We thank the Dictyostelium Stock Center for strains and reagents. This study was financed by grants from the Swiss National Science Foundation and the Canton of Basel.

<ol><li> Observe a resposta de fome precoce de Dictyostelium discoideum por microscopia de lapso de tempo. <ol><li> Cultivar células DH1.10 ou células cora -deficient num balão de Erlenmayer contendo HL-5 meio (para 1 L: 5 g de proteose peptona, 5 g thiotone E peptona, 10 g de glicose, 5 g de extracto de levedura, 0,35 g de Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0,35 g de KH 2 PO 4, 0,05 g de sulfato de di-hidroestreptomicina-, pH 6,6) a 22 ° C numa incubadora com agitação com uma rotação de 160 rpm. Manter as células a uma densidade entre 0.01 x 10 6 células / ml e 2 x 10 6 culas / ml. </li><li> Examinar a agregação de células, por meio da colheita de log-fase de cultivo de células DH1.10 21 ou cora as células -deficient 10 gerado no fundo DH1.10, crescidas em cultura com agitação com HL-5 forma a 22 ° C. Para fazer isso, tomar uma quantidade apropriada de células (normalmente entre 10 e 50 ml), centrifuga-se durante 3 min a 400 xg e lavar as células duas vezes em BSS (10 mM de NaCl, 10 mM de KCl, CaCl 2 2,5 mM, pH 6,5). </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Subsequentemente, as células em placas a uma densidade de (5, 10, 20, ou 40) 4 x 10 células / cm2 numa placa de 24 poços. Permitir-lhes a aderir durante 1 hora a 22 ° C no BSS. </li><li> Visualize a agregação por microscopia de lapso de tempo, tal como descrito antes de 10, a tomada de imagens a cada 135 segundos. utilizando uma imagem de células vivas configurar equipada com objectiva 5X e uma câmara de dispositivo de carga acoplada de multiplicação de electrões automatizado pelo software adequado (ver Materiais Tabela). </li></ol></li><li> pulsante AMPc das células Dictyostelium discoideum durante inanição. <ol><li> Examinar o efeito de impulsos de cAMP aplicados externamente sobre o desenvolvimento de células DH1.10 21 ou DH1.10 Cora -deficient células 10, por colheita de células. Para fazer isso, tomar uma quantidade apropriada de células (normalmente entre 10 e 50 ml), centrifuga-se durante 3 min a 400 xg e lavar duas vezes em BSS. </li><li> Count células utilizando um hemocitómetro e ressuspender as células a uma densidade de 1 x 10 7 células / mL em BSS. Agitar as culturas (160 rpm) a 22 ° C durante 2 h antes de aplicar pulsos. Adicionar pulsos de cAMP utilizando uma bomba peristáltica controlado temporizador. Programar a bomba para fornecer um impulso de 5 segundos a cada 6,5 ​​min de 15 uL de 50 nM de cAMP (concentração final) durante um período de 5 horas. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Subsequentemente, a chapa células a uma densidade de (5, 10, 20, ou 40) 4 x 10 células / cm2 numa placa de 24 poços. Permitir a aderir durante 1 h em BSS. </li><li> Visualizar a agregação após 16 horas a 22 ° C por microscopia de campo brilhante utilizando uma objectiva de 5x. </li></ol></li><li> Indução de Dictyostelium discoideum desenvolvimento através da exposição ao meio condicionado. <ol><li> Prepare meio condicionado fresco como descrito 22. Coletar células DH1.10 de fase log 21 ou DH1.10 Cora -deficient células 10, de tremer cultmentos com HL-5 forma a 22 ° C, utilizando uma pipeta, centrifuga-se durante 3 min a 400 xg e lavar as células três vezes em PBM (fosfato de potássio 0,02 M, 10 mM de CaCl2, e 1 mM de MgCl2, pH 6,1). </li><li> Células utilizando um hemocitómetro Contagem, ressuspender estas em PBM a uma densidade de 1 x 10 7 células / ml e agita-se durante 20 h a 110 rpm / 22 ° C. </li><li> Recolhe meio condicionado após a centrifugação a 400 x g durante 3 min e clarificar por centrifugação a 8000 × g durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Filtrar o meio condicionado através de um filtro de 0,45 um (ver Tabela Materiais) e dilui-se três vezes em PBM. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro e placa a uma densidade de (5, 10, 20, ou 40) 4 x 10 células / cm2 numa placa de 24 poços. Lhes permitem aderir durante 1 hora a 22 ° C. </li><li> Troca de sobrenadante das células com o meio condicionado previamente preparada. </li><li> Visualize a agregação de umepois de 16 horas por microscopia de campo brilhante usando uma objetiva de 5X. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Weijer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+cell+movement+in+Dictyostelium.">Morphogenetic cell movement in Dictyostelium.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).</li><li>Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+discoideum:+a+model+system+for+cell-cell+interactions+in+development.">Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development.</a> Science. 245, 1054-1058 (1989).</li><li>Kimmel, A. R., Firtel, R. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+multicellular+differentiation+in+Dictyostelium+discoideum+is+regulated+by+coronin+A.">Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A.</a> Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).</li><li>Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+holistic+phylogeny+of+the+coronin+gene+family+reveals+an+ancient+origin+of+the+tandem-coronin,+defines+a+new+subfamily,+and+predicts+protein+function.">A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function.</a> BMC Evol Biol. 11, 268 (2011).</li><li>Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+guard:+coronin+proteins+in+innate+and+adaptive+immunity.">On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity.</a> Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).</li><li>Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. 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L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronin,+an+actin+binding+protein+of+Dictyostelium+discoideum+localized+to+cell+surface+projections,+has+sequence+similarities+to+G+protein+beta+subunits.">Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits.</a> EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).</li><li>Shina, M. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+80+x+10(3)+Mr+protein+mediates+sensing+of+cell+density+and+the+onset+of+development+in+Dictyostelium.">A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium.</a> Development. (112), 269-278 (1991).</li><li>Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteinous+factor+mediating+intercellular+communication+during+the+transition+of+Dictyostelium+cells+from+growth+to+differentiation.">A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation.</a> Zoological science. 12, 61-69 (1995).</li><li>Mehdy, M. C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+factor+and+cyclic+AMP+jointly+regulate+cell-type-specific+gene+expression+in+Dictyostelium+discoideum.">A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum.</a> Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).</li><li>Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+density-sensing+factor+controls+development+in+Dictyostelium.">A density-sensing factor controls development in Dictyostelium.</a> Genes Dev. 6, 390-400 (1992).</li><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium.">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Dev Biol. 391, 1-16 (2014).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

As proteínas coronin são encontrados na maioria dos taxa do clado eucariótica. Dictyostelium discoideum coronin A, o homólogo de coronin mamíferos 1, está envolvida na resposta de fome precoce, uma vez que coronin Um deficiente em células não são capazes de formar centros de agregação durante o início do desenvolvimento ciclo 10. Para ser capaz de avaliar quantitativamente e com precisão o atraso no desenvolvimento entre as cepas, um microscópio imagens de células vivas set-up com o controlador de estágio automatizado é uma ferramenta essencial. D. discoideum utiliza cAMP como uma molécula de sinalização essencial durante vários estágios de seu ciclo de vida 1-4. Um dos pontos de controlo durante o qual o cAMP é necessário é a transição a partir de uma única célula para a formação de estruturas multicelulares. O aparecimento de ondas acampamento depois ~ 6 horas de fome é detectado pelas células e fornece o sinal quimiotático de avançar para um centro de agregação 5. estes cAMPondas pode ser mimetizado experimentalmente por pulsando fome D. células discoideum com o acampamento a cada 6,5 min durante um período de 5h 8,9. Utilizando este procedimento, é importante para privar as células de até 2h antes de aplicar os impulsos de cAMP, a fim de obter resultados fiáveis. Utilizando esta montagem experimental, fomos capazes de mostrar que A é coronin actuando a montante da sinalização de cAMP, como estes impulsos aplicados externamente resgatou o desenvolvimento em células cora -deficient (Figura 3 e 5). Estes resultados também indicam que enquanto coronin A parece ter um papel essencial na detecção da resposta de fome no início, é dispensável para os processos tais como a quimiotaxia e a agregação das células, por si só 10. O ensaio de agregação em si é um método robusto para estudar o desenvolvimento precoce de Dictyostelium discoideum. No entanto, existem várias armadilhas que podem influenciar a reprodutibilidade destes experiments, e por isso é importante que vários fatores são levados em conta: a idade das células desempenha um papel importante na análise de células Cora -deficient. Estas células tendem a compensar o fenótipo e re-total, aproximadamente após 2 semanas a partir do ponto que eles são descongelados. A densidade das células é um factor crucial, assim, como as células que exibem um defeito de sinalização e não um defeito quimiotáctico pode tendem a agregar a densidades mais elevadas devido à concentração aumentada de factores de fome início. A importância da contagem precisa e diluição das células nestes ensaios não pode ser exagerada. Para diferentes estirpes, um ajuste de múltiplas variáveis ​​do ensaio, tais como densidades celulares, o tempo de aderência, o tempo de desenvolvimento, serão necessários. O ensaio de agregação como descrito aqui é uma técnica versátil, que pode ser modificado para se adequar a diferentes investigações: as células podem ser fome, ou desenvolvimento pode ser estimulada ou inibida utilizando diferentes compostos, todosdevido a uma modulação específica de agregação. O aqui descrito set-up também permite abordagens imparciais para identificar estirpes com defeitos precoces de desenvolvimento, bem como para a identificação de genes ou factores que são importantes para o desenvolvimento inicial. Esta é também grande desvantagem do método: o ensaio de agregação é uma versão reduzida do ciclo de desenvolvimento completo. Portanto, não é adequado para a análise de fenótipos que afectam estágios posteriores do ciclo de desenvolvimento. A principal vantagem é a possibilidade de adoptar o ensaio de agregação em grande escala e formato automatizado: em placas de 48 poços e com 16 horas de evolução verificada durante a imagem automatizado, o ensaio de agregação revela-se mais tempo e recursos eficientes do que o desenvolvimento de placas de agar. Em experiências em que a resposta de fome inibidos cedo, utilizando impulsos de cAMP aplicados externamente, que mostrou que coronin A está envolvida na detecção de factores segregados por &lt;em&gt; células Dictyostelium sobre fome. O mecanismo preciso de coronin sinalização mediada por uma resposta durante a fome precoce permanece obscura. Vários fatores envolvidos durante esta fase de desenvolvimento têm sido estudadas, em particular fator de meio condicionado (CMF) 25,26. No entanto, se CMF age por conta própria ou com co-fatores permanece obscuro e sua cascata de sinalização é apenas parcialmente compreendida. Usando a capacidade de agregação de células de Dictyostelium sob condições submersas aqui descrito como um positivo read-out para o desenvolvimento permite a realização de experiências de rastreio em grande escala de uma maneira rápida e eficiente, em comparação com ensaios de agregação em superfícies de agar. No entanto, os ensaios de agregação em condições submersas têm a desvantagem de não cumprir o ciclo de desenvolvimento completo como células será preso na fase inicial de agregação. Portanto, a técnica aqui descrita não é apropriada para a análise de proce desenvolvimento posteriorsses. Em resumo, a abordagem experimental aqui documentado pode permitir a caracterização adicional do potencial de factor (es) que induz início inanição coronin entrada dependente de A para a resposta precoce inanição.

A família de proteínas coronin é altamente conservada durante toda eucariotas. Estas proteínas são caracterizadas pela presença de um triptofano-aspartato amino-terminal (WD) região seguido por uma região única ligado a um domínio em espiral espiralada carboxi-terminal contendo 13,14 repetir-(Figura 1). Coronins têm sido implicados numa variedade de funções celulares, incluindo a regulação do citoesqueleto e transdução de sinal 12. Nos mamíferos, até seis moléculas curtas coronin coronin (1-6), bem como um &quot;conjunto&quot; coronin 7, pode ser co-expressa 12,15. Coronin um membro da família é o mais extensivamente estudado, e foi mostrado para ser envolvido na destruição de agentes patogénicos, a sobrevivência das células T e sinalização neuronal. Como, exatamente, coronin 1 realiza estas actividades ainda não está claro. Enquanto coronin 1 foi mostrado para regular Ca 2+ e de sinalização dependente de cAMP, bem como de F-actina do citoesqueleto modulação 16-18, o potencial de co-expression de até 7 membros da família em mamíferos tornou-se um desafio para estudar a função molecular de coronins nesses sistemas, devido a potenciais despedimentos. Ao contrário de organismos de mamíferos, o discoideum eucariota Dictyostelium inferior expressa apenas dois membros coronin familiares (coronin A, o ortólogo de mamífero coronin 1 e coronin B, ortï¿½logo de coronin mamíferos 7) com funções aparentemente não redundantes 15,19,20. Este fato faz com Dictyostelium discoideum um modelo potente para estudar a função dos coronins. Para estudar o papel de coronin A em Dictyostelium discoideum, que induziu o ciclo de desenvolvimento pela inanição em placas de cultura de tecidos contendo solução de sal equilibrada tampão (BSS) usando quer células do tipo selvagem ou de células sem coronin Um 10. Descobrimos que as células sem coronin A foram incapazes de formar agregados multicelulares sobre fome. Para uma avaliação quantitativa exacta deste fenótipoimagens de células vivas automatizado descrito neste protocolo é uma ferramenta vital. O defeito na iniciação da resposta de fome no início de células sem coronin A pode ser resgatado por fornecimento de impulsos de AMPc, o que sugere que coronin A actua a montante da cascata do AMPc. A aplicação exógena de impulsos de campo para simular a iniciação do desenvolvimento tem sido utilizado por vários laboratórios no passado 8,9. No entanto, este procedimento é também conhecido por ser altamente dependente da densidade das células e de temporização. Portanto, o protocolo aqui descrito destina-se a reduzir estes variabilidades, a fim de garantir um elevado grau de reprodutibilidade. Tomadas em conjunto, as técnicas utilizadas nestes estudos fornecem ferramentas robustas para investigar as funções das proteínas durante as fases iniciais do ciclo de desenvolvimento de Dictyostelium discoideum e tem o potencial para identificar para cima, bem como efectores a jusante de coronin uma função.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HL-5 media (for 1L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4&#8727;2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>211693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiotone E peptone</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>211684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8727;2H2O</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydrostreptomycin-sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1954000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 &#956;M CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>self made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>self made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m Filtropure S filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-tissue-culture-plates-23/087721h">08-772-1H</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellobserver microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>custom built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioVision software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC Microprocessor&#8211;controlled dispensing pump</td>
			<td>ISMATEC</td>
			<td>ISM 931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 135M microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>491237-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Shaker</td>
			<td>Inforst HT Minitron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the function of coronin a in the early starvation response of dictyostelium discoideum by aggregation assays

Dictyostelium discoideum ameba são encontrados no solo, alimentando-se de bactérias. Quando as fontes de alimentos se tornam escassos, eles secretam fatores para iniciar um programa de desenvolvimento multicelular, durante o qual células individuais chemotax para os centros de agregação 1-4. Este processo é dependente da libertação de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) 5. O AMPc é produzido em ondas através da acção concertada de adenilato-ciclase e fosfodiesterase, e liga-se a receptores de G cAMP acoplados à proteína 6,7. Um ensaio amplamente utilizado para analisar os mecanismos envolvidos no ciclo de desenvolvimento do Dictyostelium discoideum eucariota inferior é baseado na observação de agregação de células em condições submersas 8,9. Este protocolo descreve a análise do papel de coronin A no ciclo de desenvolvimento pela inanição em placas de cultura de tecidos imersos em solução salina equilibrada (BSS) 10. Coronin A é um membro da PR amplamente conservadaotein família de coronins que têm sido implicados numa grande variedade de actividades 11,12. Dictyostelium células que carecem coronin A são incapazes de formar agregados multicelulares, e este defeito pode ser resgatado por fornecimento de impulsos de AMPc, o que sugere que coronin A actua a montante do cAMP cascata 10. As técnicas descritas nestes estudos fornecem ferramentas robustas para investigar as funções das proteínas durante as fases iniciais do ciclo de desenvolvimento de Dictyostelium discoideum a montante da cascata do AMPc. Assim, a utilização deste ensaio de agregação pode permitir a um estudo mais aprofundado da coronin Uma função e fazer avançar nossa compreensão da biologia coronin.

As células deficientes em coronin Um show de um defeito no desenvolvimento inicial (Figura 2). Na ausência de um coronin células são incapazes de formar agregados multicelulares, que é o passo inicial durante o ciclo de desenvolvimento de Dictyostelium discoideum. Portanto, coronin Um parece desempenhar um papel durante a resposta precoce fome e / ou a sinalização de cAMP. Com efeito, a falta de formação de agregados multicelulares na ausência de coronin A é acompanhada por uma redução da sinalização de cAMP 10. No entanto, a aplicação de pulsos de cAMP exógenos restaura completamente o fenótipo de tipo selvagem (Figura 3). Isto implica que coronin A, em vez de ser directamente envolvido na sinalização de cAMP, as funções a montante da cascata do AMPc (Figura 5). Quando as células Dictyostelium estão expostos a condições famintos eles induzem a secreção de fome no início factores 22,23. Um dos melhores characterized factores envolvidos na resposta precoce inanição é condicionado factor de forma (CMF) 22. Com base nos nossos resultados, a hipótese de que coronin Um quer regula a secreção de factores de fome estes primeiros ou está envolvido na transdução de sinal induzida por estes factores. A fim de ser capaz de diferenciar entre estes dois efeitos que realizada condicionado experiências médias. Células Cora -deficient de tipo selvagem ou foram expostos a sobrenadantes de células quer Cora -deficient 10 (Figura 4) do tipo selvagem faminto ou. Estes sobrenadantes são iniciadores potentes da formação de agregados multicelulares e, por conseguinte, conter factores que iniciam vias de sinalização a jusante de desenvolvimento, incluindo a sinalização de cAMP. Os nossos resultados mostram que o sobrenadante das células cora -deficient foi igualmente capaz de induzir o desenvolvimento, como foi o caso para o sobrenadante a partir de células do tipo selvagem (Figura 4). Isto implica que Cora -células deficientes são capazes de produzir e segregar factores de fome início a níveis semelhantes aos seus controlos do tipo selvagem. No entanto, as células cora -deficient não são nem capaz de responder ao seu próprio sobrenadante nem ao sobrenadante fornecida a partir de células do tipo selvagem (Figura 4). Portanto, coronin Um parece estar envolvida nas vias de sinalização induzidas por factores de fome início, em vez de a sua expressão / secreção de 10 (Figura 5). Em geral, para ser capaz de investigar ainda mais os sinais secretadas por células de Dictyostelium fome que induzem o ciclo de desenvolvimento, o ensaio de agregação em condições submersas é um potente de leitura. Células semeadas em densidades mais elevadas espontaneamente agregado, devido a uma abundância de todos os sinais necessários. No entanto, a densidades inferiores apenas a adição de meio condicionado irá induzir agregação celular (Figura 4) 22,24 </sup&gt;. Por conseguinte, este procedimento pode ser utilizado para fraccionar o meio condicionado e estudar componentes distintos para a sua actividade durante a resposta precoce inanição. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53972/53972fig1.jpg" /> Figura 1: Coronin proteínas presentes em mamíferos e Dictyostelium discoideum coronin A família é caracterizado pela presença de regiões de repetição WD-N-terminal seguido por um domínio único e uma região em espiral enrolada de terminal-C.. Enquanto os mamíferos expressar 7 proteínas coronin (A), Dictyostelium discoideum contém apenas dois membros da família (B), tornando o risco de redundância menos provável quando se estuda a sua função. Coronin A é o ortólogo de coronin mamíferos 1 e coronin B mostra uma estrutura de domínio semelhante ao coronin 7. Abreviaturas: CC, domínio de hélice enrolada; UD, de domínio exclusivo; WD repete, triptofano<html> repete-aspartato. Comprimento é dado para as sequências de rato (A) em aminoácidos (AA). Modificado de Pieters et al., 2013 12. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53972/53972fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53972/53972fig2.jpg" /> Figura 2:. Cora - Dictyostelium discoideum são incapazes de agregar durante a resposta de fome precoce do tipo selvagem (A) ou (B) células de Dictyostelium Cora -deficient foram semeadas em placas com múltiplas cavidades a uma densidade de 2 x 10 5 células / cm2, fome em BSS e trabalhada ao longo de um período de 20 h. Barra de escala = 100 pm..jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53972/53972fig3.jpg" /> Figura 3: aplicado externamente cAMP pulsa resgatar o defeito de desenvolvimento precoce de Cora - Dictyostelium discoideum do tipo selvagem vegetativo (A e B) e células Cora -deficient (C e D) foram lavadas e carente de 2 horas antes de ser pulsadas com (B. e D) ou sem (a e C) 50 nM de cAMP durante 5 h a cada 6,5 min na suspensão. As células foram então lavadas, ressuspensas em BSS, e colocados numa placa de Petri a uma densidade de 10 x 10 4 células / cm2. As imagens foram recolhidas 20 horas após a inoculação das células. Barra de escala = 100<html> ^ m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53972/53972fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53972/53972fig4.jpg" /> Figura 4: Cora -deficient Dictyostelium discoideum é capaz de produzir todos os fatores necessários para a indução do desenvolvimento, mas são incapazes de responder a elas crescimento exponencial do tipo selvagem e células Cora -deficient foram lavadas em PBM e semeadas em placas de múltiplos poços a uma densidade de (. 5, 10, 20, ou 40) 4 x 10 células / cm2, incubadas em meio condicionado obtido a partir do tipo selvagem (a) ou as células que passam fome Cora -deficient (B). As imagens foram tiradas 16 horas após a sementeira das células. Barra de escala = 100 pm.tp_upload / 53972 / 53972fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53972/53972fig5.jpg" /> Figura 5:. Modelo actual de Coronin Uma função em Dictyostelium discoideum Coronin A está envolvida na transdução de sinal de factor (es) secretado durante a resposta precoce inanição levando à indução da cascata do AMPc e a progressão através do ciclo de desenvolvimento. Modificado de Vinet et al., 2014 10. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53972/53972fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

Investigando a função de Coronin A no Precoce fome resposta de<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Por agregação Ensaios

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

investigating-function-coronin-early-starvation-response

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

7.2K visualizações.  University of Basel. The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

Vídeo: Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando a resposta optocinético para estudar a função visual de zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Biologia

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

Rastreamento Deformações Tissue Morfogenéticas no embrião de galinha precoce

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Medindo o transporte de catiões de Na, K e H, K-ATPase em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos por espectrofotometria de absorção atômica: uma alternativa para Ensaios de Radioisótopos

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

In Vitro Agregação ensaios utilizando hiperfosforilada Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune system &#8212; such as neutrophils, dendritic cells, and macrophages &#8212; retain the innate ability to detect and clear such invading pathogens through phagocytosis1. Phagocytosis involves choreographed events of membrane reorganization and actin remodeling at the cell surface2,3. Phagocytes successfully internalize and eradicate foreign molecules only when all stages of phagocytosis are fulfilled. These steps include recognition and binding of the pathogen by pattern recognition receptors (PRRs) residing at the cell surface, formation of phagocytic cup through actin-enriched membranous protrusions (pseudopods) to surround the particulate, and scission of the phagosome followed by phagolysosome maturation that results in the killing of the pathogen3,4.
Imaging and quantification of various stages of phagocytosis is instrumental for elucidating the molecular mechanisms of this cellular process. The present manuscript reports methods to study the different phases of phagocytosis. We describe a microscope-based approach to visualize and quantify the binding, phagocytic cup formation, and the internalization of particulate by phagocytes. As phagocytosis occurs when innate receptors on phagocytic cells encounter ligands on a target particle bigger than 0.5 &#181;m, the assays we present here comprise the use of pathogenic fungi Candida albicans and other particulates such as zymosan and IgG-coated beads.

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

Visualizando os estágios iniciais da fagocitose

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Investigando a função de Coronin A no Precoce fome resposta de

Resumo

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