This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.

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The authors have nothing to disclose.

Os passos mais críticos no protocolo são: 1) manter com sucesso a tumorigenicidade da linha celular; 2) assegurando a secreção PSA mensurável antes da implantação de células tumorais em camundongos; 3) a geração de uma suspensão de uma única célula para o implante, de modo a reduzir a variação no tamanho do tumor; e 4) células instilar a uma velocidade lenta para evitar o refluxo vesico-ureteral, resultando na implantação de células de tumor no rim. Após passagem prolongada in vitro, as células MB49 / MB49-PSA podem perder a sua tumorigenicidade, como demonstrado pela sua incapacidade para produzir tumores em ratinhos. Isto poderia ser um factor de confusão quanto a se ou não os ratinhos foram curados após a terapia. Na ausência de tumores, não é possível diferenciar os ratinhos curados por terapia de ratinhos curados espontaneamente devido a tumores imunogénicos ou a partir de ratos com tumores não em todos, porque a linha de células é incapaz de formar tumores. Uma forma de contrariar esta é a re-passagem, as células em camundongos através da produção de sutumores b-cutânea. Se este re-passaging é realizada com muita frequência, os tumores extremamente agressivos são gerados. Um bom equilíbrio é necessário para determinar quando as células precisam ser re-passadas. De um modo geral, antes de uma grande série de experiências, a linha celular é ressuscitado e, em seguida, implantada por via subcutânea em ratos para confirmar a sua capacidade para formar tumores. Os tumores são monitorizados durante várias semanas para garantir que não existem curas espontâneas. No entanto, se são observadas curas espontâneas, em seguida, o protocolo no passo 3 deve ser realizada. Do mesmo modo, a capacidade das células MB49-PSA para produzir PSA deverá sempre ser confirmado antes de as células são utilizadas para a implantação do tumor. PSA urinária pode ser utilizado para monitorizar o crescimento de tumores da bexiga estabelecida usando células MB49-PSA. No entanto, um valor de PSA negativo ou &quot;normal&quot; urinário não significa necessariamente ausência de células tumorais, mas apenas que menos do que 1 x 10 5 células estão presentes. Como PSA urinária é determinada por volta do dia 4ao dia 7, os ratinhos que parecem ter nenhum tumor, com base no valor do normal ratinhos + 3 SD, pode ser removida a partir da experiência. Alguns destes ratos pode desenvolver um tumor numa data posterior. Removendo ratos com tumores não garante que os tumores são muito semelhantes em tamanho antes de iniciar qualquer tratamento. Isto reduz a variação devido ao tamanho do tumor em resposta à terapia. Uma das principais causas de variação do tamanho do tumor é a aglomeração de células antes da implantação, para que os esforços devem ser feitos para voltar a suspender as células antes da implantação. No entanto, quando são utilizadas pequenas quantidades de ratinhos, pode ser necessário para manter todos os ratinhos no estudo, mesmo se os tumores não são mensuráveis ​​por dia 4 - 7. Ao monitorizar PSA no dia 11, pode ainda ser possível classificar estes ratinhos como tendo tido tumores pequenos, e análise do ponto final pode ser executada no que diz respeito ao tamanho do tumor inicial (com base na presença de PSA urinária mensurável nos dias 4 - 7 versus dia 11). A vantagem de ser capaz de quantificar tumorescom diferentes valores de PSA é que todos os ratinhos podem ser incluídos no estudo, e a resposta ao tratamento pode ser determinado com base nos seus valores de PSA / creatinina no que diz respeito ao tamanho original do tumor. Outro ponto de preocupação é o refluxo vesico-ureteral. Isto pode resultar no desenvolvimento de tumores nos rins. Reduzir o volume a ser instilado a partir de 100 ul e 50 ul e realizar a instilação lentamente reduz a probabilidade de isso acontecer. Um problema associado com os ensaios à base de urina é a recolha de urina reduzida observada como tumores ortotópicos crescer na bexiga. Enquanto urina pode facilmente ser recolhidos a partir de ratinhos durante as primeiras poucas semanas após a implantação, com o tempo, o volume de urina recolhida podem não ser suficientes para PSA e creatinina medições. O volume mínimo necessário de urina é 110 uL, mas quanto mais, melhor. Assim, as leituras de PSA pode não estar disponível para todos os ratos em momentos posteriores. Além disso, a lise de células vermelhas do sangue na urina dá falsamentealta leitura no ELISA PSA. Um ensaio não baseados em urina pode superar este problema. Infelizmente, porém imagens de fluorescência é simples de usar, descobrimos que a alimentação do rato tinha fluorescência vermelha também. Isto deu um fundo elevado contra o qual a bexiga não poderia ser facilmente visto. É possível que a utilização de um corante fluorescente verde, ou proteínas pode ultrapassar este problema, tal como descrito por Sweeney et ai. 10 Para ambos fluorescência e de ultra-sons, os ratos necessitam de ser raspado na superfície ventral. imagens de ultra-som parece ser tão bom como a expressão do gene PSA na localização de tumores. No entanto, a desvantagem de imagens ultra-sónicas é que a bexiga deve ser distendida durante a imagem para obter uma boa visualização do tumor. Enquanto as imagens são claras quando o tumor da bexiga é grande, é difícil diferenciar pequenos tumores em ratinhos a partir da ausência de tumores. Tem sido relatado que o ultra-som pode detectar tumores de cerca de 1,5 mm de diâmetro de 22, mas no dia 4após a implantação, os tumores são muito menores do que este. Assim, este método não pode ser bom para a detecção de tumores no dia 4. A Tabela 1 compara os sistemas de monitorização de tumor diferentes 3; o ELISA PSA é o mais simples de usar e não requer sistemas de imagem pequenos animais, que podem não estar disponíveis em todas as instalações para animais. Dada a maior sensibilidade da análise em tempo real de PCR da expressão do gene de PSA, pode ser utilizado no lugar de imuno-histoquímica para confirmar se os ratinhos foram curadas quando a experiência foi terminada. Com imuno-histoquímica, um tumor de 0,2 - 0,3 milímetros é detectável por dia 4 após o implante 15. No entanto, este é um método de análise de ponto final, que não pode ser usado para monitorar a implantação do tumor. Neste estudo, a IRM não foi avaliada, mas tem sido relatado para ser capaz de identificar a presença de tumores no dia 10 após a implantação 8. Ao modificar as células para expressar a proteína fluorescente verde (GFP), que ié possível confirmar a implantação do tumor por dia 7. Uma combinação de PSA urinária cedo para detectar a implantação do tumor e a análise por PCR em tempo real na terminação proporciona a confirmação de implantação do tumor e eficácia terapêutica entre os diferentes grupos de tratamento. Uma desvantagem do nosso protocolo é, principalmente, que o ensaio de ELISA não pode confirmar a presença de tumores, quando o número de células presentes é inferior a 10 5 células. Assim, os ensaios mais sensíveis têm de ser desenvolvido, bem como os ensaios mais rápidos para reduzir o tempo necessário para a detecção de PSA. ELISA leva várias horas para executar. Um método rápido, tais como o ensaio de creatinina, que é baseado no método de Jaffe 23 e demora cerca de 5 minutos para executar iria simplificar consideravelmente o controlo do crescimento do tumor. Para este efeito, foi avaliado um método à base de enzima para detectar a actividade de PSA, mas não foi bem sucedida. O uso do ouro coloidal e sistemas de ensaio à base de nanopartículas poderia reduzir o tempo necessário para realizar o ensaio de umND 24 aumentar a sensibilidade. A este respeito, os sensores de eléctrodos de base e sensores baseados electroquímicos que utilizam nanopartículas têm sido desenvolvidos para ensaio de PSA humano 25-27 e se o custo é razoável pode ser aplicável para o modelo animal. O sistema de ensaio pode também ser melhorada pela utilização de um sistema de secreção de proteína diferente tal como GFP ou luciferase em que o ensaio é realizado sob condições óptimas in vitro, em vez de depender de imagiologia in vivo, que é dependente da oxigenação dos tecidos. Enquanto a carcinogénese química em ratinhos com tumores gera semelhança com cancros humanos em termos de mutações 28, que levam mais tempo para produzir e não são de dimensão comparável entre os animais, requerendo grandes números de ratinhos que aumenta o custo de experimentação. Quando os agentes que reconhecem proteínas humanas alvo estão a ser avaliados, xenoenxertos humanos implantados subcutaneamente no imunodeficiência combinada nu ou grave(SCID) é a única opção. Embora estes modelos fornecer uma prova de conceito de reconhecimento do anticorpo, a falta de um sistema imunitário intacto impede a avaliação da activação imunitária. O recente desenvolvimento de um modelo humanizado de rato para câncer de bexiga utilizando xenoenxertos humanos 29, não fornecer alguns insights imunes, mas como células são implantadas por via subcutânea, que na verdade não recapitular o ambiente doença humana. É tecnicamente difícil produzir tumores ortotópicos em ratinhos imunodeficientes. Assim, o modelo ortotópico singênico apesar das suas limitações ainda é um bom modelo para a avaliação e desenvolvimento da terapia para câncer da bexiga, uma vez que fornece a localização do tecido correto permitindo exposição controlada à terapia modelagem da situação clínica e a capacidade de avaliar o impacto das células imunitárias do hospedeiro durante a terapia do cancro. Tudo isso combinado com o desenvolvimento do tumor em ratos rápida ea capacidade de monitorar os resultados do crescimento do tumor em um modelo rentável.

O objetivo deste método é gerar tumores de bexiga murino ortotópico e monitorar os tumores implantados mais exacta possível, de modo que os ratos sem a implantação do tumor não são pensados ​​para ter sido curado a análise de ponto final. Em geral, o método mostrado irá reduzir a necessidade de grandes números de ratinhos para análise experimental e assegurar uma maior precisão na determinação dos resultados terapêuticos. O desenvolvimento de um modelo ortotópico de câncer é importante, como células tumorais implantando subcutânea não recapitular o ambiente da doença clínica ou permitir o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. A arquitectura da bexiga permite a instilação de terapias do cancro da bexiga directamente na bexiga com efeitos sistémicos mínimos. Assim, os modelos animais que recapitulam neste ambiente, tais como um modelo ortotópico, são importantes para avaliar novas terapias. As conclusões tiradas a partir de qualquer experimental set-up são dependenT sobre as limitações do modelo. Diversas técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de tumores da bexiga ortotópico em murganhos. Estes dependem danificar a camada de glicosaminoglicano da bexiga, permitindo que as células tumorais a ser implantado. As técnicas utilizadas incluem a electrocauterização, o que resulta em um único ponto de dano na parede da bexiga, conduzindo ao desenvolvimento de tumores em um local na bexiga 1,2. No entanto, a taxa de sucesso da implantação do tumor usando electrocauterização é dependente do operador variando de 10 - 90%, e inclui o risco de que a parede da bexiga será perfurado, levando a desenvolver tumores na cavidade peritoneal. Cauterização química é realizada utilizando nitrato de prata, que danifica a parede da bexiga 3. Da mesma forma, o ácido foi utilizado para danificar a parede da bexiga 4. A tripsina também tem sido utilizado para danificar a bexiga, bem 5. Estes métodos podem resultar no desenvolvimento de mais de um tumor na bexiga.Além disso, existe o perigo de danos graves para a bexiga se os produtos químicos são deixados em contacto com a parede da bexiga por muito tempo. O método desenvolvido por Ninalga et ai. utiliza o poli-L-lisina carregada positivamente (PLL) 6 moléculas para o revestimento da parede da bexiga; isso permite que as células tumorais carregadas negativamente para furar a camada de glicosaminoglicanos da bexiga. Este método resulta geralmente em mais do que um tumor em desenvolvimento na bexiga, mas a implantação do tumor é a 80 - 100% 4,7. Tecnicamente, é também o processo mais fácil de executar. Para assegurar que os tumores que se desenvolvem são bastante uniforme em tamanho, é importante que as células tumorais não são agrupados em grandes aglomerados antes do implante. A fim de avaliar a eficácia terapêutica, é melhor para realizar este estudo em ratos com tumores bastante de tamanho semelhante. Assim, um sistema de detecção de boa que pode quantificar o tamanho do tumor logo após o implante é importante. Várias estratégias têm a abelhaN utilizado para avaliar tumores. Estes incluem a imagiologia por ressonância magnética (MRI) de 8-10, de fluorescência 11, bioluminescência 12,13, ultra-sons 14, e ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) 15,16. Enquanto ressonância magnética e ultra-som não requerem modificações de células tumorais, existe uma necessidade de equipamentos e agentes de contraste para ressonância magnética sensíveis. Os ensaios fluorescence-, luminescence-, e baseado em ELISA exigir a modificação das células tumorais para expressar proteínas marcadoras que podem ser detectados por estes métodos. Para luminescência, um substrato é necessária para a detecção da actividade de luciferase; Assim, existe um passo adicional e aumento de custo. Ambos luminescência e fluorescência requerem equipamento especializado. Para produzir fluorescência, proteína fluorescente verde (GFP) ciclização, a qual é catalisada por oxigénio molecular, é necessária. Assim, a expressão GFP pode ser variável dentro de uma massa tumoral dependendo do acesso ao oxigênio, tornando este um marcador pouco fiável <sup&gt; 17. Modificação da linha de células de cancro da bexiga murino MB49 a secretar próstata humana Specific Antigen (PSA) 15,16 como um marcador substituto é outra estratégia. Esses marcadores também fornecem um meio alternativo de confirmar a presença do tumor no final da experiência, tornando-os uma alternativa à imuno-histoquímica. Este estudo relata o método PLL de implantação do tumor ortotópico e apresenta uma comparação de sistemas de detecção de tumor, isto é, ELISA, a fluorescência, e ultra-sonografia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="893">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:404px;">MB49-PSA cells</td>
			<td style="width:188px;">N/A</td>
			<td style="width:188px;">N/A</td>
			<td style="width:113px;">ref (Wu QH, 2004)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">RPMI 1640 media</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) media</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fetal Bovine Serum (FBS) South American</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S181B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30088.03&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">L-glutamine</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>X0550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hygromycin B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">free PSA (Human) ELISA kit</td>
			<td>Abnova</td>
			<td>KA0209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TRIzol Reagent for RNA extraction&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4374967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TaqMan Gene Expression Assay &#8211; Mouse Actb</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Mm00607939_s1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TaqMan Gene Expression Assay &#8211; Human KLK3</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Hs00426859_g1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">C57BL/6J female mice</td>
			<td>In Vivos</td>
			<td></td>
			<td>4-6 wk old</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine)</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reversal drug (1mg/kg Atipamezole)</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ear punch</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72893-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hartmann&#39;s solution or Compound sodium lactate</td>
			<td>B Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat pack - HotHands handwarmers</td>
			<td>Heatmax Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Introcan Certo IV catheter</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>4251300</td>
			<td>24G x 3/4&#8243;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Aquagel Lubricating jelly</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">&#160;Poly-L-lysine solution, 0.01%,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Quantichrom Creatinine Assay Kit</td>
			<td>BioAssay Systems</td>
			<td>DICT-50&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fluorescent dye - VivoTrack 680</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEV12000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4427575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Equipment and Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">7500 Realtime PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">7500 Software v2.3</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Metabolic Cage</td>
			<td>Tecniplast&#160;</td>
			<td>Vertical type rack for 12 cages</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">BD FACSCanto I system&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">BD FACSDiva software v7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IVIS SpectrumCT in vivo imaging system&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Living Image Software v3.1</td>
			<td>Caliper Life Sciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vevo 2100 imaging system&#160;</td>
			<td>VisualSonics&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine orthotopic bladder tumor model and tumor detection system

Este protocolo descreve a geração de tumores da bexiga em ratos C57BL / 6J ratinhos fêmea, utilizando a linha celular de cancro da bexiga de murino MB49, que foi modificado para secretar humano Antigénio Específico da Próstata (PSA), e o procedimento para a confirmação da implantação do tumor. Em resumo, os ratos são anestesiados usando drogas injectáveis ​​e são feitos para colocar na posição dorsal. A urina é desocupado da bexiga e 50 ul de poli-L-lisina (PLL) é instilada lentamente a uma taxa de 10 mL / 20 s utilizando um cateter de 24 g IV. É deixado na bexiga durante 20 minutos por tapando o cateter. O cateter é retirado e PLL é desocupado por uma leve pressão sobre a bexiga. Isto é seguido por instilação da linha celular de cancro da bexiga de murino (1 x 10 5 células / 50 ul) a uma taxa de 10 mL / 20 s. O cateter é tapado para evitar a evacuação prematura. Após 1 h, os ratinhos são reavivado com uma droga inversão, e a bexiga está desocupado. A taxa de instilação lenta é importante,uma vez que reduz o refluxo vesico-ureteral, o que pode causar tumores a ocorrer no tracto urinário superior e nos rins. A linha de células deve ser bem re-suspensa para reduzir a aglutinação de células, como esta pode levar à tamanhos irregulares após a implantação do tumor. Esta técnica induz tumores com alta eficiência. O crescimento do tumor é monitorizado pela secreção urinária PSA. monitorização PSA marcador é mais fiável do que o ultra-som ou de imagem de fluorescência para a detecção da presença de tumores na bexiga. Os tumores em ratinhos geralmente atingem um tamanho máximo que afeta negativamente a saúde em cerca de 3-4 semanas, se deixados sem tratamento. Ao monitorizar o crescimento do tumor, é possível diferenciar os ratinhos que estavam curados do que aqueles que não foram implantadas com sucesso com tumores. Com a análise de ponto final, apenas, o último pode ser assumida por engano ter sido curado por terapia.

a secreção de PSA a partir de células MB49 foi encontrada a variar com o meio de crescimento. MB49-PSA é cultivada em meio DMEM, porque isto resulta em aumento da secreção de PSA (Figura 1A). A fim de determinar a sensibilidade do PSA ELISA e PCR em tempo real, os diferentes números de MB49-secretoras de PSA células foram misturadas com células parentais MB49. PSA ELISA detecta um mínimo de 1 x 10 5 células secretoras de PSA / 1 x 10 6 células (Figura 1B), enquanto que a análise por PCR em tempo real 100 detecta células secretoras de PSA / 1 x 10 6 células (Figura 1C). Assim, PCR em tempo real é mais sensível do que o teste ELISA, mas só pode ser realizado em toda a bexiga. Isto limita a sua utilidade para a análise de ponto final. O método de PLL resultados implantação do tumor em vários tumores (Figura 2a) em desenvolvimento na bexiga. Ambos coleção durante a noite de urina utilizando gaiolas metabólicas (Figura 2B </stRong&gt;, painel superior) e amostras isoladas de urina (Figura 2B, painel inferior) pode ser usado para medir de PSA por meio de ELISA. Para todos os estudos animais, o peso do rato é observado como uma medida de saúde (figura 2C, painel superior), e PSA urinária é monitorizado numa base semanal (figura 2C, painel inferior) como uma medida de crescimento do tumor. Geralmente, há uma boa correlação entre o peso do rato e o tamanho do tumor, tal como medido por PSA. Os ratos com tumores grandes começar a perder peso (Figura 2C, os ratos 3 e 5). Alguns ratos observados na Figura 2C pode ter um grande tumor mas ainda exibe um peso corporal normal. Assim, de peso corporal por si só não é suficiente uma medida do crescimento do tumor. PSA serve como um bom marcador substituto do crescimento do tumor (Figura 3A-D). Os ratos foram sacrificados cerca de 3-5 dias após a análise de urina para PSA no dia 14. As imagens das secções transversais da bexiga mostrar o tamanho do tumor ea correspondente dia 14 de PSA / creatinina x 10 6 reading. A variação do tamanho do tumor está relacionado com o tratamento os ratinhos receberam. Figura 3, painéis AD representam camundongos a partir de 3 diferentes braços de tratamento. Uma estratégia alternativa para a modificação de células de PSA é a marcação das células com um corante. Esta estratégia elimina a necessidade de transformação celular e selecção. A marcação de células MB49-PSA com um corante fluorescente é de fácil execução (Figura 4A), e na monitorização in vitro mostrou-se promissor em termos de sobrevivência do sinal, apesar de replicação celular (Figura 4B e C). No entanto, imagiologia in vivo não foi bem sucedida, porque a alimentação de rato também tinha fluorescência vermelho natural (Figura 4D), o que resultou na fluorescência não específica na região abdominal. Uma comparação foi feita entre a imagem de ultra-som, a secreção urinária PSA, e análise de ponto final de PSA. A ultra-sonografia da bexiga (Figura 5A-H) foi bom para a identificaçãotumores grandes, mas não foi tão bem sucedida com tumores pequenos. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55078/55078fig1.jpg" /> Figura 1. PSA secreção das células MB49-PSA ea determinação dos limites de detecção utilizando ELISA e análise em tempo real PCR. (A) 1 x 10 6 MB49-PSA células foram cultivadas em diferentes meios de cultura, e a secreção de PSA no sobrenadante foi detectado 2 dias mais tarde por meio de ELISA. Os meios de crescimento foram: meio RPMI com FBS- (RPMI), RPMI com FBS premium (RPMI (P)), RPMI com FBS a um alternativos (RPMI (H)), e DMEM com FBS (DMEM). células MB49-PSA cultivadas em meio DMEM com secreção PSA superior. Células MB49-PSA (10 6 células para 1 célula) (B) foram misturados com as células parentais MB49 (1 célula para 10 6 células) e plaquearam-se durante 24 h. PSA ELISA foi realizado no sobrenadante, e o ARN foi extraído a partir das células. Um mínimo de 1 x 10 5 </sup&gt; Células / 1 x 10 6 células secretoras de PSA eram detectáveis por ELISA. (C) 100 células secretoras de PSA / 1 x 10 6 células eram detectáveis por análise por PCR em tempo real. Os valores do eixo Y representa a média de RQ (quantificação relativa) ± desvio padrão. Valores RQ são mudanças vezes relativamente, obtidos através da normalização valores C T de PSA para gene da beta actina e em comparação com uma bexiga de controle que está fixada em 1. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55078/55078fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55078/55078fig2.jpg" /> Figura 2. bexiga crescimento do tumor e de detecção. (A) O exame histológico de uma bexiga de 13 dias após a implantação do tumor. A bexiga embebido em parafina foi seccionado e corado com hematoxilina (azul escuro), que stains os núcleos, e eosina (rosa), que mancha os componentes celulares restantes. O PSA / creatinina x 10 6 para este valor da bexiga nos dias 5 e 13 são mostradas como 7/2688. A ampliação é de 44.8X. A barra de escala representa 1 mm. (B) A urina foi coletada por qualquer ratos colocando em gaiolas metabólicas durante a noite e transferir a urina do tubo de coleta em 2 tubos mL (painel superior) ou pelo on-the-spot coleta de urina de ratos anestesiados (painel inferior) em tubos de 1,5 mL , que foram então transferidas para tubos de 0,6 mL. (C) após a implantação do tumor, peso ratinhos foi monitorizado duas vezes por semana (painel superior). PSA urinária foi medida para monitorizar o crescimento e a implantação do tumor em ratinhos (painel inferior). O eixo y PSA / crea representa PSA urinária normalizou a creatinina x 10 6. Os ratos foram terminadas uma vez que houve uma perda de mais de 20% do peso corporal. Nota: a expressão do gene de PSA foi detectada na bexiga de rato 2 no dia 40, quando foi TERMI<html> nadas, mesmo que ele tinha baixa PSA urinário. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55078/55078fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55078/55078fig3.jpg" /> Figura 3. PSA e no Crescimento do Tumor da bexiga. (AD) Os cortes histológicos de bexigas ratos colhidos no dia 19 (A e B), dia 17 (C) e dia 13 (D) após a implantação do tumor. No dia 4 e o dia 13 ou dia 14 PSA urinária / creatinina x 10 6 valores para cada bexiga é mostrada no lado direito de cada imagem no formato dia 4 / dia 13 ou 14. O PSA urinária / creatinina valores aumentam com o tamanho do tumor . Os ratos em imagens AD receberam terapias diferentes que representam as diferenças de tamanho do tumor. A ampliação é de 41.4X. A barra de escala representa 1 mm.&quot;Http://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55078/55078fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55078/55078fig4.jpg" /> Figura 4. Perfil de células MB49-PSA marcada com um corante fluorescente. As células coradas (A) foram analisados por citometria de fluxo antes do plaqueamento. As células marcadas foram colhidas a cada poucos dias para analisar a intensidade do corante fluorescente. (B) Percentagem de células MB49 marcadas-PSA dentro da porta P2 a partir de (A) em dias especificados pós-etiquetagem. (C) A intensidade do corante fluorescente medido pela intensidade média de fluorescência (MFI) do sinal. (D) Imagens de ratos de 10 dias após o implante com células MB49-PSA marcado utilizando um sistema de imagem in vivo mostraram fluorescência não específica na região abdominal.<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55078/55078fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55078/55078fig5.jpg" /> Figura 5. ultra-som Imagens de murino bexigas. Bexigas dos ratos (a) antes da implantação do tumor e (B) 8 dias após a implantação do tumor. (C) a (H) são imagens de ultra-som de bexigas ratinhos duas semanas após o implante. PSA / Crea: PSA urinária normalizados para creatinina (10 6). gene de PSA: a expressão do gene de PSA no bexigas (log RQ) são mostrados para cada bexiga. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55078/55078fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td&gt; <td> PSA urinária </td><td> imagens de fluorescência </td><td> Ecografia </td></tr><tr><td> Passos (tempo necessário) </td><td> Anestesiar ratos. Recolhe 110 uL de urina. (~ 1 h) Realizar PSA ELISA (tempo total de incubação: 2 h 30 min) ensaio da creatinina (tempo de incubação: 5 min) </td><td> Anestesiar ratos. Raspar pele na região abdominal. Realizar imagem. </td><td> Anestesiar ratos. Raspar pele na região abdominal. Cateterize e instilar 100 ul de solução salina no interior da bexiga. Aplique gel condutor para reduzir abdômen e obter imagens de ultra-som. </td></tr><tr><td> equipamento especializado </td><td> leitor de placas ELISA (no comprimento de onda de 450 nm e 510 nm) </td><td> imaging System </td><td> Ultrasound Imaging System </td></tr><tr><td> A modificação de células tumorais </td><td> requirEd (PSA expressando) </td><td> Obrigatório (fluorescência) </td><td> Não requerido </td></tr><tr><td> vantagens </td><td> Confiável </td><td> Simples e rápido </td><td> Pode detectar tumores grandes </td></tr><tr><td> limitações </td><td> não pode obter o suficiente de urina Um valor negativo não significa ausência de tumor (PSA análise de expressão gênica aumenta a sensibilidade, mas é limitada ao final de análise apontam) </td><td> A seleção cuidadosa de corante fluorescente é necessário para evitar elevado ruído de fundo. </td><td> Não é possível detectar pequenos tumores. Um rato de cada vez. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Comparação de métodos para a monitorização de crescimento tumoral mouse bexigas.

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A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Este protocolo descreve a geração de tumores da bexiga ortotópico de murídeo em Ratinhos C57BL / 6J e a monitorização do crescimento do tumor.

Um modelo de tumor de murino de bexiga ortotópico e Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

a-murine-orthotopic-bladder-tumor-model-and-tumor-detection-system

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

14.5K visualizações.  National University of Singapore, National University Health System.  Este protocolo descreve a geração de tumores da bexiga ortotópico de murídeo em Ratinhos C57BL / 6J e a monitorização do crescimento do tumor. 

Vídeo: A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is important to control peritoneal dissemination. However, it is still unclear how tumor cells detach from primary lesions and attach to the mesothelium. The establishment of an appropriate animal model is needed to gain an understanding of the mechanism of peritoneal dissemination in vivo. In the current study, we introduce the process from the local injection of EOC cells into the murine ovarian surface to the development of metastasis, including the peritoneum and distant organs. Female nude mice (BALB/c nu/nu) at 8 weeks of age were used. Under a microscopic field of view, EOC cells (1 x 105 cells/&#181;l of medium-extracellular matrix (ECM)-based hydrogel/unilateral ovary/mouse) were injected into murine ovaries through a retroperitoneal approach from the dorsal flank. This proposed method is a less invasive procedure for the mouse and minimizes damage to the ovary. Here, we describe the methodological steps in the development of the original and metastatic tumor formation of EOC.

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

To clarify the multistep process of peritoneal dissemination of ovarian carcinoma, the current study presents a murine experimental model of original tumor development and peritoneal metastasis via orthotopic inoculation with these tumor cells.

Murino Experimental Modelo de desenvolvimento do tumor original e Peritoneal Metástase<em&gt; via</em&gt; Ortotópico injetar células do ovário Carcinoma

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Pesquisa do câncer

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

Um mouse modelo de fadiga induzida por irradiação periférica

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when stimulated by T lymphocytes, oncogenic B cells survive and expand autonomously in undefined organ niches. Mantle cell lymphoma (MCL) is one such B cell disorder, where the median survival rate of patients is 4 - 5 years. This calls for the need of effective mechanisms by which the homing and engraftment of these cells are blocked in order to increase the survival and longevity of patients. Therefore, the effort to develop a xenograft mouse model to study the efficacy of MCL therapeutics by blocking the homing mechanism in vivo is of utmost importance. Development of animal recipients for human cell xenotransplantation to test early stage drugs have long been pursued, as relevant preclinical mouse models are crucial to screen new therapeutic agents. This animal model is developed to avoid human graft rejection and to establish a model for human diseases, and it may be an extremely useful tool to study disease progression of different lymphoma types and to perform preclinical testing of candidate drugs for hematologic malignancies, like MCL. We established a xenograft mouse model that will serve as an excellent resource to study and develop novel therapeutic approaches for MCL.

Mantle cell lymphoma (MCL) is a difficult to treat B cell disorder and it is equally difficult to establish a xenograft mouse model of primary MCL to study and develop therapeutics. Here, we describe the successful establishment of MCL xenografts in mice to help understand its underlying biology.

Enxertia de tumor em um modelo do rato de enxerto heterólogo de linfoma de células do manto humano

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory regions of oncogenes and tumor suppressors can lead to changes in gene expression and play an important role in the pathogenesis of brain tumors. Native chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a popular technique that allows the detection of modifications or other proteins tightly bound to DNA. In contrast to cross-linked ChIP, in native ChIP, cells are not treated with formaldehyde to covalently link protein to DNA. This is advantageous because sometimes crosslinking may fix proteins that only transiently interact with DNA and do not have functional significance in gene regulation. In addition, antibodies are generally raised against unfixed peptides. Therefore, antibody specificity is increased in native ChIP. However, it is important to keep in mind that native ChIP is only applicable to study histones or other proteins that bind tightly to DNA. This protocol describes the native chromatin immunoprecipitation on murine brain tumor neurospheres.

Epigenetic mechanisms are frequently altered in glioma. Chromatin immunoprecipitation could be used to study the consequences of genetic alterations in glioma that result from changes in histone modifications which regulate chromatin structure and gene transcription. This protocol describes native chromatin immunoprecipitation on murine brain tumor neurospheres.

Imunoprecipitação da cromatina nativa usando Neurospheres de Tumor de cérebro murino

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and transgenic genetically engineered mouse models. Unlike subcutaneous tumors, orthotopic tumors contain more clinically accurate vasculature, tumor microenvironment, and responses to multiple therapies. In contrast to genetically engineered mouse models, orthotopic models can be performed with lower cost and in less time, involve the use of highly complex and heterogeneous mouse or human cancer cell lines, rather that single genetic alterations, and these cell lines can be genetically modified, such as to express imaging agents. Here, we present a protocol to surgically injecting a luciferase- and mCherry-expressing murine prostate cancer cell line into the anterior prostate lobe of mice. These mice developed orthotopic tumors that were non-invasively monitored in vivo and further analyzed for tumor volume, weight, mouse survival, and immune infiltration. Further, orthotopic tumor-bearing mice were surgically castrated, leading to immediate tumor regression and subsequent recurrence, representing castration-resistant prostate cancer. Although technical skill is required to carry out this procedure, this syngeneic orthotopic model of both androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer is of great use to all investigators in the field.

The goal of this protocol is to demonstrate the intra-prostatic injection of prostate cancer cells, with subsequent castration. Orthotopic pre-clinical models of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer are critical to study the disease in the context of a clinically relevant tumor microenvironment and an immunocompetent host.

Um modelo murino de ortotópico bioluminescentes e fluorescente Syngeneic de câncer de próstata andrógeno-dependentes e castração resistente

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and colorectal cancer (CRC). More than 50% of patients with muscle-invasive UCC, despite curative therapy for clinically-localized disease, will develop metastases and die within 5 years, and metastatic CRC is a leading cause of cancer-related deaths in the US. Xenograft models that consistently mimic UCC and CRC metastasis seen in patients are needed. This study aims to generate patient-derived orthotopic xenograft (PDOX) models of UCC and CRC for primary tumor growth and spontaneous metastases under the influence of LN stromal cells mimicking the progression of human metastatic diseases for drug screening. Fresh UCC and CRC tumors were obtained from consented patients undergoing resection for HG-UCC and colorectal adenocarcinoma, respectively. Co-inoculated with LN stromal cell (LNSC) analog HK cells, luciferase-tagged UCC cells were intra-vesically (IB) instilled into female non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice, and CRC cells were intra-rectally (IR) injected into male NOD/SCID mice. Tumor growth and metastasis were monitored weekly using bioluminescence imaging (BLI). Upon sacrifice, primary tumors and mouse organs were harvested, weighed, and formalin-fixed for Hematoxylin and Eosin and immunohistochemistry staining. In our unique PDOX models, xenograft tumors resemble patient pre-implantation tumors. In the presence of HK cells, both models have high tumor implantation rates measured by BLI and tumor weights, 83.3% for UCC and 96.9% for CRC, and high distant organ metastasis rates (33.3% detected liver or lung metastasis for UCC and 53.1% for CRC). In addition, both models have zero mortality from the procedure. We have established unique, reproducible PDOX models for human HG-UCC and CRC, which allow for tumor formation, growth, and metastasis studies. With these models, testing of novel therapeutic drugs can be performed efficiently and in a clinically-mimetic manner.

This protocol describes the generation of patient-derived orthotopic xenograft models by intra-vesically instilling high-grade urothelial cell carcinoma cells or intra-rectally injecting colorectal cancer cells into non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice for primary tumor growth and spontaneous metastases under the influence of lymph node stromal cells, which mimics the progression of human metastatic diseases.

Modelos de xenoenxertos Ortotópicos derivados do paciente para Carcinoma de células urotelial humana e crescimento do tumor do câncer colorretal e metástase espontânea

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.