This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.

NOTA: O esquema do protocolo é demonstrado na Figura 1, incluindo uma linha de tempo dos procedimentos. 1. Cultura e passagem de células CVE <ol><li> Culturas de células (células ECV bEnd.3) em meio de crescimento completo (Modificado de Eagle Médium alto teor de glucose de Dulbecco, DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina, em um balão de cultura T75 cm 2 de tecido. Crescer a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. </li><li> Remova e descarte o meio de cultura celular. Lavar a camada celular com uma solução de EDTA 0,25% Tripsina-0,03%, e em seguida adicionar 1 - 2 ml de solução de tripsina-EDTA para o balão e manter o balão a 37 ° C durante 3-5 min. Observe as células sob um microscópio invertido até a camada de células é separada. Adicionam-se 10 ml de meio de crescimento completo e aspirar as células por pipetagem suave. </li><li> Decanta-se o fluido e as células para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugação a 700 xg durante 5 min para remover os detritos celulares. </li&gt; <li> Descartar o sobrenadante do tubo de centrifugação. Adicionam-se 10 ml de meio de crescimento completo e re-suspensão da pelota celular. Rodar as células a 700 xg durante 5 min. </li><li> Descartar o sobrenadante do tubo de centrifugação. Re-suspender o sedimento de células em meio de crescimento completo a uma concentração de 2,0 x 10 5 células / ml (determinado por contagem utilizando um hemocitómetro; excluir as células mortas por coloração com Trypan-azul). NOTA: As células recém-descongeladas são sub-cultivadas durante pelo menos 3 passagens para as experiências. </li></ol> 2. Seed e tratar células em placas de cultura celular <ol><li> Semear as células em uma placa de cultura de células de fluxo extracelular de 96 poços: 80 uL / ​​poço. Colocar a placa de cultura de células a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. Nota: 16 x 10 3 culas por po vai atingir 60-80% de confluência em 24 horas. </li><li> Se as células são expostas a um produto químico, adicionar os tratamentos uma vez que as células são ligadas à parte inferior da placa (8 - 24 h após verding). NOTA: Para as experiências de transfecção, não adicionar antibióticos no meio de crescimento completo. </li></ol> 3. Avaliação da função mitocondrial Usando o Bioanalyzer <ol><li> Antes do início do ensaio, hidrato de um cartucho do sensor de fluxo com extracelular de calibração por adição de 150 uL de fluxo extracelular solução de calibração para a placa e a incubação O / N a 37 ° C, sem CO2. </li><li> Usando a estação de lavagem de placas, mudar o meio de cultura celular em pH 7,0 extracelular fluxo de meio de ensaio. Incubar as células a 37 ° C, sem CO2, durante 30 - 60 min. </li><li> Preparar soluções de trabalho de 8 oligomicina uM, 4,5 uM FCCP, rotenona 10 uM, 10 uM e antimicina A em DMEM. Carga de 25 mL das soluções estoque em portos de injeção do cartucho: Port A, oligomicina; Porto B, FCCP; Porta C, rotenona e antimicina A com meio de ensaio de fluxo extracelular. Aplicar o protocolo de ensaio como descrito na Tabela 1. </li><li> Coloque o cartucho hidratado no Bioanalyzer e realizar a calibração, clicando no botão &quot;Iniciar&quot;. Após a calibração estiver concluída, remova a placa inferior do cartucho e carregar a placa de célula clicando o prompt &quot;Descarregar cartucho&quot;. Continue o ensaio até que o fim de todas as medições. </li><li> Abra o arquivo de dados e obter os valores da taxa do Bioanalyzer. Exportar os dados para um arquivo de planilha. </li></ol> 4. Análise de Dados NOTA: Os cálculos para análises de dados são formulados abaixo. Os valores são obtidos a partir do instrumento Bioanalyzer como o OCR apresentado na Figura 2. <ol><li> Para calcular respiração basal, subtrair a respiração não-mitocondrial (medidas 10 - 12) a partir do valor basal (medida 3). NOTA: respiração basal = Basal - respiração não-mitocondrial = Taxa ③ - Taxa ⑩ ~ ⑫. </li><li> Para calcular producti ATPem, subtrair a respiração ATP-ligada (medições de 4 - 6) a partir do valor de base (medição 3). NOTA: a produção de ATP = Basal - respiração ATP ligada = Taxa ③ - Taxa ④ ~ ⑥. </li><li> Para calcular a respiração máxima, subtrair a respiração não-mitocondrial (medidas 10 - 12) a partir da respiração máxima (medidas 7 - 9). NOTA: respiração máxima = respiração máxima - não mitocondrial respiração = Taxa ⑦ ~ ⑨ - Taxa ⑩ ~ ⑫. </li><li> Para calcular a capacidade de reposição, subtrair o valor basal (medida 3) a partir da respiração máxima (medidas 7 - 9). NOTA: A capacidade de reposição = respiração máxima - Basal = Taxa ⑦ ~ ⑨ - Taxa ③. </li><li> Para calcular o vazamento do protão, subtrair a respiração não-mitocondrial (medida 10 - 12) a partir da respiração de ATP-ligada (de medição 4). NOTA: vazamento Proton = respiração ATP ligada - não-mitocôndriasl respiração = Taxa ④ - Taxa ⑩ ~ ⑫. </li></ol>

<ol>
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The authors declare no potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article. Open Access fees for this article were provided by Agilent Technologies.

Este protocolo representa um método para a avaliação do fenótipo bioenergética em células endoteliais vasculares cerebrais. Ele serve como um ensaio de base para a avaliação mitocondrial de células endoteliais, e é óptima para experiências concebidas para investigar os mecanismos de estímulos que podem afectar a via de sinalização mitocondrial em células ECV. Ele também fornece um método para testar agentes terapêuticos potenciais para doenças BBB-perturbações associadas. Passos críticos dentro do Protocolo bioanalyzers fluxo extracelular tem a capacidade de medir OCR em tempo real. Neste ensaio, identificando a densidade celular apropriada é crítica. Se a densidade de células é inferior a 8 x 10 3 culas por po, o OCR basal é muito baixa para ser analisado (Figura 2 e Figura 3); Se a densidade de células é superior a 32 x 10 3 culas por po, as células não respondem a oligomicina ou FCCP treatmeNTS (Figura 2 e Figura 3). A densidade celular óptima para esta linha de células no nosso modelo experimental é de 16 × 10 3 células por poço, o que demonstra resultados replicáveis e sensibilidade a estímulos 7 e tratamentos 10,14. Se um Bioanalyzer de 24 poços é usado, novas titulações da densidade celular seria necessário para o ensaio. Ele está documentado que CVEs têm um grande volume de mitocôndrias em comparação com outras células endoteliais ou tipos de tecido 15,16, sugerindo a necessidade de uma maior produção de energia e menos células para medir o metabolismo bioenergética. Nós testamos vários tipos de células endoteliais do cérebro, tais como primário e imortalizado células endoteliais vasculares cerebrais murino 7 e imortalizado células endoteliais vasculares cerebrais humanos (dados não publicados). Estas células necessária densidades celulares semelhantes para atingir o OCR (respiração basal OCR aceitável dentro de 40-160 pmol / min duranteplacas de 96 poços e 50-400 pmol / min para placas de 24 poços), quando o ensaio foi realizado bioenergética. Kaczara et al. Relataram que mede o metabolismo bioenergético em células humanas umbilical veia endoteliais (HUVEC), que usou uma densidade celular mais elevada 17. O nosso grupo não avaliou células dos vasos de outros tecidos ou órgãos. Teoricamente, o Bioanalyzer poderia potencialmente ser usado em qualquer tipo de célula, mas requer optimizar o ensaio para a densidade celular, meio de cultura de células, e as condições de cultura (algumas células específicas podem exigir placas revestidas a crescer bem). É necessário que as experiências são concluídas para assegurar a taxa de OCR está dentro da gama aceitável. Se o OCR em células endoteliais de outros órgãos é inferior a partir de cérebros de AVCs, aumentando a densidade celular pode ajudar a obter dentro de um intervalo aceitável de OCR. Alternativamente, se as células não estão usando fosforilação oxidativa como a sua principal fonte de energia, o Bioanalyzer não seria uma optimal ensaio. O Bioanalyzer permite a interrupção sequencial da cadeia de transporte de elétrons, com base na ordem em que são aplicados os reagentes. Em primeiro lugar, é aplicada oligomicina, que inibe complexo V mitocondrial (ATP sintase). Em segundo lugar, FCCP, um desacoplador de electrões, é aplicada, o que conduz ao rompimento do gradiente de protões. Finalmente, rotenona e antimicina A, que inibem mitocondrial Complexos I e III, respectivamente, são aplicados a levar a uma inibição total do fluxo de electrões. A ordem de exposição à droga é essencial porque as drogas que bloqueiam a reação específica da cadeia de transporte de elétrons, e as mudanças sequenciais podem ser mensurados para refletir a função mitocondrial. Modificações e resolução de problemas Para avaliar a resposta a estímulos mitocondrial em células ECV, recomenda-se que os estímulos são aplicados às células após as células aderidas ao fundo da placa de cultura celular (ver a linha de tempomostrado na Figura 1; geralmente leva pelo menos 6 h). Para obter resultados reproduzíveis pelos tratamentos, é extremamente importante para manter a densidade celular consistente. Se pré-tratamentos são concebidos antes da semeadura de células, densidade celular para cada pré-tratamento devem ser cuidadosamente medido, excluindo as células mortas para semeadura. Se transfecção está incluído na concepção experimental, referem-se a transfecção protocolo do fabricante. Demonstrado nos dados apresentados na Figura 4, o miR-34a foi transfectado para as células ECV utilizando um kit de lipofectamina a transfecção, o que requer meio de cultura celular antibióticos livres e um teste de MITO-tensão para avaliar as alterações na função metabólica com a sobre-expressão de miR-34a . As doses de plasmídeo também pode ser optimizada, como anteriormente publicado a 13. Outra modificação que pode ser feita com o protocolo é a alteração das concentrações dos reagentes. Uma curva de titulação de oligomicina, FCCP, e / ou rotenona e antimicina A pode ser completed. Além disso, se este ensaio é utilizado para análises de elevado rendimento de várias drogas, sugere-se a incluir um ensaio paralelo para medir a viabilidade celular e a proliferação celular, o que foi descrito nas nossas publicações anteriores 7,13. Os valores de OCR é significativamente afectada pelo número de células (Figuras 2 e 3), e os ensaios de proliferação e viabilidade celular beneficiar a normalização dos dados. No entanto, a conclusão destes ensaios são a critério de cada laboratório individual. Limitações da técnica A principal limitação deste protocolo é que nós só usamos um modelo in vitro cultura de células in no estudo. Actualmente, não existem disponíveis modelos ex vivo ou modelos animais que podem dirigir a função mitocondrial de células endoteliais. Os novos modelos são esperados para ser desenvolvida para a avaliação da função in vivo e bioenergética <em&gt; ex vivo em estudos futuros. Outra limitação é a extensão das avaliações de barreira seguintes medidas bioenergética. As experiências não pode ser executada porque, em primeiro lugar, após a realização das medições bioenergéticos, a viabilidade celular diminui a seguir a interrupção completa da cadeia de transporte de electrões; segundo, placas e inserções de cultura de células específicas são necessárias para detectar valores bioenergética e não se encaixam inserções para as avaliações de barreira. Portanto, não há muitos ensaios funcionais que podem ser concluídas após o ensaio de bioenergética. No entanto, espera-se que os dispositivos especiais podem ser desenvolvidos para executar ensaios funcionais antes do ensaio bioenergética. Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos As técnicas anteriores para avaliar a função mitocondrial exigiu o isolamento das mitocôndrias das células 18. este neW técnica usando o Bioanalyzer permite a medição da actividade mitocondrial em células intactas, o que preserva mais do ambiente celular do que avaliar mitocôndrias isoladas. Aplicações futuras ou chegar depois de dominar esta técnica Este protocolo foi concebido e desenvolvido para a linha celular bEnd.3, mas também é compatível com endotelial vascular cerebral primário (pCVE) 7 ou outras células do endotélio, e demonstramos isto na nossa publicação anterior utilizando células pCVE 7. Quando são utilizados outros tipos de endotélio, o revestimento da placa de cultura e a utilização de factores de crescimento pode ser necessária. No entanto, o ensaio de titulação é recomendado para outros tipos de células, bem. Este protocolo oferece um método geral a ser adoptada na avaliação dos bioenergética de células ECV, e pode ser adicionalmente aplicado para estudos de mecanismos ou respostas terapêuticos desta maneira.

É amplamente reconhecido que o sangue-cérebro-barreira (BBB), formada por células endoteliais vasculares cerebrais (AVC) tem funções muito distintas e únicas primordiais para a biologia vascular. Estas células endoteliais usar mitocôndrias para gerar a maior parte do fornecimento celular de trifosfato de adenosina (ATP) como fonte de energia química. Além de fornecer ATP para as células ECV, mitocôndrias regulação de diversos processos celulares em células endoteliais vasculares, tais como sinalização celular, apoptose 1-4 5, e o controlo do ciclo celular e crescimento celular 6. A desregulação da função bioenergética mitocondrial em células ECV podem afectar a biogénese mitocondrial, levando a actividade de endotélio vascular danificado, e exacerbar doenças cerebrovasculares e desordens neurodegenerativas, por exemplo, acidente vascular cerebral 7,8 e doença de Alzheimer (AD) 9. Nós demonstramos que as células ECV insultos a seguir a exposição a lipopolysaccharide (LPS) prejudicar a função mitocondrial em células CVE e piorar acidente vascular cerebral resultados 7. Terc-butil-hidroquinona (tBHQ) aumenta mortalidade por AVC, interferindo com a fosforilação oxidativa em células CVE 10. Portanto, o modelo quantitativo da função bioenergética em células CVE não só pilotos uma série de estudos relacionados com o mecanismo de sistema nervoso central (SNC) doenças, mas também fornece um avanço na triagem de drogas de terapias dirigidas a função mitocondrial em biologia vascular. Mitocôndrias isoladas têm sido usados ​​para medir a função bioenergética. Nós 7 e outros 11 têm relatado avaliações da bioenergética celular em células intactas CVE usando um Bioanalyzer fluxo extracelular. O analisador proporciona a vantagem da avaliação do bioenergética celular endógeno. Este ensaio sensível e consistente mede o metabolismo mitocondrial de células ECV e pode ser utilizado para avaliar deficiência bioenergética por STImuli, investigar os mecanismos de vias de sinalização mitocondrial, e drogas de tela ou tratamentos que afetam a função mitocondrial em células CVE. A Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) é registrado pela Bioanalyzer usando uma abordagem de perfil farmacológico, combinando o uso de quatro disruptores mitocondriais: oligomicina, carbonil cianeto-4 (trifluorometoxi) fenil-hidrazona (FCCP), rotenona, e antimicina A. Neste protocolo, detalhamos uma abordagem otimizada que permite a medição e cálculo dos parâmetros funcionais mitocondriais em células CVE, incluindo respiração basal mitocondrial, a produção de ATP, vazamento de prótons, a respiração máxima e capacidade respiratória livre, em um único ensaio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">bEnd.3 cell line</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-2299</td>
			<td style="width:197px;">25-30 passages</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:147px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S12450</td>
			<td>10% in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Penicillin/Steptomycin</td>
			<td style="width:147px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30010</td>
			<td>1&#215;100 stocking</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">0.25% trypsin 0.03% EDTA solution</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-000-CI</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Glucose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CAS 50-99-7</td>
			<td>25 mM in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">O4876</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2920</td>
			<td>0.5 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Rotenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R8875</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CAS 1397-94-0</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Plate wash station</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux bioanayzer&#160;&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">XFe96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux cell culture plate</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux sensor cartridge</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux calibrant solution</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux assay medium</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102365-100</td>
			<td>PH buffered prior to assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells

A integridade do sangue-cérebro-barreira (BBB) ​​é crítico para evitar a lesão cerebral. endotelial vascular cerebral células (CVE) são um dos tipos de células que compõem o BBB; estas células têm uma procura muito alta energia, o que requer a função mitocondrial óptima. No caso de doença ou lesão, a função mitocondrial nestas células pode ser alterada, resultando em doença ou a abertura da BBB. Neste artigo, apresentamos um método para medir a função mitocondrial em células CVE usando células intactas, inteiras e um Bioanalyzer. Um ensaio de mito-stress é usada para desafiar as células que foram perturbadas, física ou quimicamente, e avaliar a sua função bioenergética. Além disso, este método também fornece uma maneira útil para rastrear novas terapêuticas que têm efeitos diretos sobre a função mitocondrial. Temos optimizada a densidade celular necessária para se obter as taxas de consumo de oxigénio que permitem o cálculo de uma variedade de para mitocondrialmetros, incluindo a produção de ATP, a respiração máxima e capacidade de reposição. Também mostram a sensibilidade do ensaio, demonstrando que a introdução da microRNA, miR-34a, conduz a uma diminuição pronunciada e detectável da actividade mitocondrial. Embora os dados apresentados neste documento é optimizado para a linha celular bEnd.3, temos também optimizada do protocolo para as células ECV primárias, sugerindo ainda mais a utilidade em modelos pré-clínicos e clínicos.

Para avaliar a função bioenergético das células CVE em resposta ao estresse oxidativo, nós escolhemos a linha de células de endotélio murino microvascular cerebral bEnd.3, que exibe as mesmas características de barreira comparativos como microvasculares cerebral primário células endoteliais 12. Dado que a cinética e a intensidade relativa de resposta são variadas entre os vários tipos de células, a primeira série de experiências foram concebidas para se obter níveis mensuráveis ​​de OCR, identificando o número óptimo de células bEnd.3 para usar no ensaio de perfis metabólicos, mostrado na Figura 2. Após a avaliação, os dados são quantificados e apresentados na Figura 3. respiração basal, respiração máxima, e a capacidade respiratória de reposição mostrou uma resposta proporcional com a densidade celular. No entanto, a produção de ATP diminuída quando foram seleccionados 64 x 10 3 culas por po, o que sugere que a sobre-cultura de células confluentes énão é adequado para esta experiência. As densidades celulares óptimas ocorrer entre 8-32 x 10 3 culas por po, com base na resposta a disruptores mitocondriais. Para as experiências subsequentes, uma densidade de sementeira de 16 x 10 3 culas por po foi utilizada para permitir a detecção de alterações óptima em OCR. Usando 16 × 10 3 células por poço, observamos as respostas esperadas em OCR e demonstrou que o microRNA miR-34a reduz a função mitocondrial em células CVE (Figura 4). Descrevemos previamente que o miR-34a reduzida fosforilação oxidativa nestas células 13. As experiências repetidas mostraram também que a respiração máxima e à capacidade foram significativamente diminuída pela sobre-expressão de miR-34a em CVEs às 24 h pós-transfecção, embora a respiração basal, a produção de ATP, e vazamento de protões não tiveram alterações significativas (Figura 4) . estes dadosdemonstram a sensibilidade da Bioanalyzer para detectar alterações na função mitocondrial em CVEs. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" /> Figura 1. Planejamento Estratégico para o experimento. O cronograma para a célula, prato, e preparação do cartucho é indicado. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" /> As taxas de consumo de oxigênio Figura 2. Representante dados brutos da função bioenergética em Células CVE com várias densidades celulares. Foram medidos em células CVE com diferentes densidades celulares. Os dados representam média ± SD (n = 5); OCR: Consumo de Oxigênio Taxa; FCCP: cianeto carbonil-4- (trifluorometoxi) fenil-hidrazona;<html> Rot / Anti-A: rotenona e antimicina A. ①, ② e ③ indicam respiração basal; ④, ⑤ e ⑥ indicam ATP ligada a respiração; ⑦, ⑧ e ⑨ indicam máxima respiração; ⑩, ⑪ e ⑫ indicam a respiração não-mitocondrial. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" /> Figura 3. Os resultados representativos da função bioenergética em Células CVE com várias densidades celulares. Respiração basal, a produção de ATP, respiração máxima e capacidade de reposição são calculados a partir dos dados brutos gerados pelos bioenergética ensaio funcional na Figura 2 usando as fórmulas indicadas no ponto 4 . Os dados representam média ± SD (n = 5); OCR: Consumo de Oxigênio Rate.<html> f = &quot;https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" /> Figura 4: Os resultados representativos da função bioenergética diminuiu miR-34a (A) Os dados brutos da função mitocondrial seguinte superexpressão de miR-34a às 24 h pós-transfecção.. (B) respiração basal, a produção de ATP, a respiração máxima, e a capacidade não utilizada são calculados a partir dos dados brutos gerados pelos bioenergética ensaio funcional na Figura 4A; os parâmetros são calculados segundo as fórmulas indicadas na Secção 4. A sobre-expressão de miR-34a reduz a função mitocondrial em células ECV às 24 h pós-transfecção. Os dados representam média ± SD (n = 5); OCR: Consumo de Oxigênio Rate. ****, P &lt;0,0001.files / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" /> Tabela 1. O instrumento Executar protocolo.

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Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

mitocôndrias de células endoteliais são fundamentais para manter a integridade do cérebro-barreira sangue. Nós introduzimos um protocolo para medir a função bioenergética em células endoteliais vasculares cerebrais.

Avaliação da função bioenergética em células endoteliais Vascular Cerebral

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

evaluation-bioenergetic-function-cerebral-vascular-endothelial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K visualizações.  West Virginia University.  mitocôndrias de células endoteliais são fundamentais para manter a integridade do cérebro-barreira sangue. Nós introduzimos um protocolo para medir a função bioenergética em células endoteliais vasculares cerebrais. 

Vídeo: Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The vesicles are then retrieved from the plasma membrane (endocytosis) and grouped together with the general pool of vesicles within the nerve terminal, until they undergo a new exo- and endocytosis cycle (vesicle recycling). These processes have been studied using a variety of techniques such as electron microscopy, electrophysiology recordings, amperometry and capacitance measurements. Importantly, during the last two decades a number of fluorescently labeled markers emerged, allowing optical techniques to track vesicles in their recycling dynamics. One of the most commonly used markers is the styryl or FM dye 1; structurally, all FM dyes contain a hydrophilic head and a lipophilic tail connected through an aromatic ring and one or more double bonds (Fig. 1B). A classical FM dye experiment to label a pool of vesicles consists in bathing the preparation (Fig. 1Ai) with the dye during the stimulation of the nerve (electrically or with high K+). This induces vesicle recycling and the subsequent loading of the dye into recently endocytosed vesicles (Fig. 1Ai-iii). After loading the vesicles with dye, a second round of stimulation in a dye-free bath would trigger the FM release through exocytosis (Fig. 1Aiv-v), process that can be followed by monitoring the fluorescence intensity decrease (destaining).

Although FM dyes have contributed greatly to the field of vesicle recycling, it is not possible to determine the exact localization or morphology of individual vesicles by using conventional fluorescence microscopy. For that reason, we explain here how FM dyes can also be used as endocytic markers using electron microscopy, through photoconversion. The photoconversion technique exploits the property of fluorescent dyes to generate reactive oxygen species under intense illumination. Fluorescently labeled preparations are submerged in a solution containing diaminobenzidine (DAB) and illuminated. Reactive species generated by the dye molecules oxidize the DAB, which forms a stable, insoluble precipitate that has a dark appearance and can be easily distinguished in electron microscopy 2,3. As DAB is only oxidized in the immediate vicinity of fluorescent molecules (as the reactive oxygen species are short-lived), the technique ensures that only fluorescently labeled structures are going to contain the electron-dense precipitate. The technique thus allows the study of the exact location and morphology of actively recycling organelles.

FM dyes have been of invaluable help in the understanding of synaptic dynamics. FMs are normally followed under the fluorescent microscope during different stimulation conditions. However, photoconversion of FM dyes combined with electron microscopy allows the visualization of distinct synaptic vesicle pools, among other ultrastructure components, in synaptic boutons.

Estudando Pools vesículas Synaptic usando fotoconversão de Corantes Styryl

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Neurociência

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Isolamento da Primária Murino Cérebro microvascular células endoteliais

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Quantificação de Vascular Cerebral Arquitetura usando dois fótons Microscopia em um modelo de mouse Neuroinflammation induzida por HIV

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imagiologia Fibras Serotoninérgicos na medula espinhal mouse usando o CLARIDADE / Técnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system. This system is constructed from a broadband white light source, a motorized filter wheel with a set of narrowband interference filters, a light guide, a collecting lens, a video zoom lens, and a monochromatic charged-coupled device (CCD) camera. An ellipsoidal cranial window is made in the skull bone of a rat under isoflurane anesthesia to capture in vivo multispectral diffuse reflectance images of the cortical surface. Regulation of the fraction of inspired oxygen using a gas mixture device enables the induction of different respiratory states such as normoxia, hyperoxia, and anoxia. A Monte Carlo simulation-based multiple regression analysis for the measured multispectral diffuse reflectance images at nine wavelengths (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, and 760 nm) is then performed to visualize the two-dimensional maps of hemodynamics and the light scattering properties of the in vivo rat brain.

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system.

Avaliação simultânea de Cerebral Hemodinâmica e de espalhamento de luz Propriedades do<em&gt; In Vivo</em&gt; Cérebro de Rato Utilizando Imagem de Reflexão Difusa Multispectral

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and death, caused by white matter lesions in the spinal cord and cerebellum, as well as by demyelination in grey matter. Whilst conventional models of experimental allergic encephalomyelitis are suitable for the investigation of the cell-mediated inflammation in the spinal and cerebellar white matter, they fail to address grey matter pathologies. Here, we present the experimental protocol for a novel rat model of cortical demyelination allowing the investigation of the pathological and molecular mechanisms leading to cortical lesions. The demyelination is induced by an immunization with low-dose myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) in an incomplete Freund&#39;s adjuvant followed by a catheter-mediated intracerebral delivery of pro-inflammatory cytokines. The catheter, moreover, enables multiple rounds of demyelination without causing injection-induced trauma, as well as the intracerebral delivery of potential therapeutic drugs undergoing a preclinical investigation. The method is also ethically favorable as animal pain and distress or disability are controlled and relatively minimal. The expected timeframe for the implementation of the entire protocol is around 8 - 10 weeks.

The protocol presented here allows the reproduction of a widespread grey matter demyelination of both cortical hemispheres in adult male Dark Agouti rats. The method comprises of intracerebral implantation of a catheter, subclinical immunization against myelin oligodendrocyte glycoprotein, and intracerebral injection of a pro-inflammatory cytokine mixture through the implanted catheter.

Modelo de Rato de Demyelinação Cortical Cerebral Generalizada Induzida por uma injeção intracerebral de citocinas pró-inflamatórias

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

Na imagem latente de cálcio Vivo de células de cabelo linha Lateral no Zebrafish Larval

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolamento de células endoteliais Microvascular do principal músculo esquelético murino

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...