This work was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF), funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (Grants NRF-2015M3C7A1028790); and by a grant from the Korea Health Technology R&amp;D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health &amp; Welfare, Republic of Korea (HI14C3347).

1. Preparação de Materiais e Meio de Cultura <ol><li> Para a dissecção e dissociação do SCZ, enrole a matriz cérebro, lâmina de dois gumes lâmina de barbear, e uma pinça com papel alumínio e, em seguida, esterilizá-los por autoclavagem. </li><li> Prepare 50 ml de tampão PBS fria para lavar todo o cérebro do rato. </li><li> Defina-se um microscópio de dissecção e preparar os instrumentos cirúrgicos necessários para a dissecção do cérebro (tesouras e pinças) e autoclavados o isolamento do SCZ (seringa de 1 ml, 30 agulha G, matriz cérebro, e uma pinça fina). </li><li> Preparação de N2 Médio: <ol><li> Prepare F-12 / DMEM (+ L-glutamina, + bicarbonato de sódio) forma com 2% B27, 1% suplementos de N2, e 1% de Penicilina-Estreptomicina. Nota: O meio de crescimento consiste em factores de crescimento médias e N2 (ml de factor de crescimento epidérmico purificada (EGF) e 20 ng / factor de 20 ng / mL de crescimento de fibroblastos básico (bFGF2)). </li></ol></li><li> Preparar um tampão de digestão (40 unidades / ml papaína, 2,4 unidades / ml dispase II, e 2% de penicilina-estreptomicina, em PBS) para a digestão de tecido. </li><li> Preparação da placa de revestimento e Lamela: <ol><li> Prepare a poli-L-ornitina (PLO; 0,01%) e laminina (10 ug / mL dissolvidos em dH2O). Para revestir placas de 6 poços para a manutenção de SCZ-aNSCs como uma monocamada ou lamelas 18 mm para a imunocoloração, incubar-los com PLO durante a noite a 4 ° C. Em seguida, lave-os 3 vezes com DH 2 O. Permitir que as placas e lamelas para secar após a última lavagem. </li><li> Em seguida, incubar as placas com laminina durante a noite a 4 ° C. Em seguida, lave-os 3 vezes com DH 2 O. Cuidado: Não seque a laminina, o que afetará a fixação das células. Nota: As soluções de revestimento podem ser reutilizados 3 vezes. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento e dissociação do SCZ Adulto <ol><li> Antes da preparação cultura, colocar a matriz cérebro e lâmina de dois gumes no gelo. Nota: Não congelar a matriz cérebro, porque o brain poderia anexar a ele. </li><li> Sacrificar um rato (8 semanas de idade) por asfixia com CO2 ou deslocamento cervical. <ol><li> Cortar a cabeça com uma tesoura afiada após a pulverização de 70% de etanol. Para imobilizar a cabeça, segure ambos os lados da cabeça com força. Cortar a pele com uma tesoura na linha média em sentido caudal-rostral. Isto promove a remoção completa da pele do crânio. </li><li> Remova a parte caudal do crânio (posterior ao lambda) em primeiro lugar e, em seguida, inserir a pinça entre o crânio eo cérebro na posição dorsal na linha média. Agarrar o osso parietal esquerda (ou direita) e descasque-o cuidadosamente para fora. Repetir este procedimento para a remoção do outro osso parietal. Nota: A desconexão de nervo óptico e remoção das meninges do cérebro tornar mais fácil para separar o cérebro do crânio. </li><li> Transferir o cérebro para tampão PBS frio (25 ml) e lave-o duas vezes para remover o excesso de sangue. </li></ol></li><li> Coloque o cérebro na matriz cérebro no gelo e make cortes coronais obter fatias grossas 1 mm. Transferir as fatias de cérebro (1 mm) contendo as regiões SCz que estão localizados na parte posterior do cérebro para um PBS frio num prato de petri de plástico de 35 mm. Cuidado: A fim de se obter um plano paralelo de secções coronais, assegurar que a fissura do cérebro é colocado na linha média do cérebro matriz; é fundamental para evitar variações desnecessários nas secções. Nota: obter fatias de cérebro em 2-3 mm posterior ao bregma; isto permite a separação do SCZ a partir do SVZ. </li><li> Sob o microscópio de dissecção com uma ampliação de baixo, micro-dissecar o SCZ da área de matéria branca do córtex e no hipocampo, com uma agulha de 30G 6,9 dobrada. Em seguida, remova as regiões do córtex acima do SCZ. Coloque a região SCZ dissecados das fatias em um prato de plástico Petri 35 mm no gelo sem PBS frio. Nota: A contaminação de regiões extra que contêm neurônios maduros podem afetar a viabilidade de aNSCs e neurosphere formação because eles sofrem morte celular em condições de cultura ANSC. </li><li> Usando um 30 G agulha torta, corte imediatamente os tecidos dissecados em pedaços pequenos. Nota: Se um tempo maior é necessário para dissecar o tecido SCZ, mergulhar os tecidos dissecados em PBS frio antes de cortar. </li><li> Re-suspender o tecido picado com 1 ml de tampão de digestão, o tecido transferir para um tubo de 15 ml contendo 2 ml de tampão de digestão, e incubar durante 30 min num banho de água a 37 ° C. Nota: Agitar o tubo a cada 10 minutos para misturar bem. </li></ol> 3. Cultura Adulto Neural Stem Cell Subcallosal Zone-derivado <ol><li> Toque o tubo suavemente para dissociar o tecido digerido, e em seguida, centrifugar o tubo a 145 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante, re-suspenso do tecido digerido com 1 mL de meio de pré-aqueceu-se N2 para lavar o tampão de digestão, e pipetar suavemente a solução de amostra no máximo 5 vezes usando uma pipeta P1000. Nota: Over-trituração com uma estreitapipeta de ponta pode diminuir a viabilidade celular e subsequente crescimento. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 145 xg durante 5 min. Depois de descartar o sobrenadante, re-suspender o sedimento de células em 1 ml de meio N2. </li><li> Prepare 1 ml de meio N2 num prato não-revestido de 6 poços e adicionar 1 mL da suspensão de células para fazer um volume final de 2 ml. </li><li> Adicionar EGF (20 ng / ml) e de bFGF (20 ng / ml) em cada poço. Agite suavemente o prato de cultura de 6 poços à mão para misturar os fatores de crescimento adicionados com as células plaqueadas. Manter a placa de 6 cavidades em uma incubadora de CO 2 temperatura de 37 ° C e 5%. </li><li> Adicionar EGF (20 ng / ml) e de bFGF (20 ng / mL) a cada poço a cada dia durante 8 dias. Cada terceiro dia, adicionar 200 ul de meios de N2 para manter o volume de 2 ml aproximada do meio. </li></ol> 4. Passaging de NSC como neuroesferas e para culturas em monocamada <ol><li> Reúna os neurospheres e transferi-los para um novo tubo cônico de 15 ml. Nota: O número de neuroesferas (&gt; 50 um de diâmetro) epR bem do SCZ de um único cérebro de rato foi de 64,3 ± 7,31, o que era menos do que a do SVZ (190,5 ± 6.33) 9. </li><li> Incubar as neuroesferas com 0,5 ml de tampão de dissociação durante 5 min num banho de água a 37 ° C para dissociar as neuroesferas em células individuais. neurospheres primárias podem ser dissociados em células individuais e mantido ao longo de várias passagens como neuroesferas ou monocamada culturas. Nota: Expansão SCZ-aNSCs como uma monocamada é superior a neurospheres porque SCz-aNSCs podem ser passadas&gt; 10 vezes em um formato de cultura em monocamada, mas &lt;5 vezes em um formato de cultura neurosphere. Cuidado: EZ-aNSCs exibem agregação forte, e é difícil para dissociar-los em células individuais. Assim, o formato da cultura neuroesfera não é recomendado para a expansão de células de rotina. </li><li> Suavemente pipetar a solução amostra cima e para baixo com uma pipeta P1000 menos de 5 vezes e o tubo de centrifugação a 145 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e re-supassar as neuroesferas com 1 ml de meio N2. Nota: Mais de trituração com uma ponteira estreita pode diminuir a viabilidade celular e subsequente crescimento. </li><li> Para contar as células, fazer uma mistura 1: 1 de suspensão de células (10 uL) e a solução de azul de tripano a 0,4%, e depois contar o número de células vivas em um hematocytometer. Depois de o revestimento de uma placa de 6 poços com PLO / laminina, a chapa células a 2,5 x 10 5 culas / ml com 2 ml de meio para cada poço de N2. Nota: As mudanças na densidade celular pode afetar sua condição e potencial de diferenciação. </li><li> Manter as SCZ-aNSCs com um tratamento diário de factores de crescimento (2 ml, 20 ng / ml) durante 5 dias, e eles passagem los. </li></ol> 5. Diferenciação de Subcallosal Zona derivados de células-tronco adultas neurais <ol><li> ANSCs placa sobre uma lamela de 18 milímetros PLO / laminina-revestidas com 1 x 10 5 culas / ml em 1 ml de N2 com factores de crescimento (20 ng / ml) durante a diferenciação dos SCZ-aNSCs. </li><li> O dia seguinte,quando as células estão firmemente ligados à lamela, trocar o meio de crescimento com N2 para remover os factores de crescimento. </li><li> Após 6 dias, lavar as células diferenciadas com 1 ml de PBS para remover os restos celulares e corrigi-los para a imunocoloração. Nota: podem ser de BrdU incorporada no ADN recentemente sintetizado de células em proliferação. Portanto, se desejado, BrdU (10 ug / mL) pode ser adicionado a células vivas antes da fixação das células. </li></ol> 6. Células Estaminais Imunomarcação Adulto Neurais e diferenciado Progenitores <ol><li> Para a imunocoloração, lavar as células com PBS e corrigi-los com PFA a 4% durante 20 min à temperatura ambiente. Cuidado: PFA é altamente tóxico; evitar o contacto com a pele e os olhos. </li><li> Remova a PFA 4%, lavar as células fixas com PBS 3 vezes, e em seguida armazená-los a 4 ° Cuntil eles são necessários para a imunocoloração. </li><li> Incubam-se as células sobre a lamela com uma solução de bloqueio (3% de albumina sérica bovina e 0,1% de Triton X-100 em 1x PBS) durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Prepare os anticorpos primários em solução de bloqueio fresco e incubar as amostras durante a noite a 4 ° C. <ol><li> Imunocoloração os aNSCs <ol><li> Manchar o aNSCs utilizando anticorpos anti-nestina e anticorpos anti-BrdU. Antes de fixação, adiciona-se 20 ug de BrdU para os aNSCs e incubar durante 2 h. Realizar o passo de desnaturação utilizando HCl 2 N durante 20 min a 37 ° Cbefore realizando o passo de bloqueio. </li></ol></li><li> Imunocoloração os progenitores diferenciadas: <ol><li> Utilizar anticorpos anti-proteína glial fibrilar ácida (GFAP) anti-O4, anti-BIII-tubulina, e para marcar os progenitores diferenciadas. </li></ol></li></ol></li><li> Lavam-se as amostras com PBS 3 vezes e incuba-os com anticorpos secundários conjugados com corantes fluorescentes (1: 500) em solução de bloqueio durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lavar as amostras 3 vezes com PBS. Nota: Utilize anticorpos secundários que correspondem aos anfitriões do primárioanticorpos. Hoechest33343 (1: 2000) é usado para coloração nuclear. </li><li> Adicionar solução de montagem a uma lâmina de vidro e prosseguir com a montagem. Observe e imagem da amostra sobre um microscópio confocal de múltiplos comprimentos de onda: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm), e Hoechest33343 (405 nm). </li></ol>

<ol>
	<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell.">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Developmental biology. 175, 1-3 (1996).</li><li>Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enriched+monolayer+precursor+cell+cultures+from+micro-dissected+adult+mouse+dentate+gyrus+yield+functional+granule+cell-like+neurons.">Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons.</a> PloS one. 2, e388 (2007).</li><li>Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+adult+subventricular+zone.">Neurogenesis in adult subventricular zone.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 629-634 (2002).</li><li>Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+Adult+Hippocampus.">Neurogenesis in the Adult Hippocampus.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, a018812 (2015).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li><li>Seri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+organization+of+the+SCZ:+a+large+germinal+layer+containing+neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+brain.">Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain.</a> Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).</li><li>Kim, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+spontaneous+production+but+massive+programmed+cell+death+of+new+neurons+in+the+subcallosal+zone+of+the+postnatal+mouse+brain.">Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain.</a> The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).</li><li>Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+changes+in+the+subcallosal+zone+neurogenesis+of+mice.">Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice.</a> Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+Cortical+Neurogenesis+from+the+Neural+Stem+Cells+in+the+Adult+Mouse+Subcallosal+Zone.">Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone.</a> Stem Cells. , (2015).</li><li>Nunes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain.">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature medicine. 9, 439-447 (2003).</li><li>Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+widespread+is+adult+neurogenesis+in+mammals?.">How widespread is adult neurogenesis in mammals?.</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).</li><li>Gage, F. H., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells:+generating+and+regenerating+the+brain.">Neural stem cells: generating and regenerating the brain.</a> Neuron. 80, 588-601 (2013).</li><li>Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+secondary+neural+tube-derived+embryonic+neural+stem+cells+in+vitro.">Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro.</a> Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).</li><li>Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+heterogeneity+demonstrated+by+molecular+phenotyping+of+clonal+neurospheres.">Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).</li><li>Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+generation+of+neuronal+cells+from+the+adult+mouse+brain.">De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+and+fibroblast+growth+factors+behave+as+mitogenic+regulators+for+a+single+multipotent+stem+cell-like+population+from+the+subventricular+region+of+the+adult+mouse+forebrain.">Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).</li><li>Wachs, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficacy+of+clonal+growth+and+expansion+of+adult+neural+stem+cells.">High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).</li><li>Xiong, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+time+for+passaging+neurospheres+based+on+primary+neural+stem+cell+cultures.">Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures.</a> Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).</li><li>Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Matrigel-based+culture+for+expansion+of+neural+stem+cells.">Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells.</a> Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).</li><li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse.">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).</li><li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+two+cultures:+isolation+and+culture+of+adult+neural+stem+cells+from+the+two+neurogenic+zones+of+individual+mice.">One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225 (2014).</li></ol>

The authors declare no conflicts of interest.

Este documento descreve um protocolo detalhado para gerar NSCs do SCZ do rato adulto e para mantê-los para várias aplicações. Há três passos críticos para o estabelecimento do sistema in vitro cultura necessária para purificar e expandir a EZ-NSC. Em primeiro lugar, é importante para garantir que a região de SCZ é precisamente dissecados a partir de outros potenciais regiões neurogénicos (Figura 1B). Secções espessas e precisos que contêm as regiões SCz foram obtidos com uma matriz cerebral intervalo de 1 mm, e, em seguida, uma agulha fina foi utilizado para a micro-dissecção de SCZ de outras regiões corticais (Figura 1A). Quando não NSC a partir de tecidos adjacentes, tal como o córtex cerebral, são cultivadas a EZ-aNSCs, a morte ocorre catastrófica, o que afecta negativamente a viabilidade e a esfera-formação de SCZ-NSC 16-18,22. O SCZ caudal (2-3 mm posterior ao bregma) foi confirmado como a melhor região para gerar distintas SCz-aNSCs. Em segundo lugar, o approptratamento enzimático riate nas etapas de colheita e Passaging é crítico para a obtenção de um elevado rendimento de células. Dispase II e papaína foram mais eficazes para isolar aNSCs de tripsina. Dissociação de células para passaging com tampão de dissociação em vez de tripsina reforçada a sua viabilidade 19. dissociação mecânica e a trituração com uma pipeta deve ser mínima. Em terceiro lugar, um filtro de células é geralmente usado em sistemas de cultura primária para remover os detritos celulares após digestão do tecido. No entanto, devido à localização de SCZ-aNSCs, estas células são obtidas após a quebra da substância branca através de digestão enzimática e trituração mecânica. Durante a filtração com um filtro de células, uma quantidade substancial de células seria perdida. Portanto, a cultura SCz-aNSCs sem o uso de um filtro celular é a melhor maneira de obter um alto rendimento de células. Embora ambas as culturas de neuroesferas e culturas em monocamada pode ser aplicado para a manutenção da NSC, uma limitação da neuroesfera da cultura é que NSCs único dissociado após a divisão podem ser agregados ao acaso. Os resultados da agregação de diferentes tamanhos de neurospheres. Quando o tamanho de um neuroesfera atinge um certo valor crítico, o neuroesfera cresce como uma estrutura heterogénea, devido à falta de nutrientes, factores de crescimento, e o oxigénio no núcleo 20. Além disso, neurospheres com tamanhos grandes não são facilmente dissociados com tampão de dissociação e requerem tempos de tratamento mais enzimáticos com vasta trituração mecânica, levando à viabilidade celular inferior. Portanto, o sistema de cultura em monocamada é recomendado para manter a EZ-aNSCs através de múltiplas passagens. Em um sistema de cultura em monocamada, aNSCs são estavelmente mantido como NSC (tipo B), sem diferenciação espontânea em células específicas, tais como progenitoras (tipos A e C) (Figura 3A). SCz-aNSCs foram passadas por longos períodos, &lt;5 passagens em um formato neurosphere e&gt; 10 passagens como uma monocamada. Este é consiStent com resultados anteriores que sugerem que o sistema de cultura em monocamada mantém NSC in vitro em culturas a longo prazo 21. No entanto, a velocidade de proliferação diminuída, e a porção de células que morrem aumentou durante 5 passagens. Passaging prolongada afeta o multipotency e diferenciação neuronal com o aumento de aberrações cromossómicas 22. Portanto, para evitar efeitos Passaging prolongado, recomenda-se a utilização passagem precoce (&lt;passagem 5) células de proliferação e análise de diferenciação. Embora o potencial de auto-renovação de SCZ-aNSCs é semelhante ao SVZ-aNSCs, a diferenciação neuronal foi menos mostrado na SCZ-aNSCs 9. Os métodos para isolar as regiões de aNSCs neurogénicos do cérebro adulto, incluindo o SVZ e giro dentado (DG), foram estabelecidas 22. Embora tais protocolos promoveram o isolamento e cultivo de aNSCs in vitro, há várias limitações para a obtenção de um elevado número decélulas. Muitos protocolos utilizam um helicóptero tecido cerebral que podem causar a perda de tecido cerebral durante o procedimento de corte. Outra abordagem para isolar aNSCs de regiões neurogénicos usa um corte coronal através do cérebro utilizando um bisturi. Isto é seguido pelo micro-dissecção de SVZ ou do DG ao longo da fenda longitudinal 23. A presença de outras regiões do cérebro pode causar outros tipos de células para a cultura contaminar ANSC, que possam afectar a viabilidade das células in vitro. Com o protocolo atual, muitas amostras diferentes podem ser gerenciados em um único experimento, incluindo controles contra uma variedade de grupos experimentais. Além disso, o corte usando uma matriz cerebral é superior a uma ferramenta de corte cerebral, uma vez que permite a realização de NSC a partir de várias regiões do cérebro com um rendimento celular elevada. Também permite a comparação de aNSCs de diferentes regiões do mesmo cérebro. Transplante e engenharia de NSC endógenos foram considerád como possíveis estratégias para a terapia com células-tronco. Para isso, os estudos in vitro sobre as características de aNSCs também devem ser exaustivamente explorado. Portanto, o estabelecimento de um bem caracterizada no sistema de cultura in vitro será útil para promover a aplicação da NSC. Neste sistema de cultura, as propriedades de células-tronco de SCZ-aNSCs foram bem mantidas, tal como evidenciado pela auto-renovação e diferenciação de linhagem múltipla sob as condições apropriadas. Portanto, este sistema de cultura pode ser utilizado para a expansão de SCZ-aNSCs para estudos biológicos e aplicações terapêuticas.

NSCs have characteristics of self-renewal and multiple-lineage differentiation. To confirm these properties, a neurosphere culture system has widely been used. The neurosphere culture system was developed in the early 1990s and served as a standard stem cell culture system1. Depending on self-renewal potency, NSCs continuously proliferate and generate a cell mass in a suspension culture. The number of cells and the size of the neurosphere are considered to be closely associated with the proliferation properties of the NSCs. Monolayer cultures are also widely used for the maintenance and differentiation of NSCs. Compared to the neurosphere culture, the monolayer culture system provides better homogenous maintenance and expansion of NSCs2. These two well-developed culture systems have contributed to the characterization of aNSCs in vitro. 
NSCs reside in different brain regions, such as the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and the subgranular zone (SGZ) of the hippocampus3-5. The subcallosal zone (SCZ) of the caudal subcortical white matter is recognized as a novel neurogenic region6-8. It was recently reported that the SCZ-aNSCs have therapeutic potential in traumatic brain injury9. Compared to other neurogenic regions, the SCZ resides along the subcortical white matter. In the human brain, subcortical white matter occupies a larger region than in the mouse brain10. Therefore, an understanding of the characteristics of SCZ-aNSCs using an in vitro culture system is important in order to promote the potential use of these cells for neural regeneration. Precise dissection of the desired brain region is required to rule out possible contamination by unwanted regions containing active or quiescent NSCs. For instance, aNSCs in non-neurogenic regions can be activated and produce new neural cells in injured brains or during in vitro culturing11. To obtain NSCs from the SCZ, cells were collected from brain slices containing the SCZ. Then, a careful micro-dissection of the SCZ region was performed using a fine needle. To generate the neurosphere from the SCZ, micro-dissected SCZ tissue chunks were dissociated into single cells and then cultured as a suspension in the presence of epidermal growth factor (EGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF). After SCZ-aNSCs form neurospheres, they also can be maintained as neurospheres or monolayers for expansion. This procedure also demonstrates immunostaining processes with various markers for the detection of NSCs and their progeny after their expansion and differentiation in a monolayer culture. Here, a visual protocol of the SCZ-aNSC culture system is presented. This protocol contains detailed instructions for the micro-dissection of the SCZ region and for the maintenance and passaging of the cells.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Medium components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>+L-glutamin, +Sodium bicarbonate</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth factor&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>BIOSOLUTION</td><td>BP007a</td><td>1x dilution</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Dissociattion buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>04-942-078-001</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ICT</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tool&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>WPI</td><td>555229F</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Storz</td><td>E3321-C</td><td></td></tr><tr><td>Brain matrix (1 mm)</td><td>RWD</td><td>68707</td><td></td></tr><tr><td>Double-edged razor</td><td>DORCO</td><td>ST-300</td><td></td></tr><tr><td>30 G needle</td><td>SUNGSHIM</td><td>N1300</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>35 mm dish</td><td>SPL</td><td>10035</td><td>Petri dish</td></tr><tr><td>100 mm dish</td><td>SPL</td><td>10090</td><td>Petri dish</td></tr><tr><td>Cover slip (18 mm)</td><td>Deckglaser</td><td>111580</td><td></td></tr><tr><td>12 well dish</td><td>SPL</td><td>32012</td><td>non-coating</td></tr><tr><td>6 well dish</td><td>SPL</td><td>32006</td><td>non-coating</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Coating materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLO</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>0.01%</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary antibodies&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB353</td><td>mouse (1:1,000)</td></tr><tr><td>EGFR</td><td>Abcam</td><td>ab2430</td><td>rabbit (1:1,000)</td></tr><tr><td>DCX</td><td>Santa Cruz</td><td>SC8066</td><td>goat (1:500)</td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>rabbit (1:2,000)</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Invitrogen</td><td>13-0300</td><td>rat (1:1,000)</td></tr><tr><td>O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>mouse (1:500)</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>Rat (1:500)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Secondary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>anti-mouse cy3</td><td>Jackson</td><td>715-165-151</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse 647</td><td>Jackson</td><td>715-606-150</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit 488</td><td>Alexa</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit cy3</td><td>Jackson</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit 647</td><td>Jackson</td><td>711-605-152</td><td></td></tr><tr><td>anti-goat 488</td><td>Alexa</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>anti-goat cy3</td><td>Jackson</td><td>705-165-147</td><td></td></tr><tr><td>anti-goat 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21447</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat cy3</td><td>Jackson</td><td>712-166-150</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat 647</td><td>Jackson</td><td>712-605-153</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunostaining materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Millipore</td><td>82-100-6</td><td>3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>usb</td><td>22686</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Biosesang</td><td>P2031</td><td></td></tr><tr><td>Hoechest33342</td><td>Life Technology</td><td>H3570</td><td>Dye for staining nuclei</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of adult neural stem cells from the mouse subcallosal zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Definindo o sistema de cultura para aNSCs da região neurogênica desconhecido é essencial para a compreensão dessas células e para o desenvolvimento de seu potencial uso no reparo do cérebro 12. Sabe-se que as NSC em diferentes estádios de desenvolvimento ou em regiões diferentes se comportam de maneira diferente 3,4. Recentemente, foi relatado que células-derivadas SCZ exibem potenciais diferenciais para a diferenciação neuronal in vivo e in vitro, em comparação com células-derivadas da SVZ 7-9. Portanto, para isolar precisamente cada região neurogénica, fatias de cérebro que incluem o SCZ foram dissecados utilizando uma matriz de cérebro de 1 mm (Figura 1A). Após 8 dias de cultura com factores de crescimento, derivados da aNSCs EZ pode formar neuroesferas, em que as células podem ser subsequentemente mantida (Figura 1B). Uma vez que um subconjunto de NSC nas neuroesferas podem ser spontaneously diferenciadas 13, um sistema de cultura em monocamada é também útil para a manutenção da população relativamente homogénea de SCZ-aNSCs. Os fatores de crescimento e enzimas dissociação tais como tripsina não facilmente penetrar profundamente dentro da neurosphere 14,15. culturas em monocamada fornecer mais até mesmo condições para a expansão do NSC. A partir de neuroesferas primárias, SCZ-aNSCs foram dissociadas em células individuais através de um tratamento tampão de digestão. Um dia após a sementeira de células, foram aNSCs ligado à placa revestida e a proliferação de células expostas (Figura 2A). Para confirmar a sua potência de proliferação, BrdU foi adicionado para o meio. Após incubação com BrdU durante 2 h, as células foram prontamente corados com anti-BrdU (um marcador para a proliferação) e anti-nestina (um marcador para as células estaminais neurais) anticorpos, indicando que a EZ-aNSCs estão a proliferar activamente e mantendo as principais propriedades de células estaminais (Figura 2B). Assim, eles não o fizeram exhIBIT marcadores de células diferenciadas, tais como EGFR (expressos em células transitoriamente amplificando) e DCX (expressa em neuroblastos) (Figura 2C). Para confirmar o potencial de diferenciação múltiplo de SCZ-aNSCs, factores de crescimento foram removidos a partir do meio de cultura. Após 6 dias, as células foram imunocoradas com vários fabricantes para células diferenciadas. Para exibir as diferentes progênies de aNSCs, marcadores de neurônios (TuJ1), astrócitos (GFAP) e oligodendrócitos (O4) foram empregadas; todos estes tipos de células foram geradas a partir da SCZ-aNSCs (Figura 3). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54929/54929fig1.jpg" /> Figura 1: Isolamento da região de SCZ e formação da neuroesfera. (A) Processo para a dissecação da região de SCZ a partir do cérebro do rato adulto. Para a cultura do SCZ-ANSCs, um cérebro 8 semanas de idade mouse é colocado sobre uma matriz cerebral (intervalos de 1 mm). Após o corte, de 1 mm de fatias cerebrais que incluíam a região de SCZ (2-3 mm a partir da bregma) foram dissecados (indicado pela linha a tracejado vermelho). Formação (B) Neurosphere. Oito dias após a cultura in vitro, neuroesferas primárias (passagem 0) foram formados e passadas. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54929/54929fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54929/54929fig2.jpg" /> Figura 2: Manutenção dos SCZ-aNSCs como uma cultura em monocamada. (A) um dia após a sementeira das células dissecadas, SCZ-aNSCs foram ligados e expandidos para uma placa revestida de uma forma de monocamada (à esquerda). Três dias após a manutenção, o número de SCZ-aNSCs foi aumentada (à direita). (B) A imunocoloração com BrdU (vermelho, um marcador para a células em proliferação), nestina (verde, um marcador para as células estaminais neurais), e Hoechest33343 (azul, um marcador para núcleos). (C) A imunocoloração com estaminal neuronal / marcadores de células progenitoras nestina (vermelho, um marcador para as células estaminais do tipo B neural), EGFR (verde, um marcador para as células-amplificando transientes de tipo C), e DCX (azul, um marcador para o tipo A neuroblastos). Os núcleos foram contrastadas com Hoechest33343 (branco). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54929/54929fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54929/54929fig3.jpg" /> Figura 3: imunocoloração das células diferenciadas dos SCz-aNSCs. Imunocoloração com marcadores de diferenciação TuJ1 (verde, um marcador de neurônios imaturos), O4 (vermelho, um marcador de oligodendrócitos) e GFAP (griteOW, um marcador para astrócitos). imagens ampliadas são mostrados como inserções. Hoechest33343 (azul) foi usado para contra-coloração dos núcleos. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54929/54929fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone at JoVE.com

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolamento e Cultura de células estaminais adultas neurais do Subcallosal Zona Rato

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

isolation-culture-adult-neural-stem-cells-from-mouse-subcallosal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K visualizações.  Korea University College of Medicine. Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described. 

Vídeo: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolamento e Expansão do Rato Adulto células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Neurociência

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

Isolamento e Cultura de células da crista neural-tronco de folículos capilares humanos

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nucleofecção eficiente de NSCs isoladas da zona subventricular murina

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Nucleofecção aprimorada para entrega de genes de alta eficiência em culturas de células-tronco neurais derivadas da zona subventricular murina</

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

Isolamento, expansão e nucleofecção de células-tronco neurais da zona subventricular murina adulta

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...

Isolamento e Cultura de células estaminais adultas neurais do Subcallosal Zona Rato

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Isolamento e Expansão do Rato Adulto células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Isolamento e Cultura de células da crista neural-tronco de folículos capilares humanos

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

Isolamento, expansão e nucleofecção de células-tronco neurais da zona subventricular murina adulta

Isolamento, expansão e nucleofecção de células-tronco neurais da zona subventricular murina adulta

Isolamento, expansão e nucleofecção de células-tronco neurais da zona subventricular murina adulta