We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC), em Albany Medical College e realizada de acordo com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Preparações Solução NOTA: O Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, e Rosa26-mTmG (mTmG) 20 linhas de rato foram adquiridos comercialmente cTnT-Cre 18 foi um presente do Dr. Jiao na Universidade do Alabama NFATc1-Cre.. foi um presente do Dr. Bin Zhou no Albert Einstein College of Medicine 19. Os ratinhos foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono em uma câmara fechada durante pelo menos 60 segundos, seguido por meios físicos de verificação morte por toracotomia bilateral, decapitação ou deslocamento cervical. <ol><li> Prepare Tamoxifeno. Dissolve-se 10 mg de Tamoxifeno em 10 ml de semente de girassol oieu. Uma vez que esteja completamente dissolvido, alíquota e armazenar a -20 ° C. </li><li> Preparar solução salina tamponada com fosfato (PBS). Dissolve-se Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) e KCl (0,20129 g) em 1 L de água destilada e ajustar o pH para 7,4. </li><li> Prepare PBST: 0,1% de Tween-20 em PBS solução por dissolução de 100 ul de Tween-20 em 100 ml de PBS. </li><li> Preparar tampão de bloqueio. Adicione 3% de albumina de soro bovino a solução de bloqueio (BSA) por dissolução de 3 g de BSA em 100 mL de PBST contendo 0,2% de Tween-20. </li><li> Prepare CUBIC-1 (reagente 1). Misturar 25% em peso de ureia, 25% em peso de N, N, N &#39;, N&#39;-tetraquis (2-hidroxipropil) etilenodiamina e 15% em peso de Triton X-100 em dH2O </li><li> Prepare CUBIC-2 (reagente 2). Misturar 50% em peso de sacarose, 25% em peso de ureia, 10% em peso de 2, 2 &#39;, 2&#39; &#39;- nitrilotriethanol e 0,1% (v / v) de Triton X-100 em dH2O </li><li> Prepare Sca le A2: 4 M de ureia, 10% w / v de glicerol e 0,1% w / v de Triton X-100 em dH 2 O. Ajustar o pH para 7,7. </li><li> Prepare Sca le B4: ureia 8M e 0,1% w / v de Triton X-100 em dH2O Ajustar o pH para 8,7. </li><li> Prepare Sca le 70: 4 M ureia, 70% w / v de glicerol e 0,1% w / v de Triton X-100 em dH2O </li></ol> 2. O tamoxifeno indução, isolamento de embriões e Fixação <ol><li> Tamoxifeno Indução e isolamento de embriões <ol><li> Usando um protocolo tubo de alimentação curva aprovado (ACUP 13-12007), sonda as fêmeas ratos R26Cre ERT2 Confetti (conectado por camundongos machos R26Cre ERT2) com 10 ug / g de Tamoxifen em embrionária dia de desenvolvimento E7.75 33. No dia embrionário 9,5 (E9.5) ou E10.5, eutanásia os ratos do sexo feminino com CO 2 e deslocamento cervical. </li><li> Após a verificação da morte do rato (ver secção 1 Nota), abrir a cavidade abdominal do rato com uma tesoura e dissecar o corno uterino, remover as camadas de tubo uterino com a ajuda de tesouras e pinças, e relocar os embriões do 23,24 tuba uterina. <ol><li> Transferir os embriões para uma placa de Petri contendo PBS (pH 7,4). Sob o microscópio de dissecação, remover as camadas não-embrionárias (córion, saco vitelino e âmnio) com a ajuda da pinça. </li></ol></li><li> Com uma pinça e tesouras, recolher as amostras de mulheres do rato e da cauda do embrião para genotipagem conforme relatado anteriormente 22. Usando uma pipeta de plástico, transferir cada embrião para um poço de uma placa de 48 contendo 1 ml de PBS 1x. </li><li> Sob um microscópio de fluorescência, identificar os embriões / RFP / PCP positivas GFP por meio de um microscópio invertido com uma câmara. Descascar o pericárdio, usando uma pinça e gire o coração / embrião com a ajuda de pinças curvas para determinar o número de clones fluorescentes em ambos os lados do coração com os filtros GFP / RFP / CFP. Sem cortes são necessários. </li></ol></li><li> Depois de identificar GFP / RFP / embriões PCP positivos, lavar rapidamente os embriões duas vezes (2 min cada) com 1x PBS em the 48 bem-placa num agitador de placas à temperatura ambiente (TA). Isto irá remover o excesso de sangue. </li><li> Corrigir o coração do embrião / embrionário usando 4% de paraformaldeído (PFA) a TA. O tempo de fixação depende da idade e tamanho do tecido embrionário. Para corrigir o embrião E9.5 durante 2 h à TA. Os embriões estágio embrionário final exigem mais tempo de fixação, que pode até mesmo ser prolongada até 24 horas para o coração pós-natal. CUIDADO: O paraformaldeído é tóxico, evitar o contacto com a pele, olhos e mucosas. </li><li> Após a fixação, lavar o embrião / coração no poço de placa 48 por duas vezes (10 minutos cada) com PBS 1x num agitador de placas à TA. Isto remove o excesso de PFA a partir do embrião / coração. Os embriões são então processadas para toda coloração montagem e desobstrução dos tecidos. </li></ol> 3. Whole Mount Coloração NOTA: Depois de PFA fixação do embrião / coração é submetido a toda a coloração de montagem como segue. <ol><li> Permeabilizar o embrião / coração em um bem-placa de 48 usando 1 ml de PBST 0,1% durante 2 horas num agitador de placas à TA. </li><li> Seguindo permeabilização, mergulhe o embrião / coração em 1 ml de tampão de bloqueio, por 2 horas ou durante a noite num agitador de placas a 4 ºC. </li><li> Mergulha-se o embrião / coração ao endotelial PECAM anticorpo específico da célula (CD31), diluído (1: 100) em 0,3 ml de tampão de bloqueio durante 48 horas num agitador de placas a 4 ºC. </li><li> Lave o embrião / coração utilizando PBST 5 vezes, 30 minutos cada à temperatura ambiente num agitador de placas. Isto remove o excesso de anticorpo primário não ligado específico do tecido. </li><li> Mergulha-se o embrião / coração em anticorpo secundário anti-rato de cabra Alexa Fluor 647, diluído (1: 1000) em 1 ml de tampão de bloqueio durante 48 horas num agitador de placas a 4 ºC. </li><li> Repetir o passo 3.4 para lavar o anticorpo secundário. </li><li> Pós-fixar o embrião / coração com 4% de PFA durante 1 h à TA num agitador de placas e lava-se duas vezes com PBS, 5 minutos cada. </li><li> Coloração do embrião / coração com o corante nuclear 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (diluído em PBST a uma concentração de 0,01 mg / mL) durante 10 min num agitador de placas à TA. Siga com duas lavagens com PBS de 5 minutos cada. </li></ol> 4. Embrião / Clearing coração com Sca l e ou Método CUBIC NOTA: Depois de toda coloração montagem, o embrião / coração é submetido tanto ao Sca le ou método de compensação cúbica de tecido. A escolha do método depende do tamanho e idade do tecido embrionário. Para E11.5 ou embriões idade mais precoce, o uso Sca l e método de limpeza de tecidos, enquanto que para embriões mais velhos ou corações pós-natal é preferido o método de compensação cúbica de tecido. <ol><li> Escala de tecidos Método Clearing <ol><li> Incubar o embrião / coração com 1 ml de Sca l solução de e A2 em um frasco de cintilação (embrulhadas em papel de alumínio) com ocasionais agitação suave (à mão) durante 48 horas a 4 ° C. </li><li> Após a incubação Sca l e A2, incubar o embrião / coração com 1 mL de Sca l solução de e B4 a 4 ° C no mesmo frasco com agitação suave ocasional para anot-lhe 48 h. </li><li> Incubar o embrião / coração durante mais 48 h com 1 ml Sca l e 70 a 4 ° C com agitação suave ocasional. Mount embrião usando 90% de glicerol (ver secção 5.1). </li></ol></li><li> Cúbica de tecido Método Clearing <ol><li> Para toda embrião / coração compensação cúbicos, mergulhe cada embrião / coração em 1 ml de CUBIC-1 com ocasional agitação suave durante 48 horas a 37 ºC 7. Após 48 horas, substitui a solução com o mesmo volume de reagente fresco CUBIC 1, e incuba-se a amostra para uma 48 horas adicionais a 37 ° C com agitação ocasional com a mão. </li><li> Lavar a cúbica-1 tratados coração / embrião com 1x PBS várias vezes à temperatura ambiente com agitação suave com a mão. Isso remove o excesso de solução CUBIC-1. </li><li> Depois de lavar a CUBIC-1 com PBS, mergulhar os embriões / corações em CUBIC-2 solução (1 g por embrião / coração) por 48 horas a 37 ºC com agitação ocasional gentil com a mão. Isto segue de montagem usando glicerol embrião / coração (ver secção 50,2). </li></ol></li></ol> 5. Montagem Sample and Imaging NOTA: Os embriões desmatadas ou órgãos em Sca l e 70 ou cúbica-2 solução pode ser trabalhada diretamente com Escala 70 e cúbicas-2 solução como o meio de imagem, respectivamente. No entanto, considerando a vulnerabilidade das amostras embrionárias para reagentes de compensação, se as amostras não são imediatamente ser trabalhada, mas armazenada a longo prazo, armazenar as amostras em glicerol a 90%, seguindo o protocolo abaixo. <ol><li> Diretamente mergulhe o Sca le apuradas amostra em 1 ml de 90% de glicerol e armazenar a 4 ° C até imagiologia. </li><li> Lava-se a amostra tratada cúbicos com 1x PBS, duas vezes, 5 min cada e sequencialmente incubar a amostra com 1 ml de 30%, 50%, 70% e solução de glicerol a 90% durante 30 min cada. </li><li> Para imagiologia, transferir a amostra para uma placa de Petri de vidro de fundo com uma quantidade mínima de 90% de glicerol e imagem clones com um microscópio confocal equipado com duas capacidades de fotões. </li><li> Imagem do coração ou embrião no glicerol com um / 0.3 NA 10X, um 25X / 0.8 NA imersão, ou uma lente objetiva de corretiva 40X / 1.2 NA água. Imagem DAPI usando 2-fótons de excitação de um titânio coerente: a laser camaleão safira. A escolha do microscópio e a lente objectiva dependerá da finalidade das experiências, por exemplo, para super-resolução, um microscópio de fluorescência folha de luz poderia ser utilizado. </li></ol>

<ol>
	<li>Vincent, S. D., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+heart:+the+origin+and+regulation+of+cardiac+progenitor+cells.">How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells.</a> Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).</li><li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+discoveries+in+cardiac+biology.">A decade of discoveries in cardiac biology.</a> Nat Med. 10, 467-474 (2004).</li><li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+in+the+evolution+and+development+of+the+heart.">Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart.</a> Science. 313, 1922-1927 (2006).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedding+embryos+for+high-resolution+episcopic+microscopy+(HREM).">Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM).</a> Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).</li><li>Soufan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+gene+expression+patterns+during+cardiac+development.">Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development.</a> Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noninvasive+genetic/pharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse.">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Agah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+recombination+in+postmitotic+cells.+Targeted+expression+of+Cre+recombinase+provokes+cardiac-restricted,+site-specific+rearrangement+in+adult+ventricular+muscle+in+vivo.">Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo.</a> J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).</li><li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart.">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151, 1083-1096 (2012).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+spindle+orientation+controls+cell+entry+into+the+myocardium.">Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium.</a> Dev Cell. 19, 114-125 (2010).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+family+proteins+are+essential+for+cardiac+morphogenesis+and+progenitor+differentiation.">Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation.</a> Development. 141, 281-295 (2014).</li><li>Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The atlas of mouse development. , (1992).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).</li><li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anterior+heart-forming+field:+voyage+to+the+arterial+pole+of+the+heart.">The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart.</a> Trends Genet. 18, 210-216 (2002).</li><li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+ventricle,+outflow+tract,+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary/anterior+heart+field.">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Dev Biol. 287, 134-145 (2005).</li><li>Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+the+secondary+heart+field+leads+to+tetralogy+of+Fallot+and+pulmonary+atresia.">Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia.</a> Dev Biol. 284, 72-83 (2005).</li><li>Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-acting+regulatory+sequences+governing+Wnt-1+expression+in+the+developing+mouse+CNS.">Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS.</a> Development. 120, 2213-2224 (1994).</li><li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural.">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Developement. 127, 1607-1616 (2000).</li><li>Viragh, S., Challice, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+epicardium+and+the+embryonic+myocardial+circulation+in+the+mouse.">The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse.</a> Anat Rec. 201, 157-168 (1981).</li><li>Wu, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+family+proteins:+novel+players+in+cardiac+morphogenesis+and+cardiac+progenitor+cell+differentiation.">Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation.</a> Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Lineage+Tracing+Reveals+that+Oriented+Cell+Division+Contributes+to+Trabecular+Morphogenesis+and+Regional+Specification.">Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification.</a> Cell reports. 15, 158-170 (2016).</li><li>Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+thermal-+and+chemical-induced+denaturation+of+GFP.">Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).</li><li>Captur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+myocardial+trabeculae+in+the+mouse+embryo.">Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo.</a> J Anat. , (2016).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

O isolamento de embriões é um passo muito crítica. embriões E9.5 são muito frágeis e pequeno em tamanho, por isso o cuidado extra deve ser tomado para não danificar as estruturas do embrião / coração durante o isolamento. As camadas extras não-embrionárias que envolvem o embrião / cardíaca devem ser cuidadosamente removidos especialmente quando imagiologia todo o embrião. Isto permite a penetração de anticorpos e de compensação mistura profunda dentro dos tecidos embrionários, e também ajuda na remoção do sinal de fundo quando Imaging. Vários anticorpos, incluindo anticorpos contra PECAM, acetilado α-tubulina e β1 integrina foram examinados e todos foram detectados com sucesso (resultados não apresentados) 33. Isto demonstra que a integridade molecular, a integridade celular e compatibilidade antigénio não foram perturbados durante este processo de compensação. Transferência do embrião / coração usando uma ampla pipeta de transferência boca (corte a ponta). Isto evita danos durante o manuseamento. A GFP / YFP / RFP / CFP padrão de expressão e número de clones devem ser cuidadosamente registadas no coração para determinar a dosagem apropriada para rotular um clone por coração ou quaisquer outros órgãos. Devido à baixa dose de tamoxifeno (10 ug / g), por vezes, o coração não contém quaisquer clones ou é difícil detectar quaisquer clones. Portanto, recomenda-se utilizar o saco vitelino para determinar se o embrião tem nenhum / YFP / RFP clones GFP / CFP. O embrião ou do coração de fixação é uma etapa crítica, como o excesso de fixação irá resultar em um fundo alta, enquanto sub-fixação poderá resultar num fraco coloração. Recomenda-se para fixar todo o embrião E10.5-E8.5 durante 2 horas à temperatura ambiente num agitador de placas. Enquanto que para embriões E11.5-E15.5, a recomendação é para isolar cuidadosamente o coração e corrigi-lo com PFA 4% durante 2 horas a RT. Depois de garantir a remover as camadas circunvizinhas o coração, se o processamento de todo o embrião, o embrião E13.5 E11.5- também pode ser fixada durante 3-4 horas à temperatura ambiente, mas que requer um maior tempo de eliminação nos tecidos. O E16.5-P1 (pós-natalDia 1) corações foram fixados durante 3-4 horas à temperatura ambiente num agitador de placas. Ao fixar todo o embrião, o primeiro plano e membros posteriores devem ser removidos, pois prejudicam a imagem do coração. As amostras devem ser tratados com cúbica e Sca le em frascos de cintilação para minimizar a secagem da amostra. Temos observado melhor compensação de amostras com o método de compensação cúbica de tecido, a 37 ° C, enquanto que a CEC le compensação é optimamente realizada a 4 ° C. Depois de imagem, as amostras podem ser armazenadas a curto prazo em CUBIC-2 ou Sca le 70. As amostras devem ser sempre coberto com papel alumínio para evitar o branqueamento de fluorescência. tecidos e órgãos do embrião tem menos de lípidos e deposição de matriz extracelular, o que resulta em menos tempo de eliminação. Por outro lado, eles são mais vulneráveis ​​aos reagentes de compensação. Os reagentes de compensação pode afectar a integridade da estrutura do tecido e antigénio, que resulta na têmpera do PCP, RFP e conju anticorpofluoróforo fechado. Portanto, períodos de fixação mais longos podem impedir a extinção. A extinção das proteínas fluorescentes pode ser também devido a sua sensibilidade a substâncias químicas e de pH tal como anteriormente relatado 34. Outras receitas químicas, pH, fixadores, eo comprimento de incubação devem ser exploradas para minimizar a extinção das proteínas fluorescentes. O método de transparentizing órgão todo ou compensação de tecidos revolucionou imagens 3D volumétrica. O método de imagem anterior para a morfogénese cardíaca, que envolveu o manual 2D ou 3D a reconstrução de secções em série, é demorada e exigente instrumento 5,6. Microscopia episcopic alta resolução (HREM) em conjunto com a modelagem 3D pode ser aplicada ao estudo da morfogénese do coração do rato e proporciona excelente descrição anatómica da arquitectura trabecular no desenvolvimento de embrião de rato 35. No entanto, HREM não permite a identificação de fluorescélulas marcadas proteína ENT ou marcados com anticorpo de células do resto das células 35. Usando o protocolo atual, com o mínimo de esforço e eficácia de alto custo, que têm preservado com sucesso os sinais fluorescentes no coração embrionário usando Sca le ou métodos de compensação cúbica de tecido (Figuras 1 - 3). Combinado com uma dose baixa (10? G / g) de tamoxifeno para induzir a eventos de recombinação Cre e gerar alguns clones dentro de todo o embrião e no coração, este sistema pode ser usado para localizar e estudar diferenciação de células progenitoras cardíaca único e comportamentos celulares em in vivo (Figura 2A) 33. Além disso, combinado com deleção do gene Cre mediada ou a sobre-expressão e rotulagem única célula Cre mediada, este sistema de imagem pode ser aplicado para estudar a perda genética da função ou ganho de função na diferenciação de células progenitoras e o comportamento celular, durante a morfogénese cardíaca, e, portanto, fornece uma robusta ferramenta para stUdy a etiologia de defeitos cardíacos congênitos. Os dois tecidos sistemas de compensação Sca / e e cúbicas utilizado neste estudo mostrou eficiências diferentes de compensação, o que diferencia ainda mais os sistemas com base na idade embrionária, a espessura do tecido e da duração do tempo de compensação de tecidos. Para a fase inicial de embriões E9.5-E10.5, o Sca / e sistema não só rendeu o tecido claro, mas também protegia a morfologia do embrião e preservado os sinais fluorescentes, enquanto o tratamento CUBIC resultou em dissolução embrião. Este pode ser o resultado de aminoálcoois adicional e uma maior concentração de Triton X-100 nas soluções CÚBICAS 8. Para corações mais velhos, a Sca / e sistema falhou para limpar o tecido completamente, mesmo com um tempo de incubação. A solução compensação CUBIC tornou o mais velho tecido transparente (Figura 3). No entanto, o aumento do tempo de incubação resultou em sinais mais fracos e GFP endógena única protegida, enquanto RFP, CFP e sinais de anticorpo conjugadoperdidos. Por esta razão, uma receita mais optimizada dos reagentes compensadores e melhor tempo de incubação seria necessário para volumetricamente corações ou órgãos de imagem com um espectro maior de marcadores fluorescentes. Este estudo demonstrou que se pode rotular, rastrear e imagens simples clones cardíacos em combinação com toda uma coloração montagem de endocárdio / endoteliais PECAM marcador de células do coração em desenvolvimento. Toda a montagem de coloração DAPI PECAM e neste sistema, não só ajuda a identificar os tipos de células e a morfologia das células de células marcadas dentro de um coração, mas também permite o estudo do padrão clonal, a migração e o comportamento durante a morfogénese cardíaca. Na Figura 2A observou-se um clone com 8 células em TCA. Utilizando o número de células presente neste clone com referência ao tempo de rotulagem, a taxa de proliferação de células pode ser facilmente calculada. Em outro estudo utilizando este mesmo sistema identificamos o padrão de divisão celular orientado e migrpadrão ção de um único cardiomiócitos durante o processo de trabeculação 33. A aplicação deste protocolo para estudar os efeitos da perda genética de função ou ganho de função espaço-temporalmente na diferenciação de células progenitoras cardíacas marcado, padrão clonal e comportamento celular é viável, e vai ajudar nos estudos sobre a etiologia de defeitos cardíacos congênitos em genética e nível molecular num contexto 3D. Além disso, este protocolo pode ser aplicada ao estudo de morfogénese em outros sistemas orgânicos.

Morfogénese cardíaca é um evento sequencial requer que a organização espaço-temporal de quatro tipos diferentes de células progenitoras cardíacas em sectores distintos do coração, e também requer múltiplas redes reguladoras genéticos para orquestrar este processo de modo a formar a 1,2 coração funcional. Especificação, diferenciação, padronização, e maturação das câmaras cardíacas são regulados por fatores de transcrição cardiogênicos 3. Mutação genética ou aberração pós-transcricional desses fatores em células progenitoras cardíacas pode resultar em qualquer letalidade embrionária ou cardiopatias congênitas (CC) 4. O estudo da morfogênese cardíaca requer uma compreensão de detalhes inerentes estruturais em três dimensões (3D) e linhagem de células progenitoras cardíacas simples marcado com traçado durante o desenvolvimento cardíaco irá promover o entendimento da morfogênese cardíaca. Um número de métodos de tomografia secção base de alta resolução foram desenvolvidos no the passado poucas décadas a imagem Estrutura de órgãos 5,6; No entanto, estes métodos requerem, instrumentos especializados caros, mão de obra extensa, e carecem de organização estrutural detalhada em resolução de uma única célula na volumétrica final, reconstruído imagem 7,8. Imagiologia volumétrica 3D ao nível da célula individual fornece um meio para estudar diferenciação de células progenitoras e o comportamento celular in vivo 7. No entanto, espalhamento de luz tecido permanece o principal obstáculo para imagiologia células e estruturas em 3D profundamente dentro do coração intacto. Lipídios são uma importante fonte de dispersão de luz, ea remoção de lípidos e / ou ajuste da diferença do índice de refração entre lipídios e seus arredores são abordagens potenciais para aumentar a transparência do tecido 8. Nos últimos anos, um número de métodos de limpeza de tecido foram desenvolvidos, que reduzir a opacidade do tecido e dispersão de luz, como BABB (álcool de benzilo e benzilo benzoate mistura) e DBE (tetra-hidrofurano e dibenzylether); mas nestes métodos, extinção de fluorescência permanece um problema 8-10. O solvente baseado métodos hidrofílicos, tais como SeeDB (frutose / tioglicerol) e 3DISCO (diclorometano / dibenzylether), preservar sinais fluorescentes, mas não tornem todo o órgão transparente 7,8,11. Em comparação, o método tecido desobstrução-Clareza torna o órgão transparente, mas exige um dispositivo de electroforese especializada para remover os lípidos 8,12, assim como Pact (técnica passiva clareza), que também requer a incorporação de hidrogel 7,13. Para informações detalhadas sobre todos os métodos de remoção de tecidos disponíveis, consulte a Tabela 1 em Richardson e Lichtman, et al. 7. Em 2011, Hama et al. Serendipitously descobriu uma mistura hidrofílica &#39;Sca le&#39; (uréia, glicerol e Triton mistura X-100), que torna o cérebro do rato e transpar embriãoent completamente, preservando sinais fluorescentes a partir de clones marcados 14. Isto permite a formação de imagens do cérebro intacto a uma profundidade de vários milímetros e reconstrução em grande escala de populações neuronais e as projecções com uma resolução subcelular. Susaki et ai. melhorada Sca le adicionando aminoálcoois e desenvolveu o (e desobstruídas cocktails claras de imagem cerebral e análise computacional) &#39;CÚBICAS &quot;método de compensação do tecido, o que aumentou a solubilização fosfolipídios, reduziu o tempo de compensação, e permitiu multicolor fluorescente imaging 8. No presente estudo, aproveitando a Sca le e técnicas de limpeza cúbica de tecido e alta resolução seccionamento óptico 3D, clones individuais dentro do coração durante cardiogenesis foram rastreados usando Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong&gt; NFATc1-Cre 19, e Rosa26-mTmG (mTmG) 20 linhas de rato. A combinação do método de coloração de montagem inteira (WMS) desenvolvido anteriormente 21,22 com métodos de compensação de tecido mais permitidos para a coloração de outras proteínas em clones marcados e para o estudo do seu comportamento em um contexto volumétrica 3D. A combinação de tecido e de compensação WMS permite uma melhor compreensão dos papéis dos diferentes genes e proteínas durante o desenvolvimento cardíaco, e a etiologia de defeitos cardíacos. Este protocolo pode ser aplicado para estudar diferenciação de células progenitoras outro, o comportamento celular, e morfogénese eventos órgão durante o desenvolvimento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="950">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">2,2&#8242;,2&#8242;&#8217;-nitrilotriethanol&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">90279</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% Paraformaldehyde in PBS</td>
			<td style="width:192px;">Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td style="width:192px;">Fischer Scientific&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BP16000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#160;X-100</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">U-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Sucrose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Glycerol</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">G8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Tamoxifen</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Sunflower seed oil</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">S5007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">PECAM (CD31)</td>
			<td>BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:211px;">550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">DAPI nuclear stain</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">D9542</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">37oC Incubator</td>
			<td style="width:192px;">Thermoscientific Fischer</td>
			<td style="width:211px;">Heratherm, Compact Microbiological Incubators</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">48 well plates</td>
			<td style="width:192px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:211px;">229148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:192px;">Metler Toledo</td>
			<td>PB153-S/FACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss 510 confocal microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Disecting Microscope</td>
			<td style="width:192px;">Unitron</td>
			<td style="width:211px;">Z850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer. Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Germinator 500 Glass Bead Sterilizer</td>
			<td style="width:192px;">CellPoint Scientific</td>
			<td style="width:211px;">GER-5287-120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Light Source</td>
			<td style="width:192px;">SCHOTT</td>
			<td style="width:211px;">ACE I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pair of Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish 60x15mm&#160;</td>
			<td align="left">TPP Techno Plastic Products AG</td>
			<td>93060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Rocker II&#160; Platform Rocker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td style="width:211px;">260350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scintillating tubes</td>
			<td style="width:192px;">Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>03-337-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:192px;">Samco Scientific</td>
			<td style="width:211px;">202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging cleared embryonic and postnatal hearts at single-cell resolution

rastreamento clonal único e análise ao nível de todo o coração pode determinar o comportamento de células progenitoras cardíacas e diferenciação durante o desenvolvimento cardíaco e permitir o estudo das bases celulares e moleculares da morfogênese cardíaca normal e anormal. tecnologias emergentes recentes de análises clonais individuais retrospectivos tornar o estudo da morfogênese cardíaca em resolução única célula viável. No entanto, a opacidade dos tecidos e espalhamento de luz do coração como a profundidade da imagem é aumentada dificultar imagem de todo o coração a uma resolução de uma única célula. Para superar esses obstáculos, um sistema de compensação de todo o embrião, que pode tornar o coração altamente transparentes para iluminação e detecção deve ser desenvolvida. Felizmente, nos últimos anos, muitas metodologias para sistemas de compensação de todo o organismo, tais como clareza, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, cúbico, DBE, BABB e PACT foram relatados. Este laboratório está interessado nos mecanismos celulares e moleculares de cartãomorfogênese iac. Recentemente, estabelecemos única linhagem de células de rastreamento via ROSA26-Cre ERT2; sistema ROSA26-Confetti às células rótulo escassamente durante o desenvolvimento cardíaco. Nós adaptada várias metodologias de remoção de embriões inteiros, incluindo Sca le e cúbicos (, coquetéis de imagem cerebral claras desobstruídas e análise computacional) para limpar o embrião em combinação com toda a coloração de montagem a imagem clones individuais dentro do coração. O coração foi fotografada com sucesso na resolução de uma única célula. Descobrimos que Sca le pode limpar o coração embrionário, mas não podem efectivamente limpar o coração pós-natal, enquanto cúbico pode limpar o coração pós-natal, mas danifica o coração embrionário por dissolução do tecido. Os métodos descritos aqui irão permitir o estudo da função dos genes em um único clone de resolução durante a morfogénese cardíaca, o que, por sua vez, pode revelar a base molecular e celular de defeitos cardíacos.

Imaging o coração embrionário apuradas Formação do coração dos vertebrados é um processo morphogenic espaço-temporalmente regulados e depende da organização e diferenciação de células progenitoras de quatro fontes diferentes 1. As células a partir do primeiro campo do coração do crescente cardíaca irá dobrar para a linha mediana ventral, para formar um tubo cardíaco linear. As células a partir do segundo campo do coração, inicialmente residentes dorsomedially para o primeiro campo do coração, subsequentemente translocar para a faringe e esplânenico mesoderme, a partir de onde elas migram para o andaime pré-existente do tubo cardíaco linear. As células do segundo campo coração vai contribuir para o ventrículo direito, via de saída (OFT) do miocárdio e, em certa endocárdio 25-28. células da crista neural cardíacos (CNCC), proveniente rhombomeres postotic 6, 7 e 8, vai migrar para a faringe caudal e contribuir significativamente para a camada de músculo liso e coxins endocárdicos na OFT. Eles também contribuem para a formação do septo aorticopulmonary 29,30. O quarto da população consiste em células do epicárdio derivados do órgão pró-epicárdica (PEO), e contribui para fibroblastos, células musculares lisas e outros tipos de células potencialmente cardíaca 31. O epicárdio regula o desenvolvimento vascular coronariana, o crescimento cardíaco e morfogênese 21. O conceito mais importante sobre a morfogênese cardíaca é que durante o desenvolvimento do coração, migração celular anormal / diferenciação das populações de células progenitoras de quatro irá resultar em malformações ou defeitos cardíacos congênitos 4,22,32, que é a causa número um de defeitos de nascimento no mundo . Determinar os mecanismos de morfogênese cardíaca a nível celular e molecular é um passo essencial para melhorar o diagnóstico e tratamentos potenciais para a DCC.Portanto, é fundamental para a imagem do processo de morfogênese cardíaca em todo o nível do coração com a resolução única célula. Para conseguir isso, os cardiomiócitos marcado por cruzamento da linha de Cre sob o controle de troponina T cardíaca específica (TnT), que é expressa especificamente em cardiomiócitos 18, com a linha mTmG repórter. Os embriões em E8.5 foram colhidas e coradas para PECAM para distinguir células do endocárdio e endoteliais de cardiomiócitos. Os embriões foram então afastada pelo Sca le eo coração foi fotografada. O miocárdio foi marcado por GFP devido à recombinação TnT-driven mediada por Cre do repórter mTmG, e o endocárdio foi marcado com PECAM (Figura 1A e Filme Suplementar 1). Os cardiomiócitos pode ser observada a uma resolução de célula única (Figura 1A). As estruturas do coração da parte trabalhada, como o ventrículo primitivo e OFT podem ser claramente identificados após a reconstrução 3D usando 3D resoftware de construção (Figura 1B e Suplementar Movie 2). Imagiologia clones individuais do coração embrionário apuradas Morfogénese cardíaca depende linhagem diferenciação cardíaca e organização de células individuais em toda a altura do coração 22, e, assim, é essencial para a imagem única diferenciação de células progenitoras cardíaco para diferentes tipos de células cardíacas e também a morfologia das células imagem com uma resolução de uma única célula. Para conseguir isso, Rosa26Cre ERT2 15 foi cruzado com R26R-Confetti 16, ea fêmea grávida foi tratadas por gavage com tamoxifeno em baixa concentração. Após 48 horas, o embrião foi colhido E9.5, e toda montagem corada para PECAM, em seguida, todo o coração foi fotografada. Descobrimos que havia apenas um aglomerado de células, localizada ao OFT, e este clone tinha o 8 células com basen a imagem reconstruída e secções consecutivas (Figuras 2A, 2B e 3) complementar do filme, indicando que estas células são derivadas de uma única célula progenitora. A morfologia celular e o comportamento celular, tais como a proliferação e migração celular pode ser inferida a partir da posição final das células (Figura 2A). Nós também aplicado o método cúbicos para limpar o coração embrionário em E9.5 e E10.5, e descobriu que, mesmo depois de apenas 24 horas de incubação com o reagente 1, os embriões foram subtilmente dissolvida e estrutura do tecido foi prejudicada (dados não apresentados ). Imagiologia de pós-natal apagada e corações embrionárias final Nós aplicado tanto Sca l e e cúbicos para limpar corações pós-natais. corações P2 com o genótipo de αMHC-Cre; mTmG (αMHC-Cre é expressa especificamente em cardiomiócitos &lt;sup&gt; 17) foram apuradas com Sca l e para 48 horas, mas não exibir mais transparência do que os corações tratados com apenas PBS (dados não mostrados), indicando que Sca l e de compensação não é eficaz para corações pós-natais. Quando os corações P2 foram apuradas com reagente CUBIC 1 durante 48 horas, e reagente 2 durante 96 horas, eles eram muito mais transparente do que os corações compensados ​​com o reagente de 1 para 48 horas e reagente 2 para 48 horas. A profundidade de imagem foi significativamente aumentada com 96 horas de reagente 2 de incubação (Filmes complementares 4 e 5), indicando que mais de incubação com os reagentes CÚBICAS promove a transparência e prevê um aumento da profundidade da imagem. A forma e o tamanho de cada um dos cardiomiócitos pode ser identificado pela membrana GFP localizada (Figura 3A), que pode ser usado para identificar a hipertrofia. Nós também limpou NFATc1-Cre; Confetti (feminino Confetti conectado com Nfatc1Cre male) corações E17.5 (NFATc1-Cre é expressa em células cardíacas endocárdicos 19) com reagente de CUBIC 1 durante 48 horas e o reagente 2 durante 48 h. Os corações são transparentes, e esperava-se que as proteínas fluorescentes, incluindo GFP, YFP, PCP e RFP para rotular as células do endocárdio e suas células derivadas; No entanto, apenas GFP e YFP poderia ser trabalhada através de todo o coração (Figuras 3B, 3C e Filmes complementares 6 e 7), e o PCP e RFP não pôde ser detectada (dados não mostrados). A coloração para PECAM (Alexia Fluor 647) também não pôde ser detectada (dados não mostrados), sugerindo que o reagente CUBIC extingue o PCP, RFP e o anticorpo conjugado fluoróforo neste protocolo. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54303/54303fig1.jpg" /> Figura 1:. Imaging o Sac / e limpou cardíaco embrionário (A) Uma opfatia tica de um coração E8.75 (cTnT-Cre; mTmG) é mostrado. V: ventrículo; OFT: via de saída. (B) mostra a estrutura do coração reconstruído de 93 fatias consecutivos ópticos com uma profundidade total de 110,4 pM. Barra de escala = 20 um em A. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/54303fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54303/54303fig2.jpg" /> Figura 2: A imagem latente clone único da SCA / e limpou cardíaco embrionário (A) Uma secção óptica de um clone de um coração E9.5 com o genótipo de ROSA26-Cre ERT2;. ROSA26-Confetti. A seta aponta para uma protrusão celular de um cardiomiócito. (B) mostra o clone reconstruído na região do coração OFT E9.5 com 10 fatias ópticos e 36 uM profundidade total. Barra de escala = 20 um em A.<html> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/54303fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54303/54303fig3.jpg" /> . Figura 3: Geração do pós-natal apuradas cúbica e corações embrionárias tardias (A) mostra uma secção óptica de um coração P2 com o genótipo de αMHC-Cre; mTmG; todas as secções ópticas são mostrados no filme suplementar 5. (B) mostra uma secção de um coração E17.5 com o genótipo de NFATc1-Cre; ROSA26-confetes. (C) Mostra a estrutura do coração reconstruído a partir de 106 fatias ópticos com uma profundidade total de 630 uM. A barra de escala = 20 mm em A e é 100 um de B. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/54303fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> ent &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="filme 1" src="/files/ftp_upload/54303/54303mov1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/Suppl_Movie_1.mp4" target="_blank">. Filme Suplementar 1: Imaging o Sca le apuradas cardíaco embrionário (Clique direito a download)</a> Filme 1 mostra secções ópticas de um Sca le tratada coração E8.75 (cTnT-Cre; mTmG) a partir da superfície coração a luz do coração. A profundidade é 110,4 ^ m e há 93 fatias no total. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/54303/54303mov2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/Suppl_Movie_2.mpg" target="_blank">Filme Suplementar. 2: Imaging o Sca le apuradas cardíaco embrionário (Clique direito a download)</a> Movie 2 mostra o retrato da superfície 3D do coração reconstruída no Movie 1, reconstruçâoted através do software de reconstrução 3D. marcas amarelas da expressão PECAM e etiquetas verdes todos os cardiomiócitos. <img alt="filme 3" src="/files/ftp_upload/54303/54303mov3.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/Suppl_Movie_3.mp4" target="_blank">Filme Suplementar 3: Geração de um único clone do Sca le apuradas cardíaco embrionário (clique com o botão direito para baixar).</a> Filme 3 mostra seções de um clone de um coração E9.5 com o genótipo de ROSA26-Cre ERT2. <img alt="filme 4" src="/files/ftp_upload/54303/54303mov4.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/Suppl_Movie_4.mp4" target="_blank">Filme Suplementar 4: Imagiologia os corações pós-natal apuradas cúbicos (Clique direito a download).</a> Filme 4 mostra seções de um coração CUBIC tratada P2 (&amp; #945; MHC-Cre; mTmG) a partir da superfície do coração ao lúmen do coração. Este coração P2 foi liberado com o reagente CUBIC 1 durante 48 horas, e reagente CUBIC 2 durante 96 horas. <img alt="filme 5" src="/files/ftp_upload/54303/54303mov5.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/Suppl_Movie_5.mp4" target="_blank">Filme Suplementar 5: imagiologia do coração pós-natal apuradas cúbicos (Clique direito a download).</a> Filme 5 mostra um coração que foi liberado com o reagente CUBIC 1 para 48 horas e reagente CUBIC 2 para 48 horas. A profundidade é de 136 mm, com 6 mm por seção no filme 4 e a espessura é de 76 mm, com 6 mm por seção no filme 5. <img alt="filme 6" src="/files/ftp_upload/54303/54303mov6.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/Suppl_Movie_6.mp4" target="_blank">Filme Suplementar 6: Imaging o CUBIC Embry tarde apuradas</a>coração ONIC (Clique direito a download) Filme 6 mostra seções de um coração E17.5 tratada cúbicos (NFATc1-Cre; ROSA26-Confetti). a partir da superfície do coração a luz do coração. A profundidade é de 630 mm, com 6 mm por seção. <img alt="filme 7" src="/files/ftp_upload/54303/54303mov7.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/Suppl_Movie_7.mpg" target="_blank">Filme Suplementar 7: Imaging o coração embrionário tarde apuradas cúbicos (Clique direito a download).</a> Filme 7 mostra o retrato da superfície 3D do coração no filme 6, reconstruído através do software de reconstrução 3D.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution at JoVE.com

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

imaging-cleared-embryonic-postnatal-hearts-at-single-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K visualizações.  Albany Medical College. We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately. 

Vídeo: Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

Imagens de cálcio na<em&gt; Drosophila</em&gt; At Activation Egg

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Biologia do Desenvolvimento

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Análise de vasos coronarianos nos corações embrionárias Cancelado

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early embryonic development, kinase activity is highly dynamic and widespread across the embryo. Pharmacological and genetic approaches are commonly used to probe kinase activities. Unfortunately, it is challenging to achieve superior spatial and temporal resolution using these strategies. Furthermore, it is not feasible to control the kinase activity in a reversible fashion in live cells and multicellular organisms. Such a limitation remains a bottleneck for achieving a quantitative understanding of kinase activity during development and differentiation. This work presents an optogenetic strategy that takes advantage of a bicistronic system containing photoactivatable proteins Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) and the N-terminal domain of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN). Reversible activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is achieved through light-mediated protein translocation in live cells. This approach can be applied to mammalian cell cultures and live vertebrate embryos. This bicistronic system can be generalized to control the activity of other kinases with similar activation mechanisms and can be applied to other model systems.

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

This protocol describes an optogenetic strategy to modulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity during cell differentiation and Xenopus embryonic development. This method allows for the reversible activation of the MAPK signaling pathway in mammalian cell culture and in multicellular live organisms, like Xenopus embryos, with high spatial and temporal resolution.

Modulação Reversível Mediada por Luz do Caminho Protein Quinaso Ativado por Mitogênio durante a Diferenciação Celular e Xenopus Desenvolvimento embrionário

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Microscopia de folha de luz isotrópica e análise de linhagem de células automatizadas para catalogar Caenorhabditis elegans Embryogenesis com resolução subcelular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

Capturando a resposta de lesão cardíaca de populações de células-alvo através de imagens tridimensionais do coração limpo

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Microdissecção de captura a laser da cartilagem embrionária do rato e osso para análise de expressão gênica

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Fundição Vascular de Pulmões de Camundongos Adultos e Precoces para Imagem Micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...