We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.

1. Fixação and Embedding <ol><li> preparação de reagentes <ol><li> 10x solução salina tamponada com fosfato (PBS) <ol><li> Adicionar 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, e 2,4 g de KH 2 PO 4 em 800 ml de água bidestilada (ddH2O) e ajustar o pH para 7,4 com HCl. Adicionar ddH2O para um volume total de 1 L, em seguida, adicionar 1,000 mL pirocarbonato de dietilo (DEPC) e agitar vigorosamente. Loja PBS durante a noite à temperatura ambiente e autoclave a 121 ° C durante 20 min no dia seguinte. </li></ol></li><li> 1x PBS <ol><li> Dilui-se a 10x estoque PBS a razão 1:10 em ddH2O para obter uma concentração final de 0,01 M de Na 2 HPO 4, 0,002 M de KH 2 PO 4, 0,003 M de KCl, e 0,13 M de NaCl. </li></ol></li><li> Paraformaldeído (PFA) fixador Cuidado: O paraformaldeído é tóxico. Prepare-lo sob uma coifa. Use luvas. <ol><li> Para preparar 250 mL de PFA fixador, aquecer 100ml de 1x PBS para 70 - 80 ° C e adicionar 1,750 mL de NaOH. Em seguida, adicione 10 g de paraformaldeído e misture bem até dissolver. Colocar a solução em gelo e em seguida ajustar o pH a 7,2 com H 2 SO 4 (260 - 270 ul para 100 ml) após o arrefecimento. </li><li> Ajustar o volume até 250 ml com PBS 1x, adicionar 625 uL de glutaraldeido a uma concentração final de 0,25%. Adicionar 250 uL de Triton X-100 e 250 ul de Tween 20 para facilitar a infiltração do fixador. NOTA: O fixador PFA podem ser armazenadas a 4 ° C durante um mês, sem perder a sua capacidade de fixação. </li></ol></li><li> Prepare a diferentes concentrações de etanol (30%, 50%, 70%, 85%, e 95%), com água tratada com DEPC. </li></ol></li><li> coleta de amostras de plantas <ol><li> gemas axilares <ol><li> Use plantas de orquídeas Phalaenopsis maduros na fase de quatro folhas. Retire cuidadosamente as folhas rasgando a folha após a nervura central usando as mãos. </li><li> Use um bisturi afiada para Carefully remover rebentos axilares a partir da base da terceira ou quarta folha na haste monopodial. </li></ol></li><li> amostra de sementes <ol><li> Colher vagens de sementes de orquídeas maduros aos 4 meses após a polinização. Corte vagens de sementes longitudinalmente com um bisturi. Agite o vagem da semente de abertura cuidadosamente e soltar as sementes secas em papel de filtro. </li></ol></li><li> protocórmios <ol><li> Semear as sementes de orquídea maduras em meio Murashige e Skoog placa de agar de 1 / 2x, e crescer num ambiente de cultura de tecido em um período de luz de 12 h e uma temperatura constante de 25 ° C. Amostra protocórmios verde em 7 semanas após a semeadura. </li></ol></li><li> corpos protocórmios-like (PLB) <ol><li> Cresça PLBs orquídea no T2 regenerar placas de agar como descrito anteriormente 10 e coloca-se sob as mesmas condições de crescimento tal como no passo 1.2.3.1. Recolha 10 PLB a uma altura de 5 - 8 mm. </li></ol></li><li> amostra de folha <ol><li> Recolha de tecido foliar de uma planta madura orquídea Phalaenopsis tal como descrito no passo1.2.1.1. </li><li> Usar um bisturi afiado para cortar um pedaço de tecido de folha (7 mm Largura Comprimento x 5 mm) a partir da segunda folha recém desenvolvido. </li></ol></li><li> amostra de raiz <ol><li> Usando a mesma planta descrito no passo 1.2.1.1, dissecar um centímetro de comprimento do tecido ponta de raiz utilizando um bisturi afiado. </li></ol></li><li> espiga jovem <ol><li> Usar um bisturi afiado para cortar o tecido novo pico a partir da porção de ponta do pedúnculo 10 cm de comprimento. </li></ol></li><li> Botão de flor <ol><li> Extirpar um pequeno botão de flor de 5 mm de diâmetro de caule flor da orquídea. Cortar parte do tecido flor em botão longitudinalmente (3 mm de espessura). </li></ol></li><li> tecidos foliares e tecidos Spikelet de culturas de cereais <ol><li> Cortar o tecido lâmina de folha comprimento de 1 cm do primeiras folhas recém-desenvolvidos a partir de plantas de arroz, trigo e milho. </li><li> Colete 10 espiguetas de plantas (arroz, trigo e milho) um dia antes da antese. </li></ol></li></ol></li><li> Fixação<ol><li> Fix amostras de plantas imediatamente, transferindo-os para um frasco de cintilação de vidro contendo 15 ml de gelo-frio fixador PFA. </li><li> Aplicar um vácuo (~ 720 milímetros de Hg) para amostras de plantas em um 4 ° C sala fria. Segure a vácuo durante 15 - 20 min (pequenas bolhas deve ser liberado a partir das amostras). Repita este passo até que a maioria dos tecidos afundar após a liberação do vácuo. Segurar a vácuo durante a noite e libertar o vácuo lentamente no dia seguinte. </li></ol></li><li> Desidratação NOTA: Use o mesmo frasco da fixação através dos passos de infiltração. Pour ou usar uma pipeta para drenar a solução no passo anterior e substituir por 15 ml de solução de novo para dentro do frasco. Dependendo da textura dos tecidos, o tratamento de tecidos duros tais como gema axilar orquídea, sementes, protocormos, e PLB, e espiguetas de arroz, trigo, milho e durante um tempo mais longo; tratamento de tecidos mais suaves, como a orquídea flor em botão, jovem espiga, folhas e raízes, ea folha de arroz, trigo e milho por um tempo mais curto. <ol&gt; <li> Após a fixação, mergulhar a amostra em 15 ml de 1x PBS durante 10 min em gelo. <ol><li> Desidratar amostras em séries de etanol de 15 ml à temperatura ambiente como se segue: 30% de etanol durante 30 min, 50% de etanol durante 30 min, 70% de etanol durante 1 h, 85% de etanol para 54 min para os tecidos duros e 30 min para os tecidos mais macios, 95% de etanol para 54 min para os tecidos duros e 30 min para os tecidos mais macios, e 100% de etanol duas vezes para 54 min para os tecidos duros e 30 min para os tecidos mais macios. NOTA: As amostras de plantas podem ser armazenadas em 70% de etanol a 4 ° C durante vários meses. </li></ol></li></ol></li><li> infiltração de parafina <ol><li> Se infiltrar as amostras com 15 ml de etanol e xileno mistura substituto para 54 min cada para os tecidos duros e 30 min para os tecidos mais macios, à temperatura ambiente como se segue: substituto de etanol / xileno (2: 1, v / v), etanol / substituto de xileno (1 : 1, v / v), etanol substituto / xileno (1: 2, v / v), e duas vezes substituto xileno puro. Cuidado: xileno é tóxico. Faça este passo na coifa. </li&gt; <li> Se infiltrar amostra no frasco com 15 ml de substituto de xileno e a mistura de parafina num forno a 60 ° C, durante a noite no caso dos tecidos mais duras, e durante 60 min para os tecidos mais macios, como: xileno substituto / parafina (2: 1, v / v), xileno substituto / parafina (1: 1, v / v), e xileno substituto / parafina (1: 2, v / v). </li><li> Se infiltrar amostra com 15 ml de parafina puro duas vezes por dia e incubar a 60 ° C num forno. </li><li> Repita o passo 1.5.3 do dia seguinte. </li></ol></li><li> incorporação de tecidos <ol><li> Ligue a alimentação do centro de tecidos incorporando 1 hora de antecedência para derreter a cera no reservatório de parafina antes da incorporação de tecidos em um bloco de parafina. </li><li> Aquecer os moldes de metal (tamanho de base de 3,3 centímetros de comprimento x 2 cm de largura) sobre a bandeja de aquecimento a 62 ° C, e despeje cerca de 13 ml de cera fundida para a base do molde. </li><li> Transferir uma amostra de tecido de secção 1.5.4 para dentro do molde com uma pinça aquecido e orientá-la para a posição desejada. </li><li> Mova o moldesobre a placa fria com cuidado e deixe até que a cera é solidificado. </li></ol></li></ol> 2. Tissue Seccionamento <ol><li> método de corte de parafina <ol><li> Adicione uma base de cera, colocando uma cassete de incorporação no topo de um molde (o mesmo tamanho na secção 1.6.2), preencher com cera fundida e remover o molde após a cera é solidificado. NOTA: A cassete de incorporação irão formar uma base de cera para fixar o bloco de amostras de parafina. </li><li> Apare o bloco de parafina em uma forma e tamanho adequado, e colocar algumas peças de cera em uma espátula plana. Aqueça as peças de cera usando um queimador de álcool até que os derrete a cera e, em seguida, colocar a cera derretida sobre a base de cera no ponto 2.1.1 para aderir o bloco. Apertá-lo no micrótomo. </li><li> Coloque uma lâmina nova para o micrótomo, e ajustar o ângulo de 5 graus para facilitar o seccionamento no micrótomo. </li><li> Cortar o bloco de parafina da amostra em fatias finas (10 uM), como descrito anteriormente 11. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Corte-Hybrid método de seccionamento <ol><li> Aparar o bloco de parafina da amostra a partir do passo 1.6.4 para uma coluna com uma superfície trapezoidal na parte superior para um tamanho apropriado utilizando uma lâmina de barbear. </li><li> Adicione um pouco de composto corte temperatura ideal (OCT) para o centro do palco criostato. Anexar o bloco de parafina à fase de criostato e, em seguida, rapidamente orientar o bloco de tecido para a posição desejada. </li><li> Transferir a parafina bloco / palco para uma câmara de criostato. Permitir outubro para solidificar na barra de resfriamento rápido a -42 ° C durante 10 min. Não mova o bloco durante a solidificação de outubro (Figura 2C). </li><li> Permitir que o adaptador de criostato e a temperatura da câmara a arrefecer até -20 ° C e -16 ° C, respectivamente, antes de fixar o bloco de parafina / fase para o adaptador de criostato. Secção tecidos a 10 um de espessura. </li><li> Escolha secções de tecido com uma pinça. Flutuar as seções sobre 800 mL de água tratada com DEPC num Poly - L - lisina coaTed corrediça e Transferir as lâminas para uma placa quente a 42 ° C. </li><li> Permitir que as secções para achatar em água tratada com DEPC a 42 ° C. Use papel de filtro para drenar a água a partir da borda. </li><li> tecido Mount no slide, colocando o slide em uma placa quente a 42 ° C durante a noite. </li></ol></li></ol> 3. Tissue Coloração <ol><li> desparafinização <ol><li> Recolha os slides da placa quente e colocá-los em um rack de coloração. Adicione 150 ml de xileno em uma tina de coloração no exaustor e mergulhar o rack em xileno durante 5 min. </li></ol></li><li> Reidratação <ol><li> Preparar soluções de diferentes concentrações de etanol (100%, 95%, 70%, 50%, e 30%) em água tratada com DEPC e preencher 150 ml de solução em frascos de coloração distintas, respectivamente. </li><li> Re-hidratar as amostras através de uma série de concentrações decrescentes de etanol, a cada passo, durante 3 minutos à temperatura ambiente. Transferir as lâminas na coloração rack de um frasco para outro frasco contendo dAs concentrações de etanol IFERENTES: 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol, 50% de etanol, e 30% de etanol. </li><li> Após a reidratação, mergulhar os espécimes em ddH2O por 3 min. </li></ol></li><li> coloração com hematoxilina <ol><li> amostras de tecido de manchas por imersão slides de tecidos em solução de hematoxilina durante 1,5 min. </li><li> Lavar brevemente em ddH2O contendo 1 - 2 gotas de ácido clorídrico 12 N (HCl) durante alguns segundos e, em seguida lavar brevemente em ddH 2 O. </li></ol></li><li> Desidratação <ol><li> Desidratar as amostras através de uma série de concentrações crescentes de etanol durante 3 minutos à temperatura ambiente: 30% de etanol, 50% de etanol, 70% de etanol, 95% de etanol, e 100% de etanol. Limpar os espécimes com xileno na coifa por 5 min. </li></ol></li><li> Montagem <ol><li> Gota apropriadamente 600 mL de meio de montagem à base de xileno no slide. Com cuidado, coloque uma lamela sobre o espécime. Evitar bolhas de ar formando para obter imagens de boa qualidade. </li><li> Permitir que as lâminas para o ar seco durante a noite. Observar a amostra sob um microscópio no dia seguinte. Nota: As imagens foram capturadas a 25X de ampliação 400X, dependendo do tamanho das amostras. </li></ol></li></ol> 4. Hibridização In Situ <ol><li> síntese de sonda <ol><li> Sequência de codificação usando primers Clone Phalaenopsis afrodite gene da actina específicas 5&#39;-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 &#39;e 5&#39;AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3&#39; (para obter 242 bp amplicon PCR) e CyclinB1; sequência específica de codificação 1 gene utilizando os iniciadores 5&#39;-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 &#39; e 5&#39;-ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 &#39;(para obter 327 pb fragmento amplificado pela PCR) como descrito 12. </li><li> Ligar as sequências de codificação específicas em vectores (por exemplo, pGEMT) de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Gerar digoxigenina (DIG) marcado sondas sentido e anti-usando SP6 kit rotulagem / T7 DIG RNA de acordo com as instruções do fabricantes. </li></ol></li><li> A hibridação in situ <ol><li> Corte os 2 º e 3 º fatias de tecido de gemas axilares (10 mm de espessura) gerados usando o método híbrido-Cut, e montar fatias em slides revestido. </li><li> Desparafinar secções de tecido em xileno (ver 3.1.1), re-hidratados em concentrações decrescentes de etanol (ver 3.2.2), e digest com 2 mg / ml de proteinase K a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Realiza-se em hibridização in situ de acordo com o protocolo anteriormente descrito, com algumas modificações 11,13, ou seja, com a temperatura de hibridização para a actina como 59 ° C e 60 ° C durante CyclinB1;. 1 A hibridização corrediça com 40 ng de sonda marcada com DIG RNA. </li><li> Use 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (NBT / BCIP) / solução de nitroazul de tetrazólio para detectar sinais de hibridação tal como descrito 11. </li></ol></li></ol>

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	<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+tissues.">Cryosectioning tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. 3, 1-2 (2008).</li><li>Knox, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-sectioning+of+plant+tissues.">Freeze-sectioning of plant tissues.</a> Stain Technol. 45, 265-272 (1970).</li><li>Ruan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cryosection+method+for+polyethylene+glycol+hydrogels+used+in+tissue+engineering.">An improved cryosection method for polyethylene glycol hydrogels used in tissue engineering.</a> Tissue Eng.: Part C Methods. 19, 794-801 (2013).</li><li>Prychid, C. J., Rudall, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oxalate+crystals+in+monocotyledons:+A+review+of+their+structure+and+systematics.">Calcium oxalate crystals in monocotyledons: A review of their structure and systematics.</a> Ann Bot. 84, 725-739 (1999).</li><li>Prychid, C. J., Rudall, P. J., Gregory, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematics+and+biology+of+silica+bodies+in+monocotyledons.">Systematics and biology of silica bodies in monocotyledons.</a> Bot. Rev. 69 (4), 377-440 (2004).</li><li>Arnott, H. J., Pautard, F. G. E., Steinfink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+calcium+oxalate+monohydrate.">Structure of calcium oxalate monohydrate.</a> Nature. 208, 1197-1198 (1965).</li><li>Mitani, N., Yamaji, N., Ma, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+maize+silicon+influx+transporters.">Identification of maize silicon influx transporters.</a> Plant Cell Physiol. 50, 5-12 (2009).</li><li>Hayasaka, T., Fujii, H., Ishiguro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+silicon+in+preventing+appressorial+penetration+by+the+rice+blast+fungus.">The role of silicon in preventing appressorial penetration by the rice blast fungus.</a> Phytopathology. 98, 1038-1044 (2008).</li><li>Ma, J. F., Yamaji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+uptake+and+accumulation+in+higher+plants.">Silicon uptake and accumulation in higher plants.</a> Trends Plant Sci. 11, 392-397 (2006).</li><li>Chen, W., Tang, C., YL, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+doubling+by+in+vitro+culture+of+excised+protocorms+or+protocorm-like+bodies+in+Phalaenopsis+species.">Ploidy doubling by in vitro culture of excised protocorms or protocorm-like bodies in Phalaenopsis species.</a> Plant Cell Tiss Org. 98, 229-239 (2009).</li><li>Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Hybridization+for+the+Precise+Localization+of+Transcripts+in+Plants.">In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants.</a> J. Vis. Exp. (57), e3328 (2011).</li><li>Park, D. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+Protocols.">PCR Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 687, (2011).</li><li>Lin, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation,+expression+profiling,+and+protein+interaction+studies+of+the+core+cell-cycle+genes+in+Phalaenopsis+aphrodite.">Genome-wide annotation, expression profiling, and protein interaction studies of the core cell-cycle genes in Phalaenopsis aphrodite.</a> Plant Mol Biol. 84, 203-226 (2014).</li><li>Lee, Y. -. I., Yeung, E. C., Lee, N., Chung, M. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryology+of+Phalaenopsis+amabilis+var.+formosa:+embryo+development.">Embryology of Phalaenopsis amabilis var. formosa: embryo development.</a> Bot Stud. 49, 139-146 (2008).</li><li>Endo, M., Ikusima, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+rhythm+and+characteristics+of+photosynthesis+and+respiration+in+the+leaf+and+root+of+a+Phalaenopsis+plant.">Diurnal rhythm and characteristics of photosynthesis and respiration in the leaf and root of a Phalaenopsis plant.</a> Plant Cell Physiol. 30, 43-47 (1989).</li><li>Guo, W. J., Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+leaf+and+plant+age,+and+day/night+temperature+on+net+CO2+uptake+in+Phalaenopsis+amabilis+var.+formosa.">Effect of leaf and plant age, and day/night temperature on net CO2 uptake in Phalaenopsis amabilis var. formosa.</a> J. Amer. Soc. Hort. Sci. 131, 320-326 (2006).</li><li>Lewin, J., Reimann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+and+plant+growth.">Silicon and plant growth.</a> Ann. Rev. of Plant Physiol. 20, 289-304 (1969).</li><li>Kaufman, P. B., Simpson, T. L., Valcani, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silica+in+shoots+of+higher+plants.">Silica in shoots of higher plants.</a> Silicon and siliceous structures in biological systems. , 409-449 (1981).</li><li>Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+Kranz+anatomy+to+understand+C4+evolution.">Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution.</a> J Exp Bot. 65, 3357-3369 (2014).</li><li>Liu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+transcriptional+dynamics+of+maize+embryonic+leaves+during+seed+germination.">Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3979-3984 (2013).</li><li>Driscoll, S. P., Prins, A., Olmos, E., Kunert, K. J., Foyer, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+adaxial+and+abaxial+stomata,+epidermal+structure+and+photosynthesis+to+CO2+enrichment+in+maize+leaves.">Specification of adaxial and abaxial stomata, epidermal structure and photosynthesis to CO2 enrichment in maize leaves.</a> J Exp Bot. 57, 381-390 (2006).</li><li>Karlgren, A., Carlsson, J., Gyllenstrand, N., Lagercrantz, U., Sundstr&#246;m, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-radioactive+in+situ+Hybridization+Protocol+Applicable+for+Norway+Spruce+and+a+Range+of+Plant+Species.">Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species.</a> J. Vis. Exp. (26), (2009).</li><li>Hejatko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+technique+for+mRNA+detection+in+whole+mount+Arabidopsis+samples.">In situ hybridization technique for mRNA detection in whole mount Arabidopsis samples.</a> Nat Protoc. 1, 1939-1946 (2006).</li><li>Javelle, M., Timmermans, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+small+RNAs+in+plants+by+using+LNA+probes.">In situ localization of small RNAs in plants by using LNA probes.</a> Nat Protoc. 7, 533-541 (2012).</li><li>Drea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+gene+expression+in+plants.">In situ analysis of gene expression in plants.</a> Methods Mol Biol. 513, 229-242 (2009).</li><li>Drea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+method+for+systematic,+high+resolution+in+situ+analysis+of+mRNA+distribution+in+plants.">A streamlined method for systematic, high resolution in situ analysis of mRNA distribution in plants.</a> Plant Methods. 1, 8 (2005).</li></ol>

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As células vegetais têm paredes rígidas celulares, fibras duras, cristais e elevado teor de água que causam problemas rasgar o tecido durante o corte de tecidos vegetais. Apesar de corte à base de parafina é frequentemente utilizado para tecidos de plantas, muitas vezes os cristais endógenos dilacerar o tecido da planta durante o corte (Figura 1). Devido ao teor de água elevado inerentemente dentro das células da planta, corte com base em criostato muitas vezes faz com que as células quebradas e secções de tecido rachadas. No presente estudo, um protocolo de parafina-incorporação e criocorte combinado chamado Hybrid-Cut foi desenvolvido e bons cortes de tecidos de qualidade foram obtidos. Este protocolo resolve o problema associado com elevado teor de água através da introdução de inclusão em parafina, e reduz o efeito de arrancamento por endurecimento da cera de parafina sob baixa temperatura durante o corte (Figura 3). Portanto, este protocolo modificado é vantajoso sobre qualquer sectio à base de parafinaning ou cryosectioning para preservar a integridade do tecido da planta. Este manuscrito demonstra que o método híbrido-Cut preserva a integridade do tecido, em muitos tecidos de Phalaenopsis tais como gema axilar, sementes, e PLB, etc, que contêm níveis elevados de cristais (Figuras 3-4). Além disso, este protocolo é passível de colheitas de cereais tais como órgãos reprodutores e folhas de arroz, milho e trigo, que contêm elevado teor de sílica (Figuras 5-6). Presumivelmente, este protocolo pode ser aplicado a plantas lenhosas que contêm alto teor de fibras. Em geral, o tecido completamente fixação é muito importante para o Híbrido-Cut. Descobrimos que fixador ácido-álcool formaldeído-ácido (FAA) é melhor do que o PFA para preservar a integridade do tecido de alguns tecidos tais como botões recalcitrantes axialmente, raízes, etc. No entanto, PFA funciona melhor do que FAA na preservação da integridade do RNA. Portanto PFA é recomendado para corrigiramostra para hibridação in situ trabalho (ISH). O protocolo aqui descrito é projetada para a experiência RNA ISH. Por isso, foram preparados todos os reagentes para evitar a degradação do RNA, eliminando a contaminação RNase por tratamento DEPC. Se secção Hybrid-Cut é para estudos anatômicos, osmose reversa água normal (RO) e seu tampão ou reagentes derivados são aceitáveis. Reduzindo o tamanho da amostra e a espessura inferior a 3 mm é útil para a infiltração. Além disso, aumentando o tempo de imersão para a desidratação e infiltração são necessárias para tecidos de textura dura. Limitação deste protocolo pode devido a problemas causados ​​pela fixação inadequada, desidratação e infiltração de amostra. Portanto, o ajuste de tempo de processamento para cada etapa é fundamental para a produção de blocos de parafina de boa qualidade. Normalmente, o tecido mais precisa de mais tempo de processamento do que o tecido mais macio. Além disso, mostramos que a Hybrid-Cut trabalhado com sucesso em combinação with ISH para proporcionar uma distribuição espacial dos transcritos seleccionados (figura 7). Em resumo, este protocolo é útil para o estudo da anatomia da planta e fornece um mapa de ARN específico do tecido dos genes seleccionados. Além disso, pode ser aplicado a outros estudos moleculares, tais como ensaio de transferase terminal de desoxinucleotidilo marcação terminal dUTP nick (TUNEL), hibridação in situ fluorescente (FISH), e técnicas de imunocoloração. Em conclusão, este melhorada protocolo de seccionamento de tecidos é útil e útil para pesquisadores em comunidades de plantas.

O método de corte à base de parafina é uma técnica amplamente utilizada para estudos anatómicos. Preservação da anatomia tecido intacto é importante para estudos morfológicos e biológicos. A técnica de corte em parafina é vantajosa porque a parafina incorporação retém a morfologia celular e do tecido. Além disso, os blocos de parafina pode ser convenientemente armazenado por longos períodos de tempo. No entanto, o seccionamento embebido em parafina não é adequado para tecidos de plantas contendo cristais intracelulares. Cristais dentro das células, muitas vezes rasgar fitas de parafina e integridade do tecido danos durante o corte. Ao contrário de seccionamento de parafina, cryosectioning é relativamente rápido e secções pode ser obtido sem a fixação, a desidratação de série ou a incorporação de um meio de infiltração. Criocortes são compatíveis com muitas aplicações, tais como imuno-histoquímica, hibridação in situ, e histoquímica enzima. A outra vantagem de cryosectioning éque este método não passam por um potencial de processos de desnaturação tais como temperaturas elevadas e tratamentos químicos, moléculas tão celulares são bem preservada dentro das secções de tecido 2. Cryosectioning é geralmente preferida em relação com base em parafina para seccionamento estudos em tecidos animais. No entanto, cryosectioning não é a primeira escolha em plantas, porque temperatura de congelamento, por vezes, provoca a formação de cristais de gelo que afetam a qualidade da integridade seção. Embora osmoregulação tais como soluções de sacarose, polietileno glicol (PEG), ou glicerol-3 têm sido relatados para reduzir a formação de cristal de gelo sob condições de congelamento, a melhoria é menos do que óptima. Para se adaptar a diferentes ambientes, plantas diferentes têm muitas vezes células textura do tecido e vegetais distintas evoluíram para formar paredes rígidas celulares, fibras duras, e cristais de 4,5. Por exemplo, insolúveis cristais de oxalato de cálcio e corpos de sílica são bastante comuns naplantas 6. Corpos de silicato / cristais foram relatados para ajudar a manter a arquitectura da planta, verticalidade, e prevenir a doença ou de pragas em plantas de cereais 7-9. As orquídeas em vasos e mercado de orquídea de flores de corte é florescente e é uma indústria crescente. Aphrodite de Phalaenopsis (orquídea de traça) é um dos mais importantes de exportação de plantas ornamentais em Taiwan. Esforços significativos têm sido feitos para entender as mudanças morfológicas e fisiológicas dos processos de florescência no orquídeas Phalaenopsis. Hastes florais de orquídeas Phalaenopsis são iniciadas a partir de gemas axilares na base da folha. Após um período de temperatura ambiente fresco (cerca de um mês e meio), gemas axilares ampliar, quebra de dormência, e se projetam a partir da base da folha de evoluir para jovens hastes florais. Para entender a fisiológica, celular e processos moleculares de iniciação pico, é essencial para desenvolver uma técnica anatômica robusta para Visuatecidos ou marcadores Lize em tempo hábil. No entanto, a presença de cristais onipresentes em tecidos de orquídeas, particularmente em gemas axilares, torna o trabalho anatômica difícil. Aqui procuramos melhorar a integridade seção de tecidos de plantas recalcitrantes que até agora têm sido consideradas tecnicamente desafiador. Aqui nós mostramos um protocolo melhorado chamado Hybrid-Cut. É um método de corte à base de parafina, que é realizado utilizando um criostato. inclusão em parafina resolve alto teor de água no tecido vegetal. Seccionamento sob a baixa temperatura endurece o bloco de parafina, reduz cristal rasgando problema, e melhora a integridade do tecido de forma significativa. Este protocolo melhora significativamente a integridade do tecido de amostras de plantas recalcitrantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Embedding Center model EC780-1</td>
			<td style="width:127px;">CSA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Microtome model RM2255</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Cryostat model CM 1950</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Axio Scope A1 microscope&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Murashige &#38; Skoog medium including vitamins</td>
			<td style="width:127px;">Duchefa Biochemia</td>
			<td style="width:119px;">M0222.0050</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">RNase free surface decontaminant</td>
			<td style="width:127px;">Apex</td>
			<td style="width:119px;">10-228</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:127px;">Bio Basic Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D801154</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:127px;">MDBio, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">101-7647-14-5</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:321px;">Potassium chloride, crystal (KCl)</td>
			<td style="width:127px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">7447-40-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:321px;">Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7558-79-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:321px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7778-77-0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">16005</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:127px;">Showa</td>
			<td style="width:119px;">19430160</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:321px;">Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7664-93-9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Glutaraldehyde solution</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">111-30-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20)</td>
			<td style="width:127px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">9005-64-5</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100)</td>
			<td style="width:127px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">9002-93-1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Glass scintillation vials</td>
			<td style="width:127px;">Newastar</td>
			<td style="width:119px;">DG60805-00020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Desiccator vacuum</td>
			<td style="width:127px;">Violet Bioscience Inc.</td>
			<td style="width:119px;">TS-402030</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Rotary vane pump RZ2.5</td>
			<td style="width:127px;">Vacuubrand</td>
			<td style="width:119px;">36149406</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Ethanol</td>
			<td style="width:127px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Sub-X&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Leica Surgipath</td>
			<td style="width:119px;">3803670</td>
			<td style="width:167px;">Xylene substitute</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Paraplast Plus&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Leica Surgipath</td>
			<td style="width:119px;">39602004</td>
			<td style="width:167px;">Tissue embedding paraffin</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">SUPERFROST micro slide glass</td>
			<td style="width:127px;">Matsunami</td>
			<td style="width:119px;">S7441</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:321px;">FSC 22 Clear&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Leica Surgipath</td>
			<td style="width:119px;">3801480</td>
			<td style="width:167px;">Optimal Cutting Temperature compound (OCT)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Xylenes, Purified</td>
			<td style="width:127px;">Leica Surgipath</td>
			<td style="width:119px;">3803665</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:127px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">HX305311</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7647-01-0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">Micromount</td>
			<td style="width:127px;">Leica Surgipath</td>
			<td style="width:119px;">3801731</td>
			<td style="width:167px;">Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">pGEM T-easy vector</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:127px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3115879001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit</td>
			<td style="width:127px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11175025910</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:321px;">NBT/BCIP stock solution</td>
			<td style="width:127px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11681451001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid-cut: an improved sectioning method for recalcitrant plant tissue samples

Manter a integridade seção planta é essencial para estudar estruturas anatômicas detalhadas no celular, tecido ou até mesmo nível do órgão. No entanto, algumas células de plantas têm paredes celulares rígidas, fibras duras e cristais (oxalato de cálcio, sílica, etc), e elevado teor de água que muitas vezes perturbar a integridade do tecido durante o corte do tecido da planta. Este estudo estabelece um método de corte de tecido Cut-híbrido simples. Este protocolo modifica uma técnica de corte à base de parafina e melhora a integridade das secções de tecido a partir de plantas diferentes. tecidos de plantas foram embebidos em parafina antes de seccionamento num crióstato a -16 ° C. Seccionamento sob a baixa temperatura endurecido os blocos de parafina, reduzida lacrimejamento e coçar, e melhorou a integridade do tecido de forma significativa. Este protocolo foi aplicado com sucesso em tecidos ricos em oxalato de cálcio Phalaenopsis orquídeas, bem como tecidos recalcitrantes, como orga reprodutivaNS e folhas de arroz, milho e trigo. Além disso, a elevada qualidade de secções de tecido a partir de híbrido-corte pode ser utilizado em combinação com a hibridização in situ (ISH) para proporcionar os padrões de expressão espaciais dos genes de interesse. Em conclusão, este protocolo é particularmente útil para tecido vegetal recalcitrante contendo alta cristal ou teor de sílica. Bons cortes de tecidos de qualidade permitir estudos biológicos morfológicas e outros.

Hybrid-Cut melhora a integridade dos cortes de tecidos Conhecimento da anatomia da estrutura floral reprodutiva é importante para investigar o mecanismo subjacente de iniciação flor em orquídeas. No entanto, o acúmulo de cristais de oxalato de cálcio intracelular em orquídeas Phalaenopsis faz tais estudos uma tarefa desafiadora. Para contornar os problemas associados com lacrimejamento causado por cristais durante o processo de corte (Figura 1), foi desenvolvido um sistema que chamado Hybrid-Cut. Este protocolo combina técnicas de inclusão em parafina e criocorte tradicionais. Nós testado pela primeira vez em gemas axilares de Phalaenopsis, porque eles são notórios por rigidez dos tecidos eo conteúdo cristal de alta Corte-Hybrid. tecido gema axilar foi fixado em 4% PFA (ver protocolo, passo 1.3). Após a desidratação de etanol de série e parafina infiltration, a gema axilar foi incorporado em um bloco de parafina. O bloco foi cortado para um tamanho adequado antes de seccionamento (Figura 2A). Uma pequena quantidade de outubro foi então aplicada no centro da fase de criostato (Figura 2B). O bloco de parafina foi então feita aderir à fase através de outubro O estágio foi incubado num criostato para 10 min para permitir a solidificação completa de outubro antes do corte (Figura 2C) e, em seguida, criocorte foi realizada num -16 Câmara ° C (Figura 2D). A título de comparação, um bloco de parafina contendo uma gema axilar de Phalaenopsis foi submetido a corte micrótomo regular. Como mostrado na Figura 1A, foi observada grave ruptura das fitas de parafina depois de seccionamento micrótomo. A integridade dos tecidos e estrutura celular também foi comprometido (Figura 1B). Híbrido-corte, por outro lado,secções dos tecidos produzidos intactas (Figura 3A) com integridade estrutural conservada (Figura 3B). Aplicação de Hybrid-Corta para vários tecidos do P. Afrodita Para testar ainda mais a receptividade de Hybrid-Cut, testamos diferentes tecidos de orquídeas Phalaenopsis. Muitas vezes é difícil para obtenção de cortes de sementes com boa integridade do tecido por causa das tegumento endurecido. Usando este protocolo, as estruturas pormenorizadas de sementes foram preservadas após seccionamento (Figura 4A). Como mostrado na Figura 4A, os corpos de proteína, os produtos de armazenagem comum 14, podendo ser claramente identificado. Híbrido-Cut também funcionou com sucesso e mostrou as estruturas pormenorizadas do meristema apical do rebento de um mês de idade protocormos (a estrutura germinadas a partir de uma semente) (Figura 4B) eprotocórmios-como-corpos (PLB, Figura 4C). Os cristais intracelulares foram observados em seções de orquídeas PLB. Phalaenopsis têm as folhas grossas e suculentas e eles executam o metabolismo do ácido crassuláceo (CAM) -tipo fotossíntese 15. A secção transversal da lâmina foliar mostrou grandes células do mesofilo e feixes vasculares contendo xilema e floema (Figura 4D). Poucas aberturas estomáticas foram observadas na face inferior da folha durante o dia (Figura 4D). Na verdade, as plantas CAM evoluiu para maximizar o ganho de carbono, mas minimizar simultaneamente a perda de água através da abertura de seus estômatos na noite sob condições áridas 15,16. O meristema apical da raiz de P. afrodite é mostrado na Figura 4E. As células ponta da raiz parecia conter um número significativo de cristais, que foram muito bem conservadas após seccionamento (Figura 4E). cortes longitudinais de jovens hastes florais fornecida informatíon sobre a arquitetura do primordiais florais jovens (Figura 4F). Além disso, sépalas, pétalas, labelo e pollinia poderia ser claramente identificados a partir da seção longitudinal de botões florais jovens que completaram a diferenciação neste botão de flor 5 mm (Figura 4G). Observe que os cristais foram acumulados nas sépalas de jovens botões florais. Em suma, este protocolo funciona de forma consistente para manter a integridade dos tecidos e produz morfologia intacta permitindo estudos celulares anatômicas e possíveis. Hybrid-Cut Preserva a integridade dos tecidos em culturas de cereais Nós também testado em culturas de cereais, como arroz, trigo e milho que contêm alto teor de sílica 17,18 Cut-Hybrid. Como mostrado na Figura 5, a integridade do tecido de secções transversais de arroz, trigo, milho e folhas foram significativamente melhorados pelo Hybrid-Cut método. células do xilema, floema, células do mesofilo, estomas e buliformes que controlam rolamento do limbo para evitar a perda de água foram claramente identificados a partir de seções de folhas de arroz. A anatomia Kranz, células do mesofilo e feixes vasculares da folha de milho 19,20 foram claramente identificadas. Foi intrigante descobrir uma alta densidade de estômatos em ambos os lados adaxial e abaxial de folhas de milho (Figura 5). A proporção de estômatos adaxial e abaxial de 0,7 em milho tem sido relatado previamente 21. Além disso, este protocolo também funcionou com sucesso para proporcionar a morfologia celular detalhada de espiguetas de arroz, trigo e milho (Figura 6). Spikelets são conhecidos por conter abundante de sílica 9. Normalmente, que provoca dificuldade na realização de corte de tecido. Hibridização In Situ <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;1&quot;&gt; Genômica e abordagens transcriptomic são comumente usado para anotar as funções dos genes. Que proporciona a distribuição espacial dos transcritos dos genes de interesse em contextos de desenvolvimento ou ambientais é importante para adicionar uma nova visão sobre as possíveis funções dos genes. Hibridização in-situ (ISH) foi desenvolvido para localizar os padrões de expressão de genes ao nível do tecido 11, 22-25. Além disso, pode fornecer ISH celular, e em alguns casos, sub-celular, a resolução da distribuição de ARNm em organismos multicelulares 26. Durante ISH, RNA e integridade do tecido é essencial para a obtenção de informações espaciais confiáveis ​​sobre a transcrição selecionado. Testamos ISH usando o protocolo Hybrid-Cut gene da actina (PATC157348) foi clonado utilizando os iniciadores 5&#39;-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 &#39;e 5&#39;AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3&#39; para obter 242 bp PCR amplicon ciclina B1:.. 1 (PATC146999) gene específico sequência de codificação, utilizando os iniciadores 5&#39;-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 &#39;E 5&#39;-ATGAGCATGGCGCTAATACC-3&#39; para obter 327 pb fragmento amplificado pela PCR. Depois de ISH, actina e ciclina B1: 1 expressão gênica foi monitorada em jovens e maduras gemas axilares (Figura 7). Ambos os genes foram expressos em células meristemáticas de 2 ND 3 e gomos axilares Rd, com sinais mais fortes detectada em 3 gemas axilares Rd. Estes resultados demonstraram que Hybrid-Cut reter boa anatomia e fornecer padrão de expressão gênica espacial. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig1.jpg" /> Figura 1: Seção de parafina tradicional causa lacrimejamento grave de Tissue Um bloco de parafina contendo uma gema axilar de orquídea Phalaenopsis foi submetido a corte micrótomo regular.. Observou-se rasgar severa das fitas de parafina após corte micrótomo tradicional (A) </strong&gt;. A integridade dos tecidos e estrutura celular também foi comprometida (B). As setas mostram a grave rasgamento da fatia de tecido. A seta mostra os corpos de cristal. Barra de escala de 100 m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54754/54754fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig2.jpg" /> Figura 2:. Hybrid-Cut Método Seccionamento Um tecido de gemas axilares foi fixado em PFA e os tecidos foram desidratados, infiltrado com parafina e incorporado em um bloco de parafina. O bloco de parafina foi cortada para um tamanho apropriado (A). Óptima composto de corte de temperatura (OCT) foi aplicada no centro do criostato fase (B). O bloco de parafina foi anexado aos PTU no palco criostato. Sob baixa temperatura, o bloco de parafina<html> foi aderida à fase criostato através de outubro (C). Fatias de tecido foram seccionados na câmara de criostato a -16 ° C (D). Barras de escala representam 0,5 cm (A), e 1 cm (BD). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54754/54754fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig3.jpg" /> Figura 3: Hybrid-Cut Melhora a Seção de Integridade Um bloco de parafina contendo uma gema axilar de orquídea Phalaenopsis foi submetido a Hybrid-Cut seccionamento (A) eo método híbrido-Cut seções com excelente integridade do tecido (B) produzido.. A seta mostra os corpos de cristal endógenos embutidos no tecido de gemas axilares. A barra de escala 100? M.rget = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig4.jpg" /> Figura 4: Aplicação de a várias secções de tecido de orquídea Phalaenopsis Corte-Hybrid orquídea diferente. os tecidos foram seccionados utilizando o método híbrido-corte, tal como a secção longitudinal de sementes de orquídea durante a fase madura (A), em corte longitudinal de protocormos (B), em corte longitudinal de corpos protocormos-like (PLB) (C), a secção transversal de lâmina de folha (D), seção longitudinal da raiz (e), seção longitudinal do jovem flor pico (F), e secção longitudinal de botões florais jovens (G). As secções de tecido foram coradas pela hematoxilina. SC, revestimento de semente; PB, o corpo de proteínas; H,meristema; MP, mãe PLB; DP, filha PLB; Ad, face inferior das folhas; Ab, face inferior da folha; St, estômatos; MC, célula mesofilo; VB, feixe vascular; RC, coifa; fb, botão de flor; Se, sepal; Pe, pétala; La, labelo; Po, pollinia; Ro, rostellum; Ca, calo. Pontas de setas mostram cristais. Barras de escala representam 20 mm (AE) e 200 mm (FG). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54754/54754fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig5.jpg" /> Figura 5:. Hybrid-Cut Preserva Folha integridade do tecido em diversas culturas de cereais Comparação de tecido foliar usando o método tradicional de parafina (painel da esquerda) ea técnica de Hybrid-Cut desenvolvido neste estudo (painel da direita). Imagens mostram secções transversais da folha de arroz, trigo, milho e. MC, célula mesofilo; Ph, floema; St, estômatos; BC, bu<html> celular lliform. As setas mostram o rasgamento da fatia de tecido. Pontas de flechas mostram corpos de sílica. Os azuis tracejadas círculos indicam anatomia Kranz no milho C4. Escala de barras 20 um. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54754/54754fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig6.jpg" /> Figura 6:. Hybrid-Cut Preserva Spikelet Tissue Integrity em diversas culturas de cereais Comparação de integridade do tecido de secções Spikelet entre os métodos de parafina e Hybrid-corte tradicional. As setas mostram o rasgamento da fatia de tecido. As setas indicam corpos de sílica. Barras de escala de 20 mm (arroz) e 200 mm (trigo e milho). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54754/54754fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> ent &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig7.jpg" /> Figura 7: Hibridização In Situ de actina e CyclinB1; 1 padrões de expressão na axilar Bud da orquídea Phalaenopsis fatias de tecido do rd de gemas axilares 2º gemas axilares e 3 foram preparadas utilizando o método híbrido-Cut.. Um total de 40 ng de actina e CyclinB1; 1 sonda marcada com dig foram utilizados para hibridização. A sonda de sentido directo foi utilizado como um controlo negativo. As setas indicam o meristema reprodutiva da gema axilar. Escala de barras 100 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54754/54754fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Um Método Seccionamento melhorado para amostras de tecidos de plantas recalcitrante

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

hybrid-cut-an-improved-sectioning-method-for-recalcitrant-plant

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.8K visualizações.  Academia Sinica. This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Vídeo: Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Seccionamento fina de Preparações Slice para Imunohistoquímica

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Biologia

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

Teste de tolerância à nicotina em Aphids Usando uma experiência Dieta Artificial

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

Agar-Microcosmos Bloco de decomposição controlada de Tecidos Vegetais por fungos aeróbicos

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

Genotipagem de amostras de plantas e animais, sem purificação DNA Antes

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Um método melhorado para rápido e preciso de medição de desempenho em vôo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, techniques for studying the regulatory mechanism of this system are essential to elucidating the cellular and molecular processes of the aforementioned diseases. The use of hemagglutinin derived ubiquitin probes outlined in this paper serves as a valuable tool for the study of this system. This paper details a method that enables the user to perform assays that give a direct visualization of deubiquitinating enzyme activity. Deubiquitinating enzymes control proteasomal degradation and share functional homology at their active sites, which allows the user to investigate the activity of multiple enzymes in one assay. Lysates are obtained through gentle mechanical cell disruption and incubated with active site directed probes. Functional enzymes are tagged with the probes while inactive enzymes remain unbound. By running this assay, the user obtains information on both the activity and potential expression of multiple deubiquitinating enzymes in a fast and easy manner. The current method is significantly more efficient than using individual antibodies for the predicted one hundred deubiquitinating enzymes in the human cell.

The current protocol details a method for measuring the activity of functionally homologous deubiquitinating enzymes. Specialized probes covalently modify the enzyme and allow for detection. This method holds the potential to identify new therapeutic targets.

Método para medir a actividade de enzimas deubiquitinating em linhas celulares e amostras de tecidos

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

Um cromossomo Dropping Ar seco rápido Método de Preparação Adequado para FISH em plantas

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

Técnica Swiss-rolamento melhorado para preparo intestinal tecido por imuno-histoquímica e análises de imunofluorescência

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Um método fácil para a planta polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...