Name: preparation and analysis of in vitro three dimensional breast carcinoma surrogates
Uploaded: 2016-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates at JoVE.com

The University of Alabama at Birmingham Center for Metabolic Bone Disease performed the histologic processing and sectioning of surrogates. Southern Research (Birmingham, AL) provided support for the manufacture of the bioreactor system. Funding was provided by the United States Department of Defense Breast Cancer Research Program (BC121367).

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	<li>Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+3D+environments+to+elucidate+the+effect+of+environmental+parameters+on+drug+response+in+cancer.">Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer.</a> Integr Biol (Camb). 3 (1), 31-38 (2011).</li><li>Horning, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+tumor+model+for+in+vitro+evaluation+of+anticancer+drugs.">3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs.</a> Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).</li><li>Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+chitosan+scaffold-based+MCF-7+cell+culture+for+the+determination+of+the+cytotoxicity+of+tamoxifen.">Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen.</a> Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).</li><li>Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+breast+cancer+progression:+biology+and+implications+for+treatment.">The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).</li><li>Mao, Y., Keller, E. T., Garfield, D. H., Shen, K., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+in+tumor+microenvironment+and+breast+cancer.">Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 303-315 (2013).</li><li>Paulsson, J., Micke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+relevance+of+cancer-associated+fibroblasts+in+human+cancer.">Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer.</a> Semin Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).</li><li>Roskelley, C. D., Desprez, P. Y., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-dependent+tissue-specific+gene+expression+in+mammary+epithelial+cells+requires+both+physical+and+biochemical+signal+transduction.">Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 12378-12382 (1994).</li><li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab.">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2008).</li><li>Ivascu, A., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+single-tumor+spheroids+for+high-throughput+cell+function+and+toxicity+analysis.">Rapid generation of single-tumor spheroids for high-throughput cell function and toxicity analysis.</a> J Biomol Screen. 11 (8), 922-932 (2006).</li><li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery.">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li><li>Bergamaschi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+signature+identifies+breast+cancer+subgroups+with+different+clinical+outcome.">Extracellular matrix signature identifies breast cancer subgroups with different clinical outcome.</a> J Pathol. 214 (3), 357-367 (2008).</li><li>Oskarsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+components+in+breast+cancer+progression+and+metastasis.">Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis.</a> The Breast. 22, S66-S72 (2013).</li><li>Kelley, L. C., Lohmer, L. L., Hagedorn, E. J., Sherwood, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traversing+the+basement+membrane+in+vivo:+A+diversity+of+strategies.">Traversing the basement membrane in vivo: A diversity of strategies.</a> JBC. 204 (3), 291-301 (2014).</li><li>Sadlonova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+fibroblasts+modulate+epithelial+cell+proliferation+in+three-dimensional+in+vitro+co-culture.">Breast fibroblasts modulate epithelial cell proliferation in three-dimensional in vitro co-culture.</a> Breast Cancer Res. 4, (2004).</li><li>Wendt, D., Marsano, A., Jakob, M., Heberer, M., Martin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillating+perfusion+of+cell+suspensions+through+three-dimensional+scaffolds+enhances+cell+seeding+efficiency+and+uniformity.">Oscillating perfusion of cell suspensions through three-dimensional scaffolds enhances cell seeding efficiency and uniformity.</a> Biotechnol Bioeng. 84 (2), 205-214 (2003).</li><li>Marshall, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-perfusion+bioreactor+system+for+engineered+breast+cancer+surrogates+to+be+used+in+preclinical+testing.">Flow-perfusion bioreactor system for engineered breast cancer surrogates to be used in preclinical testing.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2015).</li><li>Calcagnile, P., Fragouli, D., Mele, E., Ruffilli, R., Athanassiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+foams+with+functional+nanocomposite+cells.">Polymeric foams with functional nanocomposite cells.</a> RSC Adv. 4, 19177-19182 (2014).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+signatures+of+human+mammary+carcinoma+identify+novel+metastasis+promoters.">Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters.</a> eLife. 3, (2014).</li><li>Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+extracellular+matrix+constituents+in+breast+cancer.">Involvement of extracellular matrix constituents in breast cancer.</a> Semin Cancer Biol. 6 (3), 165-173 (1995).</li><li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+HistoGel-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology.">Evaluation of HistoGel-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> J Vet Diagn Invest. 24 (4), 710-715 (2012).</li><li>Varsegi, G. M., Shidham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Block+Preparation+from+Cytology+Specimen+with+Predominance+of+Individually+Scattered+Cells.">Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells.</a> J Vis Exp. (29), e1316 (2009).</li><li>Sadlonova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Breast+Fibroblasts+Inhibit+Growth+of+the+MCF10AT+Xenograft+Model+of+Proliferative+Breast+Disease.">Human Breast Fibroblasts Inhibit Growth of the MCF10AT Xenograft Model of Proliferative Breast Disease.</a> Am J Pathol. 170 (3), (2007).</li><li>Otali, D., He, Q., Stockard, C. R., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+immunorecognition+by+transferring+cells+from+10%+neutral+buffered+formalin+to+70%+ethanol.">Preservation of immunorecognition by transferring cells from 10% neutral buffered formalin to 70% ethanol.</a> Biotech Histochem. 88, 170-180 (2013).</li><li>Webster, S. S., Jenkins, L., Burg, K. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+Techniques+for+Porous,+Absorbable,+Polymeric+Scaffolds,+Used+in+Tissue+Engineering.">Histological Techniques for Porous, Absorbable, Polymeric Scaffolds, Used in Tissue Engineering.</a> J Histotechnol. 26 (1), 57-65 (2003).</li><li>Troy, T. -. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Paraffin+Sections+of+Mouse+Epidermis+Using+Fluorescent+Antibodies.">Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies.</a> J Vis Exp. (11), (2008).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Kwon, Y. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli1+enhances+migration+and+invasion+via+up-regulation+of+MMP-11+and+promotes+metastasis+in+ERa+negative+breast+cancer+cell+lines.">Gli1 enhances migration and invasion via up-regulation of MMP-11 and promotes metastasis in ERa negative breast cancer cell lines.</a> Clin Exp Metastasis. (28), (2011).</li><li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+for+Immunohistochemistry+on+Cryosectioned+Rat+Brain+Tissue:+Example+Staining+for+Microglia+and+Neurons.">Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons.</a> J Vis Exp. (99), e52293 (2015).</li><li>Pal, A., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+cultures:+a+tool+to+study+normal+acinar+architecture+vs.+malignant+transformation+of+breast+cells.">Three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells.</a> J Vis Exp. (86), e51311 (2014).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+High+Grade+Glioma+Cell+Culture+from+Surgical+Specimens+for+Use+in+Clinically+Relevant+Animal+Models+and+3D+Immunochemistry.">Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry.</a> J Vis Exp. (83), e51088 (2014).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J Vis Exp. (51), e2720 (2011).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multi-organ+Chip+-+A+Microfluidic+Platform+for+Long-term+Multi-tissue+Coculture.">The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture.</a> J Vis Exp. (98), e52526 (2015).</li><li>Sadlonova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Molecular+Distinctions+Between+Normal+Breast-Associated+Fibroblasts+and+Breast+Cancer-Associated+Fibroblasts.">Identification of Molecular Distinctions Between Normal Breast-Associated Fibroblasts and Breast Cancer-Associated Fibroblasts.</a> Cancer Microenviron. 2, 9-21 (2009).</li><li>Wang, J. D., Douville, N. J., Takayama, S., ElSayed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+molecular+absorption+into+PDMS+microfluidic+channels.">Quantitative analysis of molecular absorption into PDMS microfluidic channels.</a> Ann Biomed Eng. 40 (9), 1862-1873 (2012).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosens Bioelectron. 63, 218-231 (2015).</li><li>Regehr, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+polydimethylsiloxane-based+microfluidic+cell+culture.">Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture.</a> Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).</li><li>Burdett, E., Kasper, F. K., Mikos, A. G., Ludwig, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+tumors:+a+tissue+engineering+perspective+in+cancer+biology.">Engineering tumors: a tissue engineering perspective in cancer biology.</a> Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 351-359 (2010).</li><li>Caruso, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+coagulative+necrosis+in+malignant+epithelial+tumors+(Review).">Mechanisms of coagulative necrosis in malignant epithelial tumors (Review).</a> Oncol Lett. 8 (4), 1397-1402 (2014).</li><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+A+Review+of+Programmed+Cell+Death.">Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death.</a> Toxicol Pathol. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+oncosis,+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death.">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146 (1), 3-15 (1995).</li><li>Ogino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathological+epidemiology+of+epigenetics:+emerging+integrative+science+to+analyze+environment,+host,+and+disease.">Molecular pathological epidemiology of epigenetics: emerging integrative science to analyze environment, host, and disease.</a> Mod Pathol. 26 (4), 465-484 (2013).</li><li>Otali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effects+of+formalin+fixation+and+tissue+processing+on+immunorecognition.">Combined effects of formalin fixation and tissue processing on immunorecognition.</a> Biotech Histochem. 84 (5), 223-247 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Nisto, um processo de cultura 3D tem sido descrito que incorpora componentes do microambiente do tecido, incluindo a matriz extracelular (ECM) e fibroblastos de estroma humano, em um volume que mais de perto modelos de cancro da mama humano para permitir o desenvolvimento de uma morfologia 3D recapitulativo . O método de cultura 3D descrito é mais representativo das doenças humanas de cultura celular tradicional 2D em que vários tipos de células são incorporados em um volume 3D de ECM. Tem-se observado que esses parâmetros (isto é, vários tipos de células, ECM, e volume 3D) proporcionar um contexto mais apropriado para o estudo de processos biológicos porque a arquitectura dos tecidos, os sinais do microambiente, e dimensionalidade estão a ser tomadas em consideração 1,8. Outros métodos de cultura 3D foram previamente descritos incluindo, a cultura de células no topo de uma matriz 3D 29, a geração de esferóides 30, pendurado gota cutlures 31, umaND a utilização de dispositivos de microfluidos 32. Embora cada um desses sistemas tem vantagens únicas, em geral eles não incluem tanto componentes da matriz, populações de células do estroma, ou uma dimensionalidade representativa. O método de cultura 3D aqui descrito inclui cada um destes parâmetros e pode ser estabelecida utilizando um sistema de bioreactor para permitir períodos mais longos de crescimento que são difíceis de conseguir utilizando cultura 3D sólido. Além disso, a perfusão de substitutos proporciona um maior grau de crescimento comparado com substitutos sólidos. Outra característica desta abordagem para a cultura in vitro é a flexibilidade nos tipos de análises que podem ser realizadas usando os substitutos &quot;tecidos&quot;. Uma variedade de pontos de extremidade pode ser monitorizado durante a cultura indirectamente através da avaliação do meio condicionado, ou perfusato, para produtos solúveis (por exemplo, LDH como um indicador da morte celular, as proteínas secretadas ou metabolitos específicos como um indicadou da função fenotípica apropriado) ou através da utilização de imagem não invasivo de células fluorescentes ou luminescently marcadas para avaliar o crescimento e surrogate arquitetura horas extras. Após o crescimento, a ECM pode ser digerido utilizando uma protease de ECM e as células podem ser isoladas e utilizadas para análise ou mais experiências adicionais, tais como citometria de fluxo de quantificação 33. Os lisados ​​das células removidas do ECM também pode ser avaliada genomicamente, ao nível do transcrito de ARNm, ou para a expressão da proteína. Alternativamente, os terminais pode ser medido diretamente dos substitutos &quot;tecidos&quot; fixo e processados ​​após o experimento concluiu. Estes incluem uma variedade de parâmetros morfológicos (por exemplo, a morfologia nuclear / célula e o grau de agregação de células) em secções de H @ E-coradas histológicos e outras análises moleculares realizados em secções histológicas utilizando imuno-histoquímica (por exemplo, expressão de Ki-67 como indicador de célula proliferação) ou emhibridação in situ (por exemplo., a expressão de ARN de produtos de genes específicos). É também possível executar análises moleculares adicionais, tais como em tempo real, PCR quantitativo ou próxima geração de sequenciação, sobre estas, substitutos embebidos em parafina fixados com formalina; No entanto, devido à ligação cruzada molecular induzida por fixação e processamento, substitutos snap-congelados são preferidos para estes tipos de análises. Tais avaliações moleculares e morfológicas podem fornecer informações valiosas sobre o crescimento celular, a morte ou a resposta ao tratamento farmacológico durante todo o crescimento, bem como seguir cultura. A principal vantagem da utilização do programa CellProfiler para quantificação semi-automatizado de a densidade de células nucleadas presentes em cortes histológicos de substitutos é a economia de tempo que ela oferece. Embora a quantidade total de tempo necessário por substituto é variável e depende em grande parte do tamanho dos substitutos e o número de imagens adquiridas, é Estiacasaladas que chegam a uma densidade de células a partir das imagens de substituição requer 4-5 horas de mãos no tempo por substituto ao contar manualmente contra meia hora por substituto quando se utiliza o programa CellProfiler. A maioria das análises CellProfiler hands-on-time usando é atribuída à medição da área substituto no ImageJ. O programa CellProfiler requer tempo para processar automaticamente as imagens, mas não exige hands-on tempo do investigador e não importando as imagens. Há limitações dos métodos e das culturas substitutas 3D descritos aqui. Como mostrado na Figura 12, a utilização do sistema de bioreactor de perfusão proporcionado um maior grau de crescimento de culturas sólidas, em que a acumulação de células e a taxa de proliferação é consideravelmente mais lenta. Embora o sistema de bioreactor de perfusão utilizado aqui fornecida uma vantagem de crescimento, sistemas de perfusão também pode ter as suas próprias limitações. Por exemplo, é PDMSmuitas vezes utilizado no fabrico de biorreactores, devido à sua facilidade de utilização, propriedades inertes, e reprodutibilidade. No entanto, este material é conhecido para absorver moléculas hidrofóbicas a partir de meios de cultura de células e pode levar até fármacos lipofílicos 34-36. Enquanto que outros materiais podem ser usados ​​em vez de PDMS se essas limitações são uma preocupação, outros materiais disponíveis Também têm as suas próprias desvantagens que devem ser considerados. Porque a análise CellProfiler está dependente da entrada de parâmetros para o diâmetro e circularidade dos núcleos, a optimização destas entradas para cada tipo de substituto / célula pode ser necessária. É também digno de nota que a medida de densidade de celular aqui apresentada não é uma medida direta da viabilidade celular é. Foi previamente observado que uma medição directa da viabilidade celular é difícil em sistemas de cultura de 37 em 3D. No entanto, a degradação nuclear é uma parte de ambos apoptose e necrose, as duas predominam formas de morte celular. Na apoptose, os fragmentos de núcleo, umaprocesso chamado cariorrexe, após a condensação da cromatina, ou picnose 38,39. Isto difere da necrose, onde as ondas de células moribundas causando a ruptura da membrana celular e para libertar os conteúdos do seu citoplasma. Histologicamente, a necrose é caracterizada por cariólise (isto é, a dissolução de um núcleo), seguido por picnose e cariorrexe 40. Os núcleos que foram submetidos a estas alterações podem ser vistas em secções histológicas de H &amp; E-coradas mas não irá ser reconhecido como núcleos intactos por o programa CellProfiler. Estas alterações nucleares ocorrem relativamente tarde no processo de morte celular no entanto. Portanto, a quantificação do número de células nucleadas por área podem incluir células que estão nos estádios iniciais de morte celular, mas, no entanto, irá fornecer informação útil sobre a viabilidade das células no momento da fixação substituto. Outros métodos que poderiam ser utilizados para indicar a viabilidade ou crescimento incluem análises de perfusatos (por exemplo, azul de Alamar ou ensaios de LDH) OR avaliação da proliferação nas &quot;tecidos&quot; substitutos (por exemplo, através de Ki-67 rotulagem por imuno-histoquímica). etapas críticas do protocolo para a instalação substituto incluem ECM polimerização, onde a temperatura, pH, e de todos os tempos devem ser monitorados para garantir a polimerização completa antes de banhar o substituto no meio. Além disso, mantendo-se a mistura de células + ECM em gelo antes da cultura em placas com uma câmara de corrediça 8 poços de injecção ou num sistema de biorreactor é fundamental para prevenir a polimerização prematura. Além disso para evitar a polimerização durante a configuração de substituição, o bicarbonato de sódio usado para aumentar o pH a 7, deve ser adicionado à mistura anterior. Finalmente, deve ser dado tempo de incubação adequado, a 37 ° C para assegurar a polimerização completa do ECM; 45 minutos revelou-se suficiente. Outro factor importante na preparação de substituto é evitar a formação de bolhas. Em ambos os sistemas sólidos e perfundidos, o melhor é evitar a formação de bubbles na mistura de células + ECM a não criar um bloco para o fluxo de nutrientes durante a cultura. É também importante para evitar bolhas de ar durante a introdução do meio no sistema de perfusão onde uma bolha pode funcionar como uma embolia de ar, bloqueando o fluxo de meio. fixação adequada é importante para a análise a jusante; por conseguinte, a atenção para fixação padronizada e consistente (incluindo o tipo de fixação e a quantidade de tempo em fixador) e o processamento é necessário obter resultados replicativas. A duração eo tipo de fixação é menos de um problema para a coloração H &amp; E descrito aqui, mas esses parâmetros podem afetar outros tipos de análise molecular dos substitutos. Isto é porque a fixação da formalina, em particular, faz com que a ligação cruzada de moléculas, incluindo proteínas, ADN, ARN e de uma maneira um tanto dependente do tempo e específica molécula-41,42. Isto é de particular importância na análise imuno-histoquímica, quando o reconhecimento do anticorpo pode ser hinrado pelo cross-linking.

Três modelos tridimensionais de cultura (3D) que simulam de forma mais precisa a arquitectura do tumor e microambiente in vivo são importantes para estudos destinados a dissecar as interacções complexas entre as células e o seu microambiente e para testar a eficácia de terapias candidatos. Tumor impactos dimensionalidade oxigênio e gradientes de nutrientes, a uniformidade da exposição à droga, fluxo de pressão / sangue intersticial, e arquitetura 3D 1-4. A presença de um micro-ambiente apropriado estromal contribui para dimensionalidade do tumor e influências de sinalização célula-ECM e sinalização parácrina entre as células do estroma e as células epiteliais malignas. Os efeitos da dimensionalidade do tumor e do microambiente em função celular estão bem estabelecidos, com ambos os fatores que alteram a resposta à droga 1,3,5-8. Além disso, cinética celular de crescimento, as taxas metabólicas e sinalização celular diferem entre duas culturas e da cultura dimensões (2D) em 3D, com esses fatores affecting resposta celular 1,3,8-10. In vitro, o microambiente tumoral substituto pode ser modulada através da inclusão de componentes ECM representativos e populações de células do estroma. Células epiteliais malignas são influenciados pela ECM e as células do estroma associadas a cancro, quer de uma forma sinergética / protector para promover a progressão do tumor ou de uma forma supressiva para inibir ainda mais 5,6,10 propagação do tumor. Em qualquer contexto, o estroma podem afectar a resposta terapêutica e a entrega de drogas através da sinalização parácrina e / ou pelo aumento da pressão intersticial no tumor, resultando em diminuição de administração de fármaco de 1,6. Portanto, a adição de ECM e células estromais em modelos pré-clínicos irão ajudar recapitular aspectos do tumor que não pode ser modelado bem em cultura 2D. Aqui um método para estabelecer substitutos de cancro da mama que incorporam um microambiente recapitulativo, incluindo os constituintes da MEC e stromal células, num volume 3D é descrito. No carcinoma da mama, a população de células de estroma é predominantemente composta de cancro associado fibroblastos (CAF) e a ECM de estroma é em grande medida constituído por colagénio do tipo I com uma proporção menor de componentes de matriz que são encontrados na membrana basal, incluindo laminina e colagénio de tipo IV 1,4,11-13. Portanto, estes componentes do microambiente do carcinoma da mama (isto é, CAF, colagénio I, e membrana basal) foram incorporados nos substitutos. Este método pode ser usado para gerar sólido, un substitutos 3D-perfundido (Figura 1A) ou pode ser adaptado para incluir a perfusão do meio através do substituto através de um sistema de bioreactor (Figura 1B). Ambas as abordagens são descritos aqui. Este método também pode ser modificada para incluir outros elementos estromais, tais como macrófagos associados a tumores, ou para modelar outros tumores sólidos, ajustando os componentes celulares e de ECM, como apropriado. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Para o substituto carcinoma da mama descrito aqui, nós utilizamos o MDA-MB-231 (231) linha de células de cancro da mama, CAF previamente isoladas de carcinoma da mama humano 14, e um ECM composto por 90% de colágeno I ( material de 6 mg / ml) e 10% de factor de crescimento reduzida membrana basal (BM). O substituto é ou cultivados numa corrediça de 8 poços câmara (substituto sólido) ou um sistema de bioreactor é utilizado para fornecer nutrientes a perfusão contínua (substituto perfundido). Qualquer sistema de bioreactor de perfusão que podem acomodar um volume de células contendo ECM pode ser utilizado 15. Como exemplo, descreve-se a preparação dos substitutos de tecido no nosso sistema de biorreactor. Este sistema foi desenvolvido in-house e não está comercialmente disponível. Porque o nosso foco aqui é sobre a preparação e análise dos substitutos de tecido 3D, não ter ido para muitos detalhes sobre as especificidades de fabrico e montagem do nosso sistema biorreator. No entanto, uma descrição detalhada deeste sistema e seu desenvolvimento foi publicada em 16. Neste sistema biorreactor, um canal de fluxo de polidimetilsiloxano (PDMS) é utilizada para alojar o substituto, que é suportado por uma espuma de PDMS (formado usando métodos semelhantes aos descritos por Calcagnile et ai. 17). Este volume é penetrada por 4 microcanais (cada 400 um de diâmetro), que são continuamente perfundidas por meio de uma bomba através de microphysiologic para fornecer oxigénio e nutrientes para o substituto. análise adequada dos substitutos é crucial para obter informações pertinentes sobre a função celular em resposta ao tratamento ou outras manipulações. Substitutos pode ser analisado por diversos métodos, incluindo a imagiologia directa de substitutos intactas através de microscopia confocal ou outros meios de imagem não invasiva, a análise celular indirecta por análise do meio condicionado, ou perfusato, para produtos segregados, ou a análise de secções histológicas após a sua fixação e de processamento paraparafina. Um tal parâmetro que pode ser avaliada em secções histológicas é a densidade celular. Apresenta-se uma abordagem para medir a densidade celular (isto é, o número de células nucleadas por área de secção), utilizando técnicas de processamento de imagem semi-automatizados aplicados a fotomicrografias de secções histológicas coradas substitutos com hematoxilina e eosina (H &amp; E). A densidade celular pode ser usada como um indicador da mudança relativa no número de células ao longo do tempo ou que resulta de condições de crescimento diferentes e tratamentos. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54004/54004fig1.jpg" /> Figura 1. de volume 3D e sistema de biorreactor. A) Representação esquemática do processo para gerar substitutos 3D sólidos. Top: desenhos animados de volume 3D sólida contendo ECM (rosa), células de carcinoma epitelial (amarelo) e CAF (laranja); Resumindo:. Vista superior de 8 poços de slides câmara contendo substitutos B) Esquema do processo para gerar perfusão substitutos 3D. Top: cartoon de volume 3D com canais para permitir a perfusão médio e contendo ECM (rosa), células de carcinoma epitelial (amarelo) e CAF (laranja); Meio: imagem do canal de fluxo de PDMS contendo PDMS espuma (seta preta) a ser injectado com células + ECM e penetrada por fios de aço inoxidável revestidos com polímero (seta rosa) de medição de 400 um de diâmetro; Parte inferior:. Imagem do canal de fluxo de PDMS contendo um substituto e ligados ao sistema de bioreactor de perfusão para permitir o meio contínuo (bomba peristáltica e reservatório de meios não mostrados) C) Imagens de passos de processamento para ambos os substitutos sólidos e perfusados ​​após cultura. À esquerda: imagem do cryomold contendo amostra de processamento de gel e surrogate; Médio: imagem de um bloco de parafina contendo um substituto fixo e processados; Direita:. Imagem de uma lâmina de vidro com uma secção histológica H &amp; E-manchado de um substituto <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54004/54004fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma</a>versão maior desta figura.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagel Medium 1x (DMEM)</td><td>Corning CellGro</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin + 2.21&amp;nbsp;mM EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture plates, 100&amp;nbsp;mm</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229620</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Tissue Culture plates, 35&amp;nbsp;mm</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229638</td><td>For PDMS foam formation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>9&quot; Glass pipette</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>13-678-20D</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>10 ml pipette</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229210B</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>1,000 &amp;micro;l piptette tips</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-166</td><td>Sterile Filtered</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l pipette tips</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-141</td><td>Sterile Filtered</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;l pipette tips</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-158</td><td>Sterile Filtered</td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229410</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229422</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td>FisherBrand</td><td>05-408-129</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>24236-10</td><td>PDMS elastomer and curing agent. Used for our in-house bioreactor.</td></tr><tr><td>PDMS Foam</td><td></td><td></td><td>Made in-house for use in our in-house bioreactor.</td></tr><tr><td>High Concentration Bovine Collagen Type I</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5133-A</td><td>FibriCol ~10 mg/ml</td></tr><tr><td>Growth Factor Reduced Matrigel (Basement Membrane)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Basement membrane material</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Biology Grade Water</td><td>Fisher</td><td>BP2819-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 10x&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2429</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chamber Slide System&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>177402</td><td>8-well</td></tr><tr><td>Bioreactor</td><td></td><td></td><td>Made in-house.</td></tr><tr><td>Spring-Back 304 Stainless Steel&amp;mdash;Coated with PTFE polymer</td><td>McMaster-Carr</td><td>1749T19</td><td>Stainless steel wires to generate microchannels in our in-house&amp;nbsp; bioreactor system. 0.016&quot; Diameter</td></tr><tr><td>BioPharm Plus platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14</td><td>Masterflex</td><td>EW-96440-14</td><td>For use in our in-house bioreactor system. Tubing ID: 1.6 mm, Hose barb size: 1/16 in.</td></tr><tr><td>2-Stop Tubing Sets, non-flared PVC, 1.52&amp;nbsp;mm ID</td><td>Cole-Parmer&amp;nbsp;</td><td>EW-74906-36</td><td>For use in our in-house bioreactor system (with microperistalitic pump).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Six Channel precision micro peristaltic pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-74906-04</td><td>For use with our in-house bioreactor system</td></tr><tr><td>Tuberculin Syringes</td><td>BD Medical</td><td>309625</td><td>26 gauge 3/8 in. needle; Sterile</td></tr><tr><td>Dissecting Tissue Forceps</td><td>FisherBrand</td><td>13-812-36</td><td>5.5 inch</td></tr><tr><td>Mini Tube Rotator</td><td>Boekel Scientific</td><td>260750</td><td>Equipment option for surrogate rotation. Used with carousel for 50 ml tubes (model number 260753)</td></tr><tr><td>50 ml tube carousel</td><td>Boekel Scientific</td><td>260753</td><td>Used with mini tube rotator</td></tr><tr><td>Bambino&amp;nbsp; Hybridization Oven</td><td>Boekel Scientific</td><td>230301</td><td>Equipment option for surrogate rotation</td></tr><tr><td>HistoGel Specimen Processing Gel</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>Specimen Processing Gel described in Step 5.2</td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Andwin Scientific</td><td>4566</td><td>15 mm x 15 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Tissue Marking Dye</td><td>Cancer Diagnostics, inc.&amp;nbsp;</td><td>03000P</td><td>Can be used to mark surrogates,&amp;nbsp; allowing multiple samples to be included in one tissue cassette&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hinged tissue cassettes&amp;nbsp;</td><td>FisherBrand</td><td>22-272-416</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Fisher</td><td>23-245-685</td><td></td></tr><tr><td>GoldSeal Plain Glass Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>3048-002</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof (100%), USP</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2805M</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7211</td><td></td></tr><tr><td>Clarifier</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7401</td><td></td></tr><tr><td>Bluing Solution</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7301</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL mounting media</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>83124</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and analysis of in vitro three dimensional breast carcinoma surrogates

Três cultura tridimensional (3D) é um método mais fisiologicamente relevante para modelar o comportamento de células in vitro do que dois cultura tridimensional. Carcinomas, incluindo carcinomas da mama, são tecidos complexos 3D compostas por células epiteliais de cancro e componentes do estroma, incluindo fibroblastos e matriz extracelular (ECM). No entanto, a maioria dos modelos in vitro de carcinoma da mama consistir apenas de células epiteliais de cancro, omitindo o estroma e, por conseguinte, a arquitectura 3D de um tumor in vivo. modelagem 3D apropriado de carcinoma é importante para a exata compreensão da biologia do tumor, comportamento e resposta à terapia. No entanto, a duração da cultura e o volume de modelos 3D é limitado pela disponibilidade de nutrientes e de oxigénio dentro da cultura. Aqui, demonstramos um método em que as células de carcinoma da mama epiteliais e de fibroblastos do estroma são incorporados ECM para gerar um substituto do cancro da mama em 3D que inclui estroma e podem ser cultivadas como umestrutura 3D sólido ou utilizando um sistema de bioreactor de perfusão para fornecer oxigénio e nutrientes. Seguinte configuração e um período de crescimento inicial, substitutos podem ser usados ​​para testes de drogas pré-clínicos. Alternativamente, os componentes celulares e da matriz de o substituto pode ser modificado para abordar uma variedade de questões biológicas. Após cultura, substitutos são fixadas e processadas de parafina, de uma maneira semelhante ao tratamento dos espécimes de carcinoma da mama clínica, para a avaliação dos parâmetros de interesse. A avaliação de um tal parâmetro, a densidade de células presentes, é explicada, em que os sistemas de software de análise de imagem e ImageJ CellProfiler são aplicados a fotomicrografias de secções histológicas de substitutos para quantificar o número de células nucleadas por área. Isto pode ser utilizado como um indicador da mudança no número de células ao longo do tempo ou a mudança no número de células, resultante de condições de crescimento diferentes e tratamentos.

Ambos substitutos do cancro da mama 3D sólidos e perfundidos foram preparados como descrito acima e cultivados durante 7 dias. Subsequentemente, substitutos foram fixadas, processadas a parafina, seccionados e corados com hematoxilina e eosina, como descrito acima. O número de células nucleadas por área (231 células e a CAF) de cada substituto foi medida. Como pode ser visto na Figura 12, as fotomicrografias representativas das secções de H @ E-coradas demonstrar uma concentração mais elevada de células presentes nos substitutos perfundidos (Figura 12A) em comparação com os substitutos de sólidos (Figura 12B), mesmo que a densidade de células inicialmente incorporada os substitutos foi o mesmo em ambas as condições de sólidos e perfundidos. Esta representação visual do crescimento celular é suportado por um número médio mais alto de células por área (densidade) nas substitutos perfundidos (n = 3) em comparação com os substitutos de sólidos (n = 3), como determinado por Tele CellProfiler análise (figura 12C). Para obter os dados da Figura 12C, uma vista em corte histológico completa de cada substituto foi representada por imagem, sendo necessárias múltiplas imagens para cada substituto, e as imagens foram analisadas como descrito acima. Em seguida, o número total de núcleos para cada substituto foi dividida pela área total do substituto (expresso como o número de núcleos / 1 x 10 6 2 pixels), proporcionando uma densidade celular para cada substituto. Para validar o uso de CellProfiler para a quantificação de células nucleadas, os resultados obtidos utilizando o programa CellProfiler foram comparados com os obtidos por simples contagem manual o número de células presentes por área em cada uma das 6 substitutos (Tabela 3). A densidade de células de cada substituto foi calculada como descrito acima. Nenhuma diferença significativa foi encontrada nas densidades celulares obtidos por contagem manual e análise CellProfiler tanto para substitutos perfundidos (p = 0,855) ou substitutos sólidos (<html> p = 0,553). Para apoiar que a diferença na densidade de células entre os substitutos sólidos e perfundidos correlaciona-se com uma diferença no crescimento celular, proliferação de células de cada substituto foi avaliada através de análise imuno-histoquímica de Ki-67 rotulagem (Figura 12D) 27. A mesma tendência foi encontrada, com uma percentagem significativamente mais elevada de células de proliferação nas substitutos perfundidos (n = 3) em comparação com os substitutos de sólidos (n = 3), o que indica uma taxa de crescimento mais elevada nos substitutos perfundidos e correlacionando-se com o aumento da densidade celular destes substitutos. Enquanto o tipo de célula (isto é, cancro da mama epitelial ou CAF) não foi avaliada no estas medições, a imunocoloração para os marcadores específicos do tipo de célula pode ser utilizada para compreender melhor o crescimento ou a distribuição de uma população de células específico. Protocolos detalhando este processo foram previamente publicados 25,28. <html> les / ftp_upload / 54004 / 54004fig12.jpg &quot;/&gt; Figura 12. Os resultados representativos. A) Imagem representativa de uma secção H @ E-coradas a partir de um substituto perfundido cultivadas durante 7 dias (400X ampliação original). B) Imagem representativa de uma secção H @ E-coradas a partir de um substituto sólido cultivados durante 7 dias com meio mudado a cada 2 dias (400X ampliação original). C) a comparação do número médio de células nucleadas por área, ou a densidade de células, após 7 dias de crescimento substitutos perfundidos (sem mudança de meio) e sólidos (meio mudado a cada 2 dias). D) Comparação de Ki 67 o índice de marcação (ou seja, a percentagem de células numa população que expresse Ki-67), uma medida da proliferação de células, após 7 dias de crescimento substitutos perfundidos e sólidos. Os dados representam a média ± SEM, n = 3 para cada condição, ** indica p≤0.01 e *** indica p≤0.001 (teste t de Student).tp_upload / 54004 / 54004fig12highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Experimentar </td><td> CellProfiler: nucleadas células por área </td><td> Manuais: nucleadas células por área </td><td> CellProfiler média </td><td> manual de média </td><td> Valor P (t não pareado Test) </td></tr><tr><td> Perfusão Surrogate 1 </td><td> 88,178 </td><td> 75,532 </td><td> 97,225 </td><td> 99,901 </td><td> 0,855 </td></tr><tr><td> Perfusão Surrogate 2 </td><td> 107,528 </td><td> 117,812 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Perfusão Surrogate 3 </td><td> 95,967 </td><td> 106,359 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> SOlid Surrogate 1 </td><td> 19,797 </td><td> 17,480 </td><td> 16,491 </td><td> 12,991 </td><td> 0,553 </td></tr><tr><td> Surrogate Solid 2 </td><td> 8,612 </td><td> 5.650 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Surrogate Solid 3 </td><td> 21,065 </td><td> 15,844 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 3. As densidades celulares obtidos pela análise manual ou CellProfiler por 3 sólida e 3 substitutos perfundido.

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Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

Elaboração e análise de<em&gt; In Vitro</em&gt; Três mama Dimensional Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

preparation-analysis-vitro-three-dimensional-breast-carcinoma

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

10.6K visualizações.  University of Alabama at Birmingham. We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

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Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Estudando o câncer de mama triplo negativo usando modelo de câncer de mama ortotópico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Pesquisa do câncer

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred to as patient-derived organoids (PDO), are an invaluable resource for studying the mechanism of tumorigenesis and metastasis of prostate cancer. Their main advantage is that they maintain the distinctive genomic and functional heterogeneity of the original tissue compared to conventional cell lines that do not. Furthermore, 3D cultures of PDO can be used to predict the effects of drug treatment on individual patients and are a step towards personalized medicine. Despite these advantages, few groups routinely use this method in part because of the extensive optimization of PDO culture conditions that may be required for different patient samples. We previously demonstrated that our prostate cancer bone metastasis PDX model, PCSD1, recapitulated the resistance of the donor patient&rsquo;s bone metastasis to anti-androgen therapy. We used PCSD1 3D organoids to characterize further the mechanisms of anti-androgen resistance. Following an overview of currently published studies of PDX and PDO models, we describe a step-by-step protocol for 3D culture of PDO using domed or floating basement membrane (e.g., Matrigel) spheres in optimized culture conditions. In vivo stitch imaging and cell processing for histology are also described. This protocol can be further optimized for other applications including western blot, co-culture, etc. and can be used to explore characteristics of 3D cultured PDO pertaining to drug resistance, tumorigenesis, metastasis and therapeutics.

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional cultures of patient BMPC specimens and xenografts of bone metastatic prostate cancer maintain the functional heterogeneity of their original tumors resulting in cysts, spheroids and complex, tumor-like organoids. This manuscript provides an optimization strategy and protocol for 3D culture of heterogeneous patient derived samples and their analysis using IFC.

Estabelecimento e Análise de Organoides Tridimensionais (3D) derivados de amostras de metástase óssea do câncer de próstata paciente e seus Xenoenxertos

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a complex three-dimensional (3D) microenvironment involving layers of cancerous and non-cancerous cells surrounded by an extracellular matrix (ECM). The ECM provides physical and biological support and contributes to disease progression, patient prognosis, and therapeutic response.
This paper describes a protocol for assembling a 3D scaffold-based system to mimic the neuroblastoma microenvironment using neuroblastoma cell lines and collagen-based scaffolds. The scaffolds are supplemented with either nanohydroxyapatite (nHA) or glycosaminoglycans (GAGs), naturally found at high concentrations in the bone and bone marrow, the most common metastatic sites of neuroblastoma. The 3D porous structure of these scaffolds allows neuroblastoma cell attachment, proliferation and migration, and the formation of cell clusters. In this 3D matrix, the cell response to therapeutics is more reflective of the in vivo situation.
The scaffold-based culture system can maintain higher cell densities than conventional two-dimensional (2D) cell culture. Therefore, optimization protocols for initial seeding cell numbers are dependent on the desired experimental timeframes. The model is monitored by assessing cell growth via DNA quantification, cell viability via metabolic assays, and cell distribution within the scaffolds via histological staining.
This model&#39;s applications include the assessment of gene and protein expression profiles as well as cytotoxicity testing using conventional drugs and miRNAs. The 3D culture system allows for the precise manipulation of cell and ECM components, creating an environment more physiologically similar to native tumor tissue. Therefore, this 3D in vitro model will advance the understanding of the disease pathogenesis and improve the correlation between results obtained in vitro, in vivo in&#160;animal models, and human subjects.

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

This paper lists the steps required to seed neuroblastoma cell lines on previously described three-dimensional collagen-based scaffolds, maintain cell growth for a predetermined timeframe, and retrieve scaffolds for several cell growth and cell behavior analyses and downstream applications, adaptable to satisfy a range of experimental aims.

Modelo Biomimético Tridimensional In Vitro de Neuroblastoma Utilizando Arcabouços à Base de Colágeno

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Eferóides de células epiteliais e endoteliais como um modelo in vitro potencial funcional para pesquisa de câncer de mama

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantificação de cancro da mama invasiva das células usando um modelo (3D) tridimensional

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Medicina

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

Métodos para a cultura fémur humano explantes de tecido para o Estudo de Câncer de Mama Colonização celular do Niche metastático

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later distally, is a major factor in patient prognosis. Experimental systems of breast cancer rely on cell lines usually derived from primary tumours or pleural effusions. Two major obstacles hinder this research: (i) some known sub-types of breast cancers (notably poor prognosis luminal B tumours) are not represented within current line collections; (ii) the influence of the tumour microenvironment is not usually taken into account.
We demonstrate a technique to culture primary breast cancer specimens of all sub-types. This is achieved by using three-dimensional (3D) culture system in which small pieces of tumour are embedded in soft rat collagen I cushions. Within 2-3 weeks, the tumour cells spread into the collagen and form various structures similar to those observed in human tumours1. Viable adipocytes, epithelial cells and fibroblasts within the original core were evident on histology. Malignant epithelial cells with squamoid morphology were demonstrated invading into the surrounding collagen. Nuclear pleomorphism was evident within these cells, along with mitotic figures and apoptotic bodies.
We have employed Optical Projection Tomography (OPT), a 3D imaging technology, in order to quantify the extent of tumour spread in culture. We have used OPT to measure the bulk volume of the tumour culture, a parameter routinely measured during the neo-adjuvant treatment of breast cancer patients to assess response to drug therapy. 
Here, we present an opportunity to culture human breast tumours without sub-type bias and quantify the spread of those ex vivo. This method could be used in the future to quantify drug sensitivity in original tumour. This may provide a more predictive model than currently used cell lines.

We have developed a collagen-based in vitro assay which promotes proliferation and invasion from samples of all breast cancer subtypes. Optical Projection Tomography, a three dimensional microscopy technique was utilised to visualise and quantify tumour expansion. This assay may be used to quantify drug response of individual tumour samples.

Longo prazo Cultura de Amostras de mama Humano do Câncer e sua análise por meio de tomografia óptica de Projeção

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Biologia

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Tridimensional Cultura Ensaio para Explorar Cancer Invasividade celular e formação de tumor Satélite

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

Elaboração e análise de

Resumo

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