1: 500. Coeficientes de sinal de quimioluminescência, relatados como alturas ou no software do instrumento, são sobrepostos. Ao contrário as alturas, as intensidades de banda visual automaticamente são geradas e ajustadas pelo instrumento para auxiliar a visualização das bandas e são não comparável de um painel para outro. Note a diminuição do sinal de quimioluminescência aumentos de tempo de exposição, com o sinal começa a desaparecer (divisão pico) para as duas exposições mais longas, indicando depleção de substrato. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3.jpg"> 
Figura 3 . Lisada titulação mostrando os pontos de vista da pista. Lisado titulação mostrando a lane exibições (A) do lisado quando analisados com 1: 500 p53 DO-1 ou 01:50 ɑ-tubulina BEAS-2B. Ao contrário os valores de área do pico, as intensidades de banda visual são automaticamente geradas e ajustadas pelo instrumento para auxiliar a visualização das bandas e são não comparável de um painel para outro. Análise de regressão linear (B) confirma que os ensaios são lineares ao longo de toda a gama testada, de 0,01 a 0,20 µ g / µ l e 0,025 para 0,40 µ g / µ l, com valores de R2 de 0.999 e 0.985, respectivamente. As concentrações de proteína total no meio do intervalo linear foram escolhidas para acomodar variação de proteína alvo potencial em qualquer direção (por exemplo, 0,2 µ g / µ l para α-tubulina). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig4.jpg"> 
Figura 4 . Diluição de anticorpo α-tubulina curvas para dois separados BEAS-2B proteína lysates com e sem normalização da linha de base. Um definitivo Departture de linearidade é visto a 01:50 (0,02) diluição, indicando a saturação. 01:50, portanto, foi escolhida como a diluição ideal para este anticorpo. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55911/55911fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig5.jpg"> 
Figura 5. Efeito do tratamento com doxorrubicina (Glauce) 4h no total e serina fosforilado expressão de proteína p53 de células BEAS-2B. Áreas de pico são normalizadas para α-tubulina e plotadas como dobra de controle (CTL). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55911/55911fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55911/55911tbl1.jpg"> 
Tabela 1. Efeito do tratamento com doxorrubicina (Glauce) 4h no total e serina fosforilado expressão de proteína p53 de células BEAS-2B. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55911/55911tbl1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.</a>

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Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Um imunoensaio baseado no capilar, usando uma plataforma comercial para medir as proteínas alvo de preparações de proteína total é demonstrado. Além disso, o ensaio parâmetros de tempo de exposição, concentração de proteína e diluição de anticorpo são otimizados para um sistema de modelo de cultura de células.

Procedimento e estratégias de otimização de chave para um método automatizado capilar imunoensaio eletroforética com base em

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

procedure-key-optimization-strategies-for-an-automated-capillary

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K visualizações.  U.S. Environmental Protection Agency. Um imunoensaio baseado no capilar, usando uma plataforma comercial para medir as proteínas alvo de preparações de proteína total é demonstrado. Além disso, o ensaio parâmetros de tempo de exposição, concentração de proteína e diluição de anticorpo são otimizados para um sistema de modelo de cultura de células.

Vídeo: Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

Otimização da Reação UGI Usando Síntese Paralela e manipulação de líquidos Automated

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Biologia

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of microbiology was transformed with the advent of Anton van Leeuwenhoek&#39;s microscope, which allowed scientists to visualize prokaryotes for the first time. The development of the polymerase chain reaction (PCR) is one of those innovations that changed the course of molecular science with its impact spanning countless subdisciplines in biology. The theoretical process was outlined by Keppe and coworkers in 1971; however, it was another 14 years until the complete PCR procedure was described and experimentally applied by Kary Mullis while at Cetus Corporation in 1985. Automation and refinement of this technique progressed with the introduction of a thermal stable DNA polymerase from the bacterium Thermus aquaticus, consequently the name Taq DNA polymerase.
PCR is a powerful amplification technique that can generate an ample supply of a specific segment of DNA (i.e., an amplicon) from only a small amount of starting material (i.e., DNA template or target sequence). While straightforward and generally trouble-free, there are pitfalls that complicate the reaction producing spurious results. When PCR fails it can lead to many non-specific DNA products of varying sizes that appear as a ladder or smear of bands on agarose gels. Sometimes no products form at all. Another potential problem occurs when mutations are unintentionally introduced in the amplicons, resulting in a heterogeneous population of PCR products. PCR failures can become frustrating unless patience and careful troubleshooting are employed to sort out and solve the problem(s). This protocol outlines the basic principles of PCR, provides a methodology that will result in amplification of most target sequences, and presents strategies for optimizing a reaction. By following this PCR guide, students should be able to: 
 
&#9679; Set up reactions and thermal cycling conditions for a conventional PCR experiment 
&#9679; Understand the function of various reaction components and their overall effect on a PCR experiment 
&#9679; Design and optimize a PCR experiment for any DNA template 
&#9679; Troubleshoot failed PCR experiments

PCR has emerged as a common technique in many molecular biology laboratories. Provided here is a quick guide to several conventional PCR protocols. Because each reaction is a unique experiment, optimal conditions required to generate a product vary. Understanding the variables in a reaction will greatly enhance troubleshooting efficiency, thereby increasing the chance to obtain the desired result.

Reação em Cadeia da Polimerase: Protocolo Basic Plus Estratégias de solução de problemas e otimização

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

Spatial Multiobjective Optimization of Agricultural Conservation Practices using a SWAT Model and an Evolutionary Algorithm

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals across the landscape is of primary importance in watershed management. Traditional economics methods of finding the lowest-cost solution in the watershed context (e.g.,5,12,20) assume that off-site impacts can be accurately described as a proportion of on-site pollution generated. Such approaches are unlikely to be representative of the actual pollution process in a watershed, where the impacts of polluting sources are often determined by complex biophysical processes. The use of modern physically-based, spatially distributed hydrologic simulation models allows for a greater degree of realism in terms of process representation but requires a development of a simulation-optimization framework where the model becomes an integral part of optimization.
Evolutionary algorithms appear to be a particularly useful optimization tool, able to deal with the combinatorial nature of a watershed simulation-optimization problem and allowing the use of the full water quality model. Evolutionary algorithms treat a particular spatial allocation of conservation practices in a watershed as a candidate solution and utilize sets (populations) of candidate solutions iteratively applying stochastic operators of selection, recombination, and mutation to find improvements with respect to the optimization objectives. The optimization objectives in this case are to minimize nonpoint-source pollution in the watershed, simultaneously minimizing the cost of conservation practices. A recent and expanding set of research is attempting to use similar methods and integrates water quality models with broadly defined evolutionary optimization methods3,4,9,10,13-15,17-19,22,23,25. In this application, we demonstrate a program which follows Rabotyagov et al.'s approach and integrates a modern and commonly used SWAT water quality model7 with a multiobjective evolutionary algorithm SPEA226, and user-specified set of conservation practices and their costs to search for the complete tradeoff frontiers between costs of conservation practices and user-specified water quality objectives. The frontiers quantify the tradeoffs faced by the watershed managers by presenting the full range of costs associated with various water quality improvement goals. The program allows for a selection of watershed configurations achieving specified water quality improvement goals and a production of maps of optimized placement of conservation practices.

This work demonstrates an integration of a water quality model with an optimization component utilizing evolutionary algorithms to solve for optimal (lowest-cost) placement of agricultural conservation practices for a specified set of water quality improvement objectives. The solutions are generated using a multi-objective approach, allowing for explicit quantification of tradeoffs.

Otimização Multiobjetivo espacial das práticas agrícolas de conservação, utilizando um modelo SWAT e um algoritmo evolutivo

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: um plugin ImageJ para semi-automatizado de medição forma de folha

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Um método de quantificação sensível e específico para Determinação do Serum miosina cardíaca Binding Protein-C por Imunoensaio electroquimioluminescência

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Um método inovador para exossomo Quantificação e Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Preparação da grade microscópica crio-elétron para estudos resolvidos pelo tempo usando um novo sistema robótico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

Estratégias de Otimização da Aquisição de Dados de Tomografia Eletrônica Criogênica

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

Detecção em Tempo Real da Produção de Espécies Reativas de Oxigênio na Resposta Imune em Arroz com Ensaio de Quimioluminescência

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Coletando hemolinfa de pequenos artrópodes

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus transmission. Hemolymph collection is the basic technology for studying virus-vector interactions. Here, we describe a novel and simple method for the quantitative collection of hemolymph from small arthropods using Laodelphax striatellus (the small brown planthopper, SBPH) as a research model, as this arthropod is the main vector of rice stripe virus (RSV). In this protocol, the process begins by gently pinching off one leg of the frozen arthropod with fine-tipped tweezers and pressing the hemolymph out of the wound. Then, a simple micropipette consisting of a capillary and a pipette bulb is used to collect the transudative hemolymph from the wound according to the principle of capillary forces. Finally, the collected hemolymph can be dissolved into a specific buffer for further study. This new method for collecting hemolymph from small arthropods is a useful and efficient tool for further research on arboviruses and vector-virus interactions.

Autor em destaque: um método preciso e quantificável para coletar hemolinfa de pequenos artrópodes  

We describe a method to collect quantifiable hemolymph efficiently from small arthropods for subsequent analysis.