This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.

HINWEIS: Die Regelung des Protokolls ist in Abbildung 1, mit einem Zeitplan der Verfahren gezeigt. 1. Kultur und Passage von CVE-Zellen <ol><li> Kultur CVE Zellen (bEnd.3 Zellen) in komplettem Wachstumsmedium (glucosereichem Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium, DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin in einer T75 cm 2 Gewebekulturkolben ergänzt. Wachsen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Entfernen und die Zellkulturmedium zu verwerfen. Spülen Sie die Zellschicht mit 0,25% Trypsin-0,03% EDTA-Lösung, und fügen Sie dann 1 bis 2 ml Trypsin-EDTA-Lösung in den Kolben und halten den Kolben bei 37 ° C für 3 - 5 min. Beachten Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop, bis die Zellschicht abgelöst wird. In 10 ml komplettem Wachstumsmedium und aspirieren die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Man dekantiert die Flüssigkeit und Zellen in eine 15-ml-Zentrifugenröhrchen und Spinn bei 700 xg für 5 min um Zelltrümmer zu entfernen. </li&gt; <li> Überstand verwerfen aus dem Zentrifugenröhrchen. In 10 ml komplettem Wachstumsmedium und resuspendieren Zellpellet. Dreh die Zellen bei 700 · g für 5 min. </li><li> Überstand verwerfen aus dem Zentrifugenröhrchen. Resuspendieren des Zellpellets in komplettem Wachstumsmedium bei einer Konzentration von 2,0 × 10 5 Zellen / mL (bestimmt durch Zählen unter Verwendung eines Hämozytometers; auszuschließen toten Zellen durch Trypan-Blau - Färbung). HINWEIS: Frisch aufgetaute Zellen subkultiviert mindestens 3 Durchgänge für Experimente. </li></ol> 2. Seed und Behandeln Zellen auf Zellkulturplatten <ol><li> Samenzellen auf einer 96-well extrazellulärem Flußmittel Zellkulturplatte: 80 &amp; mgr; l / Vertiefung. Legen Sie die Zellkulturplatte bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator. Hinweis: 16 × 10 3 Zellen pro Vertiefung 60 erreicht - 80% Konfluenz innerhalb von 24 h. </li><li> Wenn die Zellen zu einer Chemikalie ausgesetzt werden, fügen Sie die Behandlungen, sobald die Zellen an den Plattenboden angebracht sind (8 - 24 h nach sehending). HINWEIS: Für die Transfektion Experimente, keine Antibiotika in komplettem Wachstumsmedium hinzuzufügen. </li></ol> 3. Bewertung der mitochondrialen Funktion der Bioanalyzer Verwendung <ol><li> Vor Beginn des Assays, die eine extrazelluläre Flußsensor Kartusche mit Kalibrierfluid Hydrat durch Zugabe von 150 &amp; mgr; l von extrazellulärem Flußmittel Kalibrierlösung mit der Platte und Inkubation O / N bei 37 ° C ohne CO 2. </li><li> Mit der Plattenwaschstation, ändern Sie die Zellkulturmedium in pH 7,0 extrazellulären Flusstestmedium. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C ohne CO 2 für 30 - 60 min. </li><li> Bereiten Sie Arbeitslösungen von 8 uM Oligomycin, 4,5 uM FCCP, 10 uM Rotenon und 10 &amp; mgr; M Antimycin A in DMEM. Last 25 &amp; mgr; l der Stammlösungen in Patrone Injektionsöffnungen: Port A, Oligomycin; Port-B, FCCP; Port C, Rotenon und Antimycin A mit extrazellulären Flusstestmedium. Implementieren Sie das Testprotokoll , wie in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Legen Sie das hydratisierte Patrone in den Bioanalyzer und führen Sie die Kalibrierung durch die Schaltfläche &quot;Start&quot; klicken. Nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die &quot;Unload Cartridge&quot; prompt, indem Sie auf die Patrone Bodenplatte und laden Sie die Zellenplatte. Weiter den Test bis zum Ende aller Messungen. </li><li> Öffnen Sie die Datendatei und erhalten die Rate Werte aus dem Bioanalyzer. Exportieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsdatei. </li></ol> 4. Datenanalysen HINWEIS: Die Berechnungen für die Datenanalysen werden formuliert unten. Die Werte werden aus dem Bioanalyzer erhalten wie die OCR 2 in Abbildung dargestellt. <ol><li> Zur Berechnung Basalatmung, subtrahieren Sie die nicht die mitochondriale Atmung (Messungen 10 bis 12) aus dem Grundwert (Messung 3). HINWEIS: Basalatmung = Basal - nicht die mitochondriale Atmung = Rate ③ - Bewerten ⑩ ~ ⑫. </li><li> Zur Berechnung der ATP productivom Basalwert (Messung 3) - auf der ATP-linked Atmung (6 Messungen 4) abziehen. HINWEIS: ATP-Produktion = Basal - ATP-linked Atmung = Rate ③ - Bewerten ④ ~ ⑥. </li><li> Um eine maximale Atmung zu subtrahieren , die nicht die mitochondriale Atmung (Messungen 10 bis 12) aus dem Maximum der Atmung (Messungen von 7 bis 9). HINWEIS: Maximal Atmung = maximale Atmung - nicht die mitochondriale Atmung = Rate ⑦ ~ ​​⑨ - Bewerten ⑩ ~ ⑫. </li><li> Um Ersatzkapazität zu berechnen, subtrahieren Sie den Basalwert (Messung 3) aus dem Maximum der Atmung (Messungen von 7 bis 9). HINWEIS: Die Ersatzkapazität = Maximale Atmung - Basal = Rate ⑦ ~ ​​⑨ - Bewerten ③. </li><li> Proton Leck, subtrahieren , um die nicht-mitochondriale Atmung (Messung 10 bis 12) Zur Berechnung der ATP-linked Atmung (Messung 4). HINWEIS: Protonenleck =-ATP verknüpft Atmung - nicht Mitochondrienl Atmung = Rate ④ - Bewerten ⑩ ~ ⑫. </li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> J Vis Exp. (96), e52350 (2015).</li></ol>

The authors declare no potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article. Open Access fees for this article were provided by Agilent Technologies.

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren zur in zerebralen vaskulären Endothelzellen des bioenergetischen Phänotyp auswertet. Es dient als Basistest für die endotheliale Zell mitochondrialen Auswertung und es ist optimal für die Experimente, die Mechanismen von Stimuli zu untersuchen, die die mitochondriale Signalweg in CVE Zellen beeinflussen können. Es stellt auch ein Verfahren für potentielle Therapeutika für BBB-Störung-assoziierter Krankheiten testen. Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Extrazellulärem Flußmittel bioanalyzers haben die Fähigkeit, OCR in Echtzeit zu messen. In diesem Assay wird die geeignete Zelldichte Identifizierung kritisch. Wenn die Zelldichte von weniger als 8 × 10 3 Zellen pro Vertiefung ist, die basale OCR zu niedrig analysiert werden (Abbildung 2 und Abbildung 3); Wenn die Zelldichte von über 32 × 10 3 Zellen pro Vertiefung ist, müssen die Zellen nicht zu Oligomycin oder FCCP treatme antwortennts (Abbildung 2 und Abbildung 3). Die optimale Zelldichte für diese Zelllinie in unserem experimentellen Modell ist 16 × 10 3 Zellen pro Vertiefung, die reproduzierbare Ergebnisse und Empfindlichkeit zeigt auf Reize 7 und Behandlungen 10,14. Wenn eine 24-well Bioanalyzer verwendet wird, neue Titrationen der Zelldichte würde für den Test erforderlich. Es ist dokumentiert , dass CVEs ein großes Volumen von Mitochondrien haben im Vergleich zu anderen endothelialen Zellen oder Gewebetypen 15,16, was auf die Notwendigkeit einer größeren Energieproduktion und weniger Zellen für bioenergetics Stoffwechsel zu messen. Wir haben verschiedene Arten von Gehirn - Endothelzellen getestet, wie primäre und immortalisierten murinen zerebrovaskulären Endothelzellen 7 und immortalisierten humanen zerebrovaskulären Endothelzellen (nicht veröffentlichte Daten). Diese Zellen ähnliche Zelldichten erforderlich, um die akzeptable OCR (Basalatmung OCR innerhalb von 40 zu erreichen - 160 pmol / min96-Well-Platten und 50-400 pmol / min für 24-Well-Platten), wenn der Bioenergetik-Test durchgeführt wurde. Kaczara et al. Berichteten bioenergetischen Metabolismus in menschlichen Nabelvenen - Endothelzellen (HUVEC) zu messen, die eine höhere Zelldichte 17 verwendet. Unsere Gruppe nicht beurteilen Gefäßzellen aus anderen Geweben oder Organen. Theoretisch könnte die Bioanalyzer potentiell auf jedem Zelltyp verwendet werden, aber es erfordert den Assay für die Zelldichte, Zellkulturmedium, und die Kulturbedingungen zu optimieren (einige spezifische Zellen Platten können erfordern beschichtet gut zu wachsen). Es ist erforderlich, dass die Experimente der OCR Rate innerhalb des akzeptablen Bereichs liegt, um sicherzustellen, abgeschlossen sind. Wenn die OCR in Endothelzellen aus anderen Organen niedriger als CVEs von Gehirn, kann die Zelldichte zu erhöhen helfen, innerhalb eines akzeptablen OCR Bereich zu bekommen. Alternativ kann, wenn Zellen nicht oxidative Phosphorylierung als Hauptenergiequelle verwenden, würde der Bioanalyzer kein optima seinl Assay. Die Bioanalyzer ermöglicht die sequentielle Unterbrechung der Elektronentransportkette, auf der Grundlage der Reihenfolge, in der die Reagenzien aufgebracht werden. Zuerst Oligomycin angewendet wird, welche Mitochondrien Complex V (ATP-Synthase) hemmt. Zweitens FCCP, ein Elektron Entkoppler, angewendet wird, was zur Störung des Protonengradienten führt. Schließlich Rotenon und Antimycin A, welche Mitochondrien Komplexe I und III hemmen bzw. angewendet auf eine vollständige Hemmung des Elektronenflusses zu führen. Die Reihenfolge der Arzneimittelexposition ist wichtig, weil die Medikamente die spezifische Elektronentransportkettenreaktion blockieren, und die sequentiellen Änderungen gemessen werden kann, die die Funktion der Mitochondrien zu reflektieren. Technische Änderungen und Fehlerbehebung Um mitochondrialen Antwort bewerten in CVE-Zellen auf Reize, ist es empfehlenswert, dass die Reize auf Zellen angewandt werden, nachdem die Zellen in der Zellkulturplatte Boden eingehalten werden (siehe Timelinein 1 gezeigt ist ; es dauert in der Regel mindestens 6 h). Um reproduzierbare Ergebnisse durch Behandlungen erhalten, ist es äußerst wichtig, die Zelldichte konsistent zu halten. Wenn Vorbehandlungen vor der Zellaussaat ausgelegt sind, die Zelldichte für jede Vorbehandlung sollte sorgfältig gemessen, ohne die toten Zellen für die Aussaat. Wenn die Transfektion im experimentellen Design enthalten ist, finden Sie in der Transfektion Protokoll des Herstellers. Nachgewiesene in in Abbildung Daten 4 wurde miR-34a in die CVE - Zellen , die eine Lipofectamin - Transfektion - Kit, die Antibiotika-freien Zellkulturmedium und eine Mito-Stresstest zur Beurteilung der Veränderungen in der metabolischen Funktion mit Überexpression von miR-34a erfordert . Die Dosen von Plasmid kann auch optimiert werden, wie zuvor 13 veröffentlicht. Eine weitere Änderung, die dem Protokoll vorgenommen werden können, verändert sich die Konzentrationen der Reagenzien. Eine Titrationskurve von Oligomycin, FCCP und / oder Rotenon und Antimycin A kann completed. Darüber hinaus, wenn dieser Assay mit hohem Durchsatz verwendet wird , aus verschiedenen Arzneimitteln analysiert, wird vorgeschlagen , einen parallelen Assays umfassen die Lebensfähigkeit der Zellen und die Zellproliferation zu messen, die in unseren früheren Veröffentlichungen 7,13 beschrieben wurde. Die OCR - Werte signifikant von der Zellzahl (2 und 3) und die Zellproliferation und Lebensfähigkeitstests profitieren die Normalisierung der Daten beeinflusst. Jedoch sind die Vollendung dieser Assays im Ermessen des jeweiligen Labor. Einschränkungen der Technik Die Hauptbeschränkung dieses Protokolls besteht darin , dass man nur eine in vitro Zellkulturmodell in der Studie verwendet. Zur Zeit gibt es keine verfügbaren ex - vivo - Modellen oder Tiermodellen , die die Funktion der Mitochondrien Endothelzellen richten. Neue Modelle werden erwartet , für die Auswertung der bioenergetischen Funktion in vivo entwickelt werden , und <em&gt; ex vivo in zukünftigen Studien. Eine weitere Einschränkung ist die Ausdehnung der Sperrabschätzungen nach den bioenergetics Maßnahmen. Die Experimente können nicht ausgeführt werden, weil, erstens, die nach Abschluss der bioenergetischen Messungen wird die Lebensfähigkeit der Zellen nach vollständiger Unterbrechung der Elektronentransportkette vermindert; zweitens spezielle Zellkulturplatten und Einsätze erforderlich sind Bioenergetik Werte zu erkennen und nicht-Einsätze für Barriereprüfungen passen. Daher gibt es nicht viele funktionelle Assays, die nach dem bioenergetics Assay abgeschlossen werden kann. Es wird jedoch erwartet, dass spezielle Geräte funktionelle Assays entwickelt werden können, vor dem bioenergetics Assay durchzuführen. Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden Frühere Verfahren erforderten die Isolierung von Mitochondrien aus den Zellen 18 mitochondriale Funktion zu bewerten. Diese new Technik der Bioanalyzer mit ermöglicht die Messung der mitochondrialen Aktivität in intakten Zellen, die mehr von der zellulären Umgebung bewahrt als isolierte Mitochondrien zu bewerten. Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering Dieses Protokoll wurde entwickelt und für die bEnd.3 Zelllinie entwickelt, aber es ist auch kompatibel mit primären zerebralen vaskulären endothelialen (pCVE) Zellen 7 oder andere Endothel, und das haben wir 7 unter Verwendung von pCVE Zellen in unserer früheren Veröffentlichung demonstriert. Wenn andere Arten von Endothel verwendet werden, kann die Beschichtung der Kulturplatte und die Verwendung von Wachstumsfaktoren erforderlich. Jedoch wird die Titration Assay für andere Zelltypen als auch empfohlen. Dieses Protokoll bietet ein allgemeines Verfahren in der Auswertung der bioenergetics von CVE Zellen angenommen werden, und es kann weiter Mechanismus Studien oder therapeutische Antworten auf diese Weise angewendet werden.

Es ist allgemein anerkannt, dass die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​durch cerebral vascular endothelial (CVE) Zellen gebildet hat sehr unterschiedliche und einzigartige Funktionen, ausschlaggebend für die vaskuläre biology. Diese Endothelzellen verwenden Mitochondrien meisten der zellulären Zufuhr von Adenosintriphosphat (ATP) als Quelle für chemische Energie zu erzeugen. Zusätzlich ATP für die CVE Zellen bereitzustellen, regulieren Mitochondrien verschiedene zelluläre Prozesse in vaskulären endothelialen Zellen, wie zelluläre Signal 1-4, Apoptose 5, und die Kontrolle des Zellzyklus und Zellwachstum . 6 Dysregulation der mitochondrialen bioenergetischen Funktion in Zellen CVE kann sich auf mitochondrialen Biogenese, zu einer Beeinträchtigung der vaskulären Endothel - Aktivität führt, und verschärfen zerebrovaskuläre Erkrankungen und neurodegenerativen Erkrankungen, zB Schlaganfall 7,8 und Alzheimer-Krankheit (AD) 9. Wir haben gezeigt, dass Beschimpfungen zu CVE-Zellen nach Exposition mit lipopolysacrid (LPS) die Funktion der Mitochondrien in CVE - Zellen beeinträchtigen und verschlechtern Hub 7 Ergebnisse. Tert-Butylhydrochinon (TBHQ) erhöht Schlaganfall Sterblichkeit um 10 in CVE - Zellen mit oxidative Phosphorylierung zu stören. Daher stellt die quantitative Modell der bioenergetischen Funktion in CVE-Zellen nicht nur Piloten eine Reihe von Mechanismus bezogenen Studien für das zentrale Nervensystem (ZNS) Erkrankungen, sondern auch einen Durchbruch in der Wirkstoff-Screening von Therapeutika mitochondrialen Funktion in der Gefäßbiologie Targeting. Isolierte Mitochondrien wurden verwendet bioenergetischen Funktion zu messen. Wir haben 7 und andere 11 haben Einschätzungen von zellulären Bioenergetik in intakten Zellen CVE berichtet durch einen extrazellulären Fluss Bioanalyzers verwenden. Der Analysator bietet den Vorteil der endogenen zellulären bioenergetischen Beurteilung. Dieser empfindliche und konsistente Assay misst den mitochondrialen Metabolismus von CVE Zellen und kann verwendet werden bioenergetischen Beeinträchtigung durch sti auszuwertenmuli, untersuchen die Mechanismen der mitochondrialen Signalwege und Bildschirm Medikamente oder Behandlungen, die die Funktion der Mitochondrien in CVE-Zellen beeinflussen. Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) wird durch die Bioanalyzers aufgezeichnet eine pharmakologische Profilierung Ansatz durch die Verwendung von vier mitochondrialen Disruptoren Kombination: Oligomycin, Carbonyl- Cyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazons (FCCP), Rotenon und Antimycin A. In diesem Protokoll wir ausführlich eine optimierte Ansatz, der für die Messung und Berechnung der mitochondrialen Funktionsparameter in CVE-Zellen, einschließlich basalen mitochondriale Atmung, die ATP-Produktion, Protonenleck, maximale Atmung und Ersatzatemkapazität, in einem einzigen Assay ermöglicht.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">bEnd.3 cell line</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-2299</td>
			<td style="width:197px;">25-30 passages</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:147px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S12450</td>
			<td>10% in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Penicillin/Steptomycin</td>
			<td style="width:147px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30010</td>
			<td>1&#215;100 stocking</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">0.25% trypsin 0.03% EDTA solution</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-000-CI</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Glucose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CAS 50-99-7</td>
			<td>25 mM in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">O4876</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2920</td>
			<td>0.5 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Rotenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R8875</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CAS 1397-94-0</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Plate wash station</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux bioanayzer&#160;&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">XFe96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux cell culture plate</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux sensor cartridge</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux calibrant solution</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux assay medium</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102365-100</td>
			<td>PH buffered prior to assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells

Die Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​ist kritisch Hirnverletzung zu verhindern. Zerebrale vaskuläre Endothel (CVE) -Zellen sind eine der Zelltypen, die die BBB umfassen; Diese Zellen haben eine sehr hohe Energiebedarf, der optimal mitochondrialen Funktion erfordert. Im Falle von Krankheit oder Verletzung kann die mitochondriale Funktion in diesen Zellen verändert werden, was zu einer Erkrankung oder der Öffnung der BBB. In diesem Manuskript, stellen wir eine Methode die Funktion der Mitochondrien in CVE-Zellen zu messen, indem unter Verwendung von Voll, intakte Zellen und eine Bioanalyzer. Ein Mito-Stress-Test wird verwendet, um die Zellen in Frage zu stellen, die entweder physikalisch oder chemisch gestört wurden, und ihre bioenergetischen Funktion auswerten. Darüber hinaus bietet dieses Verfahren auch eine nützliche Möglichkeit, um neue Therapeutika zu suchen, die direkte Auswirkungen auf die Funktion der Mitochondrien haben. Wir haben die Zelldichte optimiert erforderlichen Sauerstoffverbrauchsraten zu erzielen, die für die Berechnung einer Vielzahl von mitochondrialen para ermöglichenMeter, einschließlich der ATP-Produktion, maximale Atmung und freie Kapazitäten. Wir zeigen auch die Empfindlichkeit des Assays durch den Nachweis, daß die Einführung der MikroRNA, miR-34a, führt zu einer ausgeprägten und detektierbare Abnahme der mitochondrialen Aktivität. Während die in diesem Dokument dargestellten Daten für die bEnd.3 Zelllinie optimiert ist, haben wir optimiert auch das Protokoll für die primäre CVE-Zellen, ferner die Nützlichkeit in der präklinischen und klinischen Modellen hindeutet.

Um die bioenergetischen Funktion von CVE - Zellen als Reaktion auf oxidativen Stress beurteilen zu können , wählten wir die Maus Gehirn mikrovaskulären Endothel - Zelllinie bEnd.3, die die gleichen Vergleichsbarriereeigenschaften als primäre Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen 12 zeigt. Da die Kinetik und die relative Intensität der Reaktion sind unter den verschiedenen Zelltypen variiert, wurden die erste Serie von Experimenten entwickelt messbare OCR Ebenen zu erhalten, indem die optimale Anzahl von bEnd.3 Zellen identifiziert in dem Assay zur metabolischen Profils zu verwenden, gezeigt in Abbildung 2. Nach der Auswertung werden die Daten quantifiziert und dargestellt in Abbildung 3. Basalatmung, maximale Atmung und Ersatzatemkapazität zeigte eine proportionale Reaktion mit Zelldichte. ATP - Produktion verringerte sich jedoch bei 64 × 10 3 Zellen pro Vertiefung ausgewählt wurden, was darauf hindeutet , dass die Über konfluenten ZellkulturFür dieses Experiment nicht geeignet. Die optimalen Zelldichten auftreten zwischen 8-32 × 10 3 Zellen pro Vertiefung auf der Grundlage der Antwort auf die mitochondriale Disruptoren. Für nachfolgende Experimente eine Aussaatdichte von 16 × 10 3 Zellen pro Vertiefung verwendet wurde für die optimale Detektion von Änderungen in OCR zu ermöglichen. Mit 16 × 10 3 Zellen pro Vertiefung, beobachteten wir die erwarteten Antworten in OCR und gezeigt , dass die microRNA miR-34a die Funktion der Mitochondrien in CVE - Zellen (Abbildung 4) reduziert. Wir haben früher , dass miR-34a oxidative Phosphorylierung 13 in diesen Zellen reduziert berichtet. Die wiederholten Versuche zeigten auch , dass eine maximale Atmungs und Ersatzkapazität durch die Überexpression von miR-34a deutlich in CVEs bei 24 h nach der Transfektion verringert wurden, obwohl die Basalatmung, ATP - Produktion, und Protonenleck hatten keine signifikanten Änderungen (Figur 4) . Diese Datenveranschaulichen die Empfindlichkeit der Bioanalyzer Veränderungen in der mitochondrialen Funktion in CVEs zu detektieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" /> Abbildung 1. Strategische Planung für das Experiment. Der Zeitplan für die Zelle, Platte, und die Patrone Vorbereitung angezeigt wird . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Rohdaten von bioenergetischen Funktion in CVE Zellen mit verschiedenen Zelldichten. Der Sauerstoffverbrauch Raten wurden in CVE - Zellen mit unterschiedlichen Zelldichten gemessen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD (n = 5); OCR: Sauerstoffverbrauchsrate; FCCP: carbonyl Cyanid-4- (trifluormethoxy) phenylhydrazon;<html> Rot / Anti-A: Rotenon und Antimycin A. ①, ② und ③ zeigen Basalatmung; ④, ⑤ und ⑥ zeigen ATP verknüpft Atmung; ⑦, ⑧ und ⑨ zeigen maximale Atmung; ⑩, ⑪ und ⑫ zeigen nicht die mitochondriale Atmung. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse von bioenergetischen Funktion in CVE Zellen mit verschiedenen Zelldichten. Basalatmung, die ATP - Produktion, maximale Atmung und freie Kapazitäten aus den Rohdaten von den Bioenergetik funktionellen Test in Abbildung 2 mit den Formeln generiert berechnet werden in Abschnitt 4 angegeben . Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD (n = 5) bedeuten; OCR: Sauerstoffverbrauchsrate.<html> f = &quot;https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" /> Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse von Verminderte Bioenergetische Funktion von miR-34a (A) Rohdaten der mitochondrialen Funktion nach Überexpression von miR-34a bei 24 h nach der Transfektion.. (B) Basalatmung, die ATP - Produktion, maximale Atmung und freie Kapazitäten werden aus den Rohdaten von den Bioenergetik funktionellen Test in 4A erzeugt berechnet; die Parameter durch die Formeln in Abschnitt 4. Die Überexpression von miR-34a reduziert die Funktion der Mitochondrien in CVE-Zellen bei 24 h nach der Transfektion angegeben berechnet werden. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD (n = 5); OCR: Sauerstoffverbrauchsrate. ****, P &lt;0,0001.files / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" /> Tabelle 1. Das Instrument Run Protokoll.

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Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Endothelzelle Mitochondrien sind kritisch Blut-Hirn-Schranke Integrität aufrechtzuerhalten. Wir führen ein Protokoll bioenergetischen Funktion in der zerebralen vaskulären Endothelzellen zu messen.

Auswertung der bioenergetischen Funktion in Cerebral Vascular Endothelial Cells

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

evaluation-bioenergetic-function-cerebral-vascular-endothelial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K Aufrufe.  West Virginia University.  Endothelzelle Mitochondrien sind kritisch Blut-Hirn-Schranke Integrität aufrechtzuerhalten. Wir führen ein Protokoll bioenergetischen Funktion in der zerebralen vaskulären Endothelzellen zu messen. 

Serie: Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The vesicles are then retrieved from the plasma membrane (endocytosis) and grouped together with the general pool of vesicles within the nerve terminal, until they undergo a new exo- and endocytosis cycle (vesicle recycling). These processes have been studied using a variety of techniques such as electron microscopy, electrophysiology recordings, amperometry and capacitance measurements. Importantly, during the last two decades a number of fluorescently labeled markers emerged, allowing optical techniques to track vesicles in their recycling dynamics. One of the most commonly used markers is the styryl or FM dye 1; structurally, all FM dyes contain a hydrophilic head and a lipophilic tail connected through an aromatic ring and one or more double bonds (Fig. 1B). A classical FM dye experiment to label a pool of vesicles consists in bathing the preparation (Fig. 1Ai) with the dye during the stimulation of the nerve (electrically or with high K+). This induces vesicle recycling and the subsequent loading of the dye into recently endocytosed vesicles (Fig. 1Ai-iii). After loading the vesicles with dye, a second round of stimulation in a dye-free bath would trigger the FM release through exocytosis (Fig. 1Aiv-v), process that can be followed by monitoring the fluorescence intensity decrease (destaining).

Although FM dyes have contributed greatly to the field of vesicle recycling, it is not possible to determine the exact localization or morphology of individual vesicles by using conventional fluorescence microscopy. For that reason, we explain here how FM dyes can also be used as endocytic markers using electron microscopy, through photoconversion. The photoconversion technique exploits the property of fluorescent dyes to generate reactive oxygen species under intense illumination. Fluorescently labeled preparations are submerged in a solution containing diaminobenzidine (DAB) and illuminated. Reactive species generated by the dye molecules oxidize the DAB, which forms a stable, insoluble precipitate that has a dark appearance and can be easily distinguished in electron microscopy 2,3. As DAB is only oxidized in the immediate vicinity of fluorescent molecules (as the reactive oxygen species are short-lived), the technique ensures that only fluorescently labeled structures are going to contain the electron-dense precipitate. The technique thus allows the study of the exact location and morphology of actively recycling organelles.

FM dyes have been of invaluable help in the understanding of synaptic dynamics. FMs are normally followed under the fluorescent microscope during different stimulation conditions. However, photoconversion of FM dyes combined with electron microscopy allows the visualization of distinct synaptic vesicle pools, among other ultrastructure components, in synaptic boutons.

Studium synaptischer Vesikel Pools mit Photokonversion Styrylfarbstoffe

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system. This system is constructed from a broadband white light source, a motorized filter wheel with a set of narrowband interference filters, a light guide, a collecting lens, a video zoom lens, and a monochromatic charged-coupled device (CCD) camera. An ellipsoidal cranial window is made in the skull bone of a rat under isoflurane anesthesia to capture in vivo multispectral diffuse reflectance images of the cortical surface. Regulation of the fraction of inspired oxygen using a gas mixture device enables the induction of different respiratory states such as normoxia, hyperoxia, and anoxia. A Monte Carlo simulation-based multiple regression analysis for the measured multispectral diffuse reflectance images at nine wavelengths (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, and 760 nm) is then performed to visualize the two-dimensional maps of hemodynamics and the light scattering properties of the in vivo rat brain.

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system.

Die gleichzeitige Auswertung der zerebralen Hämodynamik und Lichtstreuungseigenschaften der<em&gt; In Vivo</em&gt; Rattenhirn Mit Multispektral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and death, caused by white matter lesions in the spinal cord and cerebellum, as well as by demyelination in grey matter. Whilst conventional models of experimental allergic encephalomyelitis are suitable for the investigation of the cell-mediated inflammation in the spinal and cerebellar white matter, they fail to address grey matter pathologies. Here, we present the experimental protocol for a novel rat model of cortical demyelination allowing the investigation of the pathological and molecular mechanisms leading to cortical lesions. The demyelination is induced by an immunization with low-dose myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) in an incomplete Freund&#39;s adjuvant followed by a catheter-mediated intracerebral delivery of pro-inflammatory cytokines. The catheter, moreover, enables multiple rounds of demyelination without causing injection-induced trauma, as well as the intracerebral delivery of potential therapeutic drugs undergoing a preclinical investigation. The method is also ethically favorable as animal pain and distress or disability are controlled and relatively minimal. The expected timeframe for the implementation of the entire protocol is around 8 - 10 weeks.

The protocol presented here allows the reproduction of a widespread grey matter demyelination of both cortical hemispheres in adult male Dark Agouti rats. The method comprises of intracerebral implantation of a catheter, subclinical immunization against myelin oligodendrocyte glycoprotein, and intracerebral injection of a pro-inflammatory cytokine mixture through the implanted catheter.

Rattenmodell der weit verbreiteten zerebralen kortikalen Demyelinisierung, induziert durch eine intrazerebrale Injektion von entzündungsfördernden Zytokinen

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

In Vivo Calcium Imaging der Seitenlinie Haarzellen im Larvenstadium Zebrafisch

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...