Name: through the looking glass: time-lapse microscopy and longitudinal tracking of single cells to study anti-cancer therapeutics
Uploaded: 2016-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics at JoVE.com

We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and &#946;-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).

O protocolo seguinte utiliza parâmetros definidos pelas experiências nas Figuras 4 e 6 com respeito às definições de aquisição e condições experimentais. Muitos destes parâmetros pode ser modificado para caber outras experiências (isto é, os tempos de exposição, binning, canais fluorescentes, etc.). Todos os procedimentos devem aderir às diretrizes e regulamentos institucionais e ser aprovado pela comissão de biossegurança institucional. Web site do fabricante de microscópio contém excelentes informações para imagens de células vivas. 1. Microscópios e Software Imaging <ol><li> Execute imagens de células vivas em uma ampla variedade de microscópios invertidos. Os microscópios mais comuns são widefield epifluorescência e confocal girando-disco. Aqui, usar um microscópio automatizado e motorizado widefield epifluorescência, com fonte de luz de iodetos metálicos de 200 watt. </li><li> Obter um estágio-top ou um microscópio câmara ambiental. Aqui, usar uma etapa-tcâmara ambiental op. </li><li> Use um software comercial para operar microscópios com utilitários para executar a microscopia de lapso de tempo. </li><li> Use software disponível comercialmente ou ImageJ para análise de imagem. Muitas outras ferramentas de análise estão disponíveis comercialmente, e há programas feitos sob medida, muitos dos quais foram publicados 8,18. </li></ol> 2. A visualização de processos celulares e respostas fenotípicas <ol><li> Visualize as células com microscopia de campo claro. Diferencial de contraste de interferência e de contraste de fase por si só pode ser muito informativo para estudar as respostas para as respostas de drogas anti-cancro. Estes processos podem incluir a mitose, a motilidade celular e a apoptose. </li><li> Visualizar estruturas celulares, organelas e processos com biossensores fluorescentes. As sondas fluorescentes são informativos no rastreamento de processos subcelulares específicos. Estes podem incluir dinâmica dos microtúbulos, mitocondrial e da dinâmica do retículo endoplasmático, o acúmulo de proteína e localização, esinalização molecular (por ex., fosforilação, cálcio). </li></ol> 3. Preparação de Amostras <ol><li> Cultivar células em pratos de cultura de células certificados num padrão, incubadora humidificada de cultura de células (por exemplo, 37 ° C, 5% de CO2, 80% de humidade relativa). <ol><li> Cultivar células HT1080 em MEM com EBSS. Suplementar o meio com 10% v / v de FBS, 1% v / v de Pen / Strep a 1% v / v de piruvato de sódio e 1% v / v de aminoácidos não-essenciais. </li></ol></li><li> Dois dias antes da imagem, as células placa 50.000 HT1080 Fucci em 3 poços de uma de 12 poços prato fundo # 1.5 de vidro em uma capa de fluxo laminar estéril certificada. Ajustar o número de células plaqueadas para alcançar ~ 60% de confluência para o início da experiência. Dependendo da linha celular e a natureza da experiência a densidade celular pode ser menos. Nota: A densidade celular pode ter grande influência sobre o crescimento da linha celular e os resultados experimentais. Contagem de células para minimizar experimento-a-experimento variability devido à densidade. <ol><li> Dependendo da câmara ambiental e as condições necessárias para a experiência, as células em pratos de placas único poço (tipicamente 35- ou 60-mm), 4 bem placas de 35 mm, 6-, placas de cultura de células de 12 ou 24 cavidades, ou lamela slides em vários formatos. Utilize placas com fundo de vidro com vidro # 1.5 como a maioria das lentes objetivas são otimizados para esta espessura do vidro, e imagens através de plástico de cultura de células é muito pobre. Nota: Algumas linhas celulares não crescer e sobreviver em vidro. Nestes casos, o vidro pode ser revestido, a fim de melhorar a aderência das células (por ex., Poli-lisina ou colagénio). Algumas empresas fabricam plástico de cultura de células ópticas, é necessário determinar empiricamente se esta é uma opção viável. </li></ol></li></ol> 4. Câmara Ambiental Set-up <ol><li> Antes de qualquer experimentação, definir-se a câmara com ambiente de modo a que opera em ~ 80% de humidade e assim a temperatura à posição da amostra é de 37 ° C. A maioria das células cultivadas crescem em 5% de atmosfera de ar, CO 2 / equilíbrio devido ao tampão de bicarbonato de sódio no meio. Dependendo da configuração, defina o controlador ambiental a 5% de CO 2 e vai misturar 100% CO 2 com o ar, ou use pré-misturado, certificada 5% de CO 2 / balanço de gás de ar. Siga as instruções do fabricante para o gás de caudais. Nota: Alguns linhas de células crescer em meio de CO 2 -independente, caso em que pode ser mantido sem CO 2. meios de imagem concebidas especificamente está também disponível que limita a adição de compostos autofluorescentes. Crescimento em meios de teses para o tipo de célula desejado deve ser previamente determinada empiricamente. </li><li> Antes da imagem, certifique-se o reservatório de água está cheio (seguindo as instruções do fabricante) com água destilada estéril. Ligue a câmara ambiental para o ajuste de temperatura desejada e coloque-o na inserção palco microscópio. Para poupar gás, não ligue o fluxo neste momento. Nota: Se houver algum espaço livre entre a câmara de estágio-top e inserir estágio e / ou qualquer tensão em cabos de ligação para a câmara pode introduzir artefatos de movimento para o experimento. <ol><li> Coloque pedaços de filme de parafina sobre as bordas da abertura de inserção estágio antes de inserir a câmara para ela, para acoplar a câmara para o palco, e se certificar de que não há conexões estão puxando na câmara. </li></ol></li><li> Permitir que a câmara de equilibrar a 37 o C. Manter uma temperatura estável para evitar flutuações de temperatura durante o exame que pode afetar a fisiologia celular e introduzir deriva. Alcançar equilíbrio de temperatura geralmente requer de 30 min a 1 hora, dependendo do ambiente. <ol><li> Insira um prato &#39;fictício&#39; com água nos poços para a câmara durante o aquecimento. Um prato de imagem cheio com água imita a amostra, ajudando a garantir que a câmara seja suficientemente aquecido e estabilizada. Enchendo a câmara com água estéril pré-aquecidoreduz o tempo necessário à estabilização da temperatura e minimiza a queda de temperatura após a adição da amostra experimental. </li></ol></li></ol> 5. Microscópio Set-up <ol><li> Ligue o microscópio, computador associado, e todos os periféricos necessários. <ol><li> Dependendo da fonte de luz, espere para ligá-lo até que seja necessário (por exemplo., LED). </li></ol></li><li> Com o objectivo de torre numa posição baixa, seleccionar a 20X 0,7 NA objectivo de ser utilizada. </li><li> Coloque a amostra sobre o objetivo - o que irá torná-lo mais fácil de encontrar as células quando a amostra está na câmara. </li><li> Definir parâmetros de imagem neste momento, se eles são conhecidos a partir de experiências anteriores. </li></ol> 6. Transportando Células de microscópio e para a câmara <ol><li> Transportar as células a ser trabalhada a partir da incubadora para a câmara ambiental. Garantir que isso seja feito rapidamente para limitar os efeitos de um comparativamente baixo CO 2 </sub&gt; atmosfera e diminuição da temperatura sobre as células. Siga todas as normas de biossegurança institucionais para transporte de amostras e clean-up em caso de um derramamento. <ol><li> Coloque as células em um recipiente de isopor selada ou saco isolados para evitar grandes mudanças ambientais. </li></ol></li><li> Insira o prato imaging amostras para a câmara seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Depois que as células foram garantidos dentro da câmara ambiental, selar a câmara para manter um ambiente estável e desligue imediatamente a fonte (s) de gás atmosférico. <ol><li> Como algumas câmaras ambientais não utilizam uma tampa apertada, selado, para retardar a evaporação, a camada estéril, óleo mineral certificada-embrião no topo do meio de crescimento. Envolver a película de parafina gás permeante em torno do perímetro-bordas do prato de amostras tomando cuidado para não obstruir a área de imagem de vidro. , os métodos de humidificação secundárias localizadas podem ser empregues. A condensação na tampa do prato de amostras pode diminuir desemmance de microscopia de campo claro. </li></ol></li><li> A fim de minimizar os efeitos da deriva térmica mais cedo durante o experimento, espere 30 minutos antes de iniciar o lapso de tempo. O tempo necessário varia com base no tamanho do prato de imagens e de outros factores. Determinar empiricamente. </li></ol> 7. Configurando Imaging <ol><li> condições de imagem Seleccione que melhor representam os dados. Tomar precauções para evitar fototoxicidade, limitando o tempo de exposição, utilizando menor intensidade de luz e selecionando sondas que são excitados por longos comprimentos de onda da luz. </li><li> Definir X, Y e Z-plano e desejado comprimento de onda (s) para cada posição a ser trabalhada. A resolução de tempo é limitado pelo número de posições e comprimentos de onda. Para longo prazo de lapso de tempo da maioria dos processos celulares, adquire uma imagem a cada 10-20 min; maior resolução de tempo (intervalos curtos, por exemplo., 1 min) fornece mais pontos de dados de seguimento e de células, por conseguinte, mais robusta, mas também resulta em mais integradaexposição à luz e conjuntos de dados maiores. <ol><li> Como HT1080 FUCCI têm proteínas fluorescentes verde e vermelho dinâmicas (ver resultados representativos), use os seguintes tempos de exposição: FITC / GFP - 50 ms, Texas Red / TRITC - 40 ms, campo claro - 20 ms. Use uma lata de 2 x 2. </li></ol></li><li> Ativar a focagem automática controlada software usando os parâmetros padrão em Configurações avançadas. Definir um intervalo de focagem automática de 10 mm com o tamanho recomendado etapa. Certifique-se de fazer isso antes de iniciar o lapso de tempo. Autofoco com imagens de campo claro e nunca com fluorescência para reduzir fototoxicidade e fotodegradação. <ol><li> Utilizar sistemas de focagem automática de software controlado em qualquer microscópio com um palco motorizado, e concentrar-se directamente sobre a amostra. No entanto, eles podem limitar a velocidade de aquisição do experimento. Hardware controlado sistemas com foco contínuo funcionar bem para a microscopia de lapso de tempo e melhorar a velocidade, permitindo mais posições a ser trabalhada ou uma maior taxa de aquisição. No entanto, elesconfiar na detecção da interface ar-vidro e pode perder o foco da amostra com variações na espessura do vidro através do poço. </li></ol></li><li> Substituir metade da mídia com a mídia contendo a concentração da droga desejado que tenha sido aquecido a 37 o C. substituição da mídia parcial ajuda a reduzir a dispersão térmica. As condições deste experimento são Veículo (DMSO), 1 mM selinexor e 10 mM PD0332991. Nota: Esta etapa também pode ser feito depois de iniciar a aquisição, fazendo uma pausa e reiniciar o experimento. Isto permite o acompanhamento das respostas longitudinal pré e pós-droga de células individuais. Se a estabilidade da droga ou o metabolismo é uma preocupação, parando e substituindo os meios podem ser feitos com o mesmo método. Para testar a degradação ou metabolismo de drogas, meios de células tratadas podem também ser colocadas em células naive para testar a acção do fármaco. </li><li> Comece o lapso de tempo. </li><li> À medida que o lapso de tempo é executado, garantir que os campos fotografada permanecem no foco eo chamber mantém uma úmido 37 o C. <ol><li> Ajustar o foco, conforme necessário, fazendo uma pausa a aquisição durante o intervalo de tempo entre pontos de tempo. </li></ol></li><li> Se necessário, adicione água para a câmara durante as experiências mais longas. Evitar o arrefecimento da câmara através da adição de pré-aquecido, a água destilada estéril a 37 o C. </li></ol> 8. Acabar com a Time-lapse <ol><li> Quando o experimento foi executado para conclusão, parar a aquisição se não foi definido para parar automaticamente. </li><li> Certifique-se de que o lapso de tempo foi salva corretamente para o disco rígido, embora a maioria dos pacotes de software de salvar automaticamente durante a aquisição se não for concluído de forma adequada os dados podem ser perdidos. </li><li> Retire a câmara do microscópio e eliminar as células para resíduos com risco biológico seguindo procedimentos de biossegurança institucional aprovados. </li></ol> 9. Acompanhamento Longitudinal e Análise de Time-lapse de dados <ol><li> Escolha a metodologia de análise que éapropriado para o processo biológico de interesse. Muitos plugins para ImageJ, programas Matlab e plataformas personalizadas foram produzidas para aplicações específicas. A seguinte metodologia abrange acompanhamento dos núcleos e análise de sondas fluorescentes nucleares como demonstrado nas Figuras 4 e 5. </li><li> Abra as pilhas de imagens .tif para os canais utilizados em ImageJ. Alternativamente, arquivos nativos abertas a partir do programa de aquisição diretamente no ImageJ usando o plugin Bioformats. </li><li> Desenhe uma região de interesse (ROI) dentro do núcleo de uma célula usando a imagem de campo claro ou o canal rótulo nuclear (se utilizado) e adicioná-lo ao gerente do ROI. Nota: Se as células fotografadas tem uma etiqueta nuclear (por exemplo, a histona H2B-EGFP.), Seguida de seguimento automático de células pode ser utilizado para criar as regiões de interesse (ROI) que representa núcleos individuais ao longo do tempo. </li><li> Avance para o próximo ponto de tempo e posicione o ROI dentro do mesmo nucleus. Adicione o ROI com o gerente de ROI. </li><li> Continuar a controlar e fazer ROIs para a célula individual até que haja um evento celular (mitose, apoptose, etc.) Ou a célula já não podem ser rastreados (isto é., Move-se para fora da armação ou a experiência termina). </li><li> Quando ROIs foram estabelecidas para as células através do tempo eles estão no campo, sobrepô-las para os canais fluorescentes de interesse. Medir a intensidade média da fluorescência em cada canal para cada ponto de tempo. Salvar a lista de ROI para uso posterior. <ol><li> Várias medidas podem ser feitas dentro do ROI para aplicações em diferentes experimentos. Clique Análise → Definir Medidas ... para abrir um menu para escolher o método analítico (por exemplo., A intensidade dentro do ROI, intensidade integrada, etc dizer.). </li></ol></li><li> Nota destinos celulares de células individuais (eg., Apoptose, divisão, de sobrevivência), enquanto rastreamento. Isto permite a criação de curvas de sobrevivência e furtheanálise da população r. </li><li> Com a intensidade média para os dois canais, criar um gráfico de dispersão para exibir dinâmica do ciclo celular em resposta a agentes terapêuticos (Figura 5B, C). Nota: A parcela pode ser criado para células individuais ao longo do tempo ou, calculados sobre uma população de células controladas. imagiologia quantitativa pode ser crucial para o estabelecimento de respostas complexas e relações de células em resposta à terapêutica do cancro. Microscopia de lapso de tempo de longo prazo, o acompanhamento longitudinal e análise de dados é um processo multi-passo, com muitas opções para o tipo de ferramentas de microscopia e análise, e segue o contorno geral previsto na Figura 1. </li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Vantagens de Microscopia Time-lapse e Acompanhamento Longitudinal O microscópio é um instrumento ideal para os estudos longitudinais de resposta à droga, uma vez que permite aos investigadores para rastrear as células individuais e os seus destinos, bem como a totalidade da população. A variabilidade na resposta à droga dentro de uma população de células é uma questão importante para anti-câncer projeto terapêutico. acompanhamento longitudinal de células individuais permite aos investigadores para observar essa variabilidade e começar a entender os mecanismos subjacentes e as consequências no que se refere à população de células. Utilizando uma variedade de sondas fluorescentes proporciona uma infinidade de maneiras de observar e compreender ambos os fenótipos de resposta comuns e raras. O calendário ea contribuição de diferentes destinos celulares à resposta da população, as relações entre os fenótipos e destinos específicos, e diferenças na resposta entre linhas celulares ou o estado após tratamento são exemplos do que pode ser aprendido. Muitos processos relacionados com o cancro pode ser estudada. Alguns que não são destacados neste artigo incluem a morte celular com apoptose, autofagia, e os repórteres de necrose 39-42, invasão celular 43,44, ea dinâmica de p53 que determinam as decisões do destino da célula 27. Além disso, esta abordagem não é limitado a estudos em estudos terapêuticos anti-cancro. Os mesmos princípios podem ser usadas para estudar muitos outros processos biológicos, incluindo a mitose 45 a dinâmica do citoesqueleto intracelular e 46,47 sinalização 48. microscopia de fluorescência de lapso de tempo também pode fornecer localização e intensidade de dados de proteínas e moléculas de interesse. Não só estão as mudanças no nível de proteína importante para a resposta à droga, mas a localização correcta (ou inadequada) de proteínas dentro da célula é fundamental para compreensão resposta. Microscopia de lapso de tempo fornece dados sobre onde as proteínas são localizadas (por exemplo., Núcleo, citoplasma, organelas específicas,etc.) após o tratamento de drogas e como a localização e os níveis totais de mudar ao longo do tempo em um único nível celular e população. Desafios e Limitações Apesar dos pontos fortes da microscopia de lapso de tempo e análise longitudinal de células individuais, existem limitações. repórteres fluorescência estão limitadas pela sua estabilidade e especificidade. Ao conceber proteínas de fusão fluorescentes, é importante escolher uma sonda que é foto-estável e brilhante, mas é também necessário considerar os efeitos da marcação fluorescente está ligado à proteína de interesse relativamente à sua função normal e capacidade de localizar adequadamente . Estas questões foram discutidas em detalhe em outro lugar e há muitas proteínas fluorescentes etiquetadas disponíveis que foram publicados 15,49,50. Outros marcadores fluorescentes ou marcadores podem ser adicionados às células, e deve ser tomado cuidado para assegurar que não são tóxicos. Em nossa experiência, estes pmantos, por exemplo, etiquetas mitocondriais (potencial de membrana) ou célula permeável corantes de ADN, tendem a branquear mais fácil e vai ser diluída-se devido à proliferação celular. Além disso, existem muitos desafios técnicos com crescente e observar as células em um microscópio. Instabilidade com relação a temperatura, a humidade, atmosfera e luz vai ter grandes efeitos sobre as células, resultando em perda de dados ou até mesmo todo o experimento. Estabilidade questões quanto à captura de imagem pode ser visto em filmes 1 e 2. Este efeito pode ser minimizado através da utilização de uma película de parafina (ver 4.2). Há também algoritmos de estabilização de imagem disponíveis para o processamento pós-aquisição, por exemplo usando ImageJ (NIH). Um aspecto de longo prazo de lapso de tempo que é frequentemente esquecido é a gestão de dados e tamanho do arquivo. Mesmo quando o binning de dados, numa única experiência de lapso de tempo é muitas vezes em excesso de 30 gigabytes. Alta capacidade, de alta velocidade, armazenamento de dados confiável e de transferência são fortesly incentivada. Dependendo do biossensor fluorescente (s) a ser trabalhada, muitas vezes não é necessária a aquisição de imagens de resolução completa, por exemplo nucleares ou citoplasmáticas sensores. Recomendamos sempre que possível, tomar medidas para manter arquivos pequenos, resultando em mais fácil trabalhar com dados, as necessidades de computação menos exigentes, e melhorou o fluxo de trabalho. Fototoxicidade é uma grande preocupação quando se realiza a microscopia de lapso de tempo a longo prazo. Luz de alta intensidade e exposições longas podem levar à fotodegradação de sondas fluorescentes, estresse celular e morte celular. Estes efeitos podem ter grandes efeitos sobre os dados e levar a deturpação do experimento. arrumação de câmara e o ganho pode ser utilizado para reduzir os tempos de exposição. Os filtros de densidade neutra no caminho da luz reduzir a intensidade da luz na amostra. Os comprimentos de onda da luz usada para a imagem também afetará as células. comprimentos de onda mais curtos (UV, perto UV) são mais prejudiciais para as células e resultar em foto-branqueamento em taxas mais rápidas do quecomprimentos de onda mais longos (por ex., vermelho, vermelho longínquo). Escolha de objetivo também pode afetar as condições de imagem. abertura numérica (NA) lentes maiores produzem imagens de alta resolução, mas maior ampliação permite que menos luz a ser transmitida a partir da amostra, resultando em tempos de exposição mais elevados ou luz mais intensa. Um objetivo deve ser selecionado com um NA e ampliação apropriado que irá resolver o seu objeto de interesse, sem oversampling. Em muitos casos, o maior objectivo pode não ser a escolha mais adequada. Com sondas nucleares (Figuras 4, 5), uma objectiva de baixa ampliação permite um campo maior para ser capturado, de forma eficaz o aumento do tamanho da amostra, sem comprometer a resolução do objeto desejado. De longo prazo de lapso de tempo em três dimensões deve ser realizada com cautela, devido à exposição à luz integrada. Usando um disco giratório microscópio confocal, câmera sensíveis (eg., EM-CCD), ganho de câmera, e um motor piezo rápido para z-series é suggested para reduzir a exposição à luz. Rápida aquisição da série z também é importante para minimizar artefatos de movimento devido ao movimento e dinâmica celular que ocorrem durante o período de aquisição. análise empírica de células não tratadas usando várias configurações diferentes pode ser útil para determinar os efeitos de luz fluorescente em qualquer linha de células de dados ou repórter. Além disso, a ausência de tratamento devem ser incluídos em cada experiência para determinar os efeitos citotóxicos das condições experimentais. Variações da técnica De longo prazo de lapso de tempo é robusto e muito flexível. Usando técnicas de co-cultura, diferentes linhas celulares ou as mesmas linhas celulares que expressam diferentes repórteres pode ser usado. Um excelente exemplo disso é imagiologia células fagocíticas com células-alvo que estão morrendo em resposta a uma droga anti-câncer. Outro exemplo poderia ser a de estudar o impacto das células de responder em células naive drogas vizinho. Juntamente com foto-activateable, foto-conversível, e proteínas fluorescentes foto-comutável, e as proteínas modificadas que podem ser ativadas pela luz para desencadear efeitos específicos (por exemplo., KillerRed), há muitas possibilidades. Abordagens mais complexos podem ser usados ​​que empregam vários tipos especializados de microscopia, tais como a redistribuição de fluorescência após a fotodegradação, Förster transferência de energia de ressonância (FRET) e de super-resolução (por exemplo., Microscopia reconstrução óptico estocástica (TEMPESTADE), microscopia de iluminação estrutural (SIM), ou o esgotamento emissão estimulada (STED)), e muitos outros, e há vantagens e limitações de cada abordagem. Longo prazo (por exemplo., Semanas, meses) respostas e a recuperação de células após a retirada da droga é fundamental para compreender a ação de drogas anti-câncer. pratos com fundo de vidro em grade são uma ferramenta valiosa para monitorar as células ou regiões específicas dentro de uma população / área repetidamente. Por exemplo, com um prato em grade, o dr inicialresposta UG podem ser visualizados utilizando um lapso de tempo, a droga pode ser removida, e em áreas específicas da grelha pode ser trabalhada ao longo do tempo ou submetido a lapso de tempo adicional no momento desejado. O fundo de vidro sobre os pratos podem ser removidos por qualquer de corte com uma ferramenta de escriba ou utilizando um reagente comercial, e as células no vidro pode ser corada para outros marcadores de interesse, para a actividade β-galactocidase associada exemplo senescência, e em comparação com o lapso de tempo para entender a história de como as células atingiram este estado. Se a população de células é suficientemente grande, pode também ser submetida a imunotransf erência ou citometria de fluxo. amostras grossas têm sido tradicionalmente difíceis de imagem, por exemplo, esferóides de gel em vários materiais e matrizes. Mais recente aproxima incluindo confocal de fluorescência ou microscopia multi-fotão 16,18,19,51 pode ser usado para estender a abordagem para uma compreensão situ de como as células respondem à terapêutica anti-câncer. oestudos de si e um número crescente de cientistas usando lapso de tempo para estudar a resposta à droga anti-câncer 24,52-54 demonstram claramente que estamos nos movendo para o desenvolvimento de uma compreensão de farmacodinâmica de célula única que irá ajudar a melhorar a nossa capacidade de usar drogas anti-câncer de forma mais eficaz e talvez prever a resposta de drogas anti-câncer.

microscopia de células vivas e acompanhamento longitudinal de células individuais não é uma técnica nova. Desde os primeiros microscópios, os entusiastas e cientistas têm observado e estudado células individuais e organismos, seus comportamentos e desenvolvimento 1-3. Um exemplo famoso do falecido David Rogers na Universidade de Vanderbilt na década de 1950 mostra um neutrófilo humano em um esfregaço de sangue perseguindo uma bactéria Staphylococcus aureus e, eventualmente, o processo de fagocitose 4. Este filme-célula viva é um excelente exemplo de como os processos múltiplos podem ser observados e correlacionados em um único experimento: detecção de um gradiente químico, mecânica e velocidade da motilidade celular, celular formas dinâmicas, adesão e fagocitose de um patógeno. O advento de microscópios totalmente automatizados e câmeras digitais altamente sensíveis resultou em um aumento do número de investigadores por meio de microscopia de fazer perguntas fundamentais em biologia celular variando from como as células mover 5,6 e dividir 7,8 a organela dinâmica e tráfico de membrana 9-11. Não fluorescente, microscopia de campo claro, inclusive de contraste de fase (PC), que recebeu o Prêmio Nobel de Frits Zernike em 1953, e contraste de interferência diferencial (DIC) permitem a observação de células e núcleos, mas também estruturas sub-celulares, incluindo feixes de microtúbulos , cromossomas, nucléolo, dinâmica de organelos, e fibras de actina grossas 12. Geneticamente codificado proteínas fluorescentes e no desenvolvimento de corantes fluorescentes contra organelas têm impactado drasticamente a microscopia de lapso de tempo 13-15. Embora não seja o foco deste artigo, a imagem latente em esferóides celulares e in situ (microscopia intravital) usando confocal e microscopia multiphoton representam uma nova expansão da abordagem, e há artigos pendentes que usam e discutir estas abordagens 16-19. As respostas de células a anti-Cancer drogas ou produtos naturais são determinados na escala molecular e celular. Compreender as respostas das células e destinos após o tratamento muitas vezes envolve a população ensaios de média (por exemplo., Immunoblotting, medidas bem inteiras), ou pontos de tempo fixos com a detecção de imunofluorescência e citometria de fluxo, que medem células individuais. A heterogeneidade das respostas de células únicas para fármacos dentro de uma população, em especial em tumores, pode explicar alguns dos a variabilidade na resposta observada através de linhas de células e tumores que são tratados com o mesmo fármaco em saturação. A longo prazo abordagens longitudinais seguir uma dada célula individual ou uma população de células é uma abordagem menos comum mas muito poderosa que permite o estudo directo de vias de resposta moleculares, diferentes fenótipos (por ex., Morte celular ou a divisão celular), a observação de variabilidade célula-a-célula dentro de uma população, e como estes factores contribuem para a dinâmica de resposta população 20-22. Optimista, podendopara observar e quantificar respostas de célula única vai ajudar a melhorar a nossa compreensão de como os medicamentos funcionam, por que eles às vezes não, e como melhor utilizá-los. A técnica de microscopia de longo prazo de lapso de tempo, o acompanhamento longitudinal e análise das respostas de drogas está disponível para muitos investigadores e pode ser simples, usando a luz transmitidas apenas para observar respostas fenótipo 20,21. Os principais componentes da abordagem incluem: preparação adequada das células de interesse, um microscópio automatizado com câmara ambiental, uma câmera integrada com um computador para adquirir e armazenar as imagens e software para analisar o lapso de tempo e medir e analisar as células e quaisquer biossensores fluorescentes. Nós fornecemos um protocolo detalhado com muitas dicas para a realização de microscopia de lapso de tempo de células cultivadas, enquanto vários dias usando claro e / ou microscopia de epifluorescência widefield. Este protocolo pode ser utilizado para qualquer linha de células que podem ser cultivadas em culturapara estudar as suas respostas às terapias anti-câncer. Nós fornecemos exemplos de dados adquiridos e analisados ​​utilizando vários biossensores fluorescentes geneticamente codificados diferentes e um exemplo de microscopia de contraste de fase, discutir brevemente os diferentes tipos de sondas, as vantagens e desvantagens de longo prazo de lapso de tempo e acompanhamento longitudinal, o que pode ser aprendidas para esta abordagem que é difícil de compreender a partir de abordagens não-directos, e algumas variações que esperamos que venha a ser de interesse e valor para pesquisadores inexperientes que não ter considerado usando a abordagem, e para investigadores experientes.

<table><tbody><tr><td>Taxol (paclitaxel)</td><td>Sigma</td><td>T7191</td><td>microtubule stabilizing drug</td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Selleckchem</td><td>S1225</td><td>topoisomerase II inhibitor</td></tr><tr><td>Selinexor</td><td>Karyopharm Therapeutics</td><td>na</td><td>XPO1/CRM1 inhibitor, gift</td></tr><tr><td>Kinesin-5 inhibitor</td><td>Merck Serono</td><td>na</td><td>gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2</td></tr><tr><td>Cell growth medium</td><td>HyClone (Fisher) or Mediatech</td><td></td><td>many companies available</td></tr><tr><td>5% CO2/balance air, certified</td><td>Airgas</td><td>Z03NI7222004379</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Dish, 20 mm glass bottom</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>many companies available</td></tr><tr><td>35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom</td><td>Cellvis</td><td>D35C4-20-1.5-N</td><td>many companies available</td></tr><tr><td>35 mm Dish, gridded glass bottom</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD</td><td>many companies available</td></tr><tr><td>Multi-well, glass bottom</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N</td><td>many companies available</td></tr><tr><td>Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX2-UCB controller</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIOR LumenPro200</td><td>Prior Scientific</td><td>Lumen200PRO</td><td></td></tr><tr><td>PRIOR Proscan III motorized stage</td><td>Prio Scientific</td><td>H117</td><td></td></tr><tr><td>STEV chamber</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Environmental Controller Unit</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon laser launch</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA light engine</td><td>lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td><td>ANDOR&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TOKAI HIT inclubation chamber</td><td>TOKAI HIT</td><td>TIZSH</td><td></td></tr></tbody></table>

through the looking glass: time-lapse microscopy and longitudinal tracking of single cells to study anti-cancer therapeutics

A resposta de células únicas para fármacos anti-cancro contribui significativamente para a determinação da resposta da população, e, portanto, é um factor importante que contribui para o resultado global. Immunoblotting, citometria de fluxo e experimentos com células fixas são frequentemente usados ​​para estudar como as células respondem a drogas anti-câncer. Estes métodos são importantes, mas eles têm várias deficiências. A variabilidade nas respostas ao fármaco entre o cancro e as células normais, e entre células de cancro de origem diferente, e transiente e respostas raras são difíceis de entender utilizando ensaios de média da população e sem ser capaz de controlar directamente e analisá-las longitudinalmente. O microscópio é particularmente bem adequado para células vivas imagem. Os avanços na tecnologia permitem-nos rotineiramente células de imagens em uma resolução que permite não só o acompanhamento de células, mas também a observação de uma variedade de respostas celulares. Nós descrevemos uma abordagem pormenorizada que permita a imagem contínua de lapso de tempo decélulas durante a resposta da droga para, essencialmente, desde que desejado, tipicamente até 96 horas. Utilizando variantes da abordagem, as células podem ser monitorados durante semanas. Com o emprego de codificados geneticamente biossensores fluorescentes numerosos processos, caminhos e respostas pode ser seguido. Mostramos exemplos que incluem acompanhamento e quantificação do crescimento celular e na progressão do ciclo celular, a dinâmica de cromossomas, danos no ADN e morte celular. Discutimos, também, variações da técnica e sua flexibilidade, e destacar algumas armadilhas comuns.

Watch this Scientific Journal Video about Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics at JoVE.com

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Through the Looking Glass: Microscopia Time-lapse e Longitudinal de rastreamento de células individuais para estudar Therapeutics Anti-câncer

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

through-looking-glass-time-lapse-microscopy-longitudinal-tracking

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

11.0K visualizações.  University of Colorado, Boulder. Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Vídeo: Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., proliferation, migration, and others) and in vivo models have been developed to investigate and characterize angiogenic and non-angiogenic cell phenotypes, these methods are time and labor intensive, and often require expensive reagents and instruments, as well as significant expertise. In a recent study, we used a novel quantitative phase imaging (QPI) technique to conduct time-lapse and labeling-free characterizations of angiogenic and non-angiogenic human osteosarcoma KHOS cells. A panel of cellular parameters, including cell morphology, proliferation, and motility, were quantitatively measured and analyzed using QPI. This novel and quantitative approach provides the opportunity to continuously and non-invasively study relevant cellular processes, behaviors, and characteristics of cancer cells and other cell types in a simple and integrated manner. This report describes our experimental protocol, including cell preparation, QPI acquisition, and data analysis.

Dormant and active cancer cell phenotypes were characterized using quantitative phase imaging. Cell proliferation, migration, and morphology assays were integrated and analyzed in one simple method.

Uma lapso de tempo, livre de rótulo, quantitativa fase estudo de células cancerosas humanas latentes e ativos de imagem

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

Pesquisa do câncer

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

A longo prazo viver-pilha de imagem para avaliar o destino da célula em resposta ao Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized treatment determination. However, perturbation of the tumor architecture by biopsy and other invasive procedures has been associated with undesired effects on tumor progression, which need to be studied in depth to further improve the clinical benefit of these procedures. Conventional static approaches, which only provide a snapshot of the tumor, are limited in their ability to reveal the impact of biopsy on tumor cell behavior such as migration, a process closely related to tumor malignancy. In particular, tumor cell migration is the key in highly aggressive brain tumors, where local tumor dissemination makes total tumor resection virtually impossible. The development of multiphoton imaging and chronic imaging windows allows scientists to study this dynamic process in living animals over time. Here, we describe a method for the high-resolution longitudinal imaging of brain tumor cells before and after a biopsy in the same living animal. This approach makes it possible to study the impact of this procedure on tumor cell behavior (migration, invasion, and proliferation). Furthermore, we discuss the advantages and limitations of this technique, as well as the ability of this methodology to study changes in the cancer cell behavior for other surgical interventions, including tumor resection or the implantation of chemotherapy wafers.

Here we describe a method for high-resolution time-lapse multiphoton imaging of brain tumor cells before and after invasive surgical intervention (e.g., biopsy) within the same living animal. This method allows studying the impact of these invasive surgical procedures on tumor cells&#39; migratory, invasive, and proliferative behavior at a single cell level.

Imagem latente longitudinal de intravital do comportamento da pilha do tumor cerebral em resposta a uma biópsia cirúrgica invasora

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer therapies. However, tumor-associated macrophages can be harmful to the tumor depending on the tumor microenvironment and can reversibly alter their phenotypic characteristics by either antagonizing the cytotoxic activity of immune cells or enhancing anti-tumor response. The molecular actions of macrophages and their interactions with tumor cells (e.g., phagocytosis) have not been extensively studied. Therefore, the interaction between immune cells (M1/M2-subtype TAM) and cancer cells in the tumor microenvironment is now a focus of cancer immunotherapy research. In the present study, a live cell coculture model of induced M1 macrophages and mouse mammary 4T1 carcinoma cells was developed to assess the phagocytic activity of macrophages using a time-lapse video feature using phase-contrast, fluorescent, and differential interference contrast (DIC) microscopy. The present method can observe and document multipoint live-cell imaging of phagocytosis. Phagocytosis of 4T1 cells by M1 macrophages can be observed using fluorescent microscopy before staining 4T1 cells with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). The current publication describes how to coculture macrophages and tumor cells in a single imaging dish, polarize M1 macrophages, and record multipoint events of macrophages engulfing 4T1 cells during 13 h of coculture.

Macrophage phagocytic activity against cancer cells, specifically 4T1 mouse mammary carcinoma cells, was imaged in this study. The live cell coculture model was established and observed using a combination of fluorescent and differential interference contrast microscopy. This assessment was imaged using imaging software to develop multipoint time-lapse video.

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Medicina

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biologia

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

Viver a imagem, seguida por uma única célula de rastreamento para biologia celular de Monitor e a progressão da linhagem de várias populações neurais

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Neurociência

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

Usando em Vitro viver-pilha de imagem para explorar Chemotherapeutics entregues por nanopartículas de lipídios-baseado

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...