This research was supported by the research programs of the National Research Foundation of Korea (NRF) (NRF-2015R1A1A1A05001548 and NRF-2015R1A5A1037668).

Experimentos com amostras de sangue foram realizadas em conformidade com as leis e diretrizes institucionais. As amostras foram as amostras de sangue residuais que tinham sido adquiridas e processadas em testes clínicos na instituição. Configuração óptica 1. PT-AS NOTA: Pode-se usar um tubo de micro-capilar vazio para uma configuração inicial PT-AS. <ol><li> Montar um tubo de micro-capilar vazio com diâmetros interior e exterior de 200 e 330 uM, respectivamente, e um comprimento superior a cinco centímetros ~ em uma fixação de tubo capilar. Chaves de fibras comercialmente disponíveis podem ser usados ​​como a fixação de tubo. </li><li> Ancorar firmemente um ponteiro laser 650 nm, isto é, a sonda fonte de luz, para iluminar o tubo capilar. O feixe de sonda deve ser maior que o tubo capilar. Coloque uma tela (por exemplo, papel branco) por trás do tubo capilar para observar um padrão periódico angular. </li><li> Para a parte de detecção, remova quaisquer lentes em uma webcam para capturar diretamente o scattrando padrão. Posicionar o webcam atrás do tubo capilar com um ângulo de 25-35 ° em relação à direcção do feixe sonda. Assegure-se que o padrão periódico angular produzida pelo tubo capilar pode ser medida com o detector (Figura 1). Observar o padrão periódico angular no meio do sensor de imagem quando o sensor de imagem está correctamente posicionado. </li><li> Posicionar uma fonte de luz de excitação PT 532-nm para iluminar o tubo capilar. Posicionar a fonte de luz PT em qualquer ângulo, desde que a luz de excitação PT sobrepõe com feixe de sonda no tubo capilar e não atinge o detector directamente. PT excitação das amostras de sangue utilizando alta potência óptica tipicamente melhora o PT-Como a sensibilidade, uma vez que conduz a uma variação maior no IR. <ol><li> Utilizar a maior potência óptica da fonte de luz de excitação PT empregue. Além disso, garantir que a luz PT excitação sobrepõe a luz sonda no tubo capilar. Use um tamanho feixe da luz de excitação PTpelo menos duas vezes a da sonda de luz para aquecer todo o volume da sonda. </li></ol></li><li> Coloque um filtro passa longo em frente ao detector para bloquear a luz de 532 nm, e medir apenas a luz da sonda 650-nm. </li><li> Instalar um chopper óptica no caminho da luz de excitação PT antes de iluminar o tubo capilar. O helicóptero óptico é utilizado para modular a intensidade de luz de excitação PT. </li></ol> Preparação da Amostra 2. Sangue <ol><li> Desenhar 6 mL de sangue inteiro fresco em estado anémico em ácido etilenodiaminotetracético tubos de recolha de sangue, e misturar bem as amostras. Nenhum outro tratamento é necessário. </li><li> Medem-se as amostras de sangue utilizando o sensor de PT-AS dentro de 24 horas de extracção para impedir a coagulação. </li></ol> 3. PT-como protocolos de medição <ol><li> Coloque um tubo de micro-capilar com uma amostra de sangue para medir. Encher o tubo capilar com o sangue através de uma acção capilar, colocando o tubo no sangue samplo. O volume mínimo de amostra necessário para a medição é determinada pelo diâmetro interior do tubo capilar e o tamanho do feixe de sonda. <ol><li> Empregar um tubo com um diâmetro interior de 200 um. O tamanho do feixe de sonda foi de 2 mm nos resultados representativos, sugerindo que a medição pode ser realizada com um volume de amostra de&gt; 63 nl. </li></ol></li><li> Montar o tubo capilar na posição designada no suporte. </li><li> Ligue o laser sonda 650 nm para iluminar o tubo de micro-capilar carregado de sangue. O padrão periódico angular devem ser observadas com a webcam. </li><li> Ligue o 532-nm do laser de excitação PT para iluminar o tubo. </li><li> Executar o helicóptero óptico para modular a intensidade da luz de excitação PT a 2 Hz. NOTA: O critério para a selecção de esta condição de operação é descrita em Discussão e Kim et al. 12. <ol><li> Montar uma roda de corte no conjunto do cabeçote do motor do helicóptero ópticasistema. </li><li> Ligue a caixa de controle helicóptero, e use o botão de controle no console para definir a frequência de modulação. </li><li> Execute o helicóptero usando o botão de controle. </li></ol></li><li> Gravar o padrão de espalhamento flutuante através da webcam para 5 segundos no formato MPEG-4 (mp4). </li></ol> 4. Processamento de Sinais NOTA: processamento de sinal PT-AS foi realizada utilizando um código MATLAB desenvolveu-lab. <ol><li> Carregar o arquivo de vídeo para extrair as imagens. Para cada imagem [ver Figura 2 (a), para uma imagem representativa], obter o padrão de dispersão média calculando a média dos valores de pixel ao longo da direcção vertical [Figura 2 (b, c)]. </li><li> Avaliar a transformada de Fourier do padrão de dispersão em média, e calcular a fase no pico de frequência espacial. Executar essas operações para todos os quadros de todas as imagens gravadas. </li><li> Utilizando os valores de fase obtidos a partir de todas as imagens, traçar a fase temporaisflutuação [Figura 2 (d)]. Note-se que a fase varia com a frequência de modulação PT. Aqui a transformada de Fourier a flutuação de fase no domínio do tempo, e obter a amplitude na frequência de modulação. Este sinal é referido como o PT-Como o sinal [Figura 2 (e)]. </li><li> Meça a [Hb] de uma amostra de sangue, convertendo seu sinal PT-AS para o correspondente [Hb], utilizando a curva de calibração que é obtido no Protocolo 5. </li></ol> 5. PT-AS Calibração <ol><li> Preparar as amostras de sangue, tendo [Hb] valores que estão uniformemente distribuídas no intervalo de detecção do sensor PT-AS (por exemplo, 0-18 g / dl). </li><li> Antes da calibração, quantificar os valores de [Hb] das amostras utilizando um analisador de hematologia referência. Medir os sinais PT-AS das amostras. </li><li> Derivar uma curva de calibração relacionando [Hb] para o sinal PT-AS realizando uma linear de mínimos quadrados encaixam, [Hb] = A [PT-AS Signal] + B, das experimental resultados. Para as condições de funcionamento especificados no quadro 1, a relação entre [Hb] e o sinal PT-AS foi encontrado para ser [Hb] = 5,13 [sinal PT-AS] - 0,09. Use o código MATLAB para realizar o ajuste linear. </li></ol>

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No conflict of interest is declared.

O sensor PT-AS representa um método totalmente óptica capaz de medição direta [Hb] de amostras de sangue não transformados. O método quantifica [Hb] no sangue, utilizando a resposta PT intrínseca de moléculas de hemoglobina em eritrócitos. Sob iluminação pela luz de 532 nm, as moléculas de hemoglobina absorver a energia da luz e produzir calor. O aumento da temperatura resultante altera o RI da amostra de sangue. A sensibilidade elevada RI da BSI foi explorada para medir esta mudança RI no sangue. Anteriormente, demonstrou-se que o sensor de PT-AS permite [Hb] medição com um limite de detecção de 0,12 g / dl ao longo do intervalo de 0,35-17,9 g / dl, o que é comparável à de comerciais [Hb] sensores no mercado. Uma característica notável do sensor PT-AS é que ele não necessita de qualquer pré-condicionamento de amostras de sangue ou de produtos químicos. Assim, o sensor permite direta, rápida (&lt;5 segundos), e medição favorável ao meio ambiente. O uso de tubos de micro-capilar à base de vidro, como uma amostra container habilitado ensaio [Hb] a um custo operacional baixo. O volume mínimo de amostra no sensor PT-AS é determinado pelo diâmetro interior do tubo capilar e o tamanho do feixe de medição no tubo capilar. Estima-se para ser ~ 63 nl nos resultados representativos. Em comparação com os volumes de amostra necessários nos instrumentos comerciais (por exemplo, 50-200 ul para o analisador de hematologia de referência), o sensor de PT-AS permite [Hb] medição com um volume de amostra significativamente reduzida. Várias técnicas de detecção rápida e de baixo custo [Hb] foram relatados 11,17,18, mas ainda exigem os volumes de amostra de 2-10 ul para a operação. Várias características da implementação do sensor PT-AS deve ser observado. Deve-se garantir que o tamanho do feixe de luz de excitação PT é pelo menos o dobro do feixe luminoso sonda no tubo capilar. Os dois feixes de luz devem sobrepor-se no tubo capilar, como nenhuma sobreposição ou parcial dos dois feixes de luz sobre the tubo irá resultar em nenhum ou um menor PT-AS resposta. Um deve também certificar-se de que o padrão de espalhamento angular não está saturado no detector. Ajuste da orientação padrão de dispersão ao longo do sentido horizontal ou vertical pode ser necessário; caso contrário, a imagem adquirida deve ser rodada no estágio de processamento de sinal. Note-se que a dispersão de 532 nm luz PT excitação pelo tubo também gera um padrão de espalhamento angular do detector. Assim, um filtro passa longo é necessária para bloquear a luz de 532 nm. Maior sensor de imagem captura padrões periódicos mais angulares. Transformada de Fourier do padrão angular seria, assim, produzir o sinal mais elevado na frequência espacial correspondente, que permite a medição de fase com maior precisão. Além disso, uma taxa de quadros mais alta que normalmente resultam em uma medição PT-AS com um SNR melhorada, uma vez que permite mais de amostragem da flutuação de fase temporal. Portanto, o uso de um sensor de imagem grande, de alta velocidade, com uma alta de pixel density é vantajosa. Alguns comentários também deve ser feita no tempo de medição e PT frequência de modulação. Tal como descrito em Kim et al. 12, o sinal de PT-no que se refere à magnitude da transformada de Fourier das flutuações de fase do padrão de espalhamento angular medida na frequência de modulação PT. O ruído é definida como a amplitude de pico da transformada de Fourier da medição da fase antes de excitação PT 12. A SNR do sinal de PT-AS é avaliada dividindo a grandeza do sinal de PT-AS pelo ruído. Um maior tempo de medição normalmente produz medições com um SNR mais elevado, mas aumenta o total de [Hb] tempo de ensaio. O tempo de medição foi ajustada para ser de 5 segundos para atingir um SNR superior a 3, mesmo para as amostras de sangue de [Hb] &lt;1 g / dl. A frequência óptima modulação PT pode ser encontrado através da análise do SNR do sensor PT-AS como uma função da frequência de modulação PT. A modulação de frequência ideal para a repsentante resultados verificou-se ser de 2 Hz. Operação com uma frequência de modulação PT inferior a 2 Hz não produzir uma SNR alta devido ao ruído de baixa frequência, tais como o movimento excessivo do helicóptero óptico e vibração. Nesta demonstração, o sensor PT-AS foi demonstrada em uma configuração de bancada usando um ponteiro laser comercial e de webcam. A configuração óptica é simples, e, porque não há produtos químicos estão envolvidos, os procedimentos de medição são simples. Por outro lado, deve ser enfatizado que o sensor pode, potencialmente, ser embalado num dispositivo portátil compacta. As fontes de luz para excitação da sonda e a PT pode ser substituído por diodos de laser de baixo custo ou de diodos emissores de luz. Um sensor de imagem complementar de metal-óxido-semicondutor miniaturizado com built-in poder computacional também pode ser utilizada como um detector. A integração desses componentes em um pequeno fator de forma geraria uma nova plataforma portátil, e barato livre de produtos químicos para a [Hb] ensaio. Eun Além de ensaio [Hb], o princípio de detecção do sensor PT-AS pode ser alargado para detecção de vários biomarcadores e produtos químicos que apresentam respostas PT. Por exemplo, ensaio de TP de organofosfatos e pesticidas também foi demonstrada 19, e pode ser facilmente realizado com o programa de EP-AS.

Um exame de sangue é comumente realizada para avaliar a saúde humana em geral e para detectar biomarcadores relacionados a certas doenças. Por exemplo, a concentração de colesterol no sangue serve como um critério para a hiperlipidemia, que está estreitamente relacionada com doenças cardiovasculares e pancreatite. O conteúdo de glicose no sangue deve ser medida com frequência, pois o nível de glicose está associada a complicações tais como cetoacidose diabética e síndrome hiperosmolar hiperglicêmicos. doenças graves como a malária, o vírus da imunodeficiência humana e síndrome da imunodeficiência adquirida são diagnosticadas através de exames de sangue, e quantificação dos componentes do sangue, incluindo eritrócitos, trombócitos, leucócitos e permite o rastreio de pâncreas e doenças renais. A hemoglobina (Hb), um componente crítico de sangue, torna-se cerca de 96% dos eritrócitos, e transporta o oxigénio para órgãos humanos. alteração significativa da sua concentração de massa ([Hb]) pode indicar-memudanças tabolic, doença hepatobiliar, e distúrbios neurológicos, cardiovasculares e endocrinológicos 1. [Hb] é, portanto, rotineiramente medidos em exames de sangue. Em particular, pacientes anêmicos, pacientes de diálise, e as mulheres grávidas são fortemente recomendados para monitorar [Hb] como uma tarefa vital 2. Vários métodos de detecção [Hb] foram assim desenvolvidos. O método da hemoglobina cianeto, uma das técnicas mais comuns para [Hb] quantificação, emprega cianeto de potássio (KCN), para destruir a bicamada lipídica de eritrócitos 3. A hemoglobina cianeto produzido pelo exposições químicas alta absorção em torno de 540 nm; Assim, [Hb] medições podem ser feitas através de análise colorimétrica. Este método é amplamente utilizado devido à sua simplicidade, mas os produtos químicos utilizados (por exemplo, KCN e óxido dimethyllaurylamine) são tóxicos para os seres humanos eo meio ambiente. O regime de hematócrito mede a relação do volume de células vermelhas do sangue em comparação com o volume total de sangueume através da separação centrífuga; no entanto, exige um volume relativamente grande de sangue (50-100 ul) 4. Espectrofotometria de métodos de medida [Hb] precisamente sem produtos químicos, mas medições em vários comprimentos de onda e um volume de sangue grande são necessárias 5,6. Da mesma forma, vários métodos ópticos para medir [Hb] têm sido propostos, incluindo os métodos de detecção baseadas em luz-se espalhando, mas as suas precisões de medição dependem fortemente da precisão do modelo de sangue teórica. Para superar estas limitações, [Hb] métodos de detecção baseados no efeito fototérmico (PT) de Hb recentemente têm sido propostos 7. Hb, que é composto principalmente de óxidos de ferro, absorve a luz a 532 nm e converte a energia da luz em calor 8-10. Este aumento de temperatura PT pode ser detectado opticamente por medição de uma alteração no índice de refracção (RI) de amostras de sangue. Yim et ai. empregada espectral-domain reflectometr de coerência ópticaY para medir a alteração óptica caminho de comprimento PT numa câmara contendo 11 sangue. Embora o método permite a livre de produtos químicos e directa [Hb] medição, a utilização de um espectrómetro e um arranjo de interferometria pode dificultar a sua miniaturização. Recentemente, apresentado um método de detecção alternativo [Hb], denominado sensor de fotoï¿½tï¿½rmica angular de espalhamento de luz (PT-AS), que é mais adequado para a miniaturização do dispositivo 12. O sensor PT-AS explora a sensibilidade elevada RI da interferometria de dispersão de volta (BSI) para medir as mudanças PT no RI de uma amostra de sangue dentro de um tubo capilar. BSI têm sido utilizados para medir RI de várias soluções de 13-15 e para monitorar interacções bioquímicas em solução livre 16. O sensor PT-AS emprega disposição óptica semelhante à do BSI, mas combina configuração de excitação fototérmica para medir aumento PT de RI em amostras de sangue. Princípios de funcionamento do BSI e os sensores de PT-AS são descritos em detalhe noutro lugar <sup&gt; 12,15. PT-demonstrado como sensor de medição de alta sensibilidade [Hb] ao longo de um largo intervalo de detecção (0,35-17,9 g / dl) e é capaz de funcionar com volumes de amostra de &lt;100 nl. Sem o pré-condicionamento de amostra de sangue é necessário, e o tempo de medição é apenas ~ 5 seg. Aqui, a montagem experimental e um protocolo de medição detalhada são descritos. Os resultados representativos PT-AS são fornecidos usando amostras de sangue de pacientes anêmicos, e os resultados são comparados com os de um analisador hematológico para avaliar a precisão do sensor PT-AS.

<table><tbody><tr><td>650 nm laser pointer</td><td>LASMAC</td><td>LED-1</td><td>Probe light</td></tr><tr><td>Hollow round glass capillaries</td><td>VitroCom</td><td>CV2033</td><td>Blood sample container</td></tr><tr><td>Webcam</td><td>Logitech</td><td>C525</td><td>CMOS optical sensor</td></tr><tr><td>Optical chopper system</td><td>Thorlabs</td><td>MC2000-EC</td><td>Optical chopper</td></tr><tr><td>Plastic long-pass filter</td><td>Edmund Optics</td><td>#43-942</td><td>To reject 532-nm PT excitation light</td></tr><tr><td>Fiber clamp</td><td>Thorlabs</td><td>SM1F1-250</td><td>Capillary tube fixture</td></tr><tr><td>EDTA coated blood sampling tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>VACUETTE 454217</td><td>Blood sampling &amp;amp; anticoagulating</td></tr><tr><td>Hematology analyzer</td><td>Siemens AG</td><td>ADVIA 2120i</td><td>Reference hematology analyzer</td></tr></tbody></table>

a rapid and chemical-free hemoglobin assay with photothermal angular light scattering

Fotoï¿½tï¿½rmica angular de espalhamento de luz (PT-AS) é um método óptico de novo para a medição da concentração de hemoglobina ([Hb]) de amostras de sangue. Com base na resposta fototérmico intrínseca de moléculas de hemoglobina, o sensor permite alta sensibilidade, medida livre de produtos químicos de [Hb]. [Hb] capacidade de detecção com um limite de 0,12 g / dl ao longo do intervalo de 0,35-17,9 g / dl foi demonstrada anteriormente. O método pode ser facilmente implementada usando dispositivos electrónicos de consumo de baixo custo, tais como um ponteiro laser e uma webcam. O uso de um tubo de micro-capilar como um recipiente para o sangue também permite que o ensaio de hemoglobina com um volume de sangue escala nanolitros e um baixo custo de operação. Aqui, são apresentados instruções detalhadas para os procedimentos de processamento de instalação e de sinal PT-AS óptica. Protocolos experimentais e resultados representativos para as amostras de sangue em condições anémicas ([Hb] = 5,3, 7,5, e 9,9 g / dL) são também fornecidos, e as medições são comparadas com as froma analisador hematológico. Sua simplicidade na implementação e operação deve permitir a sua ampla adoção em laboratórios clínicos e contextos de recursos limitados.

Um ensaio de hemoglobina foi realizada utilizando o sensor de PT-AS, e suas medições foram comparadas com aquelas de um analisador de hematologia. O experimento foi realizado com uma intensidade de luz PT excitação de 1,4 W / cm 2, PT modulação de frequência de 2 Hz, e medição do tempo de 5 segundos. A Tabela 1 resume as condições experimentais. Os tamanhos de feixe da luz da sonda e excitação PT foram de 5,5 e 2 mm, respectivamente. A webcam gravou as imagens a uma taxa de quadros de 30 fps. Para a medição, foram empregadas amostras de sangue anémicos com três concentrações diferentes de Hb. Antes das medições de PT-AS, os valores de [Hb] das amostras foram medidos em primeiro lugar como 5,3, 7,5, e 9,9 g / dl por o analisador de hematologia. A Figura 3 (a) mostra flutuações fase de lapso de tempo representativos dos padrões de espalhamento angular sob a iluminação de luz PT modulada. ºé informação foi obtida tomando a transformada de Fourier do padrão de espalhamento angular e medir as flutuações de fase temporais na frequência de pico espacial. Note-se que as amostras de sangue com maior [Hb] apresentam maiores desvios de fase. Os sinais PT-se como correspondendo foram avaliados e convertido em [Hb] valores. Onze medições foram realizadas para cada amostra, e os valores médios [Hb] verificou-se ser 5,46, 7,23, e 9,85 g / dl, respectivamente. Os resultados bem acordados com os obtidos usando o analisador de hematologia [Figura 3 (b)]. O [Hb] precisão da medição do sensor PT-AS foi encontrado para ser &lt;0,89 g / dl. Esta flutuação pode ser em parte explicada por flutuação o número de eritrócitos no volume de sonda e as flutuações de intensidade das fontes de luz utilizada. A Tabela 2 apresenta uma comparação detalhada das medições de PT-AS contra aqueles do analisador de hematologia. &gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55006/55006fig1.jpg" /> Figura 1: Representação esquemática do sensor de PT-AS. 650 nm de luz da sonda a partir de um ponteiro laser é dirigido a um tubo capilar com carga de sangue. A luz é então espalhados pelo tubo contendo sangue, gerando um padrão periódico em uma webcam. Após a iluminação com luz de 532 nm, em que as moléculas de hemoglobina apresentam alta absorção, as moléculas de hemoglobina absorver a energia da luz e convertê-la em calor. O aumento da temperatura resultante altera o RI do sangue. Uma vez que o padrão periódico angular varia com o RI e o tamanho físico do tubo, [Hb] no sangue é quantificada através da medição esta mudança PT no padrão periódico angular. Um triturador de óptico é utilizado para conseguir uma medição [Hb] com uma alta relação de sinal-para-ruído. Um filtro passa-tempo de plástico de baixo custo situa-se em frente à webcam para detectar somente a luz da sonda.k &quot;&gt; Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55006/55006fig2.jpg" /> Figura 2: procedimentos de processamento de sinal PT-AS. (A) imagens de webcam representativos com luz PT excitação ligado e desligado. O padrão de espalhamento angular se desloca por causa da resposta PT de moléculas de Hb. (B) Cada imagem é feita a média ao longo da (y) direcção vertical para obter o padrão de média. (C) Representante média padrões periódicos com excitação PT ligado e desligado. (D) O padrão periódico em média é então transformada de Fourier, e a fase com a frequência de pico espacial é analisado como uma função do tempo. De acordo com a iluminação de luz PT modulada, a fase do padrão periódico oscila na frequência de modulação. (E) A gripe fase medidoctuation é transformada de Fourier, e a sua magnitude avaliada na frequência de modulação, referido como o sinal de PT-AS, é convertido em [Hb]. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55006/55006fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55006/55006fig3.jpg" /> Figura 3: Medição PT-AS de amostras de sangue anêmicos. (A) as flutuações de fase representativos dos padrões de espalhamento angular medidos para três amostras de sangue em condições anémicas ([Hb] = 5,3, 7,5, e 9,9 g / dl). As amostras de sangue com valores mais elevados [Hb] produzir variações de fase maiores. (B) Comparação de [Hb] valores medidos utilizando o sensor de PT-AS com aqueles do analisador de hematologia referência. onze medições de PT-AS foram realizadas para cada amostra. o errou barra indica o desvio padrão. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55006/55006fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> As condições experimentais </td></tr><tr><td> PT frequência de modulação </td><td> 2Hz </td></tr><tr><td> Intensidade de luz PT </td><td> 1,4 W / cm² </td></tr><tr><td> Tamanho do feixe PT </td><td> 5 mm </td></tr><tr><td> Tamanho do feixe sonda </td><td> 2 milímetros </td></tr><tr><td> tempo de medição </td><td> 5 seg </td></tr><tr><td> Taxa de aquisição de quadro </td><td> 30 fps </td></tr></tbody></table> Tabela 1: experimecondições ntal. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Analisador de hematologia (g / dl) </td><td colspan="2"> PT-AS sensor </td></tr><tr><td> A média (g / dl) </td><td> SD (g / dl) </td></tr><tr><td> 5.3 </td><td> 5,46 </td><td> 0,72 </td></tr><tr><td> 7,5 </td><td> 7,23 </td><td> 0,89 </td></tr><tr><td> 9.9 </td><td> 9.85 </td><td> 0,84 </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Comparação de [Hb] medidas pelo sensor de PT-AS com aqueles por o analisador de hematologia.

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A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

A photo-thermal angular light scattering (PT-AS) sensor enables the rapid and chemical-free hemoglobin assay of nanoliter-scale blood samples. Here, details of the PT-AS setup and a measurement protocol for the hemoglobin concentration in blood are provided. Representative results for anemic blood samples are also presented.

A rápida e sem produtos químicos dosagem de hemoglobina com Photothermal angular de espalhamento de luz

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

a-rapid-chemical-free-hemoglobin-assay-with-photothermal-angular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K visualizações.  Yonsei University. A photo-thermal angular light scattering (PT-AS) sensor enables the rapid and chemical-free hemoglobin assay of nanoliter-scale blood samples. Here, details of the PT-AS setup and a measurement protocol for the hemoglobin concentration in blood are provided. Representative results for anemic blood samples are also presented.

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Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and amino acids. However, the innate weak signal intensity of FRET sensors is a major challenge that prevents their application in various fields and makes the use of expensive, high-end fluorometers necessary. Previously, we built a cost-effective, high-performance FRET analyzer that can specifically measure the ratio of two emission wavelength bands (530 and 480 nm) to achieve high detection sensitivity. More recently, it was discovered that FRET sensors with bacterial periplasmic binding proteins detect ligands with maximum sensitivity in the critical temperature range of 50 - 55 &#176;C. This report describes a protocol for assessing sugar content in commercially-available beverage samples using our portable FRET analyzer with a temperature-specific FRET sensor. Our results showed that the additional preheating process of the FRET sensor significantly increases the FRET ratio signal, to enable more accurate measurement of sugar content. The custom-made FRET analyzer and sensor were successfully applied to quantify the sugar content in three types of commercial beverages. We anticipate that further size reduction and performance enhancement of the equipment will facilitate the use of hand-held analyzers in environments where high-end equipment is not available.

This protocol describes the rapid and highly sensitive quantification of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensor data using a custom-made portable FRET analyzer. The device was used to detect maltose within a critical temperature range that maximizes detection sensitivity, enabling practical and efficient assessment of sugar content.

Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Bioquímica

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

Antígenos funcionais protegidos glóbulos vermelhos pela membrana enxerto de compactos Poligliceróis hiper

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Imunologia e Infecção

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this protocol, we describe the implementation of a new single-molecule technique, mass photometry (MP), for this purpose. MP is a label- and immobilization-free technique that detects and quantifies molecular masses and populations of antibodies and antigen-antibody complexes on a single-molecule level. MP analyzes the antigen-antibody sample within minutes, allowing for the precise determination of the binding affinity and simultaneously providing information on the stoichiometry and the oligomeric state of the proteins. This is a simple and straightforward technique that requires only picomole quantities of protein and no expensive consumables. The same procedure can be used to study protein-protein binding for proteins with a molecular mass larger than 50 kDa. For multivalent protein interactions, the affinities of multiple binding sites can be obtained in a single measurement. However, the single-molecule mode of measurement and the lack of labeling imposes some experimental limitations. This method gives the best results when applied to measurements of sub-micromolar interaction affinities, antigens with a molecular mass of 20 kDa or larger, and relatively pure protein samples. We also describe the procedure for performing the required fitting and calculation steps using basic data analysis software.

We describe a single-molecule approach to antigen-antibody affinity measurements using mass photometry (MP). The MP-based protocol is fast, accurate, uses a very small amount of material, and does not require protein modification.

Determinação rápida da afinidade anticorpo-antígeno por fotometria em massa

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to cytokines and growth factors. STAT proteins are activated by tyrosine phosphorylation mediated mainly by JAKs. The abnormal activation of STAT signaling pathways is implicated in many human diseases, especially cancer and immune-related conditions. Therefore, the ability to monitor STAT protein phosphorylation within the native cell signaling environment is important for both academic and drug discovery research. The traditional assay formats available to quantify phosphorylated STAT proteins include western blotting and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). These heterogeneous methods are labor-intensive, low-throughput, and often not reliable (specific) in the case of western blotting. Homogeneous (no-wash) methods are available but remain expensive. 
Here, detailed protocols are provided for the sensitive, robust, and cost-effective measurement in a 384-well format of endogenous levels of phosphorylated STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699), and STAT6 (Y641) in cell lysates from adherent or suspension cells using the novel THUNDER time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer (TR-FRET) platform. The workflow for the cellular assay is simple, fast, and designed for high-throughput screening (HTS). The assay protocol is flexible, uses a low-volume sample (15 &#181;L), requires only one reagent addition step, and can be adapted to low-throughput and high-throughput applications. Each phospho-STAT sandwich immunoassay is validated under optimized conditions with known agonists and inhibitors and generates the expected pharmacology and Z'-factor values. As TR-FRET assays are ratiometric and require no washing steps, they provide much better reproducibility than traditional approaches. Together, this suite of assays provides new cost-effective tools for a more comprehensive analysis of specific phosphorylated STAT proteins following cell treatment and the screening and characterization of specific and selective modulators of the JAK/STAT signaling pathway.

Time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer cell-based assay protocols are described for the simple, specific, sensitive, and robust quantification of endogenous phosphorylated signal transducer and activator of transcription (STAT) 1/3/4/5/6 proteins in cell lysates in a 384-well format.

Ensaios de transferência de energia de ressonância de Förster para medição de proteínas STAT fosforilatos endogensas em células humanas

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient's cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

Levitação magnética Juntamente com imagem Portátil e Análise para a doença Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Bioengenharia

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Detecção rápida de Homogêneos Ensaios Biológicos Usando o sistema de modulação Biossensoriais Magnetic

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Biologia

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system. This system is constructed from a broadband white light source, a motorized filter wheel with a set of narrowband interference filters, a light guide, a collecting lens, a video zoom lens, and a monochromatic charged-coupled device (CCD) camera. An ellipsoidal cranial window is made in the skull bone of a rat under isoflurane anesthesia to capture in vivo multispectral diffuse reflectance images of the cortical surface. Regulation of the fraction of inspired oxygen using a gas mixture device enables the induction of different respiratory states such as normoxia, hyperoxia, and anoxia. A Monte Carlo simulation-based multiple regression analysis for the measured multispectral diffuse reflectance images at nine wavelengths (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, and 760 nm) is then performed to visualize the two-dimensional maps of hemodynamics and the light scattering properties of the in vivo rat brain.

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system.

Avaliação simultânea de Cerebral Hemodinâmica e de espalhamento de luz Propriedades do<em&gt; In Vivo</em&gt; Cérebro de Rato Utilizando Imagem de Reflexão Difusa Multispectral

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

Neurociência

A Precision Medicine Tool for Measurement and Monitoring of Hemoglobin S in Sickle Cell Disease Patients Receiving Transfusion Therapy

Sickle cell disease (SCD) causes many severe health complications, including anemia, stroke, and acute chest syndrome. Red blood cell transfusion is the most commonly used therapy to treat or prevent these devastating complications. Other therapies include hydroxyurea therapy as well as bone marrow transplantation. Chronic intermittent transfusion is especially indicated to prevent recurrent strokes. However, transfusion therapy is associated with significant adverse effects (e.g., alloimmunization and iron overload). The point-of-care (POC) lateral flow immunoassay used here quantifies the %HbS in 15 min using a small patient blood sample. Utilizing this information, the healthcare provider is able to adjust blood transfusion volume for SCD patients to achieve the desired target HbS (most often &#60;30%), while reducing the risk of transfusion-related complications. When compared to laboratory hemoglobin electrophoresis data for 38 whole blood samples, the POC test performed with very high correlation and linear fit (slope = 0.9949, R2 = 0.9751). The strong agreement between the two hemoglobin S percentage (%HbS) quantifying methods shows that 89.5% of samples fall within &#177;5.2% HbS bias. The calibration for quantifying %HbS is built into the device to allow for an automated quantification of %HbS. This time- and cost-effective POC test thus allows the healthcare provider to make timely informed decisions when treating SCD patients, using accurate and updated data.

We have developed a point-of-care immunoassay to rapidly quantify hemoglobin S (HbS) levels during transfusion therapy for sickle cell disease (SCD) patients. By applying a small amount of treated blood to the device, the healthcare provider can determine the %HbS in a SCD patient to immediately inform clinical decisions.

Sickle cell disease (SCD) causes many severe health complications, including anemia, stroke, and acute chest syndrome. Red blood cell transfusion is the ...

Medicina

<meta charset="utf8"></head><body>Otimizando a espectroscopia VIS-SWIR para moléculas biológicas

Characterization of Biological Absorption Spectra Spanning the Visible to the Short-Wave Infrared

For noninvasive light-based physiological monitoring, optimal wavelengths of individual tissue components can be identified using absorption spectroscopy. However, because of the lack of sensitivity of hardware at longer wavelengths, absorption spectroscopy has typically been applied for wavelengths in the visible (VIS) and near-infrared (NIR) range from 400 to 1,000 nm. Hardware advancements in the short-wave infrared (SWIR) range have enabled investigators to explore wavelengths in the ~1,000 nm to 3,000 nm range in which fall characteristic absorption peaks for lipid, protein, and water. These molecules are difficult to visualize in the VIS-NIR and can provide label-free sources of biological contrast. Furthermore, lower SWIR absorption has been observed for melanin, the primary chromophore responsible for skin pigmentation. In vivo&#160;optical devices like clinically standard pulse oximeters have been found to have reduced accuracy in people with darkly pigmented skin, possibly because of the stronger melanin absorption in the VIS range. Thus, error associated with skin pigmentation could be reduced by using devices operating in the SWIR. Optical instrument design is facilitated by the understanding of the absorption properties of core tissue components from the VIS to the SWIR range. This article describes protocols and instrumentation for obtaining VIS-SWIR absorption spectra of common tissue absorbers: oxygenated hemoglobin, deoxygenated hemoglobin, melanin, water, and lipid.

<meta charset="utf8"></head><body>Caracterização de espectros de absorção biológica abrangendo o visível ao infravermelho de ondas curtas

Biological samples have distinct optical characteristics in the short-wave infrared (SWIR) compared to the visible (VIS) and near-infrared (NIR) wavelength ranges. However, recording pure SWIR absorption spectra is challenging and rarely conducted for biological molecules. This article presents a method to characterize the VIS-SWIR absorption spectra of biological absorbers.

Caracterização de espectros de absorção biológica abrangendo o visível ao infravermelho de ondas curtas

For noninvasive light-based physiological monitoring, optimal wavelengths of individual tissue components can be identified using absorption spectroscopy. ...

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Avaliação simultânea de Cerebral Hemodinâmica e de espalhamento de luz Propriedades do

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Caracterização de espectros de absorção biológica abrangendo o visível ao infravermelho de ondas curtas

Caracterização de espectros de absorção biológica abrangendo o visível ao infravermelho de ondas curtas