Il lavoro qui presentato è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (concede DCB-120266, PPP-133.377 e 348.967 HBF-a AG).

1. Cellule e trasfezioni <ol><li> Culture cellule HEK 293T in terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina. Preparare una sospensione 2 x 10 5 cellule / ml nel terreno di coltura cellulare. Aggiungere 500, 100 e 1.000 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di 24 pozzetti, 96 e 12 pozzetti, per la produzione virale, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione immunitaria, rispettivamente (Figura 2A). </li><li> Mescolare delicatamente i piatti e li incubare O / N a 37 ° C con 5% di CO 2. Crescere le cellule a 50-70% di confluenza. </li><li> Secondo un piano di trasfezione, preparare diluizioni di RNA di prova e dei loro controlli in provette da 1,5 ml (micro esempio, la figura 2B). <ol><li> Per il saggio di produzione virale, preparare un 10 ng / ml di diluizione di HIV-1 plasmide di espressione e aggiungere 10 microlitri in ciascun tubo. Successivo preparare 5 micron diluizioni di RNA di prova e un RN controllo negativoA. Aggiungere 2,5 o 10 ml di ogni RNA di prova e la diluizione di controllo negativo ai corrispondenti tubi per 25 o 100 concentrazioni finali nm. </li><li> Per il test di vitalità cellulare, preparare 5 pM diluizioni di RNA di prova e 10 mg / ml di diluizione dell&#39;RNA controllo positivo, a basso peso molecolare Poly I: C. Aggiungere 2 ml di RNA test o diluizioni di controllo RNA positivi ai corrispondenti tubi per 100 nm o concentrazioni finali ml 200 mg /, rispettivamente. </li><li> Per il saggio attivazione del sistema immunitario, aggiungere 20 ml di RNA test o diluizioni di RNA di controllo positivo previste al punto 1.3.2. ai corrispondenti tubi di 100 nm o 200 mg / ml concentrazione finale rispettivamente. Nota: Per il test di RNA plasmidi di espressione, preparare 10 ng / diluizioni microlitri al posto dei 5 micron diluizioni di RNA di prova, dando importi finali di 25 e 100 ng per passo 1.3.1. e 100 ng per passi 1.3.2. e 1.3.3. </li></ol></li><li> Aggiungere 50, 25 o 75 ml di DMEM ad ogni provetta trasfezione per prod viraleuzione, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione del sistema immunitario, rispettivamente. Per i saggi di produzione virale, portare le cellule e tubi trasfezione preparati per un 3 (BSL3) laboratorio di livello di bio-sicurezza prima del passaggio successivo. </li><li> Aggiungere 2 ml di trasfezione reattivo sequenzialmente i tubi di trasfezione e incubare 15 a 20 minuti per consentire di formare complessi. Vedere la tabella dei materiali per la specifica del reagente di trasfezione da utilizzare. </li><li> Aggiungere la miscela di trasfezione da ciascuna goccia a goccia alle posizioni corrispondenti nelle piastre di coltura cellulare tubicino. Agitare delicatamente e incubare le piastre per 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Misura HIV-1 di produzione (sezione 2), la vitalità cellulare (sezione 3) e l&#39;attivazione immunitaria (sezione 4) nelle piastre di coltura cellulare (Figura 2C). </li></ol> 2. Assay La produzione virale <ol><li> Rimuovere le piastre di coltura cellulare di 24 pozzetti da incubatore e mescolare delicatamente le piastre all&#39;interno della coltura cellulare BSL3cappuccio. Trasferire 150 pl di surnatante da ogni pozzetto ad un corrispondente bene in una piastra inferiore 96 pozzetti piatta, che sarà utilizzato per quantificare HIV-1 di produzione. Nota: saggi titolazione virale comuni includono misurando l&#39;espressione della proteina del capside di HIV-1 (p24) by enzyme-linked test immunoenzimatico (ELISA) 20, quantificando RNA virale mediante trascrizione inversa reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) 21 e misurando l&#39;attività di HIV-1 RT enzima. I passaggi da 2.2 a 2.5 spiegare i metodi per quantificare l&#39;HIV-1 RT attività 13,15,16. </li><li> Trasferimento 5 ml di surnatante in pozzetti in una piastra a 96 pozzetti, contenente 25 ml di una perturbazione virale cocktail 15 (Tabella 1). Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente e trasferire la piastra ad una workstation radioattività. Nota: Step 2.2. è necessaria solo se una workstation radioattività non è disponibile in laboratorio BSL3. Se le piastre non devono essere rimossi dallaboratorio BSL3, procedere al punto 2.3. e aggiungere 50 ml di radioattivi / virale perturbazione cocktail (Tabella 1) al posto dei 25 ml di cocktail radioattivi. </li><li> Preparare una radioattivo cocktail 15 (Tabella 1), e aggiungere 25 ml a ciascun pozzetto di surnatante virale e cocktail interruzioni. Incubare le piastre a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Spot 5 ml di miscela di reazione su piazze corrispondenti in una fibra di vetro Di Etile Amino etilico (DEAE) carta filtermat e consentire le macchie asciugare per 10 minuti. Spot la miscela di reazione su ogni altro quadrato in modo che non esistono due campioni Boarder direttamente l&#39;un l&#39;altro. Ciò consente di evitare cross-over tra i campioni per determinare i conteggi per minuto (cpm) al punto 2.6. </li><li> Lavare le carte 5X per 5 minuti con 2x salina citrato di sodio (SSC) tampone (Tabella 1), seguito da due 1 min lavaggi con etanolo al 95%. Lasciare le carte a secco e sigillarli in sacchetti di campionamento. </li><li> Clip portacampionari containing la carta filtermat in una cassetta ed inserire la cassetta in un contatore a scintillazione micropiastra. Impostare il contatore di leggere CPM per 32 P, con la data di riferimento previsto per la partita di [32 P] dTTP utilizzato nell&#39;esperimento. Selezionare quali campioni da letto utilizzando la mappa piatto e avviare il contatore. </li><li> Per qualsiasi metodo titolazione virale, dividere i valori ottenuti per ciascun RNA test il controllo negativo adiacente e moltiplicare tale valore per 100 per ottenere la percentuale di inibizione di HIV-1 di produzione per ciascun replicato degli RNA prova. Un esempio dei risultati confrontando i diversi RNA di prova, a diverse concentrazioni è fornita in figura 3. </li></ol> 3. vitalità cellulare Assay <ol><li> Rimuovere le piastre a 96 pozzetti dall&#39;incubatore e aggiungere 20 ml di 5 mg / ml MTT (3- [4,5-dimetil-2-tiazolil] -2,5-difenil-2H-tetrazolio bromide) diluito in tampone fosfato di Dulbecco ( DPBS) in ciascun pozzetto. Incubare le piastre Fo 3 ore a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 150 ml di isopropanolo acidificato con detergente (1% NP-40, 4 mM HCl in isopropanolo) a ciascun pozzetto ed incubare le piastre per 2 ore a RT. </li><li> Determinare l&#39;assorbanza a 570 nm in uno spettrofotometro per micropiastre. </li><li> Calcolare il metabolismo MTT relativo per ciascun controllo e test di RNA positivo dividendo il valore ottenuto per ciascun campione per il controllo trasfezione adiacente. Un esempio dei risultati confrontando i diversi RNA di prova e un controllo positivo è fornito in Figura 4. </li></ol> 4. Immune attivazione del test <ol><li> Rimuovere le piastre da 12 pozzetti da incubatore e aspirare il terreno di coltura. Lavare delicatamente le cellule due volte con DPBS e aggiungere 70 ml di tampone di lisi freddo 22 (tra cui proteasi e fosfatasi inibitori, Tabella 1) in ciascun pozzetto. Incubare le piastre per 10 minuti in ghiaccio. </li><li> Trasferimento lisati cellulari per tubi micro e veloce congelarli immergendo iltubi in azoto liquido. Consentire ai campioni di scongelare e ripetere per altri 2 cicli di gelo e disgelo, per un totale di 3. </li><li> Centrifugare i lisati per 15 minuti a 4 ° C, 15.700 xg, per far sedimentare i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in nuovi tubi micro e determinare la concentrazione di proteine ​​con il metodo 23,24 Coomassie blu (Bradford). </li><li> Risoluzione 75 mg di proteine ​​di ogni campione in un gel di poliacrilammide denaturante al 10% e trasferimento su membrana di nitrocellulosa come precedentemente descritto 25,26. </li><li> Dopo elettroforesi e trasferimento ad una membrana, rivelare bande proteiche incubando la membrana Ponceau S (Tabella 1) per 1 min seguita da lavaggio con acqua bidistillata. Utilizzare le bande e scaletta proteine ​​come guida per tagliare la membrana 80 e 55 kDa. Nota: Nel passo 4.4 campioni possono essere eseguiti su 16 x 18 cm 2 gel scorrimento a 34 kDa, in modo che sia facile da tagliare la membrana nelle posizioni specificate e non tagliare ilbande di interesse. In alternativa, alcuni gel possono essere eseguiti con gli stessi campioni per evitare di tagliare la membrana. </li><li> Lavare la colorazione Ponceau S con soluzione salina Tris tamponata contenente 0,05% di Tween 20 (TBST, Tabella 1). Aggiungere TBST con latte non grasso 5% per coprire completamente le membrane. Incubare le membrane a temperatura ambiente con agitazione per 1 ora. </li><li> Incubare le membrane O / N in TBST con 3% di albumina sierica bovina (BSA) e anticorpi diluito a 1 su 1.000 contro ADAR1 (110 e 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa), e fosfo-IRF3 (47 kDa), per i primi, basso e intermedio pezzi della membrana, rispettivamente. </li><li> Lavare le membrane 5X per 5 minuti con TBST e incubare in TBST con latte 5% senza grassi e di capra anti-coniglio anticorpi secondari perossidasi (diluito a 1 su 5.000) per 1 ora. </li><li> Lavare il membrane 5x per 5 minuti con TBST e applicare la soluzione elettrochemiluminescenza (ECL) per visualizzare le bande in film, secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Dopo visualizzare le bande proteiche su film, lavare i pezzi intermedia ea valle della membrana per 10 minuti con una soluzione di anticorpi stripping. Incubare le membrane O / N in TBST con 3% di BSA e anticorpi contro PKR totale (a 1 a 500) e IRF3 (a 1 su 1.000), per la metà e pezzi di fondo, rispettivamente. Ripetere i punti 4.8. e 4.9. utilizzando marcato con perossidasi di capra anti-topo al posto del anticorpo secondario anti-coniglio per la membrana PKR (centro). </li><li> Lavare il pezzo inferiore della membrana 5x per 5 minuti con TBST e incubare la membrana in TBST con 3% BSA per 1 ora con un anticorpo contro actina (diluito 1 a 5000). Ripetere i punti 4.8. e 4.9. utilizzando marcato con perossidasi di capra anti-topo al posto del anticorpo secondario anti-coniglio. Un esempio dei risultati che confrontano diversi RNA di prova e un controllo positivo viene fornito nella Figura 5. Vedere la tabella di materiali per i anticorpi specifici da utilizzare. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

L&#39;HIV-1 test di produzione, definita è stata effettuata utilizzando cellule HEK293T (Figura 2) ed è simile a dosaggi utilizzati per lo screening HIV-1 RNA per ribozyme efficace 13, shRNA 10,29, siRNA 30, e U1i RNA siti 11,31 bersaglio. Utilizzando diversi metodi per quantificare l&#39;HIV-1 di produzione, la maggior parte degli studi hanno misurato la produzione virale 48 ore dopo la co-trasfezione di HIV-1 RNA plasmide con candidati. Dopo la produzione di HIV-1, virioni immaturi subiscono scissione proteolitica dei loro poliproteine ​​dal HIV-1 proteasi diventare virioni maturi, capaci di infettare nuove cellule. Per il saggio RT attività enzimatica HIV-1 descritto nelle fasi 2.2. a 2,5., sia la produzione e gradini maturazione vengono valutati, poiché l&#39;enzima RT è attivo solo in virioni maturi. Al contrario, la proteina del capside e RNA virale possono essere presenti in entrambi i virioni maturi e immaturi. Pertanto, quantificando HIV-1 produzione p24 ELISA o RT-PCR may perdere effetti di RNA terapeutici che agiscono sul gradino maturazione del ciclo di replicazione di HIV-1, come ribozimi che localizzano per HIV-1 virioni 32 e molecole antisenso basate che inibiscono l&#39;elaborazione Gag in aggiunta a HIV-1 espressione della proteina 13, 31. Una limitazione di saggi produzione virale è che le cellule utilizzate non esprimono i recettori appropriati per HIV-1 iscrizione e non possono essere utilizzati per valutare gli effetti di RNA terapeutici su HIV-1 iscrizione o l&#39;integrazione. Per valutare gli effetti di anti HIV-1-RNA sull&#39;intero ciclo di replica, vari modelli HIV-1 sono stati utilizzati in diverse linee cellulari T linfociti o globuli primarie 5,33. Dal momento che queste linee cellulari sono difficili da trasfezione, sono necessari per fornire una quantità sufficiente di HIV-1 RNA anti-per osservare gli effetti sulla replicazione dell&#39;HIV-1 metodi più alta intensità di lavoro, come l&#39;inserimento del gene vettori lentivirali o aptameri / peptide coniugazione. Questa limitazione rende difficult per confrontare rapidamente il rapporto struttura-attività tra le varianti di un particolare anti-HIV-1 RNA o eseguire lo screening su larga scala per identificare il sito di destinazione ottimale per nuove classi di anti-HIV-1 RNA. Mentre saggi produzione virali sono utili per identificare nuove molecole anti-HIV-1 RNA, modelli cellulari alternativi in ​​linee cellulari facilmente transfettate che supportano replicazione dell&#39;HIV-1, come TZM-bl cellule, sarebbe utile per lo screening anti-HIV-1 RNA di targeting altre fasi del ciclo di replicazione, come l&#39;ingresso e l&#39;integrazione. A seconda della classe di anticorpi anti-HIV-1 RNA, sono state descritte diverse possibili meccanismi di tossicità. Ad esempio, RNA antisenso-based possono avere effetti fuori bersaglio sulla RNA cellulari contenenti la stessa o una sequenza simile al loro sito bersaglio in HIV-1 RNA. Allo stesso modo, aptameri RNA, sul modello della risposta elemento trans-attivazione (TAR) o elemento di risposta Rev (RRE), potrebbero influenzare la funzione di pr cellularioteins, come la proteina legante TAR RNA (TRBP) 34. shRNAs e siRNA hanno il potenziale aggiunto per influenzare il percorso RNA interference sequestrando proteine ​​RNAi 35 e alcune molecole U1i hanno dimostrato di influenzare la giunzione e lavorazione di RNA cellulari sequestrando proteine ​​del U1 piccoli RNA-proteina nucleare complesso 36. Mentre alcuni di questi effetti possono essere minimizzati un&#39;attenta progettazione, misurazioni della tossicità cellulare in schermi per nuove molecole anti-HIV-1 RNA sono utili per escludere molecole con potenziali effetti fuori bersaglio da un ulteriore sviluppo. Inoltre, gli effetti fuori bersaglio potrebbero indirettamente inibire l&#39;HIV-1 di produzione, rendendo tossicità cellulare una misura importante nel convalidare l&#39;efficacia di nuovi farmaci anti HIV-1 molecole identificate dagli schermi HIV-1 di produzione. Il saggio vitalità cellulare descritto in passi 3.1. a 3,4. è una variante di un test standard che è stata usata per vagliare diverse molecola antivirale<html> S 37. Il dosaggio misura l&#39;attività di enzimi cellulari NAD (P) H-dipendenti per ridurre il reagente MTT alla sua forma viola insolubile, formazan. Il protocollo è adattato da metodi precedentemente pubblicati 38 e diversi kit sono disponibili con MTT o altri reagenti strettamente correlati. Mentre è importante per saggiare la vitalità cellulare nella linea cellulare utilizzata per lo screening anti-HIV-1-RNA, va notato che diverse linee cellulari variano nella loro sensibilità verso tossicità RNA-indotta. Ad esempio, Reynolds et al. Dimostrato che Dicer siRNA substrato ha avuto alcun effetto sulla vitalità cellulare nelle cellule HEK293T, ma ha ridotto significativamente la vitalità cellulare nelle cellule MCF7, DU145 e HeLa S3 39. Per il saggio descritto, HEK293T cellule sono usati come esempio (figura 4); Tuttavia, lo stesso test è anche stato fatto in cellule MCF7 per valutare la potenziale tossicità in una linea cellulare che è più sensibile a piccole tossicità RNA-indotta 16. e_content &quot;&gt; Da-HIV-1 anti-RNA non può essere elaborato e presentato al sistema immunitario adattativo, sono considerati meno immunogenico rispetto anti-HIV-1-proteine ​​o peptidi. Tuttavia, a seconda della loro sequenza o struttura, possono suscitare innata risposte immunitarie, e diversi sensori immunitario e vie di segnalazione sono stati individuati in grado di rispondere a piccoli RNA (recensiti 40). nel saggio di attivazione immunitaria qui descritto, i livelli di PKR fosforilato e IRF3 stati confrontati in cellule trasfettate con piccoli RNA come un indicazione di attivazione PKR o TLR3 rispettivamente. Entrambi i sensori RNA sono presenti in una vasta gamma di linee cellulari e la loro attivazione può portare alla produzione di interferoni di tipo 1 e, in caso di PKR, un arresto in traduzione. per valutare il potenziale anti-HIV-1 RNA per attivare la produzione di interferoni di tipo 1 di percorsi alternativi, i livelli di interferone-stimolata gene ADAR1 (P150) sono stati confrontati in cellule trasfettate conanti-HIV-1 RNA. Come dimostrato dagli effetti della lunga controllo positivo dsRNA, Poly I: C, tutte queste risposte erano attivi nelle cellule HEK293T (Figura 5) ed effetti simili sono stati osservati nelle cellule MCF7 16. Poiché queste risposte possono inibire HIV-1 di produzione in assenza di effetti sulla vitalità cellulare, il saggio di attivazione immunitaria fornisce un&#39;ulteriore convalida per l&#39;efficacia di nuovi anti-HIV-1 RNA. Ulteriori misure che possono essere aggiunti a questa valutazione includono la misurazione della produzione di citochine infiammatorie e interferoni di tipo 1 nelle cellule in coltura supernatante, e misurando l&#39;espressione di più geni interferone-stimolata. Dato che le cellule bersaglio HIV come le cellule ei macrofagi T CD4 + possono esprimere diversi livelli di sensori immunitarie innate, i candidati individuati dai saggi descritti in questo protocollo dovrebbero essere valutati per potenziale stimolazione immunitaria in questi tipi di cellule. Per tutti i saggi descrivonod, il passaggio critico per ottenere risultati riproducibili ed accurati è la preparazione dei tubi DNA o RNA transfezione (punto 1.3.). Il DNA plasmidico o RNA dovrebbero essere di elevata purezza con concentrazioni determinate con precisione. E &#39;anche fondamentale per comprendere gli opportuni controlli. Per valutare nuovi plasmidi di espressione dell&#39;RNA prova nel test di produzione virale, un controllo negativo appropriato è il plasmide di espressione vuota. Per RNA antisenso-based, deve essere incluso un ulteriore controllo negativo plasmide che esprime un RNA non-targeting. Sequenze per un ribozima non-targeting e shRNA che non incidono produzione HIV sono forniti in 13. Per siRNA prova, l&#39;unico controllo negativo che può essere utilizzato è un RNA non-targeting e un non-targeting siRNA sequenza appropriata per il dosaggio di produzione virale è fornito in 16. Per la vitalità delle cellule e saggi di attivazione immunitaria, il controllo negativo deve essere cellule trattate con solo il reagente di trasfezione ed è critical che un controllo positivo come poli I: C è incluso per confermare che le cellule sono sensibili alla tossicità RNA-indotto o attivazione immunitaria. Per RNA plasmidi di espressione, il plasmide vuoto deve essere incluso per garantire che il vettore stesso non ha effetti tossici sulle cellule. Nel complesso, i saggi qui descritti rappresentano un buon primo passo verso l&#39;identificazione di terapie RNA sicuri ed efficaci per l&#39;uso in HIV-1 gene o la terapia farmacologica. Per molecole di targeting HIV-1 RNA, è anche importante considerare la conservazione del loro sito bersaglio in HIV-1 ceppi circolanti e metodi dettagliati per calcolare conservazione di sequenza sono stati precedentemente pubblicati 15. Per spostare una molecola in avanti in studi clinici, tossicità ed efficacia studi a lungo termine devono essere eseguite in cellule umane primarie e in modelli animali per confermare che i candidati identificati saranno al sicuro ed efficace nella clinica.

Una limitazione di corrente trattamenti HIV-1 è che devono essere somministrati cronicamente per prevenire la progressione della malattia. Trapianto di HIV-1 resistenti linfociti T, o cellule staminali ematopoietiche, ha il potenziale per fornire un controllo a lungo termine della replicazione dell&#39;HIV-1 in assenza di terapia farmacologica 1,2 e può anche essere un approccio efficace per raggiungere un HIV-1 cura 3. Un modo per rendere le cellule resistenti alla replicazione dell&#39;HIV-1 è quello di inserire uno o più geni che codificano per anti-HIV-1 RNA o peptidi nelle cellule di un individuo infetto durante un trapianto autologo 4. Diversi candidati-HIV-1 anti-geni sono stati progettati con alcuni studi clinici che entrano in combinazioni di due o tre 5 6, per prevenire lo sviluppo di HIV-1 resistenza a qualsiasi singolo gene. Anti-HIV-1 RNA sono tra i primi candidati per la terapia genica combinazione a causa del loro basso potenziale per suscitare risposte immunitarie e perchésono trascritti da sequenze geniche molto brevi. Alcuni-HIV-1 anti-RNA sono stati progettati per colpire l&#39;ingresso e l&#39;integrazione virale. Tuttavia, la maggior parte degli RNA anti-HIV-1 Target passaggi post-integrazione nel ciclo di vita virale (Figura 1). Inibitori post-integrazione includono RNA decoy, mira le HIV-1 Tat proteine ​​regolatrici o Rev 1, e RNA antisenso a base, il targeting siti diversi in HIV-1 RNA, come ribozimi 7, 8 e shRNAs U1i RNA 9. I metodi che sono stati utilizzati per confrontare l&#39;efficacia di anti HIV-1-RNA includono il monitoraggio replicazione virale in cellule trasdotte con i geni codificanti per RNA candidati e misurando la produzione virale in cellule trasfettate con plasmidi esprimenti RNA candidati e uno di HIV-1 plasmide di espressione 10 -13. Abbiamo usato in precedenza un test di produzione di HIV-1 per lo screening HIV-1 RNA per il nuovo ribozima siti bersaglio 13-15. Questi metodi sono stati dal raffinato per ottimizzare il formato di un RNAmolecola interferenze espresso dal DNA plasmide come shRNA o consegnato come siRNA sintetico 16. Il test misura la produzione di virus maturi dalle cellule 293T umane embrionali renali (HEK), e può essere utilizzato per confrontare gli effetti degli inibitori che colpiscono fasi post-integrazione nel ciclo di replicazione dell&#39;HIV-1 (Figura 1). Per gli inibitori che colpiscono fasi di pre-integrazione, sono necessari test alternativi come una prova di infettività delle cellule TZM-bl 17 per valutare l&#39;efficacia antivirale. I principali problemi di sicurezza per la fornitura di anti-HIV-1 RNA nella clinica includono potenziali effetti fuori bersaglio sulla RNA umani o proteine, e l&#39;attivazione dei sensori del sistema immunitario innato. Per valutare la tossicità di anti-HIV-1 siRNA, abbiamo utilizzato un test di vitalità cellulare in diverse linee cellulari 16. Abbiamo anche misurato attivazione dei doppi sensori immuni RNA incagliati, RNA proteina chinasi attivata R (PKR) e Toll like receptor 3 (TLR3), nonché expressione dell&#39;interferone stimolato gene, p150 ADAR1. Questi saggi possono essere usati per confermare che l&#39;efficacia anti-HIV-1 RNA non è dovuto ad effetti indiretti sulla vitalità cellulare o attivazione del sensore immunitaria. Sono anche utili per escludere RNA candidati potenziali tossicità di ulteriore sviluppo. Nelle seguenti protocolli, le procedure per identificare nuovi RNA terapeutici e ottimizzare il formato di quelli esistenti sono descritti. I metodi sono utili per gli inibitori della post-integrazione a base di screening di RNA di HIV-1 replicazione e potrebbero essere adattati per lo screening altri inibitori post-integrazione, come ad esempio piccole molecole di targeting Rev esportazione mediata di RNA virale 18 o CRISPR / sistemi Cas progettato per indirizzare integrato HIV-1 DNA 19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well.</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353075, 353047, 353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes Axygen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>311-08-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low molecular weight Poly I:C</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>3182-29-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DharmaFECT-1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>T-2001-01</td>
			<td>transfection reagent for synthetic RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td>transfection reagent for RNA expression plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 (NP-40)</td>
			<td>USB</td>
			<td>19628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[32P]dTTP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>BLU505H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(A) RNA template&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10108626001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo(dT)12-18 DNA primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18418-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEAE filtermat paper&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1450-522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1450-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1706930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001, 4906837001</td>
			<td>protease and phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel running chamber</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-dry transfer cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein ladder EZ-Run</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP3603-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>162-0094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody stripping solution</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL - Pierce</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>PI32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADAR1 antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. B.L. Bass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-T446-PKR antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-S396-IRF3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKR antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. A. Hovanessian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRF3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>11904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-labeled goat anti-rabbit</td>
			<td>KPL</td>
			<td>474-1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-labeled goat anti-mouse</td>
			<td>KPL</td>
			<td>474-1806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6226-79-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the efficacy and toxicity of rnas targeting hiv-1 production for use in gene or drug therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Uno schema generale delle procedure è mostrata in figura 2 con un piano trasfezione esempio per tre RNA di prova e un RNA di controllo fornito in Figura 2B. Per i saggi di produzione e vitalità cellulare virali, la lettura per ciascun costrutto test è normalizzata a un controllo negativo. Replicati vengono trasfettati in serie, in modo che ogni RNA test viene normalizzato al suo controllo negativo adiacente. Questo viene fatto per evitare dati imprecisi relativi al tempo tra complessante e trasfezione, che può causare, ad esempio, tutti i controlli negativi sono trasfettate prima. Poiché HIV-1 può influenzare le risposte immunitarie 27,28, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione immunitaria vengono eseguite senza l&#39;aggiunta di un plasmide che esprime HIV-1. Per identificare la lunghezza ottimale di molecole di RNA interference mira un sito conservato in HIV-1 RNA (posizione 1498-141519 in HIV-1 ceppo NL4-3) 13, un insieme di siRNAs sono stati progettati (Figura 3A). Usando il test di produzione di HIV-1, la percentuale di attività RT rispetto alle cellule trasfettate con un lungo Dicer substrato dialogo siRNA (Sins) è stata calcolata per le cellule trasfettate con l&#39;siRNA test a diverse quantità di co-trasfezione con 100 ng di plasmide esprimente HIV-1 ceppo NL4-3 (Figura 3B). Usando il test di vitalità cellulare, il metabolismo cento di MTT è stata determinata per le cellule trasfettate con i siRNA più efficaci identificati nella Figura 3B. I dati sono stati normalizzati al metabolismo MTT in cellule trattate con il solo reagente di trasfezione (Figura 4). Una lunga RNA a doppia elica (Poly I: C) ha ridotto la vitalità delle cellule; Tuttavia, l&#39;effetto era significativo soltanto alla dose più elevata. No significativa riduzione della vitalità cellulare è stata osservata per siRNA targeting 1498 SI<html> te in HIV-1 RNA, indipendentemente dalla loro lunghezza. Usando il test di attivazione immunitaria, lo stesso insieme di RNA sono stati valutati per il loro potenziale per innescare risposte immunitarie (Figura 5). In condizioni in cui Poly I: C attivata l&#39;espressione di p150 ADAR1 e fosforilazione indotta di PKR e IRF3, alcun effetto significativo sui marcatori di attivazione immunitaria potrebbe essere osservata per una qualsiasi delle RNA di prova. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54486/54486fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di passaggi pre e post-integrazione nel ciclo di replicazione dell&#39;HIV-1. Pre-integrazione (1-3) e post-integrazione (4-7) passi nel ciclo di replicazione di HIV-1 sono mostrati in scatole delineati . <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54486/54486fig1large.jpg" target="_blank">clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54486 / 54486fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Schema della produzione virale, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione del sistema immunitario. Cellule aderenti (A) Piastra e la cultura per 24 ore. Le cellule sono placcati in a 24, 96 e 12- pozzetti a 500, 100 e 1.000 ml di mezzi di coltura cellulare per la produzione virale, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione del sistema immunitario, rispettivamente. (B) Preparare le provette di trasfezione, le cellule trasfezione, e la cultura per 48 ore. Un piano esempio trasfezione per una serie di tre test (RNA RNA1-3) viene mostrato con controlli appropriati. La procedura di transfezione è anche illustrata. (C) Leggi-out. La presenza di un letto per la produzione virale, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione del sistema immunitario sono scritti e ha spiegato in dettaglio nelle sezioni 2, 3 e 4, rispettivamente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54486/54486fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> &lt;/ P&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54486/54486fig3.jpg" /> Figura 3. Effetto di siRNA di test per l&#39;HIV-1 di produzione. (A) Progettazione di siRNA con lunghezze e simmetrie differenti. Una sequenza conservata in HIV-1 RNA (1498 sito di destinazione) è stato utilizzato per la progettazione di siRNA simmetrici e asimmetrici (si1498-) con diverse lunghezze (da 17 a 29 fili nucleotide senso). Il senso atteso (in alto, nero) e antisenso (in basso, rosso) filamenti sono indicati. (B) L&#39;inibizione del virus HIV-1 produzione varianti di lunghezza si1498. La percentuale (%) di inibizione di HIV-1 RT nel supernatante di cellule trasfettate con HEK293T varianti di lunghezza si1498 simmetriche o asimmetriche è mostrato relativamente ad una lunga substrato Dicer dialogo siRNA (Sins). Ogni RNA test è stato confrontato Sins a dosi differenti in almeno due trasfezioni indipendenti con due o tre repliche. I dati sono espressed come valori medi ± mezzi di errore standard (SEM). Questa cifra è stata modificata da 16, copyright American Society for Microbiology. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54486/54486fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54486/54486fig4.jpg" /> Figura 4. Effetto di lunghezza si1498 varianti sulla vitalità cellulare HEK293T cellule sono state trasfettate con poli I:. C a 50 e 200 mcg / ml (PIC50 e PIC200) e lunghezze diverse e formati di si1498 a 100 nM. Il metabolismo% di MTT è stata determinata rispetto alle cellule trattate con solo il reagente di trasfezione (Mock, M) in tre trasfezioni indipendenti con due o tre repliche. I dati sono espressi come valori medi ± SEM. studenti spaiato t-test sono stati utilizzati per determinare se il diverso trasfezioni significantly (*, P &lt;0,05) ridotta vitalità cellulare rispetto alle cellule transfettate finta. Questa cifra è stata modificata da 16, copyright American Society for Microbiology. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54486/54486fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54486/54486fig5.jpg" /> Figura 5. Effetto della lunghezza si1498 varianti sulle risposte immunitarie innate. HEK293T cellule sono state trasfettate con PIC50, PIC200 e diverse lunghezze e formati di si1498 a 100 nM. L&#39;attivazione di PKR e TLR3 sono stati valutati misurando PKR fosforilata e IRF3, rispettivamente. L&#39;espressione di un interferone gene stimolato (ISG) è stata valutata misurando i livelli di P150 ISG ADAR1 relativi alla variante costitutivamente espresso, P110 ADAR1. L&#39;espressione di actina è stata utilizzata come controllo di caricamento. Questo figure è stato modificato da 16, copyright American Society for Microbiology. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54486/54486fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome di Buffer / reagente </td><td> Composizione </td></tr><tr><td> Cocktail interruzione virale </td><td> 60 mM Tris-HCl (da 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1,04 mM EDTA, 1% NP-40. </td></tr><tr><td> cocktail radioattivo </td><td> 60 mM Tris-HCl (da 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1,04 mM EDTA, 10 ug / ml Poly (A), 0,33 mg / ml oligo dT. Aggiunta immediatamente prima dell&#39;uso: 8 mm ditiotreitolo (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) e 5 ml [32 P] dTTP (3000 Ci / mmol) Per ogni 500 ml di cocktail. </td></tr><tr><td> Radioactive / virale cocktail perturbazione </td><td> 60 mM Tris-HCl (da 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1,04 mM EDTA, 0,1% NP-40, 5 mg / ml poli (A), 0,16 mg / oligo ml it. Aggiunta immediatamente prima dell&#39;uso: 8 mm ditiotreitolo (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) e 5 ml [32] P dTTP (3000 Ci / mmol) per ogni 1 ml di cocktail. </td></tr><tr><td> 2x SSC </td><td> 17.53 g NaCl e 8,82 g di sodio citrato - 2H 2 O in 1 LH 2 O. </td></tr><tr><td> tampone di lisi </td><td> 50 mM Tris-HCl (da 1 M Tris-HCl, pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA (da 0,5 M, pH 8,0), 10% v / v di glicerolo, 1% v / v NP-40. </td></tr><tr><td> Ponceau S </td><td> 2.5 g Ponceau S e 5 ml di acido acetico in 500 ml di H 2 O. </td></tr><tr><td> TBST </td&gt; <td> 6,05 g Tris, 8,76 g di NaCl e 1 ml di Tween 20 in 1 LH 2 O. </td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Componenti del buffer non commerciali e reagenti Ricette per tutti i buffer non commerciali e reagenti sono forniti.

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Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l&#39;uso in gene terapia farmacologica

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

evaluation-efficacy-toxicity-rnas-targeting-hiv-1-production-for-use

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K Views.  Lady Davis Institute for Medical Research. Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones. 

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Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Amplificazione e quantificazione di HIV-1 RNA in soggetti affetti da HIV con una carica virale inferiore il limite di rilevamento da parte di Standard saggi clinici

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

In uncoating vitro di HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Imaging di HIV-1 Envelope indotta Synapse virologica e segnalazione sui doppi strati lipidici sintetici

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine ​​Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Misurazione<em&gt; In Vitro</em&gt; Integrazione di attività del virus HIV-1 preintegrazione Complessi

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...