Name: cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2016-04-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

1. Crescimento e colheita de células de levedura <ol><li> Se não análise cinética de degradação de uma proteína de levedura endógena, transformar a estirpe (s) desejado levedura com um plasmídeo que codifica para a proteína de interesse. Métodos fiáveis ​​para a transformação de leveduras foram previamente descrito 37. </li><li> Inocular levedura em 5 ml de meio apropriado (por exemplo, definida SD) meio selectivo sintético (para manutenção de plasmídeo de células transformadas, ou de meio de levedura não selectivo-extracto de peptona-dextrose (YPD) para células não transformadas). Incubar durante a noite a 30 ° C, rotação. NOTA: 30 ° C é a temperatura de crescimento óptima para típica de tipo selvagem estirpes de levedura de laboratório 38. No entanto, porque algumas estirpes de leveduras mutantes não crescem optimamente a 30 ° C e algumas proteínas sofrem degradação dependente da temperatura, as temperaturas utilizadas para o crescimento de células de levedura e Chase cicloheximida deve ser determinada empiricamente 39. </li><li> Meça the a densidade óptica a 600 nm (OD600) de cada cultura durante a noite. NOTA: As células podem estar em fase de crescimento logarítmica ou estacionária, mas deve ter minimamente atingiu uma densidade que vai permitir que a diluição para um OD 600 = 0,2 em 15 ml de meio fresco. </li><li> Dilui-se as culturas durante a noite para um valor de DO 600 de 0,2 em 15 ml de meio fresco. </li><li> Incubar levedura a 30 ° C, agitando até que as células atingem a fase de crescimento meio-logarítmica (ie, uma OD 600 entre 0,8 e 1,2). </li><li> Durante o crescimento de células de levedura, faça o seguinte, em preparação para o procedimento cicloheximida perseguição: <ol><li> Definir um bloco de calor que pode acomodar tubos de 15 mL cónicos de 30 ° C durante a incubação das células na presença de ciclo-heximida. Adicionar água para os poços da placa de aquecimento para permitir a distribuição de calor eficiente para as culturas. Adiciona-se água a cada poço de tal modo que um tubo de 15 ml fará com que o nível da água suba para, mas não transbordar, o lábio do poço. </li><li> Definir um segundo bloco de aquecimento que pode acomodar tubos de 1,5 ml de microcentrífuga a 95 ° C para a desnaturação de proteínas após a lise celular. </li><li> meio de crescimento fresco pré-aquecido (1,1 ml por ponto de tempo por cultura a ser testada) a 30 ° C. </li><li> Adicionar 50 ul 20x Parar Mix de pré-rotulados microtubos (um tubo por tempo ponto por cultura a ser testada). Coloque os tubos em gelo. CUIDADO: A azida de sódio, um ingrediente em 20x Parar Mix, é tóxico por ingestão oral ou por contacto dérmico. Siga as recomendações do fabricante ao preparar, armazenar e manusear azida de sódio. Em caso de exposição acidental, consulte a folha de dados de segurança fornecido pelo fabricante. </li></ol></li><li> Quando as células atingiram crescimento meio-logarítmica, recolher 2,5 OD 600 unidades de cada cultura por ponto de tempo a ser testada (por exemplo, 7,5 unidades de OD 600 para analisar a abundância da proteína em três pontos de tempo). Centrifugar as células recolhidas em tubos de 15 ml em 3,0 cónicas00 xg à temperatura ambiente durante 2 min. NOTA: Uma unidade DO600 é igual à quantidade de levedura presente em 1 ml de cultura a uma DO 600 de 1,0. O volume de cultura (em ml) necessária para a colheita X OD 600 unidades (V) pode ser determinada usando a seguinte equação: V = X OD 600 unidades / DO600 medido. Por exemplo, para a colheita de 7,5 OD 600 unidades de cultura de células de levedura a uma DO 600 de 1,0, recolher 7,5 OD 600 unidades / 1,0 = 7,5 ml de cultura de levedura. </li><li> Ressuspender cada pelete de células em 1 ml de 30 ° C (pré-aquecido) por meio de crescimento fresco com 2,5 OD 600 unidades de células (por exemplo, 3 ml de 7,5 OD 600 unidades). </li></ol> 2. Cycloheximide perseguição <ol><li> Equilibrar as suspensões de células de levedura por incubação durante 5 min no bloco de calor a 30 ° C. </li><li> Prepare um temporizador para contar até de 0:00. </li><li> Para começar a perseguição cicloheximida, pressione &quot;Start&quot; no temporizador. rapidamente,mas com cuidado, execute os seguintes passos: <ol><li> Adicionar ciclo-heximida a uma concentração final de 250 ug / mL à suspensão de células de levedura primeiro (por exemplo, adicionar 37,5 ul de estoque de 20 mg de ciclo-heximida / ml a 3 ml de suspensão de células), e agitar com vortex para misturar brevemente. CUIDADO: Ciclo-heximida é um irritante dérmico e é tóxico por ingestão oral. Siga as recomendações do fabricante ao preparar, armazenar e manusear cicloheximida. Em caso de exposição acidental, consulte a folha de dados de segurança fornecido pelo fabricante. </li><li> Imediatamente após a adição de ciclo-heximida e vórtex, transferir 950 ul (~ 2,4 OD 600 unidades) da suspensão de células de levedura com ciclo-heximida adicionado a um tubo de microcentrífuga de pré-marcado contendo 50 ul de mistura de 20x paragem gelada. Vortex o tubo de microcentrífuga e colocar no gelo até que todas as amostras foram coletadas. </li><li> Retorno da suspensão de células de levedura a 30 ° C. </li></ol></li><li> Repita os passos 2.3.1 através de 2.30,3 para cada um dos restantes suspensões de células de levedura, a intervalos de tempo regulares (por exemplo, a cada 30 seg, de tal modo que a ciclo-heximida é adicionado à amostra # 1 a 0:00, Amostra # 2 a 0:30, a Amostra # 3 a 1:00 , etc.). </li><li> Em cada momento posterior, as suspensões de células de levedura vortex e de transferência de 950 ul a tubos de microcentrífuga rotulado contendo 50 ul pré-refrigerado 20x Parar Mix. Vortex e células lugar recolhido no gelo. Retornar 15 ml tubos cônicos de bloco de calor a 30 ° C. <ol><li> Por exemplo, para a recolha de células de 30 minutos após a adição de ciclo-heximida (assumindo 30-sec intervalos entre a adição de ciclo-heximida a suspensões de células de levedura, no início do curso de tempo), de vórtice e remover 950 ul de suspensão celular a partir da amostra # 1 a 30:00 . Repita o procedimento para Amostra # 2 em 30:30, e assim por diante. NOTA: Para evitar a sedimentação de levedura, as suspensões de células de vórtice em tubos de 15 mL cónicos aproximadamente a cada 5 min durante todo o curso da perseguição. Alternativamente, a suspensão de células de leveduras podem ser mantidos num banho de água agitando continuamente durante o período da experiência cicloheximida perseguição. </li></ol></li><li> Quando todas as amostras terem sido recolhidas, as células recolhidas pelete por centrifugação a 6500 xg à temperatura ambiente durante 30 seg. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração. As células estão agora prontos para lise alcalina. Alternativamente, snap-congelar as células peletizadas em azoto líquido e armazenar a -80 ° C. </li></ol> 3. Pós-alcalina extração de proteínas (Modificado de 16,40) <ol><li> Adicionar 100 ul de água destilada a cada sedimento de células. Ressuspender pipetando cima e para baixo ou vórtex. </li><li> Adicionar 100 uL de NaOH 0,2 M a cada amostra. Misturar por pipetagem cima e para baixo ou vórtex. </li><li> Incubar as células em suspensão, à temperatura ambiente durante 5 min. Nesta fase, as células de levedura não foram lisadas e as proteínas não tenham sido introduzidos 40. </li><li> células de pelotas por centrifugação a 18.000 xg no temperamento quartotura durante 30 segundos. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração. </li><li> Para lisar as células, adicionar 100 ul de tampão de amostra de Laemmli a cada sedimento de células. Ressuspender pipetando cima e para baixo ou vórtex. NOTA: incubação sequencial de células com proteínas de NaOH e tampão de amostra Laemmli liberta de uma forma compatível com dodecilsulfato de sódio a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), utilizando um sistema tampão de corrida Tris-glicina. </li><li> Incubar a 95 ° C durante 5 minutos para desnaturar proteínas totalmente. NOTA: A incubação a 95 ° C pode não ser adequado para análise de proteínas que são propensos a agregação (por exemplo, proteínas com vários segmentos transmembranares). Estas proteínas podem tornar-se insolúvel quando incubada a temperaturas elevadas 41. Assim, para a análise de tais proteínas, lisados ​​devem ser incubados a temperaturas mais baixas (por exemplo, 37 ° C - 70 ° C) durante 10 - 30 minutos, tal como determinado empiricamente. </li><li> lisados ​​centrifugar a 18.000 xg à room temperatura durante 1 min para sedimentar o material insolúvel. O sobrenadante (solubilizado proteína extraída) está pronta para a separação por SDS-PAGE e subsequente análise de Western blot. Alternativamente, armazenar os lisados ​​a -20 ° C. </li></ol> 4. Representante SDS-PAGE e Western Blotting Procedimento (Adaptado de 16) <ol><li> Carga de proteína padrões de peso molecular e de volume determinada empiricamente de lisados ​​num gel de SDS-PAGE. NOTA: Escolha a percentagem de acrilamida e bis-acrilamida no gel de SDS-PAGE com base no peso molecular da proteína de interesse. Em geral, os géis percentuais mais baixos são mais adequados para a resolução de proteínas de maior peso molecular. </li><li> Executar gel a 200 V até a frente do corante atingiu a borda inferior do gel. </li><li> Transferir as proteínas do gel para fluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana por transferência húmida a 20 V durante 60 - 90 min a 4 ° C. </li><li> Bloquear membrana por incubação em tampão Tris-salino tamponado (TBS) contendo 5% de leite desnatado, de balanço, à temperatura ambiente durante 1 h ou a 4 ° C durante a noite. NOTA: Para evitar o crescimento microbiano na presença de uma membrana é incubada durante a noite, recomenda-se a incluir azida de sódio na solução de bloqueio numa concentração final de 0,02%. </li><li> Incubar membrana com anticorpo primário específico para a proteína de interesse em TBS com 0,1% de Tween-20 (TBS / T) e 1% de leite desnatado, de balanço, à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Lavar membrana à temperatura ambiente, 3 x 5 min com TBS / T, de balanço. </li><li> Incubar membrana com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo apropriado em TBS / T com leite desnatado a 1% à temperatura ambiente durante 1 h, de balanço. NOTA: Os fluoróforos são sensíveis à luz. Portanto, as diluições de anticorpos conjugados com fluoróforos deve ser preparado no escuro, e a incubação de membranas na presença de anticorpos conjugados com fluoróforos e os passos de lavagem subsequentes devem ocorrer em prova de luz (por exemplo, embrulhado em papel alumínio) containers. </li><li> Lavar membrana à temperatura ambiente, 3 x 5 min com TBS / T, de balanço. </li><li> membrana imagem usando LI-COR Odyssey CLx e software de imagem Studio (ou equipamentos de imagem comparável e software), seguindo as recomendações do fabricante. </li><li> Após a aquisição de imagem de membrana, a membrana incubar com um anticorpo primário específico para uma proteína de controlo de carga em TBS / T com leite desnatado a 1% à temperatura ambiente durante 1 h, de balanço. </li><li> Lavar membrana à temperatura ambiente, 3 x 5 min com TBS / T, de balanço. </li><li> Incubar membrana com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo apropriado em TBS / T com leite desnatado a 1% à temperatura ambiente durante 1 h, de balanço. </li><li> Lavar membrana à temperatura ambiente, 3 x 5 min com TBS / T, de balanço. </li><li> membrana imagem como no passo 4.9. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Neste trabalho, um método para a análise cinética de degradação da proteína é apresentada. Esta técnica pode ser facilmente aplicado a uma variedade de proteínas degradadas por uma variedade de mecanismos. É importante notar que os ensaios de ciclo-heximida chase informar sobre a cinética de degradação de piscina de estado estacionário de uma dada proteína. Outras técnicas podem ser usadas para analisar a cinética de degradação de populações específicas de proteínas. Por exemplo, o destino de degradação de polipeptídeos nascentes podem ser rastreados por análise de perseguição de pulso 55. Em tais experiências, as proteínas nascentes são brevemente pulso-marcada (por exemplo, com aminoácidos radioactivos). Alterações na abundância das proteínas nascentes marcado (que pode ou não pode espelhar mudanças na abundância de proteína em estado estacionário) pode ser rastreado ao longo do tempo. Perseguição ciclo-heximida é apropriado para analisar a estabilidade da proteína durante um curso de tempo relativamente curto (isto é, até duas horas). Mais de um tempo mais longo courses (isto é, duas horas ou dias), ciclo-heximida, um inibidor da tradução mundial, é tóxico para as células, provavelmente devido à depleção de ubiquitina 56. Além disso, análises de estabilidade das proteínas ao longo de cursos de tempo mais longos são mais susceptíveis de ser comprometida pelos efeitos indirectos da síntese de proteínas deficientes globalmente sobre a degradação da proteína de interesse (por exemplo, a degradação de uma proteína de curta duração envolvidas na degradação da proteína de interesse). Outras técnicas, tais como a pesquisa por pulso experiências de marcação metabólica, são, portanto, mais adequado para estudar a degradação de proteínas de longa duração e podem ser realizados para confirmar os resultados obtidos em experiências com ciclo-heximida Chase. O tempo de adição de ciclo-heximida e a recolha das células é uma consideração importante no presente processo. A precisão é especialmente importante para a análise de proteínas de vida muito curta, tal como pequenos desvios no tempo decorrido a partir de ciclo-heximida adição para a colheita de células pode ter um impacto substancial na cinética de degradação aparentes. Além disso, sem um plano claro para a execução destes passos sensíveis ao tempo, um experimento pode transformar-se rapidamente em caos e frustração. Por esta razão, recomenda-se adicionar cicloheximida para culturas em intervalos regulares, planeados. intervalos de 30 seg são sugeridas neste protocolo, mas o tempo pode ser ajustado para coincidir com o nível de conforto e destreza do investigador. investigadores novatos podem achar que é útil para escrever um cronograma de horários de coleta de amostra antes de iniciar o experimento e atravessar fora cada coleta programada como ele ocorre. Nos passos 1.7 e 1.8 do protocolo aqui descrito, as culturas de células de levedura estão concentrados na redução dos volumes de meio de crescimento para facilidade de manipulação durante o processo de ciclo-heximida perseguição subsequente. No entanto, a centrifugação de células de levedura induz rapidamente determinadas respostas de stress celular (por exemplo, vias de sinalização quesão ativados pela privação de glicose) 57,58. Os investigadores estão, portanto, advertiu contra a longos períodos de centrifugação. Quando se analisa a estabilidade de proteínas que podem ser sensíveis a centrifugação, os investigadores podem desejar adicionar cicloheximida directamente a culturas de fase mid-log sem prévia centrifugação. Em tais casos, a ciclo-heximida deve ser adicionado à mesma concentração final (250 ug / ml), e as amostras de células de levedura podem ser recolhidas por metodologias que não necessitam de um passo de centrifugação inicial (por exemplo, filtração rápida) 57. Além disso, nos Passos 2,3-2,5, as amostras recolhidas em cada ponto de tempo são transferidos para uma solução que contém azida de sódio e colocadas em gelo. Estas condições inibem continuou a degradação de proteínas durante o período da perseguição. Deve notar-se que a azida reduz a concentração celular de ATP 59, inibindo assim especificamente a actividade de proteases dependentes de ATP. Enquanto temperatura reduzida deve umlso reduzir a taxa na qual a função proteolítica processos não dependente de ATP, os investigadores que estudam proteínas degradadas por tais mecanismos pode, alternativamente, optar por ajustar-congelamento sedimentos de células em azoto líquido à medida que cada amostra seja colhida. Um protocolo de exemplo para a lise celular e um protocolo representativo para western blot incluídos neste manuscrito foram adaptados a partir de relatórios anteriores 16,40. No método de lise alcalina descrito pós-aqui, NaOH pré-tratamento aumenta a extracção de proteínas de levedura após a subsequente adição de tampão de amostra Laemmli. O mecanismo pelo qual essa melhoria ocorre é mal caracterizada 40. No entanto, polissacáridos, tais como aqueles encontrados em paredes de células de levedura são solubilizados em condições alcalinas 60. Por conseguinte, é tentador especular que a incubação na presença de NaOH parcialmente ou completamente esferoplastos células de levedura (ou seja, remove componentes da parede celular), tornando-os mais Sensitivde e para o detergente SDS presente no tampão de amostra Laemmli. Porque as proteínas são libertados sob condições altamente desnaturantes, os inibidores da protease não necessitam de ser incluídos no tampão de amostra Laemmli. O método específico de lise celular pode ser modificada conforme apropriado para uma dada experiência. Por exemplo, o método de lise alcalina pós-pode não ser adequado para as proteínas de baixa abundância ou proteínas que são pobremente detectados por Western blot. Em tais casos, os métodos que incluem um passo de precipitação de ácido tricloroacético a concentrar-se amostras de proteína pode ser mais apropriado 61. Além disso, várias considerações importantes sobre a seleção de anticorpos, Carregando controlo escolha e meios alternativos de detecção (por exemplo, transferência de western quimiluminescente usando sistemas de filme ou imagem digital) ter sido discutido recentemente 16. A quantificação da abundância de proteínas ciclo-heximida a seguir ao tratamento podem ser efectuados. Muitos sistemas de imagem são vendidos com pacotes de software que facilitamesta análise. Cicloheximida perseguição pode ser implementado para analisar a degradação de uma variedade de proteínas de levedura e pode ser adaptado para estudar a estabilidade da proteína em outras células eucarióticas. Tal como descrito no presente protocolo, o tratamento com ciclo-heximida é seguido por lise de células e detecção da abundância de proteína por análise de Western blot. Dependendo da aplicação, no entanto, a abundância de proteínas ciclo-heximida a seguir ao tratamento pode ser avaliada por uma variedade de técnicas, conforme apropriado para objectivos de investigação. Por exemplo, se o tamanho da proteína não é um factor relevante para a análise, os lisados ​​celulares podem ser sujeitos a análise dot blot ou ligado a enzima ensaio imunoabsorvente (ELISA), que informam sobre a abundância de proteínas, mas não aparente peso molecular 62. Para as proteínas na superfície celular (ou fluorescente interna proteínas marcadas com internos), citometria de fluxo pode ser utilizado para quantificar a abundância de proteínas de amostras em momentos diferentes após a adição de ciclo-heximida 51. Fluomicroscopia rescência tratamento após cicloheximida iria fornecer informações tanto a abundância de proteínas e localização 18. A gama de substratos, organismos e aplicações a jusante passíveis de perseguição cicloheximida torna a técnica um meio altamente versáteis e informativos de estudar a degradação de proteínas.

Proteínas executar funções cruciais em praticamente todos os processos celulares. Muitos processos fisiológicos requerem a presença de uma proteína específica (ou proteínas) por um período de tempo definido, ou sob circunstâncias particulares. Organismos, portanto, monitorar e regular a abundância de proteína para atender às necessidades celulares 1. Por exemplo, as ciclinas (proteínas que controlam a divisão celular) estão presentes em fases específicas do ciclo celular, e a perda dos níveis de ciclina regulamentados tem sido associada com a formação do tumor maligno 2. Além de regular os níveis de proteína para satisfazer as necessidades celulares, células empregam mecanismos de controlo de qualidade degradativas para eliminar deformadas, as moléculas de proteína não montadas, ou de outro modo aberrantes 3. Controle de abundância de proteína envolve regulação tanto a síntese macromolecular (transcrição e tradução) e degradação (decomposição RNA e proteólise). a degradação da proteína deficiente ou excessiva contribui para várias patologias, Incluindo o cancro, fibrose cística, doenças neurodegenerativas, e desordens cardiovasculares 4-8. Mecanismos proteolíticas, portanto, representam alvos terapêuticos promissores para uma série de doenças 9-12. Análise de proteínas em um único ponto do tempo (por exemplo, por western blot 13, citometria de fluxo 14, ou microscopia de fluorescência 15) fornece um instantâneo da abundância de proteína em estado estacionário, sem revelar as contribuições relativas de síntese ou degradação. Da mesma forma, ensaios repórter baseada em crescimento reflectem os níveis de proteína em estado estacionário durante um período de tempo prolongado sem discriminar entre as influências de síntese e degradação 15-20. É possível inferir a contribuição dos processos de degradação para os níveis de proteína em estado estacionário, comparando abundância antes e depois de inibir componentes específicos do mecanismo de degradação (por exemplo, por farmacologicamente inactiva o proteasome 21 ou batendo para fora um gene a hipótese de ser necessário para a degradação 13). Uma alteração nos níveis de proteína em estado estacionário após a inibição das vias degradativas proporciona forte evidência para a contribuição de proteólise para o controlo da abundância de proteína 13. No entanto, essa análise ainda não fornece informações sobre a cinética de retorno da proteína. Chase Cycloheximide seguida por western blot supera essas deficiências, permitindo que os investigadores para visualizar a degradação da proteína ao longo do tempo 22-24. Além disso, porque a detecção da proteína seguinte perseguição ciclo-heximida é tipicamente realizada por Western blotting, isótopos radioactivos e passos morosos imunoprecipitação não são necessários para a perseguição ciclo-heximida, ao contrário de muitas técnicas de pesquisa por pulso habitualmente utilizados, que são também realizados para visualizar a degradação da proteína de 25. Ciclo-heximida foi pela primeira vez identificado como um composto com anti-fúngica adequadalaços produzidos por Streptomyces bactéria gram-positiva griseus 26,27. É uma molécula de células-permeável que inibe especificamente citosólica eucariótica (mas não organelar) por tradução ribossomal prejudicando translocação 28-31. Numa experiência cicloheximida Chase, ciclo-heximida é adicionado às células, e as alíquotas de células são recolhidas e imediatamente em pontos de tempo específicos após a adição do composto 22. As células são lisadas, e a abundância de proteína em cada ponto de tempo é analisado, tipicamente por western blot. Diminuições na abundância de proteínas após a adição de ciclo-heximida pode ser com confiança atribuídos a degradação da proteína. Uma proteína instável vai diminuir em abundância ao longo do tempo, enquanto que uma proteína relativamente estável irá apresentar pouca mudança em abundância. Os mecanismos de degradação de proteínas selectiva têm sido altamente conservadas ao longo da Eukarya. Muito do que se sabe sobre a degradação das proteínas foi aprendido pela primeira vez emo eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levedura de brotamento) 25,32-36. Estudos com levedura tendem a continuar fornecendo insights novos e importantes para a degradação de proteínas. Um método para a perseguição de ciclo-heximida em células de levedura, seguido de análise Western blot de proteínas de abundância é aqui apresentada.

<table><tbody><tr><td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable borosilicate glass tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Temperature-regulated incubator (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Heratherm Incubator Model IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>A tube roller is recommended to maintain overnight&amp;nbsp; starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>For use with tube roller</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216&amp;nbsp;</td><td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes</td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Analog Dri-Bath Heaters</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 &amp;deg;C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.</td></tr><tr><td>Heating block for 12 x 15 ml conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-473-70</td><td>For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.</td></tr><tr><td>Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-9Q</td><td>For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td><td></td><td></td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Western blot imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Primary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Will vary by lab and application</td></tr></tbody></table>

cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae

Regulamento da abundância de proteína é crucial para praticamente todos os processos celulares. abundância proteína reflecte a integração das taxas de síntese de proteínas e a degradação da proteína. Muitos ensaios de relatórios sobre a abundância de proteínas (por exemplo, em tempo único ponto de transferência de Western, citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, ou os ensaios reporter baseados em crescimento) não permitem discriminação dos efeitos relativos de tradução e proteólise nos níveis de proteína. Este artigo descreve a utilização de ciclo-heximida perseguição seguido de western blotting para analisar a degradação de proteínas especificamente no eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levedura de germinação). Neste procedimento, as células de levedura são incubadas na presença do inibidor de ciclo-heximida translacional. Alíquotas de células são recolhidas e imediatamente depois em pontos de tempo específicos seguintes adição de ciclo-heximida. As células são lisadas e os lisados ​​são separados por electroforese em gel de poliacrilamida for análise de Western blot de proteínas de abundância em cada ponto de tempo. O procedimento de ciclo-heximida perseguição permite a visualização da cinética de degradação da população do estado estacionário de uma variedade de proteínas celulares. O procedimento pode ser utilizado para investigar os requisitos para genéticos e influências ambientais sobre a degradação da proteína.

Para ilustrar cicloheximida metodologia perseguição, a estabilidade de Deg1 -Sec62 (Figura 1), uma degradação -associated (ERAD) substrato modelo de levedura retículo endoplasmático (ER), foi analisada 42-44. Em ERAD, de controlo de qualidade enzimas ubiquitina ligase covalentemente atribuem cadeias da pequena proteína de ubiquitina para as proteínas aberrantes localizadas à membrana do RE. Tais proteínas polyubiquitylated são subsequentemente removidos do ER e degradado pelo proteassoma, um grande, protease citosólica 45. A proteína Deg1 -Sec62 é alvo de degradação depois de persistente e aberrante envolve o translocon, um canal que facilita a translocação de proteínas no lúmen ER ou membrana 43. Da mesma forma, a apolipoproteína B de mamífero, um componente de proteína das lipoproteínas de baixa densidade, persistentemente engata a translocon ER e, subsequentemente, sofre degradação por um mecanismo relacionado quando o seu lábioparceiros de ligação id estão ausentes 46-48. Assim, análises de degradação Deg1 -Sec62 em células de levedura pode produzir insights sobre a degradação de proteínas que persistentemente ou aberrante envolver o translocon, provisoriamente denominado ERAD-T (para-translocon associado) substratos 43. Estudos anteriores indicaram que os ER residente ubiquitina ligase funções Hrd1 com a enzima de conjugação de ubiquitina Ubc7 para catalisar a degradação de Deg1 -Sec62 16,42-44. A proteína transmembranar Cue1 Ubc7 ancora à membrana do RE e activa a enzima 49-51. No entanto, um requisito para Cue1 na degradação de Deg1 -Sec62 não foi directamente investigada. Para testar a hipótese de que Cue1, como Hrd1 e Ubc7, é necessário para a degradação eficientes do Deg1 -Sec62, de tipo selvagem e mutantes de células de levedura que expressam Deg1 -Sec62 foram submetidos a perseguição e ciclo-heximida Wesanálise de mancha de andorinha (Figura 2A). A proteína Deg1 -Sec62 migra em SDS-PAGE como múltiplas espécies. Isto é consistente com estudos anteriores que indicam extensa modificação pós-tradução da proteína 43,44,52. Em células de levedura de tipo selvagem, Deg1 -Sec62 foi prontamente degradada. Como observado anteriormente, a perda de qualquer Hrd1 ou Ubc7 estabilizou substancialmente a proteína Deg1 -Sec62 42-44. Como previsto, Deg1 -Sec62 foi estabilizado na ausência de Cue1 (numa extensão semelhante como na ausência de Ubc7), confirmando um papel para a proteína que interage em Ubc7-ERAD-T. A proporção de proteína Deg1 -Sec62 restante em cada ponto de tempo foi quantificada e está representada na Figura 2B. Notamos que a taxa aparente de desaparecimento de Deg1 -Sec62 em células do tipo selvagem pode ser uma subestimação da taxa de degradação da nascente Deg1 -Sec62(Isto é, meia-vida da proteína, que pode ser mais directamente determinada por análise de pesquisa por pulso 43). Por causa do tipo selvagem de levedura activamente degradar a proteína Deg1 -Sec62 antes da adição de ciclo-heximida, abundância constante estado de Deg1 -Sec62 é substancialmente reduzida nestas células (em comparação com as células em que a degradação é diminuída). Isto pode ser apreciado por comparação da abundância de Deg1 -Sec62 nos pontos de tempo iniciais para cada estirpe na Figura 2A. Além disso, qualquer degradação subpopulação resistente à da proteína de substrato (por exemplo, se a proteína acumula-se no piscinas intracelulares a partir da qual é impedido de degradação) podem aparecer relativamente estável em células de tipo selvagem ao longo do tempo da experiência. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53975/53975fig1.jpg" /> Figura 1. Modelo de Degradação de Deg1 </em&gt; -Sec62 Seguinte aberrante Contratação de translocon (A) Representação esquemática do Deg1 -Sec62 Deg1 -Sec62 é constituído pelos seguintes elementos, em sequência:.. Deg1 (os 67 aminoácidos amino-terminais da levedura repressor da transcrição MATα2), uma bandeira (F) epitopo, da proteína 2-transmembranar sec62, e duas cópias do Staphylococcus aureus proteína a (PRA). (B) após a inserção de co-traducional normal dos seus dois segmentos transmembranares para a membrana do retículo endoplasmático (ER), uma associação persistente de Deg1 -Sec62 com o translocon desencadeia, Deg1 dependente, envolvimento translocon pós-translacional anormal. Uma porção do terminal amino citosólica e entra-aberrante provavelmente permanece dentro translocon-o. (C) Seguindo acoplamento translocon, a ubiquitina-ligase Hrd1 ubiquitylates Deg1 -Sec62. Hrd1 é assistida pela enzima de conjugação de ubiquitina LBC7, que está ancorada na membrana ER por Cue1. Ub, os monómeros de proteína ubiquitina. (D) Ubiquitylated Deg1 -Sec62 é extraído a partir da membrana ER e degradada pelo proteassoma, alívio da obstrução translocon. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53975/53975fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53975/53975fig2.jpg" /> Figura 2. Cycloheximide perseguição seguido por Western Blotting Indica que Cue1 é necessária para uma eficiente Degradação Deg1 -Sec62. (A) células de levedura da genótipos indicados foram transformadas com um plasmídeo de levedura que codifica centromérica Deg1 -Sec62 (pRS416-P MET25 - Deg1 -flag-Sec62-2xProtA; AmpR / URA3 43) e sujeitas a análise de ciclo-heximida perseguição. Proteínas a partir de cada ponto de tempo (equivalente a 0,125 OD 600 unidades) foram separados num gel de SDS-PAGE a 8% e detectados por Western blotting com anticorpos secundários de coelho anti-rato, que se ligam directamente os epitopos de proteína A do terminal C do Deg1 - sec62 proteína de fusão. Como um controlo de carga, a membrana foi subsequentemente incubada com anticorpos específicos para PGK1. Este experimento foi replicado três vezes; Os resultados representativos são representados. (B) Quantificação dos dados em (A) foi realizada usando software de imagiologia (ver Tabela de Materiais). A intensidade de fluorescência de uma área envolvendo a proteína Deg1 -Sec62 foi determinada para cada amostra. Fundo da intensidade de fluorescência para cada amostra foi extrapolada a partir da intensidade de fluorescência média de pixels próximos da proteína Deg1 -Sec62. Este extrapolada intensidade de fluorescência de fundo foi subtraída a intensidade total de fluorescência ajustado para produzir fluoresintensidade cia para cada amostra. quantificações similares para o total de fundo, e intensidades de fluorescência ajustadas foram realizadas para PGK1, uma proteína de controlo de carga cuja abundância não varia nas condições ensaiadas. Para comparar a abundância de proteína Deg1 -Sec62 entre amostras, uma proporção das intensidades de sinal é ajustada de Deg1 -Sec62 para PGK1 foi determinada para cada amostra. A proporção Deg1 -Sec62 / PGK1 foi definida como 100% para o primeiro ponto de tempo (isto é, imediatamente após a adição de ciclo-heximida) para cada estirpe em estudo. A quantidade de Deg1 -Sec62 restante em pontos de tempo subsequentes (ou seja, os rácios Deg1 -Sec62 / PGK1) foi calculado como uma porcentagem da relação Deg1 -Sec62 / PGK1 no primeiro ponto de tempo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53975/53975fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-com-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="3"> Synthetic Definido (SD) Medium Yeast Minimal </td><td rowspan="3"> 2% de dextrose, 0,67% de base azotada de levedura sem aminoácidos, 0,002% de adenina, 0,004% de uracilo, 0,002% de arginina, 0,001% de histidina, 0,006% isoleucina, 0,006% de leucina, 0,004% de lisina, 0,001% de metionina, 0,006% de fenilalanina, 0,005 % treonina, triptofano 0,004%. Por meio sólido (placa), incluir 2% de agar. </td><td> 1. meio selectivo é preparado por omitindo ácido apropriado (s) amino ou bases azotadas. </td></tr><tr><td> 2. Por razões de conveniência, estes ingredientes podem ser mantidas como soluções stock concentradas como se segue. Os aminoácidos podem ser mantidas como 100x solução estoque contendo todos os aminoácidos desejados. base de azoto de levedura pode ser mantido numa solução estoque 20x (13,4%). Dextrose pode ser mantida numa solução de 40%. Adenina e uracilo podem ser mantidas como soluções de reserva a 1% em NaOH a 0,1 M. </td></tr><tr><td> 3.Esterilizar meio em autoclave. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Extracto de levedura-peptona dextrose (YPD) meio rico levedura </td><td rowspan="3"> 1% de extracto de levedura, 2% de peptona, 2% de dextrose (Opcional: 0,002% de adenina). Por meio sólido (placa), incluir 2% de agar. </td><td> 1. Para evitar que o crescimento lento e coloração vermelha característica de estirpes de leveduras particulares laboratório na ausência (ou baixa abundância) de adenina, adenina pode ser adicionado ao meio de crescimento de YPD. </td></tr><tr><td> 2. Por conveniência, alguns ingredientes podem ser mantidas como soluções stock concentradas como se segue. Dextrose pode ser mantida numa solução de 40%. Adenina pode ser mantido como uma solução stock de 1% em NaOH 0,1 M. </td></tr><tr><td> 3. Esterilizar meio em autoclave. </td></tr><tr><td> 20x Mix Parar </td><td> 200 mM de azida de sódio, 5 mg / ml de albumina de soro bovino </td><td> A azida sódica é tóxica por ingestão oral ou por contacto dérmico. siga fabricanterecomendações ao preparar, armazenar e manusear azida de sódio. Em caso de exposição acidental, consulte a folha de dados de segurança fornecido pelo fabricante. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 20 mg / ml de cicloheximida </td><td rowspan="2"></td><td> 1. Preparar, em etanol. Armazenar a -20 ° C. </td></tr><tr><td> 2. Ciclo-heximida é um irritante dérmico e é tóxico por ingestão oral. Siga as recomendações do fabricante ao preparar, armazenar e manusear cicloheximida. Em caso de exposição acidental, consulte a folha de dados de segurança fornecido pelo fabricante. </td></tr><tr><td> 0,2 M de hidróxido de sódio </td><td></td><td> Prepare-se com água. Hidróxido de sódio reage com o vidro. Por conseguinte, para armazenamento a longo prazo, de hidróxido de sódio 0,2 M deve ser mantido em recipientes de plástico. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Tampão de amostra de Laemmli </td><td rowspan="2"> 2% de SDS, 10% glicerol, 5% &amp;# 946; -mercaptoetanol, 60 mM Tris HCl pH 6,8, 0,008% de azul de bromofenol </td><td> 1. Tampão de amostra de Laemmli é frequentemente preparada por diluição de um material mais concentrado (por exemplo, 5x). </td></tr><tr><td> 2. O corante azul de bromofenol pode ser adicionado a intensidade desejada. Um &quot;pinch&quot; (muito pequena quantidade roscado a partir da extremidade de uma espátula) é tipicamente suficiente. </td></tr><tr><td> Laemmli Correr Buffer (5x) </td><td> Tris 125 mM, glicina 960 mM, SDS a 0,5% </td><td> Para preparar 1 L de tampão de corrida 1x Laemmli, dilua 1: 5 em dH2O </td></tr><tr><td> Tris-Acetato de SDS Tampão de Transferência (5x) </td><td> 125 mM de Tris acetato (pH 8,8), glicina 960 mM, 0,05% de SDS </td><td> Para preparar 20 L de 1x Tris-Acetato de SDS Tampão de Transferência, combinar 4 L de estoque de 5x, 4 L de metanol, e 12 L de dH2O </td></tr><tr><td> 10x Tris-Buffered Saline (TBS) </td><td> Tris 500 mM, NaCl 1,5 M; pH ajustado para 7,5</td><td> Para preparar 1 L de 1x TBS, diluir 1:10 em dH 2 O. 1x TBS pode ser suplementado com o detergente Tween-20 e leite magro em pó, como apropriado. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. soluções utilizadas neste estudo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome Strain </td><td> aliás </td><td> genótipo relevante </td><td> Referências </td></tr><tr><td rowspan="7"> VJY42 </td><td rowspan="7"> MHY501 </td><td> MATa </td><td rowspan="7"> Chen et al., 1993 </td></tr><tr><td> HIS3-Δ200 </td></tr><tr><td> leu2-3,112 </td></tr><tr><td> ura3-52 </td></tr><tr><td> lys2-801 </td></tr><tr><td> trp1-1 </td></tr><tr><td> Gal2 </td></tr><tr><td rowspan="8"> VJY47 </td><td rowspan="8"> YWO55; MHY507 </td><td> MATa </td><td rowspan="8"> Jungmann et al., 1993; Rubenstein et al., 2012 </td></tr><tr><td> HIS3-Δ200 </td></tr><tr><td> leu2-3,112 </td></tr><tr><td> ura3-52 </td></tr><tr><td> lys2-801 </td></tr><tr><td> trp1-1 </td></tr><tr><td> Gal2 </td></tr><tr><td> ubc7Δ :: LEU2 </td></tr><tr><td rowspan="8"> VJY56 </td><td rowspan="8"> YTX105; MHY1364 </td><td> MATa </td><td rowspan="8"> Biederer et al., 1997; Ravid et ai., 2006 </td></tr><tr><td> HIS3-Δ200 </td></tr><tr><td> leu2-3,112 </td></tr><tr><td> ura3-52 </td></tr><tr><td> lys2-801 </td></tr><tr><td> trp1-1 </td></tr><tr><td> Gal2 </td></tr><tr><td> cue1Δ :: HIS3 </td></tr><tr><td rowspan="8"> VJY172 </td><td rowspan="8"> MHY6199 </td><td> MATa </td><td rowspan="8"> Este estudo </td></tr><tr><td> HIS3-Δ200 </td></tr><tr><td> leu2-3,112 </td></tr><tr><td> ura3-52 </td></tr><tr><td> lys2-801 </td></tr><tr><td> trp1-1 </td></tr><tr><td> Gal2 </td></tr><tr><td> hrd1Δ :: kanMX4 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Cepas de levedura utilizada neste estudo. Todas as estirpes são congênica com MHY500 53. VJY42, VJY47, e VJY56 foram descritos anteriormente 49,53,54. Uma geração detalhada tensão e estratégia de confirmação para VJY172 (preparado para este estudo) está disponível mediante solicitação.

Watch this Scientific Journal Video about Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Cicloheximida Análise perseguição de degradação da proteína em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

cycloheximide-chase-analysis-protein-degradation-saccharomyces

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

28.8K visualizações.  Ball State University. Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Vídeo: Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Biologia do Desenvolvimento

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

Ajustando a degradação para conseguir a depleção de proteína específica e eficiente

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...

Imunologia e Infecção

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Estudar proteólise de ciclina B no nível da célula individual em populações de células inteiras

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Biologia

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Baseada Reporter ensaio de crescimento para análise sistemática de degradação de proteínas

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Medição do mRNA Decay Preços em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Usando<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Determinação baseado no crescimento e confirmação bioquímica de Requisitos Genéticos para a degradação de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome segregation. As DNA synthesis defects underlie chromosome rearrangements, monitoring DNA replication has become essential to understand the basis of genome instability. Saccharomyces cerevisiae is a classical model to study cell cycle regulation, but key DNA replication parameters, such as the fraction of cells in the S phase or the S-phase duration, are still difficult to determine. This protocol uses short and non-toxic pulses of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), a thymidine analog, in engineered TK-hENT1 yeast cells, followed by its detection by Click reaction to allow the visualization and quantification of DNA replication with high spatial and temporal resolution at both the single-cell and population levels by microscopy and flow cytometry. This method may identify previously overlooked defects in the S phase and cell cycle progression of yeast mutants, thereby allowing the characterization of new players essential for ensuring genome stability.

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

We describe two complementary protocols to accurately determine S-phase duration in S. cerevisiae using EdU, a thymidine analog, which is incorporated in vivo and detected using Click chemistry by microscopy and flow cytometry. It allows for the easy characterization of the duration of DNA replication and overlooked replication defects in mutants.

Determinação da Duração da Fase S Usando a Incorporação de 5-Etil-2'-desoxiuridina em Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

Uso de microscopia Time-Lapse e Depleção Nuclear Específica de Estágio de Proteínas para Estudo da Meiose em S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

An Introduction to Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research. S. cerevisiae is an attractive model organism due to the fact that its genome has been sequenced, its genetics are easily manipulated, and it is very easy to maintain in the lab. Because many yeast proteins are similar in sequence and function to those found in other organisms, studies performed in yeast can help us to determine how a particular gene or protein functions in higher eukaryotes (including humans).
This video provides an introduction to the biology of this model organism, how it was discovered, and why labs all over the world have selected it as their model of choice. Previous studies performed in S. cerevisiae that have contributed to our understanding of important cellular processes such as the cell cycle, aging, and cell death are also discussed. Finally, the video describes some of the many ways in which yeast cells are put to work in modern scientific research, including protein purification and the study of DNA repair mechanisms and other cellular processes related to Alzheimer&rsquo;s and Parkinson&rsquo;s diseases.

Saccharomyces cerevisiae Yeast as a Model Organism

Uma Introdução a Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research.  S. ...

Education

JoVE Science Education

Biologia Básica

Biologia I: levedura, Drosophila e C. elegans

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

Source: Guo, L. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

Ensaio de degradação de proteínas propensas a dobramento incorreto: uma técnica para monitorar a degradação de proteínas mal dobradas usando tratamento com cicloheximida e fracionamento de detergente

Source: Guo, L. et al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for ...

Cicloheximida Análise perseguição de degradação da proteína em

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo