This study was supported by NIH grants R21HL118661, R56HL124444, and R01HL124444 to CDK, and by NIH grants R00HL103797 and R01HL125695 to JMM.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso do Duque Institucional Animal. ratos machos foram utilizados neste estudo, apesar de ambos os sexos, pode ser utilizado como indicado para o objectivo científico do estudo. 1. Remoção do cabelo <ol><li> Antes da indução da anestesia, configurar uma área de preparação de pré-cirúrgico constituído por uma almofada de aquecimento coberto fixada em 37 ° C e uma porta de nariz cónico ligado ao fluxo contínuo de isoflurano. </li><li> Posicione o mouse na câmara de indução da anestesia. Ajuste o medidor de fluxo de O2 a 1 L / min e isoflurano a 1 - 3%. NOTA: A anestesia é tipicamente induzido em um rato de 25 g com isoflurano a 2%. </li><li> Verificar a resposta de estímulo do rato-o suavemente a câmara e observando a falta de um reflexo de endireitamento. </li><li> Lavar a câmara com O2 para limpar o isoflurano antes da abertura. mova rapidamente o mouse para o aquecimento panúncio e conectá-lo ao isoflurano via o cone do nariz. </li><li> Ajustar o isoflurano a 1,5%. Verifique a resposta ao estímulo por pedal reflex (pitada tep). </li><li> Aplique lubrificante oftálmica liberalmente a ambos os olhos para evitar a secagem durante a cirurgia. </li><li> Raspar o cabelo de ambos os membros posteriores utilizando um pequeno aparador elétrico. Segure a pele firmemente enquanto barbear para evitar lacerar a pele. </li><li> Aplique o creme de depilação a pré-aquecido e deixe descansar por 1 min. Limpe suavemente com uma gaze umedecida. </li><li> Para o procedimento cirúrgico em um momento posterior, desligue o isoflurano e mova o mouse para uma gaiola de recuperação forrado de papel toalha vazio para garantir o mouse não aspirar a roupa de cama gaiola. Monitorar o animal até que ele é capaz de manter decúbito esternal. Caso contrário, mova o mouse para a mesa cirúrgica. NOTA: O processo de remoção de cabelo pode irritar a pele e afetar as medições de perfusão. Recomenda-se que esperar 1 - 2 dias após a remoção de pêlos do animal antes de performing uma varredura de perfusão pré-cirúrgica ou realização de cirurgia. </li></ol> Preparação 2. Pré-Cirúrgica <ol><li> Use as seguintes ferramentas durante o processo; pequenas tesouras retas cirúrgicos, 2 de ponta fina pinças anguladas, pequenas pinças Graefe, fórceps motorista agulha, 3 afastadores, tesoura pequena mola, e cotonetes de ponta fina. </li><li> Esterilizar todas as ferramentas, utilizando uma autoclave antes do início da cirurgia. Use um esterilizador talão quente antes e entre cada procedimento cirúrgico, para até 5 animais. Esterilizar pacotes adicionais de ferramentas cirúrgicas para cirurgias de grupos superiores a 5. </li><li> Preparar um campo cirúrgico estéril que consiste numa almofada de aquecimento coberto e uma porta de isoflurano. Executar todo o trabalho sob um microscópio de dissecção 10 estéreo. </li><li> Anestesiar e preparar o rato, tal como descrito nas etapas 1.1 a 1.5. </li><li> Verifique se o mouse está totalmente sedado e coloque em uma posição supina na mesa cirúrgica. Prenda as duas pernas com fita cirúrgica. &lt;/ Li&gt; <li> Se estiver usando uma temperatura controlada almofada de aquecimento, coloque a sonda de temperatura e fixá-lo à base da plataforma cirúrgica usando fita cirúrgica para garantir que ele não será acidentalmente puxado para fora durante o procedimento. </li><li> Limpar o local da incisão usando 3 alternadas iodopovidona e álcool toalhetes. Cobrir o animal com um penso cirúrgico estéril e cortar um furo para expor o local da incisão. </li></ol> 3. Indução de isquemia <ol><li> Usar um bisturi para fazer uma incisão inicial ao longo do centro da coxa medial, correndo a partir do joelho para o abdómen, e alongar a incisão de cerca de 1 cm com uma tesoura fina (Figura 1A). </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54166/54166fig1.jpg" /> Figura 1. Sítio Cirúrgico e vasculares anatômicas Marcos para Cirurgia Rato dos membros posteriores isquemia. (A) Visão externa dao membro posterior de um rato em decúbito dorsal. A linha chocado indica o local da incisão para executar corretamente os procedimentos hindlimb isquemia. (B) Vista do proximal vasculatura do mouse hindlimb. A extremidade proximal da artéria femoral (AF) se coloca por baixo do ligamento inguinal (IL). A extremidade distal do FA está localizado na sua bifurcação para a artéria popliteal (PA) e a artéria safena (SA). Os principais artérias colaterais fora da FA são a artéria lateral do circunflexo femoral (AGCL), o proximal caudal da artéria femoral (pCFA), ea artéria epigástrica caudal superficial (SCEA). A veia femoral (FV) corre ao lado da FA, e ramos venosos pode ser visto em paralelo às principais ramos arteriais. Os asteriscos (*) indicam os locais proximal e distal para a colocação de constrictors AMEROID ou ligaduras, dependendo se será induzida subaguda ou isquemia aguda. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54166/54166fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, cli</a>ck aqui para ver uma versão maior desta figura. <ol start="2"><li> Utilizando uma pinça, abrir a incisão e expor a membrana que cobre o tecido de gordura inguinal (IFT). </li><li> Utilizando-forceps fechadas, perfure através da membrana para a separação entre o IFT eo abdômen. Suavemente libertar a pressão sobre a pinça para separar a IFT dos músculos abdominais, expondo o feixe neurovascular por baixo. Observe a proximal e ramos caudais superficiais como marcos anatômicos importantes (Figura 1B). </li><li> Inserir um retractor e puxar o tecido abdominal proximal para expor o constritor ameróide ou ligadura local proximal, imediatamente proximal à artéria femural circunflexa lateral (Figura 1B). A artéria circunflexa lateral situa-se cerca de 5 mm proximal ao proximal e artérias caudais superficiais. <ol><li> Inserir mais de dois afastadores para a parte distal da incisão, medial e lateral, para puxar a IFT distalmente longe dolocal da cirurgia para alargar o campo cirúrgico. </li></ol></li><li> Use duas pinça fina para remover a membrana mais externa que abrange o feixe neurovascular. Insira com cuidado metade da ponta da pinça fina entre a veia e artéria, deslizando a ponta fórceps sob a membrana que os une. Feche a pinça e gentilmente rasgar a membrana. </li><li> Inserir a ponta de uma pinça fechadas entre a veia e a artéria e criar uma folga entre eles pela libertação da pressão sobre a pinça. Repita esta técnica para criar um fosso entre a artéria e nervo. </li><li> Para subaguda isquemia, colocar um constritor ameróide na artéria femoral proximal (Figura 2). <ol><li> Para instalar o constrictor ameróide proximal, deslize a ponta de uma pinça sob a artéria femoral para o isolar o feixe neurovascular. Usar um segundo conjunto de pinças angled- para prender a borda do constrictor e guiá-lo sob a artéria femoral. </li><li> Coloque a artéria femoral para as smuito no constrictor. Repetir para o constritor distal, posicionando-o imediatamente proximal à bifurcação da artéria femoral para a artéria popliteal e artéria safena (Figura 2). </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54166/54166fig2.jpg" /> Figura 2. Colocação de AMEROID Constrictors e ligaduras. (A) Exemplo de dois constrictors AMEROID colocados na artéria femoral para induzir subaguda hindlimb isquemia. O constritor proximal é colocada imediatamente proximal à artéria femural circunflexa lateral (AGCL). O constrictor distal é colocada imediatamente proximal à bifurcação da poplítea (PA) e as artérias safena (SA). Constrictors são instalados com a ranhura voltada para cima para garantir a artéria está devidamente definido dentro do constrictor. (B) Exemplo de ligaduras de artéria femoral para induzir isquemia dos membros posteriores aguda. LigaturES (setas amarelas) são colocadas de tal forma que eles flanquear a posição dos constritores no painel (B), e a artéria femoral é seccionado entre cada conjunto de duas ligaduras (asteriscos). Bar, 1 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54166/54166fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="8"><li> Para isquemia aguda, ligar e transecto a artéria femoral proximal. <ol><li> Para transecção da artéria femoral, linha 7 - O fio de sutura sob a artéria imediatamente proximal à posição do constrictor proximal (ver Passo 3.7) e ligar. Amarrar uma segunda ligadura cerca de 1 mm distai em relação à primeira. </li><li> Use uma tesoura de mola para transecto a artéria entre as duas ligaduras. Para a transecção arterial distal, repita essas etapas, colocando duas ligaduras cerca de 1 mm, apenas proximal à bifurcação da artéria femoral para a artéria poplítea ea artéria safena, mas garantindo que eles são distal ao CAUD superficialal artéria epigástrica (ver Figura 1) </li></ol></li><li> Fechar a incisão utilizando interrompido 5 - suturas Vicryl S. </li></ol> 4. Perfusão de imagem <ol><li> Mova o mouse para a 37 ° C de aquecimento pad definido sob o imager laser Doppler perfusão (LDPI) e se conectar através de um cone do nariz para a fonte de isoflurano. Se não está disponível monitor de temperatura, permitir que 5 min para o ratinho se aquecer até 37 ° C. </li><li> Ligue o gerador de imagens e lançar o software de captura de imagem. </li><li> Clique no ícone &#39;Nova Imagem Única &quot;para abrir a janela&quot; Configuração do scanner&#39;. Defina o &quot;Tamanho de Leitura &#39;para&#39; Grande &#39;e&#39; Speed ​​Scan &#39;para&#39; 4 ms / pixel &#39;. Definir a área de digitalização, alterando os valores x e y no âmbito da &quot;Área de Digitalização (unidades) &#39;painel. </li><li> Clique na guia &#39;Video and Distance&#39; para ver o vídeo, e organizar o mouse para encaixar na área de digitalização indicado por um contorno vermelho. Clique em &#39;Auto Distance&#39; para calibrara distância entre o laser para o sujeito. Clique em &quot;Avançar&quot; para abrir a janela dos detalhes sujeito &quot;. </li><li> Insira as informações de assunto e quaisquer observações pertinentes. Clique no botão &#39;Seguinte&#39; para avançar para a janela de digitalização. </li><li> Clique no botão &quot;Iniciar medição &#39;para abrir o&#39; Confirmar ou Ignorar Verificação Distance &#39;diálogo. Clique em &quot;OK&quot; para confirmar a distância de varredura. Observe o processo de digitalização começar e correr para 4-8 min, dependendo do tamanho da área de digitalização. </li><li> Após a digitalização estiver concluída, observe a janela &quot;Salvar como&quot;. Nomeie o arquivo e salvá-lo. </li><li> Desligue o isoflurano e mova o mouse para uma gaiola de recuperação vazia e monitorar até que o animal é capaz de manter decúbito esternal. Nunca coloque um rato a recuperar da anestesia em uma gaiola com outros ratos. </li><li> Abra o software de análise de imagem. Clique no ícone &#39;Open&#39; e procurar e abrir o arquivo de imagem para análise. Na janela do arquivo, observe o fluxo,fotografias, e imagens coloridas do mouse. </li><li> Para marcar a região de interesse (ROI) na imagem fluxo, clique no ícone &#39;Mostrar ROIs&#39;. Em seguida, clique no botão &quot;Adicionar Polígono &#39;e arraste o cursor em torno do membro não-cirúrgico para desenhar o ROI. Botão direito do mouse para fechar a forma. Escolha &#39;Adicionar Polígono&#39; novamente e desenhe um ROI de correspondência em torno do membro cirúrgica. </li><li> Clique no ícone &#39;Estatísticas&#39; para abrir o &#39;Imagem Resultados ROIs Estatística (PU)&#39; janela. Observe a diferença percentual em fluxo na coluna &#39;Flux%&#39;. NOTA: A primeira ROI elaborado servirá como referência. NOTA: Antes de cada cintilografia de perfusão subsequente siga os passos descritos na Seção 1 para anestesiar o rato e nos passos 4.1 a 4.11 para a imagem do animal. </li></ol>

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The authors have no conflicts of interest to disclose.

Talvez o passo mais desafiadora no presente processo é a separação da artéria femoral a partir da veia femoral. O maior diâmetro e mais finas paredes da veia femoral em comparação com aqueles da artéria aumentar a sua susceptibilidade para perfurar e rasgar durante a manipulação cirúrgica. A probabilidade de perturbar a veia pode ser reduzido, mantendo a ferida húmida utilizando uma zaragatoa estéril humedecida com PBS. É também importante para garantir que todos os fórceps são afiadas, alinhados, e livre de quebras, a fim de permitir a manipulação precisa dos vasos e tecidos circundantes. No caso em que o sangramento ocorrer, aplicar pressão para a área com gaze estéril até que o sangramento parou. notas cirúrgicos detalhados deve ser mantido para cada animal, como o que pode ser percebido como eventos &quot;menores&quot; sangramento pode representar uma lesão isquêmica involuntariamente mais graves no longo prazo. Para a consistência dos dados, as cirurgias que não envolve nenhuma hemorragia arterial ou venosa colateraleventos ing são cruciais. Uma limitação desta técnica é que a gravidade e / ou início da isquemia (no modelo constritor ameróide subaguda) pode variar amplamente, dependendo de vários factores. O local constritor / ligadura proximal vai determinar quantos artérias colaterais são afectados pela indução de isquemia. Partindo ramos colaterais intactos diminui a gravidade da lesão, embora, como notado, em certos contextos, ou seja, em animais de certas origens genéticas ainda mais leves, subaguda isquemia pode causar necrose de tecidos substancial 23. Além disso, a adição de um segundo constritor, distai ou ligadura irá diminuir a perfusão, tanto no modelo aguda e subaguda 23. Alguns pesquisadores têm ligado ou usou um bisturi elétrico para retirar ramos colaterais a artéria lateral, circunflexo, a artéria femoral caudal proximal, ea superficial artéria epigástrica caudal 24. Isto resulta em mais um isquemia graveND pode induzir uma maior lesão muscular, embora isso também depende fundo genético. É importante notar que eletrocautério podem ser mais propensos a resultar em prejuízo para os tecidos circundantes e deve, portanto, ser utilizado com precaução. À luz dessas variáveis, é crítico que a anatomia vascular é identificado com precisão antes da selecção do local de oclusão. Kochi et al. 25 notaram uma acentuada falta de consenso entre os numerosos relatórios sobre os nomes e localizações de vasos sanguíneos no membro posterior do rato, e eles forneceram uma descrição muito detalhada da anatomia arterial que acreditamos é um guia essencial para qualquer pessoa realizar este procedimento. Uma publicação anterior nesta revista demonstrou a técnica para induzir isquemia aguda 13, no entanto, que o relatório as referências anatômicas vasculares não foram bem definidas. Um objetivo importante deste relatório foi o de fornecer uma representação visual melhorou of esses marcos Além de demonstrar uma modificação da técnica utilizando subaguda isquemia. Uma limitação adicional desta abordagem é que o início da isquemia no modelo de isquemia subaguda é uma função da qualidade dos constritores AMEROID que se usa. Verificou-se que constritores comerciais pode variar em profundidade e a sua forma de ranhura interna (Figura 4). Se a ranhura é muito raso da artéria pode ser extrudido durante a constrição. Constrictors com caseína rachado ou ranhuras malformados deve ser descartada. Além disso, a distribuição inconsistente de caseína dentro do constrictor pode resultar em taxas aceleradas de oclusão. O tamanho e idade dos ratos é outro fator crítico a considerar, como as dimensões dos navios em camundongos &quot;adultos&quot; podem variar consideravelmente entre as idades de 8 e 30 semanas de idade. Isto é particularmente importante quando se utiliza vários grupos independentes de ratinhos para gerar os conjuntos de dados, como aparentemente Smalgamas L em geral (por exemplo, 10 - 16 semanas) pode resultar em taxas inconsistentes de oclusão e a gravidade da lesão membro isquémico. Quantificação de imagiologia de perfusão de Doppler a laser também pode variar largamente, dependendo da temperatura do corpo do animal e a posição (Figura 4), ​​bem como o agente anestésico utilizado. É crucial que o mouse manter uma temperatura de 37 ° C a temperatura do corpo durante a cintilografia de perfusão. Se a temperatura for superior a 37 ° C, a imagem de perfusão será saturado. Se a temperatura for inferior a 36 ° C, o sinal de perfusão pode ser demasiado fraca. É também importante para manter as duas pernas tão simétrico quanto possível para se obter uma razão de perfusão precisas (perfusão no membro isquémico em comparação com que no membro não-isquémico). Embora os ratos são frequentemente fotografada enquanto estava deitado em decúbito dorsal, a simetria pode ser mais difícil de manter nesta posição. Além disso, a variação no fluxo sanguíneo na porção superior do campo de imagem, isto é, o prcoxa oximal, pode contribuir para a variabilidade na quantificação. Em adição, a anestesia com isoflurano frequentemente resulta num aumento da circulação no peito, que por sua vez faz com que o movimento das pernas e a variabilidade no sinal obtido por LDPI. Verificou-se que colocando os animais em decúbito ventral dá mais apoio para os membros, permitindo um posicionamento mais fácil e movimento muito reduzida, o que resulta na quantificação mais reprodutível de perfusão do membro (Figura 5). Além disso, a posição de bruços facilita a manutenção mais consistente de 37 ° C de temperatura nos membros digitalizados, o que também melhora a reprodutibilidade de quantificação (Figura 5). Comparado com o isoflurano, os ratos anestesiados com display cetamina diminuiu movimento do tórax, fazendo imagens supina menos variável. No entanto, a cetamina também irá aumentar a indução da anestesia eo tempo de recuperação, resultando em significativo aumento da perfusão absoluta valores de 16. Cada combinação da posição do corpo e anestagente hetic pode criar um valor de imagem distinta de perfusão, assim, é importante utilizar uma técnica consistente para cada um destes métodos em todas as subsequentes medições de perfusão. É importante reconhecer diversas outras limitações desta técnica. Porque o modelo é frequentemente realizada em camundongos sem co-morbidades, como obesidade, hiperlipidemia, aterosclerose, diabetes mellitus, ou outros fatores que predispõem à doença vascular, a indução da isquemia de membros nunca vai perfeitamente replicar a patologia da PAD clínica. Como se observa, os efeitos da isquemia aguda foram avaliados em ratos idosos, diabéticos e com hipercolesterolemia, e no futuro será útil para determinar os efeitos dessas comorbidades sobre as respostas a isquemia subaguda membro. Além disso, porque PAD é uma doença crônica, mesmo subaguda isquemia é um modelo imperfeito do cenário clínico. Por conseguinte, será importante continuar a desenvolver modelos queresultar em verdadeira isquemia crônica e para testá-los em conjunto com modelos de fatores de risco cardiovascular. Uma limitação técnica da modalidade de imagem de laser Doppler, independentemente do modelo de animal a ser usado é que ele mede a velocidade do fluxo sanguíneo e não perfusão tecidual absoluta, por isso, pode ser utilizado apenas para comparar as mudanças relativas no fluxo sanguíneo dentro de um determinado animal. Notavelmente, isquemia que causa perda do membro irá resultar em uma relação de perfusão reduzida independentemente das mudanças no fluxo sanguíneo 23. Em resumo, nós fornecemos métodos detalhados para induzir isquemia dos membros posteriores aguda e subaguda em ratos com a finalidade de analisar os efeitos no músculo esquelético e remodelação vascular. Especial atenção é dada à identificação dos marcos vasculares críticas para facilitar intra precisas e reprodutibilidade inter-operador do modelo. Refinamento adicional da técnica pode, eventualmente, levar ao desenvolvimento de um modelo de isquemia crónica que precisaly replica a patogênese da PAD clínica.

Doença arterial periférica (DAP) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade cardiovascular em países desenvolvidos 1. resultados Pad de obstrução aterosclerótica das artérias periféricas, que leva a isquemia de membros com a dor de esforço ou de descanso resultante e, ocasionalmente, úlceras e gangrena que necessitam de amputação do membro não-cura. Terapias enfocadas PAD são essencialmente direccionado para endovascular 2 ou revascularização cirúrgica 3, como essencialmente não existem terapias médicas eficazes 4. Infelizmente, a revascularização é muitas vezes de benefício limitado, como enxertos têm elevadas taxas de insucesso (até 50% dentro de 5 anos) 5 que são piores em algumas populações (por exemplo, fumantes, mulheres, enxertos de veia safena não) 6,7. abordagens endovasculares, como a angioplastia e colocação de stent, também estão comprometidos por elevadas taxas de restenose (em excesso de 50% a 1 ano), especialmente in femoropoplítea doença 8, embora o uso de balões e stents farmacológicos melhorou resultados pouco 9-11. A fim de desenvolver novos tratamentos para a DAP é essencial para desenvolver modelos animais que reproduzem de forma fiável a doença humana. Até à data, o modelo mais comum de DAP é o modelo da pata traseira isquemia (HLI), que é mais frequentemente realizada em ratos 12,13. Na sua manifestação mais comum, o modelo envolve a ligadura cirúrgica da artéria femoral proximal e distai e os seus intervenientes ramos laterais seguida por excisão do vaso, resultando na oclusão do fluxo sanguíneo e a indução de isquemia aguda. HLI tem sido principalmente utilizado para estudar as respostas angiogénicas e arteriogénica no tecido muscular do membro periférico e os efeitos de várias terapias (por exemplo, drogas, a entrega do gene, as células estaminais) sobre essas respostas. Mais recentemente, o nosso grupo utilizou este modelo para examinar o papel das células do músculo esquelético in a resposta à isquemia e os efeitos das diferenças genéticas sobre os resultados 14. O modelo HLI tem facilitado a nossa compreensão actual que as respostas vasculares e dos músculos a isquemia são dependentes genética (isto é, estirpe consanguínea) 15, 16 anos de idade, e a presença ou ausência de outras doenças ou condições relevantes para a aterosclerose, incluindo a diabetes mellitus 17 e hipercolesterolemia 18. No entanto, um ponto fraco importante do modelo tradicional HLI é que é um modelo de isquemia aguda 12,13, enquanto DAP humana provoca isquemia crónica, como resultado do desenvolvimento progressivo de lesões ateroscleróticas oclusivas nas artérias periféricas. Em uma tentativa de contornar essa fraqueza, Tang e seus colegas inicialmente desenvolvido um modelo de rato da oclusão arterial femoral gradual usando constrictors AMEROID 19, e do mesmo grupo posteriormente developed um rato modelo semelhante 20. Constrictors AMEROID foram descritos inicialmente na década de 1950 em um modelo canino de isquemia miocárdica crônica 21,22. Estes dispositivos têm uma manga de metal externo envolvendo uma camada interior de um material higroscópico, geralmente caseína, e quando colocado em torno de uma artéria que induzir a oclusão progressiva vaso à medida que absorvem humidade a partir dos tecidos circundantes. Na sua modificação do modelo, Yang et al. Constritores colocado em ambas as extremidades proximal e distai artéria femoral em locais análogos aos locais de ligação cirúrgica, e eles ligado aos ramos laterais da artéria femoral, como no modelo tradicional. Comparado a HLI aguda, isquemia induzida pelo constrictor ameróide resultou em menor expressão de genes inflamatórios e cisalhamento dependentes de tensão, menor recuperação do fluxo sanguíneo 4 - 5 semanas após a cirurgia, e menos necrose muscular 20. Com base nestas observações, considerou-se que a oclusão arterial gradual pode fornecer um modelo de PAD mais relevante para a doença humana. Notavelmente, no relatório original, foram examinados os efeitos de isquemia induzida por constritor ameróide apenas em ratinhos C57BL / 6 19, que são relativamente resistentes à necrose do músculo induzida por isquemia 15. Nós recentemente modificou o modelo de isquemia gradual mais e explorou seus efeitos no mais isquemia e suscetíveis BALB / c do mouse estirpe 23. Na primeira manifestação do modelo, colocado constrictors tanto no proximal e artéria femoral distal, mas deixou todos os ramos laterais intacta. Em uma segunda modificação, mais suave, colocamos um único constrictor apenas na artéria femoral proximal e novamente à esquerda todos os colaterais ramos da artéria intacta. Em ambas as modificações deste modelo, descobrimos que os ratos BALB / c, mas não camundongos C57BL / 6, exibido necrose muscular significativa, apesar de ter o fluxo sanguíneo semelhante e densidade vascular. Semelhante ao nosso estudo anterior 14, estes resultados demonstraram que muscular de membroso prejuízo não é apenas influenciado pelo fluxo sanguíneo, mas é em parte dependente de fundo genético. Além disso, descobrimos que o fluxo sanguíneo do membro caiu para seu ponto mais baixo dentro de 3 dias, assim, o modelo parece ser mais um dos &quot;subaguda&quot; em vez de isquemia gradual. Com base nestes estudos prévios, parece claro que um método único para a indução de isquemia dos membros posteriores pode não ser adequado em todos os casos. Por causa de uma variedade de condições (por exemplo, diferenças genéticas e a presença ou ausência de condições co-mórbidas) influenciam tanto a vascular e respostas específicas do músculo esquelético, os investigadores podem encontrar-se necessário modificar a cronicidade e / ou a gravidade de isquemia dos membros posteriores de melhor atender às suas finalidades. Além disso, as descrições anteriores do modelo normalmente faltava marcos anatômicos adequados para facilitar confiável reprodutibilidade inter-examinador da técnica. Neste trabalho, métodos para induzir isquemia dos membros posteriores aguda ou subaguda em ratossão descritos, e as estruturas anatómicas precisos são fornecidos.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5/45 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Dumoxel</td></tr><tr><td>Dumont Style 5 Mini Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-14</td><td>Inox</td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>7 - 0 Silk Suture</td><td>Sharpoint</td><td>DA-2527N</td><td></td></tr><tr><td>5 - 0 Coated Vicryl Suture</td><td>Ethicon</td><td>J463G</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Artifical Tears Ointment</td><td>Rugby Laboratories</td><td>0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Tape</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>Fine Cotton Swabs</td><td>Contec</td><td>SC-4</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2DF</td><td></td></tr><tr><td>Ameroid Constrictors</td><td>Research Instruments SW</td><td>MMC-0.25 x 1.00-SS</td><td></td></tr><tr><td>Hot Bead Sterilizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deltaphase Isothermal Pad</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Needle Driver</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Moor LDPI</td><td>Moor Instruments</td><td>moorLDI2</td><td></td></tr><tr><td>moorLDI Measurement software</td><td>Moor Instruments</td><td>v. 6.0</td><td></td></tr><tr><td>Hair Removal Cream</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia

doença arterial periférica (DAP) é uma das principais causas de morbilidade e mortalidade cardiovascular em países desenvolvidos, e modelos animais que reproduzem de forma fiável a doença humana são necessários para desenvolver novas terapias para esta doença. O modelo do rato de membro posterior isquemia tem sido amplamente utilizado para este fim, mas a prática padrão de indução de isquemia aguda por ligação da artéria femoral pode resultar em necrose do tecido substancial, comprometer a capacidade de os investigadores a estudar as respostas vasculares e dos tecidos do músculo esquelético para isquemia . Uma abordagem alternativa para a ligação da artéria femoral é a indução de oclusão da artéria femural gradual através da utilização de constritores AMEROID. Quando colocado em torno da artéria femoral na mesma ou em diferentes locais, como os locais de ligação da artéria femoral, estes dispositivos de oclusão da artéria mais de 1 - 3 dias, resultando em mais gradual, isquemia subaguda. Isto resulta em necrose do tecido muscular esquelético menos substancial, Which pode imitar mais de perto as respostas observadas nos PAD humano. Porque genéticos influências fundo resultados em ambos os modelos de isquemia aguda e subaguda, a consideração da estirpe de ratinhos em estudo é importante na escolha do melhor modelo. Este artigo descreve o procedimento adequado e colocação anatômica de ligaduras ou constrictors AMEROID na artéria femoral do rato para induzir subaguda ou isquemia dos membros posteriores aguda no mouse.

identificação adequada da vasculatura do mouse hindlimb é fundamental para garantir a reprodutibilidade das técnicas para induzir tanto subaguda e isquemia dos membros posteriores aguda, conforme descrito aqui. Além da variação inerente em estudos com animais, outros factores podem introduzir variabilidade na imagiologia de perfusão de Doppler a laser (LDPI), incluindo o tipo de anestesia, a posição do animal (comparada propenso supina), e a temperatura do corpo (ver Figura 3). Além disso, o modelo de isquemia dos membros posteriores subaguda é dependente da qualidade dos constritores AMEROID, que pode variar amplamente dentro de um dado lote (ver Figura 4). Cada um destes problemas podem ter efeitos substanciais sobre a quantificação de fluxo medido por LDPI e são discutidos em mais detalhe abaixo. Após a colocação de constrictors AMEROID no modelo de isquemia subaguda hindlimb ou ligadurae o corte transversal da artéria femoral, no modelo de isquemia aguda dos membros posteriores, imagens LDPI deve ser obtida imediatamente após a operação, enquanto o animal ainda é anestesiado para demonstrar os efeitos da cirurgia e estabelecer um nível pós-operatória da linha de base da perfusão (Figura 5). A determinação quantitativa da perfusão é realizada através da elaboração de uma região de interesse (ROI) em torno do membro posterior isquémico e um ROI comparável em torno do membro posterior não-isquémica. A perfusão é mais geralmente expresso como uma razão da perfusão no membro isquémico para que no membro não-isquémico e as alterações em relação este são medidos ao longo do tempo. Nós descobrimos que os ratos de imagem nos resultados posição prona em menor variação devido ao movimento de animais e mudanças no posicionamento dos pés de um ponto de tempo para o próximo. Além disso, a perfusão na coxa superior tende a ser mais variável quando os ratos estão na posição supina. A perda completa da perfusão dos membros posteriores devem ser observadas após a indução do membro agudaisquemia, enquanto que apenas uma ligeira diminuição de perfusão é tipicamente observado após a colocação de constritores AMEROID no modelo subaguda (Figura 5). Em alguns casos, temos observado oclusão constrictor rápida, com dramática perda resultante da perfusão imediatamente no pós-operatório. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54166/54166fig3.jpg" /> Figura 3. Variação de Perfusão de imagem baseada em membros posteriores Posição e imagens de perfusão temperatura corporal. Laser Doppler de um único rato BALB / c, anestesiados com isoflurano a 1,5% e digitalizados, tanto na posição supina e propenso a 35 ° C, 37 ° C, e 38 ° C. Com anestesia com isoflurano, os membros posteriores dos animais tendem a mover-se com a respiração, resultando em um artefacto (linhas horizontais), que são observados com maior frequência em decúbito dorsal em comparação com imagens de bruços. Na posição de bruços, é muito mais fácil de reproduzir o ângulo precisodos pés, fazendo quantificação da perfusão com o tempo mais precisa. Perfusão é substancialmente reduzido, como a temperatura do corpo cai abaixo de 37 ° C, enquanto que as imagens estão saturados em temperaturas mais altas. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54166/54166fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54166/54166fig4.jpg" /> Figura 4. Variabilidade da Comercialmente Disponível AMEROID Constrictors (A) Um exemplo de um constrictor ideal 0,25 mm de diâmetro interior (seta dupla) com forma slot de espessura uniforme e caseína (B - D).. Os exemplos de variação forma slot. Slots às vezes pode exibir uma forma de &#39;D&#39; (B e C) ou uma forma de &#39;b&#39; (D). Nestes casos, a caseína é bem distribuídos e os slots são suficientes profunda hold a artéria. (E) Um exemplo de espessura desigual caseína. Este constritor seria descartada. (F) Um exemplo de uma ranhura que é muito raso para manter a artéria no local durante a constrição. Este constrictor também seria descartado. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54166/54166fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54166/54166fig5.jpg" /> Figura 5. Perfusão Imagens Imediatamente após a indução da subaguda ou aguda dos membros posteriores isquemia. Imagens de perfusão representativos, tanto na posição supina e propenso de camundongos BALB / c que foram submetidos a colocação de dois constrictors AMEROID na artéria femoral esquerda para induzir subaguda isquemia dos membros posteriores ou colocação de duas ligaduras e transecção da artéria femoral esquerda para induzir isquemia dos membros posteriores aguda. Note-se que perfusion é reduzido, mas ainda detectável após a colocação constrictor ameróide, ao passo que, essencialmente, nenhum fluxo é detectado imediatamente após dupla ligadura / transecção da artéria femoral. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54166/54166fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

Surgical induction of hindlimb ischemia in the mouse is useful to examine angiogenesis, however this is compromised in certain inbred mouse strains that display marked ischemia-induced tissue necrosis. Methods are described to induce subacute limb ischemia using ameroid constrictors to circumvent this problem through the induction of gradual arterial occlusion.

Métodos para aguda e subaguda Murino dos membros posteriores Isquemia

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

16.2K visualizações.  Duke University Medical Center. Surgical induction of hindlimb ischemia in the mouse is useful to examine angiogenesis, however this is compromised in certain inbred mouse strains that display marked ischemia-induced tissue necrosis. Methods are described to induce subacute limb ischemia using ameroid constrictors to circumvent this problem through the induction of gradual arterial occlusion. 

Vídeo: Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

Ligadura da artéria coronária e injeção intramiocárdica em um modelo murino de infarto

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Medicina

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide. Medical therapies for symptomatic relief are limited. Surgical or endovascular interventions are useful for some individuals, but long-term results are often disappointing. As a result, there is a need for developing new therapies to treat PAD. The murine hindlimb ischemia preparation is a model of PAD, and is useful for testing new therapies. When compared to other models of tissue ischemia such as coronary or cerebral artery ligation, femoral artery ligation provides for a simpler model of ischemic tissue. Other advantages of this model are the ease of access to the femoral artery and low mortality rate. 
In this video, we demonstrate the methodology for the murine model of unilateral hindimb ischemia. The specific materials and procedures for creating and evaluating the model will be described, including the assessment of limb perfusion by laser Doppler imaging. This protocol can also be utilized for the transplantation and non-invasive tracking of cells, which is demonstrated by Huang et al.1.

Murine Model of Hindlimb Ischemia

The surgical procedure for induction of unilateral hindlimb ischemia is demonstrated, with confirmation of ischemia by laser Doppler perfusion imaging.

Modelo murino de isquemia dos membros posteriores

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

Biologia

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to stimulate microcirculation. The choice of delivery method for these agents is important because the route of administration profoundly affects the bioactivity and efficacy of these agents1,2. In this article, we demonstrate how to locally administer a substance in ischemic hindlimbs by using a catheterized osmotic pump. This pump can deliver a fixed volume of aqueous solution continuously for an allotted period of time. We also present our mouse model of unilateral hindlimb ischemia induced by ligation of the common femoral artery proximal to the origin of profunda femoris and epigastrica arteries in the left hindlimb. Lastly, we describe the in vivo cannulation and ligation of the infrarenal abdominal aorta and perfusion of the hindlimb vasculature with Microfil, a silicone radiopaque casting agent. Microfil can perfuse and fill the entire vascular bed (arterial and venous), and because we have ligated the major vascular conduit for exit, the agent can be retained in the vasculature for future ex vivo imaging with the use of small specimen micro-CT3.

We show here the in vivo insertion of an osmotic pump for constant local drug delivery and the creation of hindlimb ischemia in a mouse model. Moreover, the hindlimb vasculature is perfused with Microfil, a silicone radiopaque agent, to prepare for micro-computed tomography (micro-CT) imaging.

Osmótica Drug Delivery para hindlimbs isquêmicos e perfusão da vasculatura com Microfil para Micro-tomografia computadorizada

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion

Background 
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered advancements to decrease the occurrence this injury.&#160;The current model demonstrates reproducible lower&#160;extremity paralysis following thoracic aortic occlusion.
Methods 
Adult male C57BL6 mice were anesthetized with isoflurane. Through a cervicosternal incision the aorta was exposed. The descending thoracic aorta and left subclavian arteries were identified without entrance into pleural space. Skeletonization of these arteries was followed by immediate closure (Sham) or occlusion for 4 min (moderate ischemia) or 8 min (prolonged ischemia). The sternotomy and skin were closed and the mouse was transferred to warming bed for recovery.&#160; Following recovery, functional analysis was obtained at 12 hr intervals until 48 hr.
Results 
Mice that underwent sham surgery showed no observable hind&#160;limb deficit. Mice subjected to moderate ischemia for 4 min had minimal functional deficit at 12 hr followed by progression to complete paralysis at 48 hr. Mice subjected to prolonged ischemia had an immediate paralysis with no observable hind-limb movement at any point in the postoperative period. There was no observed intraoperative or post&#160;operative mortality.
Conclusion 
Reproducible lower extremity paralysis whether immediate or delayed can be achieved in a murine model. Additionally, by using a median sternotomy and careful dissection, high survival rates, and reproducibility can be achieved.

The lack of mechanistic understanding of spinal cord ischemia-reperfusion injury has hindered further adjuncts to prevent paraplegia following high risk aortic operations. Thus, the development of animal models is imperative. This manuscript demonstrates reproducible lower extremity paralysis following thoracic aortic occlusion in a murine model.

Reproducable Paraplegia por Thoracic Aorta Oclusão em um modelo murino de Medula Espinhal A isquemia-reperfusão

Background
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of stroke on tissue injury and to evaluate the effectiveness of therapeutic interventions, several experimental models in a variety of species were developed. They include complete global cerebral ischemia, incomplete global ischemia, focal cerebral ischemia, and multifocal cerebral ischemia. The model described in this protocol is based on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and is related to the focal ischemia category. This technique produces consistent focal ischemia in a strictly defined region of the hemisphere and is less invasive than other methods. The procedure described is performed on mice, given the availability of several genetic variants and the high number of tests standardized for mice to aid in the behavioral and neurodeficit evaluation.

We describe a mouse model of stroke induced by the occlusion of the middle cerebral artery using a silicone coated suture. The protocol can be applied to induce permanent occlusion or a temporary ischemia, followed by reperfusion.

Indução de Acidente Vascular Cerebral Isquêmico e isquemia-reperfusão em ratos usando a técnica de oclusão da artéria Oriente e Visualização de infarto Área

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard therapy, a considerable number of CLI patients are not suited for either surgical or endovascular revascularization. Angiogenic therapies are emerging as an option for these patients but are currently still under investigation. Before application in humans, those therapies must be tested in animal models and its mechanisms must be clearly understood. An animal model of hindlimb ischemia (HLI) has been developed by the ligation and excision of the distal external iliac and femoral arteries and veins in mice. A comprehensive panel of tests was assembled to assess the effects of ischemia and putative angiogenic therapies at functional, histologic and molecular levels. Laser Doppler was used for the flow measurement and functional assessment of perfusion. Tissue response was evaluated by the analysis of capillary density after staining with the anti-CD31 antibody on histological sections of gastrocnemius muscle and by measurement of collateral vessel density after diaphonization. Expression of angiogenic genes was quantified by RT-PCR targeting selected angiogenic factors exclusively in endothelial cells (ECs) after laser capture microdissection from mice gastrocnemius muscles. These methods were sensitive in identifying differences between ischemic and non-ischemic limbs and between treated and non-treated limbs. This protocol provides a reproducible model of CLI and a framework for testing angiogenic therapies.

Here, a critical hindlimb ischemia experimental model is presented followed by a battery of functional, histologic and molecular tests&#160;to assess the effectiveness of angiogenic therapies.&#8203;

Avaliando a angiogênese terapêutica em um modelo murino de isquemia Retromembro

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is a common, noninvasive, repeatable method for assessing blood flow recovery. The technique calculates overall blood flow in the sampled tissue from the Doppler shift in frequency caused when a laser hits moving red blood cells. Measurements are expressed in arbitrary perfusion units, so the contralateral non-intervened upon leg is usually used to help control measurements. Measurement depth is in the range of 0.3-1 mm; for hindlimb ischemia, this means that dermal perfusion is assessed. Dermal perfusion is dependent on several factors&#8212;most importantly skin temperature and anesthetic agent, which must be carefully controlled to result in reliable readings. Furthermore, hair and skin pigmentation can alter the ability of the laser to either reach or penetrate to the dermis. This article demonstrates the technique of LDPI in the mouse hindlimb.

Here, we present a protocol that demonstrates the technique and necessary controls for Laser Doppler perfusion imaging to measure blood flow in the mouse hindlimb.

Imagem de perfusão doppler laser no hindlimb mouse

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is ...

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering from its most severe form, chronic limb-threatening ischemia (CLTI), face substantial impairments to daily living, including chronic pain, limited walking distance without pain, and nonhealing wounds. Preclinical models have been developed in various animals to study PAD, but mouse hindlimb ischemia remains the most widely used. There can be significant variation in response to ischemic insult in these models depending on the mouse strain used and the site, number, and means of arterial disruption. This protocol describes a unique method combining femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor to reliably induce footpad gangrene in Friend Virus B (FVB) mice that resembles the tissue loss of CLTI. While traditional means of assessing reperfusion such as laser Doppler perfusion imaging (LDPI) are still recommended, intracardiac perfusion of the lipophilic dye 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) is used to label the vasculature. Subsequent whole-mount confocal laser scanning microscopy allows for high-resolution, three-dimensional (3D) reconstruction of footpad vascular networks that complements traditional means of assessing reperfusion in hindlimb ischemia models.

The present protocol describes a unique, clinically relevant model of peripheral arterial disease that combines femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase inhibitor to induce hindlimb gangrene in FVB mice. Intracardiac DiI perfusion is then used for high-resolution, three-dimensional imaging of the footpad vasculature.

Imagem tridimensional de alta resolução da Vasculatura do Footpad em um Modelo de Gangrena Hindlimb Murine

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Oclusão da artéria média distal para desenvolver um modelo de camundongo com AVC isquêmico

Induction of Acute Ischemic Stroke in Mice Using the Distal Middle Artery Occlusion Technique

Ischemic stroke remains the predominant cause of mortality and functional impairment among the adult populations globally. Only a minority of ischemic stroke patients are eligible to receive intravascular thrombolysis or mechanical thrombectomy therapy within the optimal time window. Among those stroke survivors, around two-thirds suffer neurological dysfunctions over an extended period. Establishing a stable and repeatable experimental ischemic stroke model is extremely significant for further investigating the pathophysiological mechanisms and developing effective therapeutic strategies for ischemic stroke. The middle cerebral artery (MCA) represents the predominant location of ischemic stroke in humans, with the MCA occlusion serving as the frequently employed model of focal cerebral ischemia. In this protocol, we describe the methodology of establishing the distal MCA occlusion (dMCAO) model through transcranial electrocoagulation in C57BL/6 mice. Since the occlusion site is located at the cortical branch of MCA, this model generates a moderate infarcted lesion restricted to the cortex. Neurological behavioral and histopathological characterization have demonstrated visible motor dysfunction, neuron degeneration, and pronounced activation of microglia and astrocytes in this model. Thus, this dMCAO mouse model provides a valuable tool for investigating the ischemiastroke and worth of popularization.

Autor em destaque: Estabelecendo um modelo confiável de oclusão distal de MCA em camundongos para pesquisa de AVC

Here, we present a protocol to establish a distal middle cerebral artery occlusion (dMCAO) model through transcranial electrocoagulation in C57BL/6J mice and evaluate the subsequent neurological behavior and histopathological features.

Indução de AVC Isquêmico Agudo em Camundongos Usando a Técnica de Oclusão Distal da Artéria Média

Ischemic stroke remains the predominant cause of mortality and functional impairment among the adult populations globally. Only a minority of ischemic ...