Este trabalho foi apoiado por uma bolsa Joseph P. Healey, da Universidade de Massachusetts Boston (LSH) e R15 GM86805 do NIH (LSH). SMP é suportado em parte por uma Sanofi-Genzyme Fellowship da Universidade de Massachusetts Boston.

1. Preparação para a esporulação Nota:. Os meios de comunicação descritos neste protocolo são feitas usando receitas e métodos padrão 13,17 Tabela 1 dá a formulação para 1 L de vários meios de comunicação utilizados neste protocolo. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" height="180" width="469"><colgroup><col /><col /><col span="3" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"></td><td style="width: 55px;"> Bacto Peptona </td><td style="width: 50px;"> Extracto de levedura </td><td style="width: 50px;"> Bacto Agar </td><td style="width: 60px;"> Dextrose </td><td style="width: 70px;"> acetato de potássio </td><td style="width: 60px;"> glicerina </td><td style="width: 60px;"> ddH2O </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> placas YPG </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 30 ml </td><td> 970 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> placas de YPD </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1.000 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> líquido YPD </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1.000 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> líquido YPA </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> 1.000 ml </td></tr><tr height="15"><td style="height: 20px; width: 80px;"> meios de esporulação </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 1.000 ml </td></tr></tbody></table> Tabela 1:. Formulações de mídia Valores são dadas por 1 L de mídia. Detalhes sobre a mídiaingredientes pode ser encontrada na Tabela Materiais. <ol><li> Se todas as células esporulação será o mesmo genótipo, siga este procedimento: <ol><li> Thaw cepa de levedura para ser usado em um (YPGlycerol) placa YPG. Cresça levedura durante 12-16 h a 30 ° C. Importante, as células SK1 também estão prestes a esporular, de modo estirpes SK1 não deve ser deixado muito tempo em placas de YPG, ou eles podem esporular na placa. Nota: Uma estirpe recentemente descongelado cultivadas em YPG é preferido, como a utilização de glicerol como fonte de carbono requer a fosforilação oxidativa, e assim selecciona para células que têm o DNA mitocondrial funcional. células SK1 têm uma tendência a perder DNA mitocondrial funcional e tornar-se petites. DNA mitocondrial funcional é necessário para a esporulação. </li><li> levedura Streak da placa YPG para um (YPDextrose) placa YPD para as colónias individuais. Cresça levedura na placa de YPD 24-28 h a 30 ° C. </li><li> Após cerca de 36-48 horas de crescimento em YPD meios sólidos, começar uma cultura de 25 ml YPD usando uma única colôniaa partir da placa de YPD. Crescer esta cultura até que as células são cerca de OD 600 = 4,0 a 7,0. Executar este passo, a 30 ° C durante a noite num incubador com agitação, agitação a 220 rpm. </li><li> A partir da cultura de YPD, usar uma quantidade apropriada de células para iniciar a 1.000 ml de cultura YPA (YPAcetate) que é OD 600 = 0,1 para cada necessidade placa de 96 poços na Secção 2. levedura crescer num incubador com agitação a 30 ° C (agitação a 220 rpm) até a cultura DO600 é entre 1,3 a 1,5. Nota: inocular 100 mL de cultura YPA para cada placa de poços múltiplos 96 a ser blindado, no capítulo 2. Por exemplo, se quatro rastreio de 96 placas com múltiplas cavidades, serão necessários 400 ml de cultura YPA. Começando com 10% de volume adicional na cultura YPA é necessário para proteger contra a perda de volume por evaporação. Normalmente, vai demorar entre 12-16 horas para as células a alcançar o OD apropriado 600; a quantidade de tempo pode variar dependendo do genótipo da estirpe de levedura. YPA é a mídia presporulation. Pregrowthem acetato ajuda a induzir a expressão de genes (tais como IME1) necessário para a esporulação eficiente e síncrona 6. </li><li> Centrifugação a 1800 x g numa centrífuga de topo de mesa durante 5 min para sedimentar as células cultivadas em YPA. Lavar as células 1x com 0,5 volumes de água desionizada autoclavada estéril. Girar novamente, e descartar lavar. Ressuspender as células em meios volume de esporulação 1x. Continue a Seção 2. </li></ol></li><li> Se usando células para a esporulação que são de diferentes genótipos, (isto é, transformadas com diferentes plasmídeos contendo mutações ou diferentes, tipicamente obtidas e armazenadas como reservas congeladas), as células da matriz dos diferentes genótipos em um formato de poços múltiplos 96. Então, siga este procedimento: <ol><li> Use um estéril frogger 96 pinos para transferir células de stocks congelados descongelados em 96 placa com múltiplas cavidades (s) em YPG meios sólidos. Levedura crescer durante a noite a 30 ° C. </li><li> Usando um estéril frogger 96 pinos, transferir células de YPG meios sólidos em YPD meios sólidos ou seletivameios sólidos (isto é, meio mínimo sintético sem aminoácidos, se as células contêm plasmídeos que requeiram seleção). Cresça levedura a 30 ° C até as colónias são formados para cada estirpe, tipicamente de 1 dia e 2 dias de YPD se meio selectivo é necessário. </li><li> Aliquota de 1,2 ml de YPD meios líquidos ou meios líquidos selectivos em cada poço de uma placa com múltiplas cavidades profundas 96 2 ml. Transferência de células a partir de suportes sólidos em meios líquidos, usando um frogger, cobrir com uma tampa de plástico mantidas no lugar pela fita, e crescer durante a noite em 30 ° C agitador, agitação a 220 rpm. Nota: Para minimizar a contaminação, placas de cobertura usando as tampas de plástico a partir de uma placa de petri rectangular. Segurar tampas no local usando um pedaço de fita adesiva, de modo a que a circulação de ar é minimamente restrito. </li><li> placas Centrifugar a 1.800 xg durante 5 minutos, utilizando uma centrífuga basculante com adaptadores para acomodar placas de 96 poços. Deitar fora media de células; Adicionar 500 ul a cada poço YPA e ressuspender as células sedimentadas no YPA. Cobrircom tampa de plástico mantido no lugar por fita. </li><li> Crescer as células durante 15 h a 30 ° C num incubador com agitação, agitação a 220 rpm. Continue a Seção 2. </li></ol></li></ol> 2. Células esporulantes num formato de 96 Multiwell <ol><li> Adicionar tanto ona 3 mm de contas de vidro sólido estéril ou uma estéreis 5 mm x 2 mm de barra de agitação magnética a cada poço de uma placa de 96 poços com 1,3 ml de poços. (Veja resultados representativos abaixo para uma discussão sobre a possibilidade de usar um cordão ou uma barra de agitação.) </li><li> Se todas as células a serem rastreados estão do mesmo genótipo, ir a 2.2.1. Se as células a serem selecionados são de diferentes genótipos, vá para o 2.2.2. <ol><li> Aqui as células a partir do passo 1.1.5 e alíquota de 500 ul de células mais meios de comunicação em cada poço da placa de poços múltiplos 96. Cubra com tampa de plástico mantido no lugar por fita. Avance para o 2.3. </li><li> células de rotação que são em YPA de 1.2.4 a 1.800 xg durante 5 minutos, utilizando uma centrífuga basculante com adaptadores para acomodar placas de 96 poços. Derrame demeios a partir de células f. Adicionar 500 ul de meio de esporulação a cada poço e ressuspender as células sedimentadas no meios de esporulação. Cubra com tampa de plástico mantido no lugar por fita. Avance para o 2.3. </li></ol></li><li> Se estiver usando uma conta de vidro, amostras de lugar em uma incubadora com agitação a 30 ° C e agitar a 220 rpm para a esporulação. Se estiver usando uma barra de agitação magnética, amostras lugar numa placa de agitação dentro de um C incubadora de 30 ° para a esporulação. Nota: A velocidade de agitação exata para as barras de agitação magnéticas não é muito importante, desde que todos os bares estão se movendo energicamente ea cultura é arejada. </li><li> Para monitorar a progressão através de esporulação, retirar-se amostras da cultura esporulados para visualização, Adicionar 6 ul de células a partir das culturas esporuladas a 24 uL de meio de esporulação em uma placa de 96 poços lamela (diluição 1: 5). Deixar as células de se contentar com 5 min antes de examinar as células utilizando um microscópio invertido. Nota: Em células SK1 tipo selvagem, esporos maduros compactos formará por 36 horas após a transferência para a mídia esporulação. Progressão através da esporulação pode ser monitorizada por microscopia utilizando marcadores fluorescentes, tais como um marcador nuclear (isto é, HTB2-mCherry 18) para examinar a divisão meiótica ou um marcador de membrana prospore (ou seja, G-20 19) para examinar esporos morfogénese. Em alternativa, a formação de esporos refractários podem ser vistos usando microscopia de Nomarski DIC começando cerca de 12 horas após a transferência para meios de esporulação. </li></ol>

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The authors have no competing financial interests.

Aqui apresentamos um protocolo para esporulação levedura SK1 em um formato com vários poços 96. O arejamento é a chave para a esporulação eficiente, que requer a utilização de qualquer uma barra de agitação ou um cordão de vidro em cada poço. Quando as células são esporulados em uma placa com múltiplas cavidades 96 numa incubadora com agitação sem qualquer uma pérola ou uma vareta de agitação, as células não esporular eficientemente. Apenas um pequeno aumento na eficiência de esporulação é visto quando as células são esporulados, sem qualquer uma pérola ou uma vareta de agitação num incubador com agitação, comparado a estar a 30 ° C sem agitação (Tabela 1; 17% em agitador vs 10% colocada sobre uma mexa placa). Da mesma forma, o uso de uma barra de agitação 7 mm resultou em baixa eficiência esporulação (28%), provavelmente porque os 7 mm agitar bares não arejar a cultura adequadamente devido às interações com barras de agitação em poços adjacentes. Este protocolo descreve as condições de esporulação usando a forma síncrona e eficiente esporulação SK1 estirpe de levedura 7,8 comumente usados ​​para estudar sporulation; eficiências esporulação que podem ser obtidos com outras cepas de leveduras que utilizam este protocolo deve ser examinado antes de empreender uma grande tela usando essas técnicas. Embora a 5 mm x 2 mm resultados barra de agitação em um pouco melhor esporulação em comparação com o uso de uma conta de vidro (66% de 5 mm de barra de agitação x 2 milímetros vs 56% com um talão de vidro), o custo necessário para a compra agitar o suficiente barras para cada poço pode ser proibitivo. As eficiências de esporulação obtidos utilizando um cordão de vidro proporciona uma solução de baixo custo que cria arejamento suficiente para rastreio de alto rendimento em formato de poços múltiplos 16, 96. Infelizmente, a adição de uma barra de agitação ou uma pérola de vidro não atingir os rendimentos de esporulação muito elevadas (tipicamente ~ 80% ou mais) visto quando esporulação em balões, e fenótipos de esporulação assim subtis pode ser difícil de detectar quando o rastreio de uma 96 bem formato. Ao contrário dos métodos previamente descritos esporulação 9-13 </sup&gt; que utilizam meios sólidos ou volumes de mídia líquida maiores, usando frascos ou tubos de cultura, este protocolo descreve condições para esporulação eficiente em um formato com vários poços 96. A utilização de um formato de poços múltiplos 96 é compatível com diferentes tipos de rastreios de elevada capacidade que podem ser levadas a cabo para examinar os fenótipos de esporulação. Por exemplo, as telas químicas que afectam os processos em esporulação pode ser levada a cabo utilizando esta técnica, em que as células esporuladas são tratadas com diversos compostos que foram dispostas em um formato de 96 poços. Neste caso, as células a serem esporulados iria ser todos do mesmo genótipo, e os compostos seria adicionado no passo 2.2 de esporulação. Este protocolo é também compatível com o rastreio de células de diferentes genótipos para fenótipos de esporulação, tais como células de levedura transformadas com uma biblioteca de elevado número de cópias ou uma colecção de estirpes de levedura mutantes. Para este caso, as estirpes que necessitam de ser dispostas em primeiro lugar num formato de 96 poços e o protocolo descrito a partir de umt passo 1.2 seria apropriado.

Esporulação na levedura de brotamento foi estudado para fornecer insights sobre muitos aspectos da biologia, incluindo o controle da segregação cromossômica durante a meiose 1, os mecanismos de recombinação genética 2, o controle do desenvolvimento de sinalização celular 3, controle nutricional do desenvolvimento 4, a transcrição regulação do desenvolvimento 5, eo exame de formação de esporos 6. A formação de esporos inclui um evento de divisão celular romance que envolve a formação de novos compartimentos membranares dentro da célula mãe, seguido pela deposição de uma parede de esporos 6 protectora. Estes estudos que examinam as células esporuladas muitas vezes tirar proveito da estirpe de levedura rapidamente esporulantes SK1, que pode sofrer o processo de esporulação em cerca de 24 horas de um modo relativamente eficiente 7,8. Embora a optimização das condições de esporulação de brotamento de levedura foram descritas 9-13, estes experimentos examinados esporulação em meios sólidos ou em culturas líquidas de maior escala, onde a esporulação é efectuada utilizando tubos de cultura ou frascos. Descrevemos aqui um método para a esporulação de levedura num formato de placa de poços múltiplos 96. Nós achamos que para este método, aeração é crítica para a esporulação síncrona e eficiente, e desenvolveram técnicas para garantir a esporulação suficiente um formato com vários poços de pequeno volume. Esporulantes num formato de 96 placa de poços múltiplos permite a células a ser rastreada utilizando técnicas de alto rendimento e reagentes optimizados para um formato de placa de poços múltiplos, tais rastreio de supressores elevado de cópias usando uma biblioteca de azulejos 14-16.

<table><tbody><tr><td>Nunc 1.3 ml DeepWell Plates</td><td>ThermoScientific</td><td>260251</td><td>Used for sporulation</td></tr><tr><td>Nunc 2.0 ml DeepWell plates</td><td>ThermoScientific</td><td>278743</td><td>Used for presporulation growth, step 1.2.3</td></tr><tr><td>3 mm glass bead</td><td>Fisher</td><td>11-312A</td><td>Used for sporulation</td></tr><tr><td>5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12</td><td>Fisher</td><td>14-511-82</td><td>Used for sporulation</td></tr><tr><td>96 well frogger</td><td>V&amp;amp;P Scientific</td><td>VP407</td><td>needed for step 1.2</td></tr><tr><td>library copier</td><td>V&amp;amp;P Scientific</td><td>VP381</td><td>needed for step 1.2; to be used with the frogger</td></tr><tr><td>rectangular Petri dish</td><td>ThermoScientific</td><td>264728</td><td>needed for step 1.2</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td>needed for media</td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>BD</td><td>212750</td><td>needed for media</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>212750</td><td>needed for media</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D16-3</td><td>needed for media</td></tr><tr><td>Potassium Acetate</td><td>Fisher</td><td>P171-500</td><td>needed for media</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>needed for media</td></tr><tr><td>Black 96 well glass bottom plate</td><td>MatTek</td><td>PBK96G-1.5.5-F</td><td>needed for step 2.4</td></tr></tbody></table>

efficient sporulation of saccharomyces cerevisiae in a 96 multiwell format

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

<html> Para avaliar este protocolo, as eficiências de esporulação obtidos a partir de células esporuladas em placas com múltiplas cavidades (como descrito acima) foram comparados às células esporulados usando maiores volumes em frascos (Tabela 2). O uso de placas de múltiplos poços não atingiu a alta eficiência visto quando esporulação em frascos, onde a eficiência ~ 80% podem ser rotineiramente visto. Esporulantes em placas com múltiplas cavidades com arejamento adequado (fornecida por pérolas de vidro ou barras de agitação) pode atingir eficiência de esporulação suficientes maior do que 50%, com os melhores resultados de eficiência (66%) obtida utilizando uma barra de agitação 5 milímetros x 2 mm. A esporulação representante de duas linhagens diferentes (tipo selvagem e smk1Δ) é mostrado aqui (Figura 1). Estas células são examinadas após 36 horas em meios de esporulação e visualizados usando uma placa de 96 poços de fundo de vidro. 84 / 54584fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Células esporulação de uma esporulação representante tipo selvagem e smk1Δ células 20 esporulados em um placas de 96 poços múltiplos. As células foram visualizadas utilizando uma objectiva 63X de um microscópio invertido. Tétradas refractáveis ​​(pontas de seta) pode ser visto na cultura do tipo selvagem, mas não na cultura contendo células smk1Δ. Barra de escala = 10 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54584/54584fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A esporulação foi testada usando um 5 mm ou 7 mm de barra de agitação, cada um dos quais se encaixa dentro do poço de uma 96 placa com múltiplas cavidades 1,3 ml (Tabela 2). Usando uma barra de agitação 7 milímetros resultou em baixa eficiência esporulação (28%) em comparação com a maior eficiência (66%) conseguido usando a barra de mistura 5 mm. A barra de agitação 7 mm de um poço tendem a interagir com uma barra de agitação em umN bem adjacente (Figura 1), impedindo que as barras sejam capazes de agitar adequadamente e proporcionar arejamento suficiente da cultura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> células esporuladas (%) </td><td> EPM (%) </td></tr><tr><td> balão no agitador </td><td> 82 </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> sem talão no shaker </td><td> 17 </td><td> 2.4 </td></tr><tr><td> talão no shaker </td><td> 56 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> nenhuma barra de agitação na placa de agitação </td><td> 10 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> 5 mm agitar bar na placa de agitação </td><td> 66 </td><td> 3.9 </td></tr><tr><td> 7 mm agitar bar na placa de agitação </td><td> 28 </td><td> 6,7 </td></tr><tr><td> EPM = erro padrão da média </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Mesa 2:Eficiências de esporulação usando condições diferentes. A esporulação foi realizado em placas de 96 poços com múltiplas cavidades, como descrito acima, ou, se indicado, em frascos de 500 ml contendo 50 ml de meio de esporulação. Oito diferentes poços foram a média para cada condição realizada numa placa de poços múltiplos. Três garrafas diferentes foram esporulados. Todas as culturas são repetições técnicos, iniciado a partir da mesma colônia de HTB2 mCherry-marcado, mas de outra forma tipo selvagem SK1 diplóide cepa de levedura (LH902 18). Estas células foram cultivadas num frasco de YPD e um único balão de YPA, e, em seguida, dividido para inocular placas de 96 poços contendo meio de esporulação, como descrito acima. eficiência esporulação foi determinada pela contagem esporos refrï¿½teis 36 horas após a transferência para meios de esporulação usando microscopia de campo claro Nomarski DIC. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54584/54584fig2.jpg" /> Figura 2: Stirbares em 96 1,3 ml placas com múltiplas cavidades. cultura Esporulação contendo quer (A) 5 mm x 2 milímetros barras de agitação (vermelho) ou (B) bares 7 mm x 2 milímetros agitar (azul) em uma placa com múltiplas cavidades 96 1,3 ml em uma agitação magnética prato. Barra de escala = 10 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54584/54584fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

A esporulação eficiente dos<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Num Multiwell Format 96

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

10.0K visualizações.  University of Massachusetts Boston. Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissecção da Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biologia

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast

Mutations introduced in the spliceosome or its substrate have significantly contributed to our understanding of the intricacies of spliceosomal function. Whether disease-related or functionally selected, many of these mutations have been studied using growth assays in the model organism Saccharomyces cerevisiae (yeast). The splicing-specific copper growth assay, or ACT1-CUP1 assay, provides a comprehensive analysis of mutation at the phenotypic level. The ACT1-CUP1 assay utilizes reporters that confer copper tolerance when correctly spliced. Thus, in the presence of copper, changes in yeast viability correlate to changes in mRNA production through splicing. In a typical experiment, the yeast spliceosome is challenged with different non-consensus splicing reporters and the splicing factor mutation of interest to detect any synergetic or antithetical impact on splicing. Here a full description of copper plate preparation, plating of yeast cells, and data evaluation are given. A selection of complimentary experiments is described, highlighting the versatility of the ACT1-CUP1 reporters. The ACT1-CUP1 assay is a handy tool in the splicing toolbox thanks to the direct read-out of mutational effect(s) and the comparative possibilities from the continuing use in the field.

The ACT1-CUP1 assay, a copper growth assay, provides a quick readout of precursor messenger RNA (pre-mRNA) splicing and the impact mutant splicing factors have on spliceosomal function. This study provides a protocol and highlights the customization possible to address the splicing question of interest.

Ensaios de ACT1-CUP1 determinam as sensibilidades específicas do substrato de mutantes spliceossomais em leveduras em brotamento

Mutations introduced in the spliceosome or its substrate have significantly contributed to our understanding of the intricacies of spliceosomal function. ...

Genética

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within a cell, tissue, organ, biological fluid, or organism. Metabolomics traditionally focuses on water-soluble metabolites. The water-soluble metabolome is the final product of a complex cellular network that integrates various genomic, epigenomic, transcriptomic, proteomic, and environmental factors. Hence, the metabolomic analysis directly assesses the outcome of the action for all these factors in a plethora of biological processes within various organisms. One of these organisms is the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a unicellular eukaryote with the fully sequenced genome. Because S. cerevisiae is amenable to comprehensive molecular analyses, it is used as a model for dissecting mechanisms underlying many biological processes within the eukaryotic cell. A versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of the water-soluble metabolome would provide the essential methodology for dissecting these mechanisms. Here we present a protocol for the optimized conditions of metabolic activity quenching in and water-soluble metabolite extraction from S. cerevisiae cells. The protocol also describes the use of liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of the extracted water-soluble metabolites. The LC-MS/MS method of non-targeted metabolomics described here is versatile and robust. It enables the identification and quantification of more than 370 water-soluble metabolites with diverse structural, physical, and chemical properties, including different structural isomers and stereoisomeric forms of these metabolites. These metabolites include various energy carrier molecules, nucleotides, amino acids, monosaccharides, intermediates of glycolysis, and tricarboxylic cycle intermediates. The LC-MS/MS method of non-targeted metabolomics is sensitive and allows the identification and quantitation of some water-soluble metabolites at concentrations as low as 0.05 pmol/&#181;L. The method has been successfully used for assessing water-soluble metabolomes of wild-type and mutant yeast cells cultured under different conditions.

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol for the identification and quantitation of major classes of water-soluble metabolites in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The described method is versatile, robust, and sensitive. It allows the separation of structural isomers and stereoisomeric forms of water-soluble metabolites from each other.

Metabolômica Quantitativa de Saccharomyces Cerevisiae Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Bioquímica

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in situ. Owing to the strong interaction of an electron with the matter, high-resolution cryo-ET studies are limited to specimens with a thickness of less than 200 nm, which restricts the applicability of cryo-ET only to the peripheral regions of a cell. A complex workflow that comprises the preparation of thin cellular cross-sections by cryo-focused ion beam micromachining (cryo-FIBM) was introduced during the last decade to enable the acquisition of cryo-ET data from the interior of larger cells. We present a protocol for the preparation of cellular lamellae from a sample vitrified by plunge freezing utilizing Saccharomyces cerevisiae as a prototypical example of a eukaryotic cell with wide utilization in cellular and molecular biology research. We describe protocols for vitrification of S. cerevisiae into isolated patches of a few cells or a continuous monolayer of the cells on a TEM grid and provide a protocol for lamella preparation by cryo-FIB for these two samples.

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

We present a protocol for lamella preparation of plunge frozen biological specimens by cryo-focused ion beam micromachining for high-resolution structural studies of macromolecules in situ with cryo-electron tomography. The presented protocol provides guidelines for the preparation of high-quality lamellae with high reproducibility for structural characterization of macromolecules inside the&#160;Saccharomyces cerevisiae.

Preparação e micromaquinção Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Tomografia Crio-Elétron

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Purificação Citometria de Fluxo com base em<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigotos

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Dirigido Método Evolução<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Criação e Triagem

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The fermentable carbon concentration mainly governs how the yeast cells generate ATP; thus, the variation in fermentable carbohydrate levels drives the energetic metabolism of S. cerevisiae. This paper describes a high-throughput method based on exponential yeast growth to estimate the effects of concentration changes and nature of the carbon source on respiratory and fermentative metabolism. The growth of S. cerevisiae is measured in a microplate or shaken conical flask by determining the optical density (OD) at 600 nm. Then, a growth curve is built by plotting OD versus time, which allows identification and selection of the exponential phase, and is fitted with the exponential growth equation to obtain kinetic parameters. Low specific growth rates with higher doubling times generally represent a respiratory growth. Conversely, higher specific growth rates with lower doubling times indicate fermentative growth. Threshold values of doubling time and specific growth rate are estimated using well-known respiratory or fermentative conditions, such as non-fermentable carbon sources or higher concentrations of fermentable sugars. This is obtained for each specific strain. Finally, the calculated kinetic parameters are compared with the threshold values to establish whether the yeast shows fermentative and/or respiratory growth. The advantage of this method is its relative simplicity for understanding the effects of a substance/compound on fermentative or respiratory metabolism. It is important to highlight that growth is an intricate and complex biological process; therefore, preliminary data from this method must be corroborated by the quantification of oxygen consumption and accumulation of fermentation byproducts. Thereby, this technique can be used as a preliminary screening of compounds/substances that may disturb or enhance fermentative or respiratory metabolism.

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Here we present a protocol to estimate the respiratory and fermentative metabolism by fitting the exponential growth of Saccharomyces cerevisiae to the exponential growth equation. Calculation of the kinetic parameters allows for the screening of influences of substances/compounds on fermentation or mitochondrial respiration.

Saccharomyces cerevisiae Cinética de crescimento exponencial na cultura de lote para analisar o metabolismo respiratório e fermentação

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

A esporulação eficiente dos

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Dissecção da Saccharomyces cerevisiae Asci

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Purificação Citometria de Fluxo com base em

Dirigido Método Evolução

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