This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.

As práticas utilizadas para obter os tecidos de camundongos foram aprovadas pelo corpo para a Protecção dos Animais (OPBA) da Universidade de Trento (Itália), o Protocolo n. 04-2015, o Decreto conforme art.31 Legislativo n. 26/2014. Todos os ratos foram mantidos no Centro Organismo Modelo do Centro de Biologia Integrativa (CIBIO), da Universidade de Trento, Itália. Cuidado: Para evitar qualquer degradação RNA das amostras, preparar todos os buffers que utilizam água tratada com DEPC para minimizar a contaminação RNase. 1. Preparação de polissomas a partir de cérebros inteiros <ol><li> Reunindo tecidos cerebrais (15 min) <ol><li> Eutanásia de tipo selvagem estirpe de murganho C57BL / 6 com asfixia com CO2 durante 5 min 36. Cuidadosamente dissecar o cérebro para fora a partir do crânio 36, colocar o tecido em um tubo de 1,5 ml e colocá-lo imediatamente em azoto líquido. Armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Preparação de lisado (30 min) <ol><li> Pulverizar todo o tecido cerebral usandoum almofariz e pilão em azoto líquido. </li><li> Transferir cerca de 25 mg de pó para um tubo de microcentrífuga e imediatamente a frio (para evitar o descongelamento do tecido pulverizado) adicionar 0,8 ml de tampão de lise (ver Tabela 1) e interromper a célula por pipetagem para cima e para baixo 25 vezes rapidamente. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 12.000 xg durante 1 min a 4 ° C para sedimentar os detritos celulares. </li><li> Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação e manter o tubo em gelo durante 15 min. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar os núcleos e as mitocôndrias. </li><li> Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação. </li><li> Armazenar o sobrenadante a -80 ° C durante um máximo de 6 meses ou utilizá-lo imediatamente. </li></ol></li><li> preparação em gradiente de sacarose e centrifugação (2 horas e 30 min) <ol><li> Lavagem de ultracentrífuga tubos extensivamente com RNase água (dietilpirocarbonato água tratada (DEPC-água) ou comercial) umd 3% de H 2 O 2 / DEPC H2O solução. </li><li> Colocar os tubos em gelo e adiciona-se 5,5 ml de solução fria de 50% de sacarose na parte inferior de cada tubo (ver Tabela 1 para as soluções de sacarose). Adiciona-se cuidadosamente a 15% gota a gota uma solução de sacarose, permanecendo perto da interfase, a fim de preservar uma interfase afiado, até que o tubo está completamente cheia. Quando o tubo está completamente cheia, a fechar com uma tampa de borracha para evitar a formação de bolhas de ar. </li><li> Em uma sala fria suavemente fixar os tubos na horizontal e mantê-lo nessa posição durante 2 horas. Após este tempo, os tubos de endireitar-se lentamente de volta para a posição vertical e colocá-los em gelo. Os gradientes está agora pronto para ser usado. Em alternativa, preparar o gradiente de sacarose de 15-50%, utilizando um gradiente convencional ex. </li><li> Em um quarto frio remover cuidadosamente 1,0 ml a partir do topo do gradiente e sobrepor a gota sacarose a gota, com o lisado citosólica (isto é, o sobrenadante obtido no step 1,2). </li><li> Cuidadosamente abaixe as para dentro dos baldes de rotor basculante. Centrifugar os gradientes de 100 min a 180000 xg, a 4 ° C usando uma ultracentrífuga. </li><li> Depois da centrifugação, os tubos em deixar os baldes durante 20 min a 4 ° C para permitir que os gradientes de estabilizar. </li></ol></li><li> fraccionamento em gradiente de sacarose (2 h) <ol><li> Remova cuidadosamente um tubo de ultracentrífuga do rotor de ultracentrífuga e montá-la no dispositivo coletor de um gradiente de densidade Fracionamento do sistema. Recolher fracções de 1 ml monitorizando a absorvância a 260 nm com um detector de UV / VIS (Ver Figura 1 Painel superior). Mantenha as fracções recolhidas em gelo. </li><li> Preparar alíquotas de 30-40 uL das fracções de interesse, mantê-los em gelo antes de as armazenar a -80 ° C até utilização. Não use alíquotas ou fracções de sacarose que foram submetidos a mais de dois ciclos de congelamento-descongelamento (ver Figura 1 painel inferior). </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Preparação de Amostras para Microscopia de Força Atômica (3 horas) <ol><li> Usando a fita, retire as folhas de mica. </li><li> Lave as folhas de mica 3-4 vezes com DEPC-água e colocá-lo em uma pequena placa de Petri. Em seguida, seque a superfície com o ar. </li><li> Cobrir a mica com 200 ul de 1 mM de 4 Niso e incubar durante 3 min a RT. </li><li> Remover a solução de níquel e, em seguida, seca-se a superfície utilizando ar. Realizar todos os passos futuros, a 4 ° C através da colocação da placa de Petri com a mica em gelo. </li><li> Descongelar uma aliquota obtida em 1.4.2 em gelo e cuidadosamente adicionar toda a amostra gota a gota na mica. Utilizando uma ponta de pi 100-200, espalhar a amostra em toda a superfície da mica. Incubar a amostra em gelo durante 3 min. </li><li> Cobrir a gota folha de mica a gota com 200 ul de Tampão de frio-AFM (ver Tabela 1) e incubar durante 1 hora em gelo. </li><li> Imaging no líquido <ol><li> Retire cuidadosamente o tampão de-AFM e lavar as folhas de mica 3-4 vezs com 200 ul fria Tampão-AFM para remover o excesso de sacarose. Em seguida, lavar as folhas de mica 3 vezes com solução de lavagem frio (ver Tabela 1), deixando a superfície mica coberta por alguns microlitros de solução. </li><li> Ir ao ponto 3 (aquisição de imagem). </li></ol></li><li> Imaging no ar <ol><li> Cuidadosamente remover o tampão e lava-se a AFM mica 3-4 vezes com 200 ul de Tampão de frio-AFM para remover o excesso de sacarose. Em seguida, lava-se a mica 3 vezes com solução de lavagem frio (ver Tabela 1) e drenar o excesso de água, utilizando papel. </li><li> Deixar a secagem da amostra sob o capô química com a parte superior da placa de Petri parcialmente aberta. Após 2 horas, feche a placa de Petri e armazenar a RT. Medir a amostra depois de 2-3 horas, à medida que eles são estáveis ​​durante anos. </li></ol></li></ol> 3. Aquisição de Imagem (15 min por imagem após estabilização térmica) Nota: polissomos imobilizadas em mica podem ser visualizados no ar ou no estado líquido, usando o modo AC. <ol><li> Fixe a mica ao titular da amostra usando fita dupla face. </li><li> Insira o suporte da amostra na fase AFM seguindo as instruções do fabricante. Quando imagiologia no estado líquido, se possível, para tentar manter a amostra a uma temperatura inferior a 25 ° C para aumentar a estabilidade no tempo polissoma. </li><li> Selecione um cantilever adequado para imagiologia AC e montá-la no suporte a ponta seguindo as instruções do fabricante. Aqui, o uso de consolas com força constante entre 2-20 N / m para a imagem latente do ar e cerca de 0,1 N / m para a imagem latente líquida. </li><li> Ajustar o ponto de laser sobre o braço de suporte e zero os sinais de detector de quadrante. </li><li> Selecione uma frequência de condução oportuno e conduzir o cantilever com uma amplitude de 10-20 nm. </li><li> Aproxime-se da amostra até a ponta engata na superfície. </li><li> Selecione uma área de digitalização de mm 2x2, adquirir pelo menos 512x512 pixel imagens (pixels de largura &lt;4 nm), seleccionar um modo de subtração de fundo ao vivo e uma escala Z de 20-25 nm. </li><li> Inspecione tele imagem procurando a presença de objectos redondos, caracterizado por a altura entre 10 e 15 nm, quando a aquisição de ar e 25 e 30 nm, quando no estado líquido e a largura na gama de 25-30 nm. Ajustar os parâmetros de referência e de opinião até objetos pontiagudos são visualizados. O fundo deve aparecer relativamente plana em boas amostras, com alguns objetos de altura 2-4 nm (ver Figura 2A e B). </li><li> Se a imagem parece ser bom (como indicado no ponto 3.8), adquirir vários (pelo menos dez) scans 2x2 mícron em diferentes áreas de amostra. </li><li> (opcional). Se necessário, adquirir imagens de alta resolução de polissomos selecionadas (veja a Figura 2C). </li><li> Aplicar correções de software (subtração de avião e linha por linha de algoritmos de correção) para corrigir as imagens de AFM remoção de inclinação arbitrário e efeitos à deriva. </li></ol> 4. Análise de Dados (30 min por imagem) <ol><li> Exportar imagens em ImageJ (opcional: aplicar um fator de escala) preferentei ra me usando um formato de compressão sem perdas, por exemplo, o formato TIFF (ver Figura 3A). </li><li> Use a macro RiboPick.ijm conjunto de ferramentas ImageJ (a ser copiado no ImageJ macro / conjunto de ferramentas subdiretório) para contar ribossomos em polissomos (ver Figura 3B) e calcular propriedades estatísticas da amostra (ver Figura 3C). <ol><li> Começar a carregar uma imagem usando o &lt;image Leia&gt; ferramenta que inicializa o programa. </li><li> Escolha os centros de ribossomas com o padrão &lt;selecção Point&gt; ImageJ ferramenta (Shift + clique esquerdo permite que o multi-seleção de ribossomas). Marque os ribossomos selecionados com o &lt;Marcos ribossomos&gt; ferramenta. coordenadas ribossomas aparecerá em uma janela de texto personalizado. </li><li> Adicionar mais ribossomos ao mesmo polysome repetindo o procedimento indicado no ponto 4.2.2. </li><li> Remover ribossomos erroneamente marcados usando o &lt;Undo última escolha&gt; ferramenta (começa a remover a partir do último ribossomo adicionado ao primeiro212; na polysome atual). </li><li> Quando o polysome for concluída, use o &lt;polysome Novo&gt; ferramenta. Como o número polysome é adicionado como uma sobreposição à imagem, a janela de texto é atualizado. </li><li> Use o &lt;Guardar resultados e perto&gt; para escrever o ribossomo coordena uma imagem PNG que resume ribossomas e polissomos o escolhido arquivo (as unidades padrão da imagem são usados) e. A imagem original é fechado sem ser salvo. </li></ol></li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+studies+of+ribosomal+clusters+synthesizing+hemoglobin.">Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin.</a> Science. 138, 1399-1403 (1962).</li><li>Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysomes+of+eukaryotic+cells+observed+by+electron+microscopy.">Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests in this paper and nothing to disclose.

Como a estrutura do DNA foi provado ser de suma importância para descrever o processo de transcrição e como a organização da cromatina avançado nossa compreensão do controle transcricional da expressão do gene, é essencial analisar a organização e estrutura do polissomos para melhorar a compreensão verdadeiras da tradução e da sua regulação. Com o protocolo descrito, uma densidade óptima de polissomas suavemente imobilizados sobre uma superfície plana, adequados para imagiologia de AFM é obtido. Usando estas condições com amostras convenientemente preparados, quase 50 polissomos por hora podem ser adquiridos, pronto para mais análises e caracterização. Além disso, as amostras secas armazenadas à TA provaram ser adequados para imagiologia após mais de um ano. Para obter êxito imagens polissomas com nosso protocolo, existem alguns passos fundamentais: a utilização de tecidos que tenha sido devidamente congelados rapidamente imediatamente após dissection e armazenado a -80 ° C para minimizar a degradação de ARN; usar o tampão de lise contendo inibidores de cicloheximida e RNase para evitar a dissociação do ribossoma de ARNm; para executar todas as incubações sobre gelo durante a deposição da amostra em mica; e quando da preparação da amostra para geração de imagens AFM no ar, para lavar extensivamente a amostra na mica com tampões de RNase água livre na presença de cicloheximida. O último ponto é particularmente importante. Se a imagem parece conter superfícies lisas aproximadamente na altura certa, mas 100-1.000 nm de largura, esta é uma indicação clara de uma amostra mal lavado (muitas vezes ribossomas / polissomos pode ser ainda observado como, objetos incorporados fracos). Um método para resolver este problema é repetir o procedimento de lavagem, mas isso não costuma mitigar o problema em uma amostra já secou. Neste caso vale a pena começar de novo com uma nova aliquota. Dada a resolução de AFM, este método para polissomos estudando não pode resolver o strucdetalhes turais de interfaces de ribossomais em polissomos. Na verdade, AFM é uma abordagem complementar e mais simples de Cryo-EM, representando uma técnica eficaz e robusto, para adquirir e analisar milhares de polissomos, e entender melhor a organização geral ribossomo em polissomos. Importante, este protocolo tem a vantagem única de identificação de filamentos compatíveis com RNA 27. Isto muito mesmo procedimento pode ser usado para qualquer amostra obtida a partir de qualquer polissomal tecido biológico ou linha celular. Mais importante que também pode ser empregue com sucesso para obter informação específica-transcrição utilizando sistemas de tradução in vitro, tal como foi recentemente demonstrado pela Lauria e colegas de trabalho 35. Esta metodologia irá pavimentar o caminho para várias experiências, para ganhar a compreensão da cinética de polysome formação ou mudanças na organização polysome sob diferentes condições de celulares ou do tecido.

A síntese de proteínas é o processo que consome mais energia nas células 1,2. Por isso, não surpreende que a abundância de proteína são controladas principalmente para a translação em vez de 3,4,5 nível da transcrição. O polissoma é o componente macromolecular fundamental que converte a informação em leituras de ARNm proteicos funcionais. Os polissomas são até agora reconhecida como complexos macromoleculares, onde vários controlos traducionais convergem 6-13. Apesar das centenas de estudos sobre a estrutura do ribossoma 14- 16, os insights moleculares detalhados sobre a dinâmica da tradução e da topologia da polissomos encontrou um interesse limitado. Como consequência, a organização do complexo polissomal ribonucleoproteï¿½a nativa e seu efeito potencial sobre a tradução ainda são questões bastante obscura. Polissomos pode esconder organizações ordenadas e funcionais ainda desconhecidos, potencialmente um reflexo do que nucleossomos e contro epigenéticals ter representado para o campo de transcrição. Na verdade, a investigação desta hipótese intrigante requer estudos adicionais e novas abordagens técnicas. Nesta linha, as técnicas estruturais e de microscopia de força atômica pode proveitosamente colaboram para desvendar novos mecanismos para controlar a expressão do gene, à semelhança do que foi conseguido para a nucleossomo 17,18. Desde a descoberta do ribossoma 14-16, a sua estrutura foi extensivamente caracterizado em procariotas, levedura 19,20 21 e, mais recentemente, em 22 humana, proporcionando a descrição molecular dos mecanismos na base da síntese de proteínas. Polissomas foram reconhecidos inicialmente na membrana do retículo endoplasmático, formando organizações geométricas 2D típicos 14. Como mencionado antes, polissoma montagem não tenha sido o objecto de interesse constante à medida que a estrutura do ribossoma. No passado, têm sido estudados polissomas essencialmente por trtécnicas ansmission EM-base. Só recentemente, técnicas de crio-EM permitiu a reconstrução 3D do polissomos purificados a partir in vitro sistemas de tradução 23-26, lisados ​​celulares humanos 27 ou em células 28. Estas técnicas ofereceu informações mais refinado sobre a organização ribossomo-ribossomo em polissomos 23, 26-28 e uma descrição molecular preliminar das superfícies de contato dos ribossomas adjacentes em polissomos gérmen de trigo 24. Assim, a tomografia crio-EM permite a divulgação de interações ribossomas-ribossomo com detalhes molecular, mas é sobrecarregado por extensa pós-processamento e análise de reconstrução que exigem recursos computacionais pesadas para a manipulação de dados. Além disso, para obter os detalhes moleculares das interacções ribossoma ao ribossoma, um mapa altamente resolvidas do ribossoma é necessário, e este tipo de ribossoma de referência está disponível apenas para algumas espécies. É importante ressaltar que a tomografia crio-EM não é capaz de detectar RNA livre. Therefminério, novas técnicas são necessárias para compreender plenamente a organização da maquinaria de tradução. Ao lado de crio-EM, AFM foi também empregado como uma ferramenta útil para a imagem latente direta de polissomos em eucariotos inferiores 29-33 e humanos 27. Em comparação com EM, AFM não requer a fixação da amostra ou rotulagem. Além disso, as medições podem ser efectuadas em condições fisiológicas próximo e com a possibilidade única de identificar claramente ambos os ribossomas e cadeias de ARN nus 27. Imagiologia de polissomos individuais podem ser realizadas de forma relativamente rápida, a obtenção de milhares de imagens em nano-resolução com pouco esforço pós-processamento em comparação com a extensa e pesada de pós-processamento e análises de reconstrução exigida por microscopia crio-EM. Consequentemente, AFM manipulação e análise de dados não precisa de estações de trabalho caras e poder de computação de alta. Como tal, esta técnica recolhe informação sobre formas polissomal, características morfológicas (tais comoaltura, comprimento e largura), densidades de ribossomas, a presença de RNA livre eo número de ribossomas por polysome 27 com um caudal superior a crio-EM. Em tal forma, AFM representa uma abordagem poderosa e complementar às técnicas de EM para retratar polissomos 27. Aqui nós apresentamos um gasoduto completa de purificação para análise de dados, onde AFM é aplicado à imagem e analisar polissomos cérebro do rato. O protocolo proposto concentra-se em problemas de purificação e na deposição precisa de polissomas em substratos de mica que são usados ​​para imagiologia AFM. Além da análise convencional de partícula que pode ser facilmente realizada com o software comum utilizado pela comunidade AFM, um plug-in ImageJ 34, chamado RiboPick, é apresentado para a contagem do número de ribossomas por polissoma 27, 35.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAseI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89836</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboLock RNAse Inhibitor</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>EO-0381</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>40718</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8532</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Sucrose gradient preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima LE-80K</td>
			<td>Sucrose gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW 41 Ti</td>
			<td>Sucrose gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyallomer tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td>Sucrose gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Fractionation System&#160;</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td>67-9000-176</td>
			<td>Sucrose gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM</td>
			<td>Asylum Research</td>
			<td>Cypher</td>
			<td>Polysome visualization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

peering at brain polysomes with atomic force microscopy

A maquinaria de tradução, ou seja, o polysome ou polyribosome, é uma das maiores e mais complexas máquinas citoplasmáticos nas células. Polissomos, formadas por ribossomas, mRNAs, várias proteínas e RNAs não-codificantes, representam plataformas onde os controles de translação ocorrem integrado. No entanto, enquanto o ribossomo tem sido amplamente estudada, a organização do polissomos carece ainda de compreensão abrangente. Assim, muito esforço é necessário, a fim de elucidar a organização polissoma e qualquer novo mecanismo de controlo de tradução que pode ser incorporado. microscopia de força atômica (AFM) é um tipo de microscopia de varredura por sonda que permite a aquisição de imagens 3D em resolução nanoescala. Em comparação com técnicas de microscopia electrónica (ME), uma das principais vantagens da AFM é que ele pode adquirir milhares de imagens, tanto no ar e em solução, permitindo que a amostra a ser mantida sob condições fisiológicas próximo, sem qualquer necessidade de coloração e fixação próprocedimentos. Aqui, um protocolo detalhado para a purificação precisa da polissomos de cérebro do rato e sua deposição em substratos de mica é descrito. Este protocolo permite a imagiologia polissoma no ar e líquido com a AFM e a sua reconstrução de objectos tridimensionais. Complementar ao microscópio crio-elétron (crio-EM), o método proposto pode ser convenientemente utilizado para analisar sistematicamente polissomos e estudar sua organização.

Sacarose profiling gradiente polissomal de cérebro inteiro de rato É possível purificar polissomas a partir de um ligado celular por perfis polissomal, que separa as macromoléculas de acordo com o seu peso e tamanho. Com perfis polissomal, lisados ​​citoplasmáticos obtidos a partir de células ou tecidos em cultura, tal como neste exemplo, são carregados sobre um gradiente de sacarose linear e processadas por ultracentrifugação para separar RNA isento de 40S e 60S subunidades, ribossomas 80S e polissomas de acordo com os seus coeficientes de sedimentação ( Figura 1 painel superior). A absorvância da amostra a 254 nm e a recolha de fracções permitir o isolamento da fracção de sacarose enriquecida em ribossomas ou polissomas com diferente número de ribossomas por transcrição. As fracções podem ser recolhidas, aliquotadas para imagiologia de AFM e armazenado a -80 ° C (Figura 1painel inferior). Polissomos nativas do cérebro do rato observada por AFM no ar revelam interações ribossomas apertados aquisição de imagem é realizada usando o modo AC (também conhecido como modo de tocar). Esta modalidade é particularmente adequada para a imagiologia de amostras macios (tais como os polissomas) porque a interacção ponta-amostra e as correspondentes forças de cisalhamento são grandemente reduzidas. Desta forma, tanto a ponta e a amostra são preservadas. AFM de imagem permite que a aquisição de dados em alta resolução, com valores exactos que dependem de vários factores, tais como as condições de medição, o tipo de ponta, e as propriedades da amostra. Nas condições descritas neste documento uma resolução lateral de cerca de 4-6 nm e uma resolução vertical de 0,1-0,2 nm são atingíveis. Após a deposição de aliquotas de sacarose em mica, AFM fornece descrições de polissomas que individuaisaparece como agregados de ribossomas embaladas apertadamente (Figura 2A, C e C). Por análise de secção transversal (Figura 2D), a altura dos picos ribossomais é de cerca de 14 nm, em conformidade com o que foi anteriormente observado para ribossomas humanos em polissomas após secagem ao ar 27. O centro de distância do centro de ribossomos identificadas pelo perfil de linha é de 23 nm, o que está de acordo com a dimensão dos ribossomos em solução 37, 38. O número de ribossomas por polissoma a partir de uma fracção única mostra uma distribuição mono-dispersa Figura 3A relata uma imagem AFM típicos obtidos através da aquisição de uma amostra absorvida em mica a partir de uma fracção do gradiente de sacarose. A inserção mostra um zoom digital de um único polissoma, com um factor de ampliação adequados para a identificação de ribosOMES na polissoma. O painel B mostra a mesma imagem após a identificação do ribossoma com a macro RiboPick. círculos vermelhos (ver a inserção) marcar os ribossomas, e um número progressivo (ciano) é usado para ajudar a associação do ribossoma coordena com uma polysome específico. A distribuição do número de ribossomas por polissoma frequência foi analisada por fracção # 10 (Ver Figura 1, painel inferior, correspondente a polissomas Médio do Peso Molecular (MEM)), o que mostra claramente um pico único (painel C, barras cinzentas). A distribuição experimental foi montado com uma curva de Gauss (linha preta), que foi centrada em 5,8 ribossomas / polysome, com um desvio padrão de 1,3 ribossomas / polissomas. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53851/53851fig1.jpg" /> Figura 1. Perfil absorção Representante para a sedimentação em gradiente de sacarose de todo o cérebro do rato. (Superior pAnel) Um polissomal ligado citoplasmática foi obtido a partir de cérebro de rato P27 e carregou-se um gradiente linear de sacarose (15-50% de sacarose [w / v]). É possível observar picos claros correspondentes a absorvância a 254 nm de RiboNucleoParticles (RNP), subunidades ribossomais (40S e 60S), ribossomas (80S) e polissomos. Para evitar repetidos de congelação e descongelação de amostras de ciclos antes da deposição de AFM em mica, é conveniente dividir em alíquotas tanto fracção de ribossoma e fracções polissomal (painel inferior) com um número diferente de ribossomas por transcrição (isto é, baixa, média e alta polissomos peso -molecular (LMW, MMW e HMW, respectivamente)). As aliquotas podem ser guardadas a -80 ° C durante até dois anos. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53851/53851fig2.jpg" /> Figura 2. Imagens de polissomos cerebrais por toque Mode-Microscopia. (A) Exemplo de Força Atômica imagem AFM da MMW poli cérebrosomes após a absorção em mica utilizando uma escala de cor cinza linear. (B) A mesma imagem mostrada em (A) é representado usando um diferentes Z-intervalos para a escala de cores: 0-0,5 nm cinzento para o fundo, 0,5-2 nm, e 2-10 nm amarelas dos ribossomas. Neste caso, um contraste visual melhor é obtido em ambos os objectos de baixa e alta Z-gama. (C) Ampliação de um polysome típica MMW com perfil transversal (linha branca pontilhada). Perfil (D) Altura de dois ribossomas definidos pelo perfil de secção transversal em (C) mostra a altura de ribossoma de 14 nm. Este valor é compatível com o observado anteriormente em AFM dos ribossomas humanos em polissomos 27. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53851/53851fig3.jpg" /> Figura 3. Exemplo de contagem do número de ribossomas por polissoma MMW em polissomas cerebrais. (A) imagem de AFM que represenSents a entrada da macro ImageJ, RiboPick. (B) Depois de escolher manualmente cada ribossomas por polissoma, marcas RiboPick na imagem da posição de cada um dos ribossomas (círculos vermelhos). (C) O número de ribossomas obtido por polissomas pode ser representada graficamente como uma distribuição que pode ser equipado com uma curva de Gauss. O número de polissomas considerados neste exemplo é de 164, obtido a partir de 9 imagens independentes. O encaixe com a curva de Gauss devolve o valor médio da população de polissomas na fracção MMW (# ribossomas / polissomas 5,8 ± 1,3, R 2 = 0,99). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Amortecedor </td><td> Composição </td><td> Aplicação </td></tr><tr><td> Tampão de lise </td><td> mM de Tris-HCl a 10, pH 7,5 </td><td> Preparação de lisado (1,1) </td></tr><tr><td></td><td> 10 mM de NaCl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 mM de MgCl2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1% de Triton-X100 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1% de Na-desoxicolato </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 0,4 U / ml de ARNase Inibidor </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 mM de DTT </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mg / ml de ciclo-heximida </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 U / ml de ADNase I </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50% de solução de sacarose </td><td> 50% (w / v) de sacarose em </td><td> preparação em gradiente de sacarose (1,2) </td></tr><tr><td></td><td> 100 mM de NaCl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 mM de MgCl2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Tris 10 mM / HCl pH 7,5 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> 15% de solução de sacarose </td><td> 15% (w / v) de sacarose em </td><td> preparação em gradiente de sacarose (1,2) </td></tr><tr><td></td><td> 100 mM de NaCl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 mM de MgCl2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Tris 10 mM / HCl pH 7,5 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> solução de níquel </td><td> 1 mM NiSO4 </td><td> preparação de amostras para AFM (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampão-AFM </td><td> 100 mM de NaCl </td><td> preparação de amostras para AFM (2) </td></tr><tr><td></td><td> 10 mM de MgCl2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 100 ug / ml de cicloheximida </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Hepes 10 mM </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"> 3% (w / v) de sacarose, pH = 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solução de lavagem </td><td> DEPC-água </td><td> preparação de amostras para AFM (2) </td></tr><tr><td></td><td> 100 ug / ml de cicloheximida </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Tampões.

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Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Olhando para Cérebro polissomos com Microscopia de Força Atômica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

peering-at-brain-polysomes-with-atomic-force-microscopy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K visualizações.  Fondazione Bruno Kessler. While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid. 

Vídeo: Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

Estado de dependência-Efeitos sobre a TMS: Um olhar sobre Comportamento fosfeno Motive

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Neurociência

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Ion Beam centrada Fresagem e Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido Cerebral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron escala Resolução óptica Tomografia de todo cérebro do rato com confocal Luz Folha de Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

O Sistema Olfativo como um modelo para estudar os padrões de crescimento axonal e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Experimental desmielinização e remielinização de Medula Espinhal Murino por Injeção Focal de lisolecitina

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

Caracterizando Propriedades Multiscale mecânicas do tecido cerebral usando microscopia de força atômica, recuo de impacto, e Reologia

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

Análise de marcha automatizados em ratos com lesão crônica de constrição

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Olhando para Cérebro polissomos com Microscopia de Força Atômica

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