This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the S&#228;chsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).

Todas as amostras de sangue humano foram obtidas de voluntários saudáveis, e o protocolo de enriquecimento de leucócitos aplicada segue as diretrizes da comissão de ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Leipzig. Os experimentos com sangue de rato foram aprovados pelo comitê de ética local responsável (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), de acordo com as directrizes alemãs sobre cuidados com os animais e utilização. 1. Configuração Experimental NOTA: Como o procedimento de lise hipotônica para o esgotamento dos eritrócitos a partir das amostras de sangue é um procedimento de tempo crítico, prepare todo o equipamento necessário (por exemplo, buffers) para esta parte do protocolo de antecedência. <ol><li> Rotular um 15 ml tubo de centrifugação para a lise hipotônica e um tubo de 1,5 ml da amostra para posterior fluoresceína aminofenil (APF) coloração por amostra de sangue. <ol><li> Se o enriquecimento de leucócitos irão ser realizada sob condições estéreis, executar esta rotulagem sob um fluxocaixa. </li></ol></li><li> Prepare a cerca de 12 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS, 10 mM) por amostra. Dependendo do facto de os leucócitos devem ser isolados, em condições estéreis ou não, preparar PBS, quer com a solução estéril pronta a partir de um fornecedor ou por dissolução de comprimidos de PBS em água destilada. Verificar o valor de pH e, se necessário, ajustar o pH para 7,4, utilizando pequenas quantidades de soluções de 0,1 M de HCl e de NaOH. <ol><li> Dissolve-se comprimidos PBS (ver tabela de materiais) em 200 ml de água destilada para obter uma solução tampão não-estéril suficiente para cerca de 16 amostras. Se desejado, esterilizar a solução por filtração estéril. </li></ol></li><li> Prepare a cerca de 1 ml de solução de Hanks equilibrada de sais (HBSS) suplementada com Ca 2+ por amostra. <ol><li> Dissolve-se 970 mg de sal de HBSS em 100 ml (volume final) de água bidestilada. Antes de preencher até ao volume final, verifique o valor de pH e ajustá-lo para pH 7,4. Devido à sua capacidade tampão baixo, preparar este tampão fresco cada dia, umd realizar o ajustamento do pH com especial cuidado, usando pequenas quantidades de soluções de HCl 0,1 M e NaOH. NOTA: solução estéril pode ser usado, dependendo da experiência. A solução pode ser esterilizada por filtração estéril. </li></ol></li><li> Além dos dois tampões, de etiquetas e preparar um tubo (por exemplo, 50 ml de tubo de centrifugação) ou recipiente de vidro (por exemplo, 250 ml de medição do copo) com água duplamente destilada para o procedimento de lise hipotónico com antecedência. Prepare cerca de 10 ml de água por amostra. </li><li> Preparar um recipiente com gelo esmagado para a coloração APF (secção 3), a qual é realizada em gelo. </li><li> Preparar alíquotas de APF antecedência para permitir a preparação rápida de soluções de trabalho utilizados durante a coloração (passo 3.2) e evitar repetidamente congelamento e descongelamento da solução APF. NOTA: APF é geralmente obtido como um 5 mg / ml (11,81 mM) solução estoque em acetato de metilo. <ol><li> Congelar alíquotas de 10-100 ul em tubos de 0,5 ml. Para a APF manchando uma finalconcentração de corante de 10 uM é utilizado (Passo 3.8). </li></ol></li></ol> 2. Hypotonic lise dos eritrócitos NOTA: Execute as etapas de lise hipotônica (exceto os passos de centrifugação) sob uma bancada de fluxo laminar para evitar a contaminação. Executar todo o processo à temperatura ambiente. À medida que a lise hipotónica é um processo crítico tempo, ajustar as pipetas para água (2 ml) e PBS (5 ml) adição com antecedência e abre a água e frascos PBS antes de iniciar o procedimento. Guardar a solução de PBS e a água destilada, à temperatura ambiente antes do uso. <ol><li> A partir de cada amostra de sangue de transferência 100 ul aos 15 ml tubo de centrifugação adequado. Nota: Nas nossas experiências amostras de sangue geralmente contêm 10 U / ml de heparina, a fim de evitar a coagulação. No entanto, devido a diferentes fontes de material de amostra a natureza e concentração do anti-coagulante podem ser diferentes. A sua influência sobre a coloração APF deverão ser testadas por Comparção dos resultados com os resultados obtidos a partir de amostras de sangue para além de outros tipos ou as concentrações de anti-coagulante. </li><li> Adicionar 2 ml de água destilada e misturar as amostras usando um misturador de vórtice para definir um nível médio. Incubar as amostras durante 60 segundos, em seguida, adicionar 5 ml de PBS por amostra e misturar usando o misturador de vórtice. NOTA: até cerca de 5 amostras podem ser preparadas em paralelo. Manter a ordem da amostra o mesmo para a adição de água e PBS para atingir tempos de incubação comparáveis. </li><li> Após regeneração das condições isotónicas através da adição de PBS (passo 2.2) sedimentar as restantes células intactas em todas as amostras por centrifugação durante 6 min à temperatura ambiente e 450 x g. </li><li> Retire o sobrenadante por coloca-lo em um caixote do lixo mesa. Remover o máximo de líquido possível, invertendo o tubo de centrifugação e tocando a abertura em uma toalha de papel. Assegure-se que o pellet celular é o mais seco possível. </li><li> Repetir o procedimento de lise hipotónico, tal como descrito antes (passo 2.2). NOTA: Em princípio este procedimento de lise hipotónico (passos 2.3 a 2.5) poderia ser repetido mais de uma vez, dependendo da pureza da fracção de leucócitos mista a ser obtido. Após dois lise passos a quota de permanecer eritrócitos na fracção celular mista obtida é cerca de 25%. </li><li> Sedimentar as restantes células intactas por centrifugação durante 6 min à temperatura ambiente e 450 x g. Remover o sobrenadante (veja o passo 2.4). Adicionar 500 uL de HBSS ao sedimento e dissolvê-lo suavemente até se obter uma solução homogénea. Transferir cada amostra para o tubo de amostra de 1,5 ml em conformidade marcado. </li><li> Dependendo da experiência analisar directamente amostras obtidas (por exemplo, por meio de citometria de fluxo) 25, mancha com anticorpos marcados por fluorescência (para a identificação de tipos de células individuais) 32, incubar com estímulos de células (para as experiências de activação de células) 33 ou armazenado em gelo e utilização mais tarde. Dependendo do objetivo do estudo, imediatamente realizar experimentos subsequentes sobrea fracção de leucócitos mista desde granulócitos têm uma meia-vida relativamente curto de cerca de 20 h. NOTA: O mesmo vale para a coloração atividade da peroxidase descrito abaixo. </li></ol> 3. halogenação atividade da peroxidase Coloração NOTA: HOCl- e HOBr-produção pelas peroxidases heme derivados do sangue de MPO e EPO é quantificada usando APF, o qual é oxidado a fluoresceína pelos ácidos hypohalous nomeados. Portanto, se a rotulagem de células com anticorpos marcados com fluorescência é realizada em combinação com coloração APF, fluoróforos evitar que interferem com o sinal de emissão da fluoresceína. <ol><li> Realização da coloração APF a 4 ° C em gelo. </li><li> Para a preparação de uma solução de trabalho de APF descongelar uma aliquota adequada do corante (por exemplo, 10 ul, 11,81 mM) e dilui-lo com HBSS a exactamente 1 mM (por exemplo, adicionar 108,1 ul de tampão para o 10 ul). <ol><li> Para cada amostra (solução de células ul 500) preparar 5 μl da solução de trabalho APF descrito. Por conseguinte, utilizar uma aliquota de 10 ul de APF (11,81 mm), que produz 118,1 solução ul APF de trabalho (1 mM) para preparar cerca de 20 amostras. Devido à perda durante a pipetagem preparar cerca de 10% mais solução de trabalho APF do que calculado. </li></ol></li><li> A fim de verificar a especificidade da peroxidase da coloração APF, preparar amostras de controlo com o inibidor de heme peroxidase de hidrazida do ácido 4-aminobenzóico (4-ABAH) 35. <ol><li> Prepara-se uma solução stock de 1 M de 4-ABAH (151,17 g / mol) em sulfóxido de dimetilo (DMSO) por diluição de 75,6 mg de 4-ABAH em 500 mL de solvente. Diluir 4-ABAH 1/10 em HBSS. </li></ol></li><li> Para a preparação de uma solução de marca H 2 O 2 trabalhando em dois tubos de 1,5 ml com centrifugação &quot;mM H 2 O 2 70&quot; e &quot;H 7 mM de 2 O 2&quot;, respectivamente. <ol><li> No tubo rotulado &quot;mM H 2 O 2 70&quot;, recém Diluir 10 uLde uma solução de estoque de 30% (8,8 mM) de H 2 O 2, usando 990 ul de água destilada para se obter uma concentração de cerca de 88 mM. Armazenar em gelo e usar dentro de 4 horas. NOTA: H 2 O 2 é normalmente fornecido como uma solução estoque de 30% pelos fornecedores. Quando armazenado a 4 ° C, é estável durante cerca de 3 anos. Efectuar diluições de H 2 O 2 em água destilada para evitar a decomposição. H 2 O 2 diluições também pode ser preparada em solução de 0,1 M de NaOH. </li><li> Para a determinação da H exacta concentração 2 O 2 a preparar uma diluição adicional de 1 a 10 a partir do primeiro H 2 O 2 a solução de estoque (cerca de 88 mM) pela adição de 100 ul desta solução a 900 ul de água destilada no tubo 1,5 ml rotulados &quot;mM H 7 2 O 2&quot;. </li><li> Gravar um espectro na gama de UV próximo (por exemplo, 200-300 nm) usando um photospectrometer UV-Vis e usar a absorvância a 240 nm (49; 240 = 34 M -1 cm -1) para determinar a concentração real de H 2 O 2 na segunda H 2 O 2 a solução de reserva 34. Certifique-se de que a cuba de referência contém apenas água destilada. Para as cuvetes de quartzo de medição como o uso de um espectro na gama de UV é registada. </li><li> A partir deste resultado, calcular as concentrações exactas de ambas as soluções de reserva de H 2 O 2. Ajustar a concentração de a primeira solução de estoque no &quot;mM H 2 O 2 70&quot; de tubos de amostra para exactamente 70 mM, por adição de uma quantidade adequada de água destilada. Guardar a solução obtida trabalhando sobre gelo e utilizar no prazo de uma hora. </li></ol></li><li> Adicionam-se 5 ul da solução de trabalho de 4-ABAH (100 mM) às amostras adequadas para uma concentração final de 1 mM. Incubar as amostras durante 15 min a 37 ° C na incubadora antes de APF adição. </li><li> Adicionar 5 uL APF solução de trabalho (1 mM) a cada500 ul de amostra para se obter uma concentração de corante final de 10 uM. Misturar suavemente as amostras (por exemplo, usando o misturador de vórtice de uma definição média) e incubar durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 5 uL H solução de trabalho 2 O 2 (70 mM) a cada amostra de 500 ul para uma concentração final de 700 uM. Misturar suavemente as amostras e incuba-se-lhes durante 60 minutos a 37 ° C. Realizar medições adequadas de controlo em paralelo. NOTA: As medidas de controlo mostraram que 700 uM de H 2 O 2 não são tóxicos para as células. quaisquer respostas celulares significativas nem foram observados. NOTA: A coloração com APF pode também ser realizada por omitindo a adição de H 2 O 2, dependendo da questão científica. Na ausência de peróxido de hidrogénio apenas a MPO cloração basal e a actividade da EPO é determinada, enquanto a adição de H 2 O 2 permite a detecção da produção máxima de HOCl e HOBr pelas células. Tele últimos meios um sinal de fluorescência significativamente maiores. </li><li> Por peletização das células, centrifugação das amostras durante 10 min a temperatura ambiente e 400 x g. Cuidadosamente remover o sobrenadante sem destruir o sedimento e adicionar 250 uL de HBSS para ressuspender as células. NOTA: As amostras estão agora prontos para análise através de citometria de fluxo 25. </li><li> Armazenar as amostras no escuro até análise para evitar branqueamento. Após excitação a 480-490 nm detectar a emissão de fluoresceina a cerca de 525 nm de 37. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Como os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue humano, o isolamento de células de peroxidase-positivos muitas vezes só incide sobre estas células e inclui uma separação dos neutrófilos a partir de outros leucócitos por centrifugação em gradiente de densidade de 38. No entanto, como os neutrófilos são muito menos abundante em amostras de sangue de murino 39 para os últimos métodos mais complicadas tem que ser utilizado 40. Além disso ambos os métodos também conduzem à remoção de monócitos peroxidase-positivos a partir das amostras e, devido à necessidade de os volumes de sangue maiores (por exemplo, 400 ul 41), não são aplicáveis ​​a micro-amostras obtidas durante a amostragem de sangue de repetição a partir de pequenos animais de laboratório 38,40. A purificação dos neutrófilos murino de exsudato peritoneal também precisa do sacrifício dos animais e, além disso, não produz granulócitos derivados do sangue 38,40. Recentemente desenvolveram métodos para obter fracções altamente purificadas a partir de granulócitos BL murinoood (por exemplo, a aplicação de anticorpos) são frequentemente caro, complicado e demorado 40,42,43 e novamente apenas se concentrar na purificação de um tipo de leucócitos da peroxidase-positiva. Assim, o método aqui apresentado tem um par de vantagens sobre os outros métodos aplicados para a purificação de leucócitos da peroxidase-positiva. Como é baseado em pequenas amostras de sangue as células obtidos representam a situação na circulação. Devido ao pequeno volume da amostra inicial necessário para o protocolo, o método é aplicável tanto sangue humano e não-humano, apesar das diferenças específicas de espécies na abundância de neutrófilos. Na verdade, nós fomos capazes até mesmo de aplicar o método descrito para rubricar volumes de sangue tão pequenas quanto 50 pi (dados não mostrados). A pequena amostra de sangue necessária para o método, também o torna adequado para a retirada repetida de sangue a partir de pequenos animais de laboratório ou em aplicações médicas especiais (por exemplo, diagnóstico de recém-nascido). como tele enriquecimento de leucócitos baseia-se na depleção de todas as células de eritrócitos de peroxidase-positivo (neutrófilos, eosinófilos, monócitos) são incluídas na fracção de leucócitos mista obtido e pode ser analisada separadamente, utilizando citometria de fluxo. O método é rápido, confiável e tem baixos requisitos em matéria de produtos químicos e de instrumentação, tornando o protocolo apropriado para vários ambientes científicos. Como neutrófilos são facilmente activado um passo crítico durante o método descrito é o ajustamento exacto do valor das soluções tampão utilizadas pH (PBS e HBSS, ver passos 1.2 e 1.3 da secção de protocolo). Além disso, o tempo de incubação das células do sangue com água destilada não deve continuar a ser de 60 segundos antes de restaurar as condições de normosmotic (ver passo 2.2 da secção de protocolo. O (quase) completamente a remoção do solvente a partir do sedimento de células (passo 2.4) antes da adição de água para a segunda lise hipotônica é mais um passo crítico como lustreresíduos de er irá diminuir a eficiência do procedimento de lise hipotónica. Outro passo importante refere-se à aplicação de H 2 O 2 durante a coloração do APF. Embora a quantidade aplicada não deve ser citotóxico, a vitalidade das células devem ser verificadas. Durante os nossos estudos que normalmente aplicar o corante de 5,5 &#39;, 6,6&#39;-tetracloro-1,1&#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimi dazolylcarbocyanine iodeto (JC-1) para a detecção de eventos apoptóticos início. Além disso, há um par de limitações do método de enriquecimento de leucócitos simplificado descrito. Embora a técnica pode ser aplicada a amostras de sangue a partir de várias espécies (homem, rato e o rato têm sido tentadas), a quantidade de leucócitos obtido após a lise de eritrócitos depende da sua abundância no sangue inicial. Este último certamente varia entre as espécies 39 e também é dependente do estado inflamatório do indivíduo apalpada. Além disso, enquanto o procedimento de lise pode ser feito com até umcentenas de amostras em paralelo os passos de centrifugação intermediários constituem uma limitação, dependendo da centrifugadora usada, apenas até 30 amostras podem ser processadas em paralelo. Além disso, enquanto APF facilmente detecta HOCl e HOBr na presença de SCN -, a actividade de MPO de halogenação e a EPO também afecta a este último pseudo-halogeneto. Deste modo hypothiocyanite (- OSCN) é formada, que é incapaz de oxidar APF. Outra limitação vem das propriedades do corante APF utilizado para a determinação de HOCl- e HOBr-produção por MPO e EPO. Como o corante é oxidado a f luoresceina, a coloração não podem ser combinados com anticorpos fluorescentes, com um espectro de emissão na mesma gama. É claro que quaisquer interferências entre a fluorescência APF-derivado e o sinal de sinais fluorescentes adicionais têm de ser verificados e compensada no citômetro de fluxo. Caso contrário, se a detecção da actividade de peroxidase de halogenação não é do âmbito daestudar, depois da aplicação do método de depleção dos eritrócitos podem ser utilizados outros métodos de análise, em vez de APF. À medida que o procedimento de lise hipotónica descrito leva apenas a um esgotamento parcial de eritrócitos e de leucócitos, como todos estão ainda presentes na fracção celular mista obtida, únicos métodos que permitem a análise de uma única célula deve ser aplicada. Os métodos que incluem a lise de células (por exemplo, por análise de dispersão Ocidental) não irá produzir resultados fiáveis. O pequeno volume da amostra inicial pode ser mais um obstáculo para esses métodos analíticos. Em relação à investigação de MPO (e EPO) A atividade em leucócitos muitas vezes só a produção geral oxidante pelas células são os destinatários em vez de avaliar especificamente a atividade da peroxidase heme 44,45. Além disso, muitas vezes não são feitas tentativas para distinguir entre a halogenação e a actividade de peroxidase de MPO e EPO 46,47. Métodos, que abordam especificamente a atividade MPO cloração por quantifying produtos HOCl derivados como clorotirosina não detectar excesso de oxidado e / ou produtos metabolizado e, assim, muitas vezes, levar a uma subestimação do real HOCl-produção 48. Além disso, este método assim como a detecção de HOCl-derivado 2-chloroethidium também são demorados, necessita de equipamento caro e analítica incluem a lise de células 48-50 .não são muitos relatos sobre novos corantes para a determinação especifica da actividade de MPO de cloração dentro de células vitais 44,51,52. No entanto, até à data apenas APF e sua fluoresceína hidroxifenil composto relacionado (HPF) estão comercialmente disponíveis e, por conseguinte, utilizado rotineiramente na investigação 25,33. De facto, usando APF podemos mostrar que a actividade de MPO cloração pode não só ser quantificada usando a enzima isolada 53, mas também através da aplicação do corante para as células vivas 26,33. Assim, combinando o enriquecimento de leucócitos rápida de micro-amostras de sangue acima referidos com umN APF de coloração desenvolveu-se um protocolo, que é adequada para tratar especificamente e, simultaneamente, a actividade de MPO de halogenação e EPO em todos os leucócitos positivos peroxidase, isto é, neutrófilos, monócitos e eosinófilos 32. Além disso, o método não requer a lise celular, o que permite que uma ampla variedade de métodos analíticos, incluindo citometria de fluxo e microscopia de fluorescência confocal. Além disso, esta coloração de actividade de peroxidase pode ser combinado com a aplicação de marcadores de superfície celular, o que permite que a análise específica da sub-fracções de leucócitos, dependendo da tarefa científica. No entanto, tem de considerar-se que os anticorpos marcados com fluorescência aplicados não interferir com o sinal de fluorescência de fluoresceína à base utilizada para quantificar a oxidação HOCl- e APF-HOBr derivado. Em resumo, este método pode fornecer uma nova ferramenta para obter mais esclarecimentos sobre o papel fisiológico da atividade de halogenação peroxidase do re imunológicalevant peroxidases derivados do sangue MPO e EPO, que ainda não é bem compreendido 8,20,23. Além disso, em um estudo animal em que a artrite reumatóide pode observar recentemente que este protocolo pode levar à avaliação da produção de HOCl MPO-derivado como um novo marcador clínico em doenças inflamatórias crónicas (dados não publicados).

Leucócitos polimorfonucleares (PMN, também denominados granulócitos e monócitos) representam importantes componentes celulares do sistema imune inato no sangue 1,2. Eles contribuem para a defesa principal contra patogénios, assim como para a activação do sistema imune adaptativo e o início de uma resposta inflamatória sistémica 2-4. No entanto, especialmente dos neutrófilos, o tipo mais abundante de granulócitos e monócitos também contribuem significativamente para a regulação e rescisão de eventos inflamatórios agudos 5. Por conseguinte, estas células podem também desempenhar um papel importante em doenças inflamatórias crónicas como a artrite reumatóide 6,7. Na verdade, a asma, uma doença inflamatória crónica das vias aéreas, é caracterizada por uma apoptose dos eosinófilos auditivos, o segundo tipo mais de granulócitos no sangue 8. No entanto, a apoptose de granulócitos e sua rápida remoção por macrófagos são dois passos essenciais durante a terminação celularde inflamação 9-11. Nas células imunes chamados duas enzimas intimamente relacionados, nomeadamente mieloperoxidase (MPO, neutrófilos e monócitos) e peroxidase de eosinófilo (EPO, eosinófilos) pode ser encontrado 12,13. Estas peroxidases heme são classicamente relacionada com a resposta imune humoral como eles de duas electronicamente oxidar halogenetos de (pseudo) para o hipo correspondente (pseudo) halous ácidos que são conhecidos pelas suas propriedades bactericidas 14-16. Sob condições fisiológicas MPO se forma principalmente o ácido hipocloroso (HOCl) e hypothiocyanite (- OSCN) enquanto que o ácido hipobromoso e último (HOBr) são formados por EPO 17-19. Novos resultados sugerem que esta atividade da enzima de halogenação (pseudo-) também podem contribuir para a regulação de respostas inflamatórias e ao encerramento de reações imunes 20,21. De facto, a produção de HOCl por MPO e produtos derivados foram mostrados para suprimir respostas adaptativas baseados em células imunitárias T 22-24. A fim de obter mais insights sobre o papel imunológico de leucócitos a partir do sistema imune inato em doenças inflamatórias crónicas e para determinar a contribuição de MPO e EPO a esta função fisiológica foi desenvolvido um método para enriquecer rapidamente leucócitos a partir de pequenas amostras de sangue para uma específica subsequente determinação da atividade da peroxidase de halogenação nestas células. Para a depleção de eritrócitos nós escolhemos um método padronizado incluindo as etapas de lise hipotônica de dois subsequentes com água destilada, o que leva a um enriquecimento de leucócitos rápido em custos de material baixos. Para a determinação subsequente da MPO halogenação e da actividade EPO a HOCl- e específicos de HOBr corante aminofenil fluoresceína (APF) foi usado 25-27. Em contraste com a aplicação de métodos de coloração de peroxidase inespecífica 28,29, esta abordagem permite a detecção selectiva da actividade de peroxidase de halogenação, o qual é muitas vezes prejudicada pelo infl graveamação 30,31.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="738">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">materials/equipment</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">15 ml centrifugation tubes</td>
			<td style="width:203px;">VWR/Corning</td>
			<td style="width:120px;">734-0451</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">1.5 ml sample tubes</td>
			<td style="width:203px;">VWR/Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">211-2130DE</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:213px;">Pipettes for volumes up to 5 ml</td>
			<td style="width:203px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">e.g. 3120000070</td>
			<td style="width:203px;">We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 &#181;l, 10-100&#181;l, 100-1000 &#181;l an 500-5000&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">laminar flow bench</td>
			<td style="width:203px;">Thermo Electron Corperation</td>
			<td style="width:120px;">HeraSafe</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:203px;">Bender &#38; Hobein AG</td>
			<td style="width:120px;">Vortex Genie 2</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tabletop centrifuge</td>
			<td style="width:203px;">Kendro Laboratory Products</td>
			<td style="width:120px;">Laborfuge 400R</td>
			<td style="width:203px;">The centrifuge should be able to be used at 450x g</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Small centrifuge</td>
			<td style="width:203px;">eppendorf</td>
			<td style="width:120px;">5415D</td>
			<td style="width:203px;">The centrifuge should be able to be used at 400x g</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Incubator</td>
			<td style="width:203px;">Heraeus</td>
			<td style="width:120px;">cytoperm 2</td>
			<td style="width:203px;">Settings: 37 &#176;C, 95% humidity, 5 % CO2 content</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:203px;">Varian</td>
			<td style="width:120px;">Cary 50 bio</td>
			<td style="width:203px;">A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Flow cytometer</td>
			<td style="width:203px;">Becton, Dickinson</td>
			<td style="width:120px;">BD Facs Calibur</td>
			<td style="width:203px;">Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:203px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Chemicals</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:203px;">amresco</td>
			<td style="width:120px;">K812</td>
			<td style="width:203px;">sterile solution, ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;"></td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P4417</td>
			<td style="width:203px;">tablets for solving in 200 ml millipore water</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+)</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">H1387</td>
			<td style="width:203px;">970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:203px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:120px;">1.09057.1000</td>
			<td style="width:203px;">1M solution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:203px;">Riedel-deHa&#235;n</td>
			<td style="width:120px;">30620</td>
			<td style="width:203px;">Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:213px;">Aminophenyl fluorescein</td>
			<td style="width:203px;">Cayman</td>
			<td style="width:120px;">10157</td>
			<td style="width:203px;">5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 &#181;l should be prepared and stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:213px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">H1009</td>
			<td style="width:203px;">This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:213px;">4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH)</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A41909</td>
			<td style="width:203px;">A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">DMSO</td>
			<td style="width:203px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:120px;">23500.26</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast and specific assessment of the halogenating peroxidase activity in leukocyte-enriched blood samples

Neste trabalho é descrito um protocolo para o enriquecimento rápido e padronizado de leucócitos a partir de amostras de sangue total pequenos. Este procedimento baseia-se na lise hipotónica de eritrócitos e pode ser aplicado a amostras humanas, bem como com o sangue de origem não-humana. O pequeno volume da amostra inicial de cerca de 50 a 100 ul torna este método aplicável para a amostragem de sangue de repetição a partir de pequenos animais de laboratório. Além disso, o enriquecimento de leucócitos é alcançado em poucos minutos e com os esforços de baixo materiais entre os produtos químicos e de instrumentação, tornando este método aplicável em vários ambientes de laboratório. Purificação de leucócitos Padronizada é combinado com um método altamente selectivo coloração para avaliar a actividade da peroxidase de halogenação das peroxidases heme, mieloperoxidase (MPO) e peroxidase de eosinófilo (EPO), ou seja, a formação de ácido hipocloroso e hipobromoso (HOCl e HOBr). Enquanto MPO é fortemente expressa em neutrophils, o tipo de célula mais abundante imunitário no sangue humano, assim como em monócitos, a enzima relacionada com a EPO é expresso exclusivamente em eosinófilos. A atividade de halogenação destas enzimas são os destinatários usando a fluoresceína específica HOBr-quase HOCl- e corante aminofenil (APF) e da peroxidase primário de peróxido de hidrogênio substrato. Após a análise de citometria de fluxo subsequente todas as células peroxidase-positivo (neutrófilos, monócitos, eosinófilos) são distinguíveis e a sua actividade de peroxidase de halogenação pode ser quantificada. Uma vez que a coloração APF pode ser combinado com a aplicação de marcadores de superfície celular, este protocolo pode ser estendido para abordar especificamente sub-fracções de leucócitos. O método é aplicável para a detecção de HOCl e HOBr produção tanto em humano e em leucócitos de roedores. Dado o papel imunológico amplamente discutido e diversamente destes produtos enzimáticos em doenças inflamatórias crónicas, este protocolo pode contribuir para uma melhor compreensão dorelevância imunológica de peroxidases heme derivados de leucócitos.

Como relatado anteriormente o método descrito acima acabou por ser aplicável tanto para a saúde humana e para o material não-humano 32. Além disso, como mostrado para ratos com sintomas asmáticos a coloração APF pode ser um instrumento adequado, para detectar diferenças no estado pró-inflamatória sistémica. Portanto, em um estudo posterior utilizou-se este protocolo para avaliar repetidamente a atividade de halogenação de MPO (e EPO) em ratas escuro Agouti com artrite induzida por pristano (PIA). Um exemplo representativo de enriquecimento de leucócitos e coloração realizada durante esta experiência é mostrado na Figura 1. Cerca de 200 ul de sangue total foi obtido a partir do plexo venoso retrobulbar do animal, sob anestesia e heparinizados. O esgotamento dos eritrócitos e uma subsequente coloração APF foram realizadas com 100 ul volume de amostra. Depois a amostra foi analisada por citometria de fluxo. (Figura 1A), um forte depleção de eritrócitos a partir da amostra foi alcançado. Além disso, diferentes tipos de leucócitos foram claramente discernível, que foram identificados mediante a aplicação de marcadores de superfície de células marcadas por fluorescência (não mostrado). Resumidamente eritrócitos (CD235a-positivo) / região detritos da célula responsáveis ​​por apenas 22% dos eventos, enquanto cerca de 48% dos eventos foram identificados como neutrófilos CD16-positivo. Além disso 3% dos eventos foram, cada um identificado como eosinófilos CCR3-positiva e monócitos CD14-positiva e cerca de 19% dos eventos responsáveis ​​por CD5 positivas a CD19 / B e linfócitos T, respectivamente. A distribuição da intensidade da fluorescência APF-derivado (Figura 1B) claramente permitiu a discriminação de eritrócitos e linfócitos peroxidase-negativos, enquanto monócitos e eosinófilos levou a uma oxidação APF moderada e neutrófilos foram fortemente peroxidase-positiva sob o chOsen condições experimentais. Estes resultados estão de acordo com a elevada abundância de MPO nas últimas células, em comparação com a concentração de enzima em monócitos 20. A resposta relativamente fraca dos eosinófilos pode ser explicado pelo facto de, que não foi adicionado o brometo, o qual pode ter levado a formação de EPO derivada de HOBr. Estudos preliminares sobre eosinófilos isolados surpreendentemente não mostrou um grande influência de brometo adicionado externamente sobre a oxidação APF por estas células. Ainda assim, a oxidação do APF pelos eosinófilos foi observada, que pode ser explicada pela introdução de pequenas quantidades de Br - através das soluções tampão utilizadas (PBS e HBSS). Alternativamente, a EPO também pode produzir pequenas quantidades de HOCl, pelo menos sob condições ácidas (por exemplo, em fagolisossomas). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54484/54484fig1.jpg" /> Figura 1: o enriquecimento de leucócitos e APF-derived fluorescência numa amostra de sangue de micro-a partir de um rato. Uma quantidade de cerca de 200 ul de sangue total foi obtido a partir do plexo venoso retrobulbar de uma fêmea de rato escuro Agouti. Após a aplicação do procedimento descrito para a hemólise de 100 ul de sangue e um APF de coloração subsequente da fracção celular mista foi analisada por citometria de fluxo. Como mostrado pelo FSC / SSC- Lote (A) os eritrócitos foram fortemente empobrecido a partir da amostra e os diferentes tipos de leucócitos pode ser facilmente distinguida. A distribuição da intensidade de fluorescência APF-derivado (B) mostrou claramente heme peroxidase-negativos células (eritrócitos e linfócitos), bem como os leucócitos com moderadas (eosinófilos e monócitos) ou forte (neutrófilos) actividade de halogenação peroxidase. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54484/54484fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para visualizar um versão maior desta figura.</a>

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Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

Avaliação rápida e específica da atividade da peroxidase de halogenação em amostras de sangue enriquecido por leucócitos

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

fast-specific-assessment-halogenating-peroxidase-activity-leukocyte

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K visualizações.  University of Leipzig. This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

Vídeo: Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Esgotamento das populações de células específicas de Esgotamento Complemento

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Imunologia e Infecção

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

Purificação da população de células específicas de separação de células de fluorescência Ativado (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

Determinação da atividade fagocítica de amostras de anticorpos Clínica

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome. Aging is associated with an increased susceptibility to viral and bacterial infections and decreased responsiveness to vaccines with a well-documented decline in humoral as well as cell-mediated immune responses1,2. We have recently assessed the effects of aging on Toll-like receptors (TLRs), key components of the innate immune system that detect microbial infection and trigger antimicrobial host defense responses3. In a large cohort of healthy human donors, we showed that peripheral blood monocytes from the elderly have decreased expression and function of certain TLRs4 and similar reduced TLR levels and signaling responses in dendritic cells (DCs), antigen-presenting cells that are pivotal in the linkage between innate and adaptive immunity5. We have shown dysregulation of TLR3 in macrophages and lower production of IFN by DCs from elderly donors in response to infection with West Nile virus6,7. 
Paramount to our understanding of immunosenescence and to therapeutic intervention is a detailed understanding of specific cell types responding and the mechanism(s) of signal transduction. Traditional studies of immune responses through imaging of primary cells and surveying cell markers by FACS or immunoblot have advanced our understanding significantly, however, these studies are generally limited technically by the small sample volume available from patients and the inability to conduct complex laboratory techniques on multiple human samples. ImageStream combines quantitative flow cytometry with simultaneous high-resolution digital imaging and thus facilitates investigation in multiple cell populations contemporaneously for an efficient capture of patient susceptibility. Here we demonstrate the use of ImageStream in DCs to assess TLR7/8 activation-mediated increases in phosphorylation and nuclear translocation of a key transcription factor, NF-&kappa;B, which initiates transcription of numerous genes that are critical for immune responses8. Using this technology, we have also recently demonstrated a previously unrecognized alteration of TLR5 signaling and the NF-&kappa;B pathway in monocytes from older donors that may contribute to altered immune responsiveness in aging9.

We describe use of ImageStream technology (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank">www.amnis.com</a>), which combines quantitative flow cytometry with simultaneous high-resolution digital imaging, to quantify cellular mechanisms of primary immune cells from well-defined patient cohorts. Our studies provide a blueprint for translational investigations to quantify lineage specific cellular responses in small samples from subject cohorts.

Imagem quantitativa da linhagem específica Toll-like receptor-mediados sinalização em monócitos e células dendríticas a partir de pequenas amostras de sangue humano

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Citometria de fluxo de partículas ligadas aos Bet v 1 alérgeno no PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran aumenta a eficiência de Lentivirus transdução das células NK primário murino e humano

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

Método agitador magnético para Detecção de<em&gt; Trichinella</em&gt; As larvas em amostras de músculo

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...