Agradecemos ao final de Rudy Limburg para fabricar as perímetro de braço cardan, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, e Raju Metherate para nos emprestar equipamentos e Almut Kelber e Kentaro Arikawa, para o incentivo. Este trabalho foi apoiado por uma National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship para KJM e concessão NSF IOS-1257627 para ADB

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

gravação intracelular pode ser uma técnica difícil de dominar, devido aos muitos passos técnicos envolvidos. Para experiências com sucesso vários pontos importantes devem ser considerados. Em primeiro lugar, é importante ter uma tabela adequadamente vibratoriamente-isolado no qual é realizada a experiência. Muitos pesquisadores usam tabelas de ar, que separam completamente a mesa a partir da base, dando isolamento de vibração superior. Nossa configuração envolve uma mesa de mármore de espessura com uma caixa de areia no topo, na qual é colocado o aparelho estágio micromanipulador / suporte do eletrodo / espécime. Esta é uma alternativa eficaz e mais acessível a uma tabela de ar, especialmente se o acesso ao gás em casa ou ar comprimido é uma limitação. Podem ser tomadas como medidas adicionais de absorção de vibrações como suspensão a ar passivo, ou a adição de elementos de amortecimento para os pés da tabela (por exemplo, abriu bolas de tênis, tubos de bicicleta, almofadas de gel de espessura). Além disso, é essencial que a configuração experimental estar dentro de umgaiola de Faraday com tudo devidamente aterrada. A gaiola de Faraday deve ter uma tela de malha de metal na frente que pode ser removido quando se trabalha dentro da gaiola e substituído facilmente quando a gravação. Mesmo uma pequena quantidade de ruído eléctrico ambiente (especialmente 50 Hz ruído da principal fonte de alimentação AC) pode fazer uma gravação de outra forma boa inutilizável. Ao preparar a amostra, hemolinfa e pigmentos camadas em torno da ommatidia pode impedir gravações bem sucedidas. Se o furo na córnea é cortado muito grande, de bombeamento normal da hemolinfa no corpo faz com que a superfície do líquido para cima e para baixo no local do corte, resultando em uma gravação instável. Uma vez que o furo é cortado, hemolinfa e camadas de pigmento de superfície irá coagular rapidamente num sarna impenetrável mesmo quando seladas com geleia de petróleo, por isso é importante para obter o eléctrodo para dentro do olho, o mais rapidamente possível. solução de Ringer, também pode ser usado em vez de vaselina. O eléctrodo de terra pode ser introduzido nobucais ou no tronco de uma antena de corte. Além disso, muitas vezes é útil para manter o animal tão escuro-adaptado quanto possível. Para este método, os passos incluem manter sala de gravação muito escuro, bloqueando a luz difusa da lâmpada Xenon de entrar na gaiola de Faraday, curta duração do estímulo flashes (30-50 ms), e uma baixa frequência suficiente entre flashes (0.5 ou superior). Quando um pigmento visual absorve um fotão, o cromóforo em rodopsina muda de 11- cis-3-hydroxyretinal para todos - trans-retinal, induzindo a alteração conformacional da proteína opsina, e activar todo o complexo como metarodopsina, que inicia a proteína G cascata. Photo-branqueamento ocorre quando luz de alta intensidade faz com que o cromóforo para separar fisicamente a partir da proteína opsina. O tempo é um fator limitante nesta experiência porque o eletrodo irá gravar apenas estavelmente respostas de dentro da célula por um determinado período de tempo antes que ele cai foraou a membrana é danificado. Por esta razão, não quebram para permitir que a célula a se recuperar, mas o fazemos usar uma duração do flash e frequência que encontramos não degrada a resposta da célula ao longo do tempo. É importante para diminuir a frequência e intensidade da luz se foto-branqueamento ocorre. Durante a gravação, um grande ponta do eletrodo ou grande movimento pelo eletrodo pode danificar o celular ao penetrar a membrana. Somente finas pontas (pelo menos ~ 100 mohms) e pequenos movimentos devem ser usados ​​quando se aproxima de uma célula para a gravação. Se a gravação intracelular é aplicada para outras aplicações, tais como gravações cerebrais, extremamente finas, resistentes eléctrodos pode ser puxado através de vidro de quartzo, mas um puxador especializado deve ser utilizado para estes eléctrodos. Quando pela primeira vez fazendo um eletrodo puxando programa, verificamos resistência de ponta de aterro eletrodo, fixando-o porta-eletrodo em uma configuração simulada, e colocando a ponta e eletrodo terra em solução salina. Next aplicamos uma corrente para medir a mudança na tensão no osciloscópio. Para mover a ponta do eletrodo usamos um micromanipulador manual que se move ao longo de dois eixos. Existem outros manipuladores incluindo os digitais que permitem o movimento ao longo de todos os três eixos, e estes podem ser utilizados para este ou mais complexos aplicações. Há muitas maneiras de construir um palco para gravação, e há muitos tipos diferentes de hardware e software utilizados na gravação e análise dos dados observados. Nossa configuração representa uma configuração simples, fácil e acessível da plataforma de gravação. Na construção da curva VlogI, as funções desenvolvidas por Naka e Rushton 33 e outros 34,35 contas para as porções não-lineares das respostas traçados. Vários métodos são usados ​​para ajustar esta curva para os dados, e representada graficamente os resultados de um tal método que não requeira o software de ajuste de curva, embora outros métodos também são adequados 36,37 ( <strong&gt; Figura 7). Também pode ser útil para comparar a sensibilidade espectral para modelos de absorvância rodopsina a um dado comprimento de onda de pico. Vários modelos publicados como objectivo reproduzir rodopsina absorvância espectros 38,39. Uma ideia mais precisa do espectro de absorção do pigmento visual expresso em uma célula de fotorreceptores de insectos pode ser modelado tendo em conta as propriedades ommatidial tais como pigmentos de filtragem, mas isso requer a medição de parâmetros fisiológicos e anatómicos adicional 11,40. Uma limitação deste método é que, se o organismo estudo expressa mais do que uma opsina geneticamente semelhantes no olho, pode ser difícil identificar qual opsina ARNm corresponde provavelmente a que classe espectral de células fotorreceptoras. Para superar este problema, este método tem sido combinada com o corante-injecções e hibridação in situ ou imuno-histoquímica para identificar com sucesso as opsinas expresso em células gravadas 10. Nosso método é simples e acessível para os pesquisadores não familiarizados com eletrofisiologia visual. Esta técnica é comum em neuroscience, mas específica e métodos claros estão ausentes na literatura, tornando este método de difícil reprodução. Embora existam muitas variações desta técnica, oferecemos uma maneira simples para medir a sensibilidade espectral do olho composto. Os dados fisiológico é uma peça importante de provas em histórias de ecologia visual e evolução 41. variação de sequência de opsina está ligado intimamente com a sensibilidade de uma célula foto-receptor, tornando este método ideal para estudos que examinam a base genética para a mudança fenotípica. A medição da sensibilidade das células fotorreceptoras também pode ser emparelhado com ensaios de discriminação de cor comportamentais, mostrando a base fisiológica para importantes limiares de discriminação na visão de cores 42-46. Em manipulações genéticas ou terapêuticos em Drosophila por exemplo, este technique pode ser uma boa maneira de medir a função fisiológica adequada do olho ou cérebro, bem 47,48. Embora o nosso não é o primeiro ou o método mais complexo de gravação intracelular no olho, a nossa esperança é que podemos tornar este método mais facilmente disponíveis para a reprodução e integração em programas de investigação fora da neurociência formal.

As propriedades eléctricas de células tais como neurónios são observadas através da medição do fluxo de iões através das membranas celulares, como uma mudança na tensão ou corrente. Uma variedade de técnicas electrofisiológicas foram desenvolvidos para medir bioeléctico eventos em células. Os neurónios encontrados nos olhos dos animais são acessíveis e os seus circuitos muitas vezes é menos complexa do que no cérebro, fazendo com que estas células bons candidatos para estudo electrofisiológico. As aplicações comuns de eletrofisiologia no olho incluem eletrorretinografia (ERG) 1,2 e microeletrodos de gravação intracelular. ERG envolve a colocação de um eléctrodo dentro ou sobre o olho de um animal, aplicando-se um estímulo de luz e medindo a variação de tensão como a soma de todas as respostas de células vizinhas 3-6. Se alguém está interessado especificamente na caracterização sensibilidades espectrais de células fotorreceptoras individuais, muitas vezes vários tipos de células respondem simultaneamente em diferentes pontos fortes para um dado estímulo; assimpode ser difícil determinar a sensibilidade de tipos específicos de células a partir de dados do ERG especialmente se houver vários tipos diferentes de células fotorreceptoras espectralmente semelhantes no olho. Uma possível solução é criar transgênicos Drosophila com o gene fotorreceptor (opsina) de interesse expressa nas células maioria R1-6 no olho e depois executar ERGs 7. Desvantagens potenciais deste método incluem não a baixa expressão da proteína fotorreceptor 8, eo período de tempo longo para a geração e triagem de animais transgênicos. Para os olhos, com menor número de tipos de fotorreceptores espectralmente distintos, a adaptação do olho com filtros coloridos podem ajudar com a redução da contribuição de alguns tipos de células para o ERG, permitindo assim a estimativa da sensibilidade espectral máximos 9. gravação intracelular é uma outra técnica em que uma multa eletrodo espeta uma célula e um estímulo é aplicado. Os registros de eletrodos só isso indivA resposta de células idual para que a gravar e analisar várias células individuais podem produzir sensibilidades específicas de fisiologicamente diferentes tipos de células 10-14. Embora o nosso protocolo centra-se na análise de sensibilidade espectral, os princípios básicos da intracelular de gravação com eletrodos pontiagudos são modificáveis ​​para outras aplicações. Usando uma preparação diferente de uma amostra, por exemplo, e usando eléctrodos de quartzo afiadas, um pode gravar a partir de mais profundo no lobo óptica ou outras regiões do cérebro, de acordo com a questão que se coloca. Por exemplo, os tempos de resposta de células fotorreceptoras individuais 15, a actividade de células na óptica lóbulos 16 (lâmina, medula ou lobula 17), cérebro 18 ou outros gânglios 19 também podem ser gravadas com técnicas semelhantes, ou estímulos de cor pode ser substituído com polarização 20 -22 ou movimento estímulos 23,24. Fototransdução, o processo pelo qual a luzenergia é absorvida e transformada em um sinal eletroquímico, é uma característica antiga comum a quase todos os dias atuais filos animais 25. O pigmento visual encontrado em células fotorreceptoras e responsável por iniciar fototransdução visual é rodopsina. Rodopsinas em todos os animais são constituídos por uma proteína opsina, um membro da família G transmembranar sete do receptor acoplado à proteína, e um cromóforo associado que é derivada de uma molécula de retina ou semelhantes 26,27. Opsina sequência de aminoácidos e estrutura cromóforo afectar a absorvência da rodopsina para diferentes comprimentos de onda de luz. Quando um fotão é absorvido pelo cromóforo a rodopsina torna-se activa, iniciando uma cascata de proteína G na célula que, em última análise conduz à abertura de canais iónicos ligados à membrana 28. Diferentemente da maioria dos neurônios, células fotorreceptoras sofrer alterações potenciais graduados que podem ser medidos como uma mudança relativa na amplitude da resposta com a mudança de estímulo luminoso. Tipicamente, uma dadaTipo de fotorreceptores expressa apenas um gene da opsina (embora existam exceções 8,10,29-31). visão de cores sofisticada, do tipo encontrado em muitos vertebrados e artrópodes, é conseguido com um olho complexo de centenas ou milhares de células fotorreceptoras cada expressando mais uma ou ocasionalmente tipos rodopsina. A informação visual é capturado por comparação das respostas sobre o mosaico de fotorreceptores via de sinalização a jusante neural complexo no olho e no cérebro, resultando na percepção de uma imagem completa a cores e com movimento. Depois de medir as respostas de matérias de uma das células fotorreceptoras para diferentes comprimentos de onda da luz de gravação via intracelular, é possível calcular a sensibilidade espectral. Este cálculo baseia-se no princípio de Univariance, o que indica que a resposta de uma célula de fotorreceptores é dependente do número de fotões que absorve, mas não sobre as propriedades particulares dos fotões que absorve 32. Qualquer fotões que é absorbed por rodopsina irão induzir o mesmo tipo de resposta. Na prática, isto significa que a amplitude de resposta em bruto de uma célula irá aumentar devido a um aumento na intensidade da luz (mais fotões de absorver), ou a uma mudança no comprimento de onda para a sua sensibilidade de pico (maior probabilidade de rodopsina absorvendo esse comprimento de onda). Nós fazemos uso deste princípio em relacionar as respostas celulares a uma intensidade conhecida e ao mesmo comprimento de onda de respostas em diferentes comprimentos de onda e na mesma intensidade, mas sensibilidade relativa desconhecida. Os tipos de células são frequentemente identificado pelo comprimento de onda a que os seus picos de sensibilidade. Aqui nós mostramos um método para gravação e análise de sensibilidade espectral de fotorreceptores no olho de uma borboleta intracelular, com um foco em tornar este método mais acessível à comunidade científica em geral. Embora a gravação intracelular continua a ser comum na literatura, particularmente com respeito à visão de cores em insetos, encontramos that descrições de materiais e métodos são geralmente demasiado curto para permitir a reprodução da técnica. Nós apresentamos este método em formato de vídeo com o objectivo de permitir sua replicação mais fácil. Descrevemos também a técnica de utilização de equipamento de fácil obtenção e acessível. Abordamos ressalvas comuns que muitas vezes não são relatados, que retardam a investigação ao otimizar uma técnica nova e complexa.

determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings

gravação intracelular é uma técnica poderosa usada para determinar a forma como uma única célula podem responder a um dado estímulo. Na pesquisa visão, a gravação intracelular tem sido historicamente uma técnica comum usada para estudar as sensibilidades de células fotorreceptoras individuais a diferentes estímulos luminosos que ainda está sendo usado hoje. No entanto, continua a existir uma carência de metodologia detalhada na literatura para os investigadores que desejam replicar experiências de gravação intracelulares no olho. Aqui nós apresentamos o inseto como um modelo para examinar a fisiologia do olho em geral. células fotorreceptoras de insectos estão localizados perto da superfície do olho e são, portanto, fácil de alcançar, e muitos dos mecanismos envolvidos na visão são conservadas entre filos animais. Nós descrevemos o procedimento básico para in vivo de gravação intracelular de células fotorreceptoras no olho de uma borboleta, com o objetivo de tornar esta técnica mais acessível a pesquisadores com pouca experiência anterior em electrophysiology. Introduzimos o equipamento básico necessário, como preparar uma borboleta vivo para o registo, o modo de inserir um microeléctrodo de vidro em uma única célula, e, finalmente, o processo de gravação em si. Nós também explicar a análise básica de dados de resposta matérias para determinar sensibilidade espectral de tipos de células individuais. Embora o protocolo centra-se na determinação da sensibilidade espectral, outros estímulos (por exemplo, luz polarizada) e variações do método são aplicáveis ​​a esta configuração.

Para muitos elementos da configuração de gravação, uma descrição escrita não fornece detalhes suficientes. A Figura 1 é um esquema dos componentes envolvidos na configuração completa de gravação. Na Figura 2, os espectros são traçados para a luz branca e cada um filtro de interferência para dar um sentido de por que é necessário um factor de correcção eo que é necessário para calcular essa correção. A Figura 3 mostra fotos e um diagrama do braço Cardan que é usado para estes experiências. a Figura 4 é uma imagem composta que mostra a fase de gravação e micromanipulador. a Figura 5 mostra vários passos na preparação de uma borboleta para a experiência. Uma vez que o início da gravação, uma alteração na tensão negativa em resposta a um flash de luz significa que o eléctrodo está fora de uma célula, como na Figura 6a. A força da resposta depende da proximidade do eléctrodoDica Para uma célula de fotorreceptores, e do ângulo de incidência da luz do flash. A resposta deve ser grande (&gt; 30 mV) antes de a ponta está perto o suficiente para uma célula para empalar. Figura 6B mostra uma resposta despolarizante claro para um estímulo de luz, o que significa a entrada em uma das células fotorreceptoras. O potencial de repouso deve ser estável e a amplitude da resposta deve ser grande (pelo menos 40 mV), embora a amplitude absoluta pode variar consideravelmente. Medimos a resposta relativa, por isso é mais importante que a relação sinal-ruído é alta. Se o descanso alterações potenciais grandemente, a forma de onda de resposta parecer anormal, ou a resposta máxima é demasiado baixo, então a comparação das respostas relativas em todos os filtros de interferência torna-se impossível. Exemplos de gravações não utilizáveis ​​são mostrados na Figura 6c, 6d. Depois de completar um registo bem sucedido, as respostas ND deve ser traçada e a equação Naka-Rushton deve ser ajustada aos dados 33, shown na Figura 7. Esta figura é representada usando a série filtro ND, sem quaisquer filtros de interferência. Se a gravação é estável, os dados da série filtro ND deve ser semelhante antes e depois da experiência. Sensibilidade espectral é determinado pelo ajuste da equação Naka-Rushton para a trama VlogI na Figura 7, em seguida, resolvendo para (I) para cada resposta (V) em um determinado comprimento de onda, como explicado nos cálculos da secção 6 do protocolo. Um exemplo representativo de sensibilidade espectral derivada de uma única gravação é plotado na Figura 8a (por favor note que este exemplo mostra dados reais calculados, mas o pico foi deslocado como este resultado é inédito). Os tipos de células podem ser classificadas por uma sensibilidade de pico no comprimento de onda similar e forma global do espectro de sensibilidade. Tipos de células semelhantes são então calculados e a sensibilidade média é representada com barras de erro padrão em cada comprimento de onda na Figure 8b. Sensibilidades espectrais de três tipos de células típicos encontrados em um insecto são mostrados na Figura 8c (magnitude e barras de erro são calculados a partir de dados reais, mas os picos são deslocados). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig3.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> Figura 1:. Esquemático de componentes de gravação Componentes do caminho da luz, espécime de configuração, e gravação de hardware são indicados. Trilha óptica senta-se no banco de madeira fora da gaiola de Faraday. Xe, lâmpada de arco de xenon, Cd, montagem condensador, Lx, lente convexa, ND, roda de filtro de densidade neutra, Cf, filtro de interferência, S, obturador, Lc, lente côncava, Co , sonda feixe collimating, FO, cabo de fibra óptica. A gaiola de Faraday senta-se nabanco de madeira em todo o espécime. O banco de madeira fica acima, mas não toque na mesa de mármore vibrationally isolado por baixo. Gravação (Rc) e de referência (Rf) eléctrodos estão ligados ao andar de entrada (Hs). Rc é introduzida no olho (E) e Rf é introduzido numa outra parte do corpo. O headstage é parte da configuração pré-amplificador (Pa) fora da gaiola de Faraday. O sinal é transmitido a partir do pré-amplificador de ruído através do redutor da farsa (Hb), e no osciloscópio (OS). A partir do osciloscópio o sinal é passado através do hardware Powerlab (Plb) e em que o computador portátil (CPU), onde ele é lido pelo software LabChart. O obturador é controlado por um gerador de funções (Fg) que é passado através de um segundo canal no osciloscópio, e podem também ser passados ​​através de um segundo canal no hardware Powerlab se esse sinal vai ser gravado. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig5.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> Figura 2:. Luz Branca e Interferência Filtro Spectra usada para calcular fatores de correção Os espectros medida no passo 2.5 do protocolo são mostrados 300-700 nm, para a luz branca, bem como cada um dos filtros de interferência 41. Cada espectro filtro de interferência é medido com apenas esse filtro no caminho da luz. 520 t corresponde à área sob o espectro para o filtro com pico a 520 nm, e de 520 corresponde à intensidade de luz branca em pico de comprimento de onda do filtro, a 520 nm. Estes valores são utilizados para calcular os factores de correcção para cada filtro (neste caso a 520 nm), tal como descrito na etapa 2.6 do protocolo. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig4.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> Figura 3:. Descrição do Cardan perímetro do braço utilizado nas experiências O braço Cardan prende o cabo de fibra óptica e permite a rotação esférica completa e regulação angular de modo que a luz pode ser entregue no ângulo apropriado de incidência para a célula a ser gravada. (A) de cima para baixo ponto de vista. (B) Vista do lado em um ângulo. Os números correspondem à mesma parte em todos os painéis. (1) A placa de fundo permite a rotação completa circular no plano horizontal. (2) A chapa vertical permite a rotação circular do braço num plano vertical. (3) Este cilindro contém o braço de metal com o cabo de fibra óptica na extremidade, e que permite que um segundo plano vertical de rotação circular perpendicular a (2). (4) O cabo de fibra óptica é mantida iN lugar na extremidade do braço, e a luz é dirigida para o local da amostra na montagem experimental. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig1.jpg" /> Figura 4:. Componentes da configuração de gravação (A) do tubo de plástico usado para armazenar a amostra. (B) A vista aérea da plataforma sobre a qual a amostra e tubo são montados. (C) Vista lateral da plataforma de bola-e-conjunta com base magnética (1). eléctrodo de referência mantida imóvel com cola e cera no lado da plataforma (2). eletrodo de referência envolvida em torno de jacaré e soldada no lugar, proporcionando uma área de fixação, onde o eletrodo de referência headstage pode cortar (3). (D) Eletrodo ponta sob ampliação de 20x. Barra de escala, 25 um. (E) Palco, suporte do eletrodo e configuração micromanipulador. O andar de entrada (1) é fixada por cima do aparelho com ofio de gravação de prata (2), eo eletrodo de referência com jacaré (3) anexado. O suporte do eléctrodo (4) está fixado a um micromanipulador manual (5) com um poste em baixo que pode ser ajustado com um botão para o movimento vertical ou pode ser empurrado ou puxado para o movimento horizontal do suporte de eléctrodo. A plataforma magnética com a amostra fica no palco (6) logo abaixo o suporte do eléctrodo. (F) A gaiola de Faraday rodeia a configuração de gravação com uma tela que pode ser puxado para cima ou para baixo na frente. A folha de alumínio é colocado debaixo todo o equipamento com almofadas de borracha na parte superior. O cabo de fibra óptica (1) conduz para dentro da gaiola da pista óptica fora, e é dirigido por o braço de Cardan (2) para a fase (3). O aparelho fase de gravação e manipulador é colocado em uma caixa de areia (4) descansando sobre uma mesa de mármore debaixo da configuração. Todos os outros equipamentos repousa na bancada de madeira que não toca a mesa de mármore. A caixa de areia fica em cima da mesa de mármore em um buracocortada da mesa de madeira, de modo que a amostra é completamente vibrationally isolado do equipamento sobre a mesa de madeira. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53829/53829fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig2.jpg" /> Figura 5:. Prep borboleta (A) a borboleta é inserido dentro do tubo e a cabeça, asas, e antenas são imobilizadas com cera quente. O eléctrodo indiferente é inserido o aparelho bucal (1), um pedaço de cera seca é usado para manter para baixo no abdómen (2), e um tecido molhado é colocado atrás do espécime. (B) Close-up da cabeça encerado para baixo. O olho a ser gravado a partir de (1) é mantido limpo de cera ou detritos, eo eletrodo de referência (2) é inserido no aparelho bucal e cera quente é rapidamente derretido sobre ele para mantê-lo no lugar.(C) Um furo cortado dentro do olho, onde a camada de células fotorreceptoras-rosa branca pode ser visto. pigmento preto e hemolinfa amarelo estão ausentes. (D) vista lateral do espécime com um eléctrodo de registo de vidro (1) colocada no olho, e o eléctrodo indiferente (2) ligados à fase de cabeça, que deve completar um circuito, como visto no osciloscópio. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53829/53829fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig6.jpg" style="font-size: 14px;" /> Figura 6:. Responses-primas a partir de gravações de amostra Cada resposta corresponde a um único flash de luz de 50 mseg de duração (barras pretas). (A) Um exemplo da grande variação de tensão negativa que deve ser vista apenasantes de entrar em uma célula. (B) Uma gravação limpa deve ter pouco ruído de fundo e uma grande resposta despolarizante, tipicamente de pelo menos 40 mV. (C) Um exemplo de uma gravação pobres devido à mudança potencial negativo após o pico principal (setas). (D) Um outro exemplo de uma gravação má. O potencial de repouso está passando por grandes flutuações (barra vermelha) e a grande quantidade de ruído de fundo pode obscurecer a amplitude da resposta (seta). <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig7.jpg" /> Figura 7:. Response-Intensidade Função Log-Linear círculos sólidos mostram as respostas medidas de uma célula 3,5-0 OD, para esta configuração experimental. A intensidade da luz é em uma escala logarítmica. Em muito altas intensidades a resposta é saturado, e em intensidades muito baixas uma pequena resposta persistir em vez de cair para zero ao longo da linha. Tequação ele Naka-Rushton 33 está equipado com esta forma não-linear (linha pontilhada). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig8.jpg" /> Figura 8:. Exemplos de sensibilidade espectral (A) foram registadas respostas Uma única célula representativa e sensibilidade espectral relativa foi calculada. O pico desta célula é a 440 nm, o que significa que responde melhor a luz azul. dados de célula única pode parecer ruidosa (pico a 380 nm). (B) As células com o mesmo pico relativa e forma-se a média em conjunto e as barras de erro padrão são adicionados. Aqui, sete células azuis de sete indivíduos foram em média, fornecendo forte evidência de que um tipo de célula existe nesta espécie maximamente sensíveis à luz a 440 nm. (C) Este processo pode ser repetido para todos os tipos de células encontradas, e representada graficamente em conjunto. Os olhos dos insetos variam muito em suas sensibilidades espectrais, mas um ins típicosect pode ter picos mostrados aqui, a 370 nm, 440 nm e 510 nm. A nota, estas sensibilidades espectrais são todos calculados usando dados reais, mas os picos foram deslocados porque os dados ainda não foi publicado para esta espécie.

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Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

A técnica eletrofisiológica da gravação intracelular é demonstrado e usado para determinar sensibilidades espectrais de células fotorreceptoras único no olho composto de uma borboleta.

Determinação dos fotorreceptores celular Sensibilidade espectral em um inseto modelo de<em&gt; In Vivo</em&gt; Gravações intracelulares

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

determination-photoreceptor-cell-spectral-sensitivity-an-insect-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

11.3K visualizações.  University of California, Irvine.  A técnica eletrofisiológica da gravação intracelular é demonstrado e usado para determinar sensibilidades espectrais de células fotorreceptoras único no olho composto de uma borboleta. 

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic nerve. In vivo recordings of ganglion cell spike trains in several animal models have revealed much of what is known about how the early visual system processes and encodes visual information. However, such recordings have been rare in one of the most common animal models, the rat, possibly owing to difficulty in detecting spikes fired by small diameter axons. The many retinal disease models involving rats motivate a need for characterizing the functional properties of ganglion cells without disturbing the eye, as with intraocular or in vitro recordings. Here, we demonstrate a method for recording ganglion cell spike trains from the optic chiasm of the anesthetized rat. We first show how to fabricate tungsten-in-glass electrodes that can pick up electrical activity from single ganglion cell axons in rat. The electrodes outperform all commercial ones that we have tried. We then illustrate our custom-designed stereotaxic system for in vivo visual neurophysiology experiments and our procedures for animal preparation and reliable and stable electrode placement in the optic chiasm.

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Retinal ganglion cells transmit visual information from the eye to the brain with sequences of action potentials. Here, we demonstrate how to record the action potentials of single ganglion cells in vivo from anesthetized rats.

Única unidade de In vivo Gravações do quiasma óptico de rato

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

Concepção e montagem de um Microdrive Ultra-leve motorizada para doenças crônicas Recordings Neurais em Pequenos Animais

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Um método simples e barato para a determinação da sensibilidade Fria e Adaptação no Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em