The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

1. النمو والحصاد من خلايا الخميرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إن لم يكن تحليل حركية تدهور بروتين الخميرة الذاتية، وتحويل الخميرة المطلوب سلالة (s) مع ترميز البلازميد بروتين من الفائدة. وقد وصفت وسائل موثوق بها للتحول الخميرة سابقا 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم الخميرة في 5 مل من المتوسط ​​المناسب (على سبيل المثال، انتقائية الاصطناعية تعريف (SD) المتوسطة للصيانة بلازميد من الخلايا تحولت أو (YPD) متوسطة غير انتقائي خلاصة الخميرة، ببتون-الدكستروز للخلايا غير حولت). احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، بالتناوب. ملاحظة: 30 درجة مئوية هي درجة الحرارة نمو الأمثل لنموذجي من النوع البري سلالات الخميرة مختبر 38. ومع ذلك، لأن بعض سلالات الخميرة متحولة لا تنمو بالشكل الأمثل عند 30 درجة مئوية وبعض البروتينات الخسف التي تعتمد على درجة الحرارة، ودرجات الحرارة المستخدمة لنمو الخلايا الخميرة ومطاردة سيكلوهيكسيميد يجب أن تحدد تجريبيا 39. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس عشرالبريد الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) من كل ثقافة بين عشية وضحاها. ملاحظة: قد تكون الخلايا في مرحلة النمو لوغاريتمي أو ثابتة ولكن ينبغي أن يكون وصلت الحد الأدنى كثافة من شأنها أن تسمح التخفيف إلى OD 600 = 0.2 في 15 مل من المتوسط ​​الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الثقافات بين عشية وضحاها إلى OD 600 قيمة 0.2 في 15 مل من المتوسط ​​الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخميرة في 30 درجة مئوية، والهز حتى الخلايا تصل إلى مرحلة النمو منتصف لوغاريتمي (اي ان يكون OD 600 بين 0.8 و 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال نمو الخلايا الخميرة، نفذ ما يلي في التحضير لإجراء سيكلوهيكسيميد مطاردة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين كتلة الحرارة التي يمكن أن تستوعب 15 مل أنابيب مخروطية إلى 30 درجة مئوية لمدة الحضانة من الخلايا في وجود سيكلوهيكسيميد. يضاف الماء إلى آبار كتلة الحرارة للسماح توزيع الحرارة كفاءة الثقافات. يضاف الماء إلى كل هذا جيدا أن 15 مل أنبوب مخروطي الشكل سوف يتسبب في منسوب المياه في الارتفاع، ولكن لا تجاوز، الشفة من البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين كتلة حرارة الثانية التي يمكن أن تستوعب 1.5 مل أنابيب microcentrifuge إلى 95 درجة مئوية لمدة تمسخ البروتين بعد تحلل الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل دافئ متوسطة النمو الطازجة (1.1 مل في نقطة زمنية في الثقافة إلى أن يعاير) إلى 30 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر 20x ووقف مزيج ما قبل المسمى أنابيب microcentrifuge (أنبوب واحد في وقت نقطة لكل ثقافة أن يعاير). وضع أنابيب على الجليد. تنبيه: أزيد الصوديوم، وهو عنصر في 20x ووقف ميكس، هي سامة عن طريق الابتلاع عن طريق الفم أو ملامسة الجلد. اتبع توصيات الشركة المصنعة عند إعداد وتخزين ومعالجة أزيد الصوديوم. في حال التعرض العرضي، والتشاور المادية ورقة بيانات السلامة المقدمة من قبل الشركة المصنعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما وصلت إلى خلايا نمو متوسطة لوغاريتمي، وجمع 2.5 OD 600 وحدة من كل ثقافة في نقطة زمنية إلى أن يعاير (على سبيل المثال، 7.5 OD 600 وحدة لتحليل وفرة البروتين في ثلاث نقاط الوقت). أجهزة الطرد المركزي التي تم جمعها الخلايا في أنابيب مخروطية 15 مل في 3،000 x ج في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. ملاحظة: واحد OD 600 وحدة مساوية لكمية من الخميرة الموجودة في 1 مل الثقافة في لOD 600 من 1.0. يمكن تحديد حجم الثقافة (في مل) المطلوبة لحصاد X OD 600 وحدة (V) ​​باستخدام المعادلة التالية: V = X OD 600 وحدة / قياس OD 600. على سبيل المثال، لحصاد 7.5 OD 600 وحدة زراعة الخلايا الخميرة في وOD 600 من 1.0، وجمع 7.5 OD 600 وحدة / 1.0 = 7.5 مل الثقافة الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend كل بيليه خلية في 1 مل من 30 درجة مئوية (قبل تحسنت) متوسط ​​نمو جديدة في 2.5 OD 600 وحدة من الخلايا (على سبيل المثال، 3 مل 7.5 OD 600 وحدة). </li></ol> 2. سيكلوهيكسيميد تشيس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن تعليق خلية الخميرة التي كتبها حضانة لمدة 5 دقائق في كتلة C الحرارة 30 درجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جهاز توقيت لالعد حتى من 00:00. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للبدء في مطاردة سيكلوهيكسيميد، اضغط على &quot;ابدأ&quot; على جهاز ضبط الوقت. بسرعة،ولكن بعناية، قم بالخطوات التالية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة سيكلوهيكسيميد إلى التركيز النهائي من 250 ميكروغرام / مل إلى تعليق الخلية الأولى الخميرة (على سبيل المثال، إضافة 37.5 ميكرولتر من 20 ملغ / مل الأسهم سيكلوهيكسيميد إلى 3 مل من التعليق الخلية)، ودوامة لفترة وجيزة لخلط. تنبيه: سيكلوهيكسيميد غير مهيج الجلد وسامة عن طريق الابتلاع عن طريق الفم. اتبع توصيات الشركة المصنعة عند إعداد وتخزين ومعالجة سيكلوهيكسيميد. في حال التعرض العرضي، والتشاور المادية ورقة بيانات السلامة المقدمة من قبل الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فورا بعد إضافة سيكلوهيكسيميد وvortexing ل، ونقل 950 ميكرولتر (~ 2.4 OD 600 وحدة) من تعليق خلية الخميرة مع سيكلوهيكسيميد إضافة إلى أنبوب microcentrifuge قبل المسمى يحتوي على 50 ميكرولتر مزيج 20x وتوقف الجليد الباردة. دوامة أنبوب microcentrifuge، ومكان على الجليد حتى يتم جمع كل العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق خلية الخميرة إلى 30 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.3.1 خلال 2.30.3 لكل من تعليق خلية الخميرة المتبقية على فترات زمنية منتظمة (على سبيل المثال، كل 30 ثانية، بحيث يضاف سيكلوهيكسيميد إلى نموذج رقم 1 الساعة 0:00، نموذج رقم 2 في 00:30، نموذج رقم 3 في الساعة 1:00 ، الخ.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كل نقطة زمنية لاحقة، تعليق دوامة الخميرة خلية ونقل 950 ميكروليتر إلى أنابيب microcentrifuge المسمى يحتوي على 50 ميكرولتر قبل المبردة 20x ووقف ميكس. دوامة ومكان جمع الخلايا على الجليد. العودة أنابيب مخروطية 15 مل إلى 30 درجة مئوية كتلة الحرارة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على سبيل المثال، لمجموعة من الخلايا 30 دقيقة بعد إضافة سيكلوهيكسيميد (على افتراض 30 ثانية فترات بين الجمع سيكلوهيكسيميد إلى تعليق خلية الخميرة في بداية دورة زمنية)، دوامة وإزالة 950 ميكرولتر من تعليق خلية من عينة # 1 في 30:00 . تكرار لنموذج رقم 2 في 30:30، وهلم جرا. ملاحظة: لمنع تسوية من الخميرة، تعليق خلية دوامة في أنابيب مخروطية 15 مل تقريبا كل 5 دقائق طوال فترة المطاردة. بدلا من ذلك، تعليق خلية الخميرةالصورة يمكن الاحتفاظ بها في حمام مائي التحريض مستمر لمدة التجربة سيكلوهيكسيميد مطاردة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تم جمع كل العينات، بيليه جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6500 x ج في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. إزالة طاف قبل pipetting أو الطموح. الخلايا هي الآن جاهزة للتحلل القلوية. بدلا من ذلك، والمفاجئة تجميد مكعبات الخلايا في النيتروجين السائل ومخزن في -80 درجة مئوية. </li></ol> 3. بعد القلوية البروتين استخراج (معدلة من 16،40) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من الماء المقطر إلى كل خلية بيليه. و resuspend pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم إلى كل عينة. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا معلق في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. في هذه المرحلة، لم هي lysed خلايا الخميرة، والتي لم يتم الافراج عن البروتينات 40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 18000 x ج في المزاج الغرفةature لمدة 30 ثانية. إزالة طاف قبل pipetting أو الطموح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز الخلايا، إضافة 100 ميكرولتر من العازلة عينة Laemmli إلى كل خلية بيليه. و resuspend pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing ل. ملاحظة: حضانة متتابعة من الخلايا التي تحتوي على هيدروكسيد الصوديوم وLaemmli النشرات عينة العازلة البروتينات في شكل متوافق مع دوديسيل الصوديوم وكبريتات إس دي إس بايج (SDS-PAGE) باستخدام نظام المخزن تشغيل تريس، جليكاين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتفسد تماما البروتينات. ملاحظة: الحضانة في 95 ° C قد لا تكون مناسبة لتحليل البروتينات التي تكون عرضة لتجميع (على سبيل المثال، والبروتينات مع عدة قطاعات الغشاء). قد تصبح هذه البروتينات غير قابلة للذوبان عندما حضنت في درجات حرارة مرتفعة 41. وبالتالي، لتحليل هذه البروتينات، ينبغي المحتضنة لست] في درجات حرارة منخفضة (على سبيل المثال، 37 درجة مئوية - 70 درجة مئوية) لمدة 10 - 30 دقيقة، كما تحدد تجريبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لست] أجهزة الطرد المركزي في 18000 x ج في ريال عمانيدرجة الحرارة أوم لمدة 1 دقيقة لتكوير المواد غير القابلة للذوبان. طاف (بالفاعلات البروتين المستخرج) جاهز للانفصال من قبل SDS-PAGE واللاحقة تحليل لطخة الغربي. بدلا من ذلك، لست] مخزن في -20 درجة مئوية. </li></ol> 4. ممثل SDS-PAGE والغربية والإجراءات التنشيف (مقتبس من 16) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتين تحميل معايير الوزن الجزيئي وحجم مصمم تجريبيا للست] على هلام SDS-PAGE. ملاحظة: اختر نسبة الأكريلاميد ومكررا الأكريلاميد في هلام SDS-PAGE على أساس الوزن الجزيئي للبروتين من الفائدة. بشكل عام، وانخفاض المواد الهلامية نسبة أكثر ملاءمة لحل أعلى البروتينات ذات الوزن الجزيئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصلت تشغيل هلام في 200 V حتى الجبهة صبغ الحافة السفلية من هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البروتينات من الهلام إلى فلوريد البولي (PVDF) الغشاء عن طريق التحويل الرطب في 20 V ل60-90 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع غشاء التي يحتضنها في تريس مخزنة المالحة (السلS) التي تحتوي على الحليب الخالي من الدسم 5٪، هزاز، في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة أو عند 4 درجات مئوية خلال الليل. ملاحظة: لمنع نمو الجراثيم في وجود غشاء حضنت بين عشية وضحاها، فمن المستحسن أن تشمل أزيد الصوديوم في عرقلة الحل في تركيز النهائي من 0.02٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية محددة للبروتين من الفائدة في TBS مع 0.1٪ توين 20 (TBS / T)، والحليب الخالي من الدسم 1٪، هزاز، في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع TBS / T، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع المناسبة الضد الثانوي fluorophore مترافق في TBS / T مع الحليب الخالي من الدسم 1٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، هزاز. ملاحظة: Fluorophores وحساسة للضوء. لذلك، التخفيفات الأجسام المضادة مترافق fluorophores يجب أن تكون مستعدة في الظلام، وحضانة للأغشية في وجود الأجسام المضادة مترافق fluorophores والخطوات اللاحقة غسل ينبغي أن يحدث في lightproof (على سبيل المثال، احباط الملفوفة) شاركntainers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع TBS / T، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة غشاء باستخدام LI-COR أوديسي CLX والبرمجيات صورة ستوديو (أو معدات التصوير مقارنة والبرمجيات)، بناء على توصيات الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحصول على صورة غشاء، واحتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية محددة لبروتين تحكم تحميل في TBS / T مع الحليب الخالي من الدسم 1٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع TBS / T، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع المناسبة الضد الثانوي fluorophore مترافق في TBS / T مع الحليب الخالي من الدسم 1٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع TBS / T، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غشاء صورة كما في الخطوة 4.9. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في هذه الورقة، وتقدم طريقة لتحليل حركية تدهور البروتين. هذه التقنية يمكن تطبيقها بسهولة إلى مجموعة من البروتينات التي تدهورت بفعل مجموعة متنوعة من الآليات. من المهم أن نلاحظ أن التجارب سيكلوهيكسيميد مطاردة تقرير عن حركية تدهور تجمع الدولة المطرد للبروتين معين. ويمكن استخدام تقنيات أخرى لتحليل حركية تدهور فئات معينة من السكان من البروتينات. على سبيل المثال، يمكن تتبع مصير الهادمة من البروتينية الوليدة من خلال تحليل نبض مطاردة 55. في مثل هذه التجارب، والبروتينات الوليدة هي لفترة وجيزة نبض المسمى (على سبيل المثال، مع الأحماض الأمينية المشعة). يمكن تتبع التغيرات في وفرة من البروتينات الوليدة المسمى (التي قد تكون أو لا تعكس التغييرات في المطردة البروتين وفرة الدولة) مع مرور الوقت. مطاردة سيكلوهيكسيميد مناسبة لتحليل استقرار البروتين خلال دورة زمنية قصيرة نسبيا (أي ما يصل إلى ساعتين). على مدى أطول وقت جourses (أي اثنين من ساعات إلى أيام)، سيكلوهيكسيميد، مثبط العالمي للترجمة، هي سامة للخلايا، على الأرجح بسبب نضوب اليوبيكويتين 56. وعلاوة على ذلك، يحلل الاستقرار البروتين على دورات زمنية أطول هم أكثر عرضة للخطر بسبب الآثار غير المباشرة للإعاقة على مستوى العالم تخليق البروتين على تدهور البروتين من الفائدة (على سبيل المثال، تدهور البروتين قصيرة الأجل تشارك في تدهور البروتين فائدة). بالتالي أفضل ملاءمة لدراسة تدهور البروتينات طويلة العمر غيرها من التقنيات، مثل نبض مطاردة التجارب وضع العلامات الأيض، هي ويمكن أن تؤدى إلى التثبت من صحة النتائج التي تم الحصول عليها في التجارب سيكلوهيكسيميد مطاردة. توقيت إضافة سيكلوهيكسيميد ومجموعة من الخلايا هو أحد الاعتبارات الهامة في هذا الإجراء. دقة له أهمية خاصة في تحليل البروتينات قصيرة الأجل جدا، والانحرافات الصغيرة في الوقت انقضى من عدي سيكلوهيكسيميدنشوئها إلى الحصاد خلية يمكن أن يكون لها تأثير كبير على حركية تدهور واضح. وعلاوة على ذلك، من دون خطة واضحة لتنفيذ هذه الخطوات الحساسة للوقت، وهي تجربة قد تؤول بسرعة إلى حالة من الفوضى والإحباط. لهذا السبب، فمن المستحسن أن إضافة سيكلوهيكسيميد على الثقافات في فترات المخطط لها، العادية. واقترح فترات لمدة 30 ثانية في هذا البروتوكول، ولكن توقيت قد يتم تعديلها لتتناسب مع مستوى الراحة والبراعة من المحقق. المحققين المبتدئين قد تجد أنه من المفيد لكتابة جدول مرات جمع العينات قبل البدء في التجربة وشطب كل مجموعة مقررا كما يحدث. في خطوات 1.7 و 1.8 من بروتوكول الموصوفة هنا، تتركز مزارع الخلايا الخميرة في تقليل أحجام متوسطة النمو لسهولة التلاعب أثناء إجراء سيكلوهيكسيميد مطاردة لاحق. ومع ذلك، الطرد المركزي من خلايا الخميرة يدفع بسرعة معينة استجابات التوتر الخلوي (على سبيل المثال، مسارات مما يشير إلى أنوتفعيلها من خلال الحرمان الجلوكوز) 57،58. ولذلك حذر المحققون ضد فترات طويلة من الطرد المركزي. عند تحليل الاستقرار من البروتينات التي قد تكون حساسة لالطرد المركزي، قد ترغب المحققين لإضافة سيكلوهيكسيميد مباشرة على الثقافات مرحلة منتصف السجل دون الطرد المركزي مسبق. في مثل هذه الحالات، يجب إضافة سيكلوهيكسيميد إلى نفس تركيز النهائي (250 ميكروغرام / مل)، ويمكن حصاد عينات خلية الخميرة التي كتبها المنهجيات التي لا تتطلب خطوة الطرد المركزي الأولية (على سبيل المثال، والترشيح السريع) 57. وعلاوة على ذلك، في خطوات 2،3-2،5، يتم نقل العينات التي تم جمعها في كل نقطة زمنية لمحلول يحتوي على أزيد الصوديوم ووضعها على الجليد. هذه الشروط تمنع استمر تدهور البروتين لمدة المطاردة. وتجدر الإشارة إلى أن أزيد يقلل من تركيز الخلوي للاعبي التنس المحترفين 59، الأمر الذي يعيق تحديدا نشاط البروتياز ATP التي تعتمد على. في حين انخفاض درجة الحرارة ينبغي ليسوتو تقليل المعدل الذي غير ATP التي تعتمد على البروتينات وظيفة العمليات والمحققين يدرسون البروتينات التي تدهورت بفعل هذه الآليات قد تختار بدلا من ذلك لالتقاط تجميد الكريات خلية في النيتروجين السائل كما هو المقطوع كل عينة. تم تعديل بروتوكول عينة لتحلل الخلايا وبروتوكول ممثل لالنشاف الغربي المدرجة في هذه المخطوطة من التقارير السابقة 16،40. في طريقة تحلل بعد القلوية الموصوفة هنا، هيدروكسيد الصوديوم المعالجة يعزز استخراج البروتينات الخميرة على إضافة لاحقة من عينة العازلة Laemmli. الآلية التي يحدث بها هذا الجهاز يتميز سيئة 40. ومع ذلك، يتم بالفاعلات السكريات مثل تلك التي وجدت في جدران الخلايا الخميرة في الظروف القلوية 60. ولذا فمن المغري إلى التكهن بأن حضانة في وجود هيدروكسيد الصوديوم جزئيا أو كليا spheroplasts خلايا الخميرة (أي يزيل مكونات جدار الخلية)، مما يجعلها أكثر sensitivه إلى SDS المنظفات الموجودة في المخزن المؤقت عينة Laemmli. لأنه يتم الافراج البروتينات في ظل ظروف تغيير طبيعة غاية، ليس من الضروري أن يدرج مثبطات الأنزيم البروتيني في عينة العازلة Laemmli. قد يتم تعديل طريقة محددة للتحلل الخلية بما يتناسب مع تجربة معينة. على سبيل المثال، قد لا تكون الطريقة تحلل بعد القلوية مناسبة للبروتينات وفرة منخفضة أو البروتينات التي يتم الكشف عنها سيئة من قبل لطخة غربية. في مثل هذه الحالات، الأساليب التي تشمل خطوة حمض الخليك ثلاثي الكلور هطول الأمطار على التركيز عينات البروتين قد يكون الأنسب 61. وعلاوة على ذلك، هناك عدة اعتبارات هامة بشأن اختيار الأجسام المضادة، وتحميل السيطرة على اختيار وسيلة بديلة لكشف (على سبيل المثال، النشاف الغربي chemiluminescent باستخدام الفيلم أو التصوير الرقمي الأنظمة) وقد تم مؤخرا مناقشة 16. ويمكن تنفيذ الكميات وفرة البروتين بعد العلاج سيكلوهيكسيميد. وتباع العديد من أنظمة التصوير مع حزم البرمجيات التي تسهلهذا التحليل. يمكن تنفيذ سيكلوهيكسيميد مطاردة لتحليل تدهور مجموعة متنوعة من البروتينات الخميرة ويمكن تكييفها لدراسة الاستقرار البروتين في الخلايا حقيقية النواة الأخرى. كما هو موضح في هذا البروتوكول، ويتبع العلاج سيكلوهيكسيميد التي تحلل الخلايا والكشف عن وفرة البروتين عن طريق تحليل لطخة غربية. اعتمادا على التطبيق، ومع ذلك، وفرة البروتين بعد العلاج سيكلوهيكسيميد يمكن تقدير من قبل مجموعة من التقنيات، بما يتناسب مع أهداف البحث. على سبيل المثال، إذا كان حجم البروتين ليس عاملا ذا أهمية للتحليل، قد يتعرض لست] الخلية إلى وصمة عار نقطة أو تحليل انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA)، الذي يقدم تقريرا عن وفرة البروتين، ولكن ليس من الواضح الوزن الجزيئي 62. لالبروتينات على سطح الخلية (أو fluorescently الداخلي الموسومة البروتينات الداخلية)، التدفق الخلوي يمكن أن تستخدم لتحديد وفرة البروتين من عينات في أوقات مختلفة بعد سيكلوهيكسيميد إضافة 51. فلووسوف rescence المجهر العلاج سيكلوهيكسيميد التالية تقدم معلومات عن كل من وفرة البروتين وتوطين 18. مجموعة من ركائز والكائنات، والتطبيقات المصب قابلة للمطاردة سيكلوهيكسيميد يجعل هذه التقنية وسيلة مرنة للغاية ومفيدة لدراسة تدهور البروتين.

البروتينات تؤدي وظائف مهمة في كل عملية الخلوية تقريبا. تتطلب العديد من العمليات الفسيولوجية وجود بروتين معين (أو البروتينات) لفترة محددة من الزمن أو في ظل ظروف معينة. لذا الكائنات مراقبة وتنظيم وفرة البروتين لتلبية احتياجات الخلوية 1. على سبيل المثال، الحلقيات (البروتينات التي تتحكم في انقسام الخلايا) موجودة في مراحل محددة من دورة الخلية، وارتبط فقدان مستويات السيكلين المنظمة مع تشكيل الورم الخبيث 2. بالإضافة إلى تنظيم مستويات البروتين لتلبية احتياجات الخلوية، وخلايا توظف آليات الهادمة لمراقبة الجودة للقضاء تتجمع، غير المجمعين، أو الشاذة إلا جزيئات البروتين 3. السيطرة على وفرة البروتين ينطوي على تنظيم كل من تخليق الجزيئات (النسخ والترجمة) وتدهور (RNA الانحلال والتحلل البروتيني). ضعف أو الإفراط في تدهور البروتين يساهم في أمراض متعددة، بما في ذلك السرطان، والتليف الكيسي، والظروف العصبية، واضطرابات القلب والأوعية الدموية 4-8. وبالتالي تمثل آليات بروتين الأهداف العلاجية واعدة لمجموعة من الأمراض 9-12. تحليل البروتينات عند نقطة زمنية واحدة (على سبيل المثال، لطخة الغربية 13، وتدفق الخلوي 14، أو المجهري مضان 15) على لقطة من مطردة البروتين وفرة الدولة دون الكشف عن الإسهامات النسبية للتركيب أو تدهورها. وبالمثل، تعكس المقايسات مراسل القائم على نمو مستويات البروتين حالة مستقرة على مدى فترة زمنية طويلة دون التمييز بين تأثيرات التوليف وتدهور 15-20. فمن الممكن أن نستنتج مساهمة العمليات الهادمة لمستويات البروتين حالة مستقرة من خلال مقارنة وفرة قبل وبعد تثبيط مكونات محددة لآلية الهادمة (على سبيل المثال، عن طريق تعطيل دواء والمتواجدكتبها asome 21 أو ضرب الجينات افترض أن تكون هناك حاجة لتدهور 13). أي تغيير في مستويات البروتين حالة مستقرة بعد تثبيط مسارات الهادمة دليلا قويا للمساهمة التحلل البروتيني إلى السيطرة على البروتين وفرة 13. ومع ذلك، فإن مثل هذا التحليل لا يزال لا يوفر معلومات حول حركية دوران البروتين. مطاردة سيكلوهيكسيميد تليها الغربية النشاف تتغلب على نقاط الضعف هذه من خلال السماح للباحثين لتصور تدهور البروتين مع مرور الوقت 22-24. وعلاوة على ذلك، لأنه كشف عن البروتين بعد مطاردة سيكلوهيكسيميد تتم عادة من قبل النشاف الغربي، النظائر المشعة والخطوات مناعي طويلة ليست مطلوبة لمطاردة سيكلوهيكسيميد، على عكس العديد من التقنيات مطاردة نبض شيوعا، والتي تتم أيضا إلى تصور تدهور البروتين 25. وقد تم تحديد سيكلوهيكسيميد أولا كمركب مع المضادة للفطريات السليمالعلاقات التي تنتجها السبحية البكتيريا إيجابية الجرام سنجابي 26،27. وهو جزيء خلايا قابلة للاختراق الذي يمنع على وجه التحديد عصاري خلوي حقيقيات النوى (ولكن ليس organellar) الترجمة عن طريق إضعاف الريباسي النبات 28-31. في تجربة سيكلوهيكسيميد مطاردة، يضاف سيكلوهيكسيميد إلى الخلايا، ويتم جمع aliquots من الخلايا فورا وعند نقاط زمنية محددة بعد إضافة مركب 22. وهي lysed الخلايا، ويتم تحليل وفرة البروتين في كل نقطة زمنية، وعادة من قبل لطخة غربية. انخفاض في وفرة البروتين بعد إضافة سيكلوهيكسيميد يمكن أن يعزى بثقة إلى تدهور البروتين. سوف بروتين غير مستقر نقصان في وفرة مع مرور الوقت، في حين أن البروتين مستقر نسبيا سوف يحمل تغيرا طفيفا في وفرة. وقد آليات تدهور البروتين انتقائية الحفظ جدا في جميع أنحاء حقيقيات النوى. وعلم لأول مرة بكثير من ما هو معروف عن تدهور البروتين فيوحقيقي النواة وحيدة الخلية نموذج، خميرة الخباز (مهدها الخميرة) 25،32-36. ومن المرجح أن يواصل تقديم رؤى جديدة وهامة في تدهور البروتين الدراسات مع الخميرة. تم توضيح طريقة لمطاردة سيكلوهيكسيميد في خلايا الخميرة يليه تحليل لطخة الغربي من وفرة البروتين هنا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="607">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable borosilicate glass tubes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-961-32</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)</td>
			<td style="width:105px;">Dot Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51028068</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:216px;">New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td>
			<td style="width:105px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:119px;">M1053-0450</td>
			<td style="width:167px;">A tube roller is recommended to maintain overnight&#160; starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td>
			<td style="width:105px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:119px;">M1053-4004</td>
			<td>For use with tube roller</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td style="width:105px;">Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Centrifuge 5430</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td>5427 000.216&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td>F-35-6-30</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td>
			<td style="width:105px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.554.205</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22364120</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:216px;">Analog Dri-Bath Heaters</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1172011AQ</td>
			<td style="width:167px;">It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 &#176;C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Heating block for 12 x 15-ml conical tubes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-473-70</td>
			<td style="width:167px;">For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-718-9Q</td>
			<td style="width:167px;">For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td>
			<td style="width:105px;">Li-Cor</td>
			<td>9140-01</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">IPFL00010</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td>
			<td style="width:105px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">459250</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21065</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae

تنظيم وفرة البروتين ضروري لكل عملية الخلوية تقريبا. تعكس البروتين وفرة التكامل بين معدلات تخليق البروتين وتدهور البروتين. العديد من فحوصات الإبلاغ عن وفرة البروتين (على سبيل المثال، لمرة واحدة نقطة النشاف الغربي، وتدفق الخلوي، المجهري مضان، أو المقايسات مراسل القائم على النمو) لا تسمح التمييز من آثار النسبية للترجمة والتحلل البروتيني على مستويات البروتين. توضح هذه المقالة استخدام مطاردة سيكلوهيكسيميد تليها الغربية النشاف لتحليل تحديدا تدهور البروتين في حقيقي النواة وحيدة الخلية النموذجية، خميرة الخباز (مهدها الخميرة). في هذا الإجراء، يتم تحضين الخلايا الخميرة في وجود سيكلوهيكسيميد متعدية المانع. يتم جمع أجزاء مأخوذة من خلايا مباشرة بعد وعند نقاط زمنية محددة بعد إضافة سيكلوهيكسيميد. وهي lysed الخلايا، ويتم فصل لست] من قبل الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد FOص تحليل لطخة الغربي من وفرة البروتين في كل نقطة زمنية. يسمح الإجراء سيكلوهيكسيميد مطاردة تصور حركية تدهور سكان الولاية ثابت من مجموعة متنوعة من البروتينات الخلوية. ويمكن استخدام هذا الإجراء لتحقيق متطلبات الوراثية للوالتأثيرات البيئية على تدهور البروتين.

لتوضيح منهجية مطاردة سيكلوهيكسيميد، تم تحليل استقرار Deg1 -Sec62 (الشكل 1)، وهذا نموذج الخميرة الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) تدهور -associated (ايراد) الركيزة، 42-44. في ايراد، ومراقبة الجودة الانزيمات اليوبيكويتين يغاز إرفاق تساهمي سلاسل من اليوبيكويتين بروتين صغيرة لالبروتينات الشاذة مترجمة إلى غشاء ER. تتم إزالة هذه البروتينات polyubiquitylated في وقت لاحق من لائحة وتدهورت قبل proteasome و، كبير، البروتيني عصاري خلوي 45. ويستهدف هذا البروتين Deg1 -Sec62 للتدهور بعد ذلك باستمرار وaberrantly يشرك translocon، قناة تسهل النبات البروتين في التجويف ER أو غشاء 43. وبالمثل، ئي الثدييات باء، وهو عنصر البروتين من البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة، يشارك باستمرار في translocon ER، وبعد ذلك يخضع التدهور من خلال آلية ذات الصلة عند شفة لهاشركاء ملزم معرف غائبة 46-48. وهكذا، تحليلات تدهور Deg1 -Sec62 في خلايا الخميرة قد تسفر التبصر في تدهور البروتينات التي بإصرار أو aberrantly إشراك translocon، ووصف مؤقتا اراد-T (مقابل translocon المرتبطة بها) ركائز 43. وقد أشارت دراسات سابقة إلى أن مهام Hrd1-ER المقيمين اليوبيكويتين يغاز مع انزيم التصريف اليوبيكويتين Ubc7 لتحفيز تدهور Deg1 -Sec62 16،42-44. بروتين الغشاء Cue1 المراسي Ubc7 إلى غشاء ER وينشط الإنزيم 49-51. ومع ذلك، لم يتم التحقيق مباشرة شرطا لCue1 ​​في تدهور Deg1 -Sec62. لاختبار الفرضية القائلة بأن Cue1، مثل Hrd1 وUbc7، مطلوب لتدهور كفاءة Deg1 -Sec62، تعرض من النوع البري وخلايا الخميرة متحولة معربا عن Deg1 -Sec62 لمطاردة سيكلوهيكسيميد ووستحليل لطخة الخرشنة (الشكل 2A). البروتين Deg1 -Sec62 يهاجر على SDS-PAGE كما أنواع متعددة. وهذا يتفق مع الدراسات السابقة التي أظهرت تعديل واسع في مرحلة ما بعد متعدية من البروتين 43،44،52. في خلايا الخميرة من النوع البري، كان Deg1 -Sec62 المتدهورة بسهولة. كما لوحظ سابقا، وفقدان إما Hrd1 أو Ubc7 استقرت إلى حد كبير البروتين Deg1 -Sec62 42-44. وكما كان متوقعا، فقد استقرت Deg1 -Sec62 في غياب Cue1 (إلى حد مماثل في غياب Ubc7)، مما يؤكد وجود دور للبروتين Ubc7-التفاعل في ايراد-T. وكميا نسبة البروتين Deg1 -Sec62 المتبقية في كل نقطة زمنية وتآمر في الشكل 2B. ونلاحظ أن معدل ما يبدو من اختفاء Deg1 -Sec62 في البرية من نوع الخلايا قد يكون التقليل من معدل تدهور الوليدة Deg1 -Sec62(أي نصف الحياة البروتين، والذي يمكن تحديده بشكل مباشر عن طريق تحليل نبض مطاردة 43). لأنه من النوع البري الخميرة تتحلل بنشاط بروتين Deg1 -Sec62 قبل إضافة سيكلوهيكسيميد، يتم تقليل وفرة حالة مستقرة من Deg1 -Sec62 إلى حد كبير في هذه الخلايا (مقارنة مع الخلايا التي تضعف تدهور). وهذا يمكن أن يكون موضع تقدير من خلال مقارنة وفرة Deg1 -Sec62 في نقطة زمنية الأولية لكل سلالة في الشكل 2A. وعلاوة على ذلك، أي حيوانية مقاومة للتحلل البروتين الركيزة (على سبيل المثال، إذا يتراكم البروتين في برك داخل الخلايا التي يتم منع تدهور) قد تظهر استقرارا نسبيا في الخلايا من النوع البري على مدار الساعة من التجربة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53975/53975fig1.jpg" /> الشكل 1. نموذج لتدهور Deg1 </em&gt; -Sec62 التالية الشاذة إشراك Translocon (A) تصوير تخطيطي Deg1 -Sec62 Deg1 -Sec62 تتكون من العناصر التالية، في تسلسل:. Deg1 (67 الأحماض الأمينية الأمينية محطة من الخميرة قامع النسخي MATα2)، وهو العلم (F) حاتمة، البروتين 2-الغشاء Sec62، ونسختين من المكورات العنقودية الذهبية البروتين (برا). (ب) بعد الإدراج المشترك متعدية الطبيعي للشرائح الغشاء وهما في غشاء الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا)، جمعية المستمرة من Deg1 -Sec62 مع translocon يطلق الشاذ، Deg1 معتمد على، بعد متعدية المشاركة translocon. جزء من محطة الأمينية عصاري خلوي يدخل وaberrantly على الأرجح لا يزال داخل وtranslocon. (C) في أعقاب اشتباك translocon، واليوبيكويتين يغاز Hrd1 ubiquitylates Deg1 -Sec62. ويساعد Hrd1 من قبل انزيم التصريف اليوبيكويتين Ubc7، الذي يرتكز في غشاء ER التي كتبها Cue1. يو بي، أحادية البروتين اليوبيكويتين. يستخرج (D) Ubiquitylated Deg1 -Sec62 من غشاء ER والمتدهورة التي proteasome و، والتخفيف من translocon إعاقة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53975/53975fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53975/53975fig2.jpg" /> الشكل 2. سيكلوهيكسيميد تشيس تليها الغربية التنشيف يشير إلى أن Cue1 هو مطلوب لكفاءة تدهور Deg1 -Sec62. تحولت خلايا (A) الخميرة من المورثات المشار إليها مع الخميرة القسيم المركزي ترميز البلازميد Deg1 -Sec62 (pRS416 ف MET25 - Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA، AmpR / URA3 43) وتعرض لتحليل سيكلوهيكسيميد مطاردة. بروتينتم فصل الصورة من كل نقطة زمنية (أي ما يعادل 0.125 OD 600 وحدة) على 8٪ هلام SDS-PAGE والكشف عن طريق ويسترن النشاف مع الأجسام المضادة الثانوية أرنب لمكافحة فأر، التي تربط مباشرة الحواتم البروتين C-الطرفية من Deg1 - Sec62 البروتين الانصهار. كما تحكم التحميل، وحضنت الغشاء في وقت لاحق مع الأجسام المضادة المحددة لPgk1. لقد تم نسخ هذه التجربة ثلاث مرات؛ المصورة نتائج ممثل. (ب) الكمي للبيانات في الفقرة (أ) تم تنفيذها باستخدام برامج التصوير (انظر الجدول المواد). تم تحديد كثافة مضان الإجمالية للمنطقة تشمل البروتين Deg1 -Sec62 لكل عينة. تم استقراء خلفية كثافة مضان لكل عينة من متوسط ​​كثافة مضان من بكسل بالقرب من البروتين Deg1 -Sec62. تم طرح هذا كثافة مضان الخلفية استقراء من إجمالي كثافة مضان أن تسفر fluoresc المعدل<html> كثافة سينعقد لكل عينة. أجريت التحديد الكمي مماثلة لمجموعه، الخلفية، وكثافة مضان المعدلة لPgk1، وهو بروتين تحكم التحميل التي لا تختلف في الظروف يعاير وفرة. للمقارنة بين وفرة البروتين Deg1 -Sec62 بين العينات، تم تحديد نسبة من شدة إشارة تعديل من Deg1 -Sec62 إلى Pgk1 لكل عينة. وقد تم تعريف نسبة Deg1 -Sec62 / Pgk1 إلى 100٪ للنقطة لأول مرة (أي مباشرة بعد إضافة سيكلوهيكسيميد) لكل سلالة قيد التحليل. كمية Deg1 -Sec62 المتبقية في نقطة زمنية لاحقة (أي نسب Deg1 -Sec62 / Pgk1) تم حسابها كنسبة مئوية من نسبة Deg1 -Sec62 / Pgk1 عند نقطة لأول مرة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53975/53975fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:k</html style=";text-align:right;direction:rtl">الآثار البيئية، مع next.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="3"> الاصطناعية تعريف (SD) الحد الأدنى من الخميرة المتوسطة </td><td rowspan="3"> 2٪ سكر العنب، 0.67٪ قاعدة الخميرة النيتروجين دون الأحماض الأمينية، 0.002٪ الأدنين، 0.004٪ اليوراسيل، 0.002٪ أرجينين، 0.001٪ الحامض الاميني، 0.006٪ آيسولوسين، 0.006٪ ليسين، 0.004٪ ليسين، 0.001٪ ميثيونين، 0.006٪ فينيل ألانين، 0.005 ٪ ثريونين، 0.004٪ التربتوفان. للصلب (لوحة) المتوسطة، وتشمل 2٪ أجار. </td><td> يتم إعداد 1. المتوسطة الانتقائي عن طريق حذف حمض أميني المناسب (ق) أو القواعد النيتروجينية. </td></tr><tr><td> 2. للراحة، فإنه يجوز الإبقاء على هذه المكونات كحلول الأسهم تتركز على النحو التالي. ويمكن الاحتفاظ الأحماض الأمينية كحل 100X الأسهم التي تحتوي على جميع الأحماض الأمينية المطلوبة. ويمكن الاحتفاظ الخميرة قاعدة النيتروجين في حل 20x والأوراق المالية (13.4٪). فإنه يجوز الإبقاء على سكر العنب في 40٪ محلول المخزون. ويمكن الاحتفاظ الأدينين واليوراسيل من 1٪ الحلول الأسهم في 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم. </td></tr><tr><td> 3.تعقيم متوسطة قبل التعقيم. </td></tr><tr><td rowspan="3"> استخراج-ببتون خميرة سكر العنب (YPD) ريتش الخميرة المتوسطة </td><td rowspan="3"> 1٪ خلاصة الخميرة، 2٪ ببتون، 2٪ سكر العنب (اختياري: 0.002٪ الأدنين). للصلب (لوحة) المتوسطة، وتشمل 2٪ أجار. </td><td> 1. لمنع النمو البطيء ومميزة تلوين حمراء معينة سلالات الخميرة مختبر في غياب (أو منخفضة وفرة) من الأدنين، ويمكن أن يضاف الأدنين إلى متوسطة النمو YPD. </td></tr><tr><td> 2. للراحة، فإنه يجوز الإبقاء على بعض المكونات كحلول الأسهم تتركز على النحو التالي. فإنه يجوز الإبقاء على سكر العنب في 40٪ محلول المخزون. فإنه يجوز الإبقاء على الأدنين كحل الأسهم بنسبة 1٪ في 0.1 م هيدروكسيد الصوديوم. </td></tr><tr><td> 3. تعقيم متوسطة قبل التعقيم. </td></tr><tr><td> 20x ووقف ميكس </td><td> 200 ملي أزيد الصوديوم، 5 ملغ / مل ألبومين المصل البقري </td><td> أزيد الصوديوم السامة عن طريق الابتلاع عن طريق الفم أو ملامسة الجلد. اتبع الشركة المصنعةتوصيات عند إعداد وتخزين ومعالجة أزيد الصوديوم. في حال التعرض العرضي، والتشاور المادية ورقة بيانات السلامة المقدمة من قبل الشركة المصنعة. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 20 ملغ / مل سيكلوهيكسيميد </td><td rowspan="2"></td><td> 1. إعداد في الإيثانول. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية. </td></tr><tr><td> 2. سيكلوهيكسيميد هو مهيج الجلد وسامة عن طريق الابتلاع عن طريق الفم. اتبع توصيات الشركة المصنعة عند إعداد وتخزين ومعالجة سيكلوهيكسيميد. في حال التعرض العرضي، والتشاور المادية ورقة بيانات السلامة المقدمة من قبل الشركة المصنعة. </td></tr><tr><td> 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم </td><td></td><td> إعداد في الماء. هيدروكسيد الصوديوم يتفاعل مع الزجاج. لذلك، لتخزين على المدى الطويل، وينبغي الحفاظ 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم في حاويات من البلاستيك. </td></tr><tr><td rowspan="2"> العازلة عينة Laemmli </td><td rowspan="2"> 2٪ SDS، 10٪ الجلسرين، 5٪ و# 946؛ -mercaptoethanol، 60 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 0.008٪ برموفينول الأزرق </td><td> وغالبا ما أعد 1. العازلة عينة Laemmli عن طريق تمييع الأسهم أكثر تركيزا (على سبيل المثال، 5X). </td></tr><tr><td> 2. يمكن إضافة برموفينول الأزرق صبغ للكثافة المطلوبة. و&quot;قرصة&quot; (كمية صغيرة جدا استغلالها من على حافة ملعقة) هو عادة كافية. </td></tr><tr><td> Laemmli تشغيل العازلة (5X) </td><td> 125 ملي تريس، 960 ملي الجلايسين، 0.5٪ SDS </td><td> لإعداد 1 لتر من 1X Laemmli تشغيل العازلة، وتمييع 1: 5 في DH 2 O. </td></tr><tr><td> نقل تريس خلات-SDS العازلة (5X) </td><td> 125 ملي تريس خلات (الرقم الهيدروجيني 8.8)، 960 مم الجلايسين، 0.05٪ SDS </td><td> لإعداد 20 لتر من 1X تريس خلات-SDS نقل العازلة، والجمع بين 4 لتر ​​من الأسهم 5X، 4 لتر ​​من الميثانول، و 12 L من درهم 2 O. </td></tr><tr><td> 10X تريس مخزنة المالحة (TBS) </td><td> 500 ملي تريس، 1.5 M كلوريد الصوديوم. درجة الحموضة تعديلها إلى 7.5</td><td> لإعداد 1 لتر من 1X TBS، وتمييع 01:10 في DH 2 O. 1X TBS يمكن أن تستكمل مع المنظفات توين-20 و الحليب الخالي من الدسم مسحوق، حسب الاقتضاء. </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الحلول المستخدمة في هذه الدراسة. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم سلالة </td><td> الاسم المستعار </td><td> التركيب الوراثي ذات الصلة </td><td> المراجع </td></tr><tr><td rowspan="7"> VJY42 </td><td rowspan="7"> MHY501 </td><td> MATα </td><td rowspan="7"> تشن وآخرون، 1993 </td></tr><tr><td> HIS3-Δ200 </td></tr><tr><td> leu2-3،112 </td></tr><tr><td> ura3-52 </td></tr><tr><td> lys2-801 </td></tr><tr><td> trp1-1 </td></tr><tr><td> gal2 </td></tr><tr><td rowspan="8"> VJY47 </td><td rowspan="8"> YWO55. MHY507 </td><td> MATα </td><td rowspan="8"> Jungmann وآخرون، 1993؛ روبنشتاين وآخرون، 2012 </td></tr><tr><td> HIS3-Δ200 </td></tr><tr><td> leu2-3،112 </td></tr><tr><td> ura3-52 </td></tr><tr><td> lys2-801 </td></tr><tr><td> trp1-1 </td></tr><tr><td> gal2 </td></tr><tr><td> ubc7Δ :: LEU2 </td></tr><tr><td rowspan="8"> VJY56 </td><td rowspan="8"> YTX105. MHY1364 </td><td> MATα </td><td rowspan="8"> Biederer وآخرون، 1997؛ رابيد وآخرون، 2006 </td></tr><tr><td> HIS3-Δ200 </td></tr><tr><td> leu2-3،112 </td></tr><tr><td> ura3-52 </td></tr><tr><td> lys2-801 </td></tr><tr><td> trp1-1 </td></tr><tr><td> gal2 </td></tr><tr><td> cue1Δ :: HIS3 </td></tr><tr><td rowspan="8"> VJY172 </td><td rowspan="8"> MHY6199 </td><td> MATα </td><td rowspan="8"> هذه الدراسة </td></tr><tr><td> HIS3-Δ200 </td></tr><tr><td> leu2-3،112 </td></tr><tr><td> ura3-52 </td></tr><tr><td> lys2-801 </td></tr><tr><td> trp1-1 </td></tr><tr><td> gal2 </td></tr><tr><td> hrd1Δ :: kanMX4 </td></tr></tbody></table> الجدول 2. سلالات الخميرة المستخدمة في هذه الدراسة. جميع سلالات هي مسانج مع MHY500 53. وصفت VJY42، VJY47، وVJY56 سابقا 49،53،54. جيل مفصل سلالة واستراتيجية تأكيدا لVJY172 (المعد لهذه الدراسة) متوفر عند الطلب.

Watch this Scientific Journal Video about Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

سيكلوهيكسيميد تحليل تشيس من تدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

cycloheximide-chase-analysis-protein-degradation-saccharomyces

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

28.7K Views.  Ball State University. Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Video: Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

تشريح السكيراء الجعوية زقاق

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

التعبير وتنقية عبر الغشاء التليف الكيسي بروتين منظم المواصلة في خميرة الخباز

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

تنقية التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم البروتين المعبر عنه في<em&gt; خميرة الخباز</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

الفحص النمو القائم على مراسل لتحليل منهجي من تدهور البروتين

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.