We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.

1. Síntese e Preparação ARNcd <ol><li> Identificar uma região knockdown 200-800 pb (para gerar o ARNcd correspondente) dentro do gene de interesse que é previsto para ter não identificáveis ​​efeitos fora do alvo (por exemplo, nenhuma homologia de sequência de ≥18 pb dentro de um outro gene) e um controlo negativo (por exemplo, , uma sequência heteróloga que não está presente dentro do genoma de insectos alvo, tal como o gene lacZ de Escherichia coli (GenBank gene ID: 945006). em alternativa, utilizar um controlo positivo (por exemplo, o que origina um fenótipo facilmente observado, tais como 21,22 SRPN2 , Gene GenBank ID:. 1270169) a sequência do SRPN2 segmentação ARNcd é definido em Michel et al (2005) 21.. Nota: E-ARNi é um recurso bioinformática-fonte aberto que é útil para a identificação de tais regiões e para o processo de concepção de iniciadores oligonucleotídicos 23. </li><li> execute standard amplificação de PCR (ou seja, realizada com Taq DNA polimerase, utilizando 30-35 ciclos) utilizando um ADN genómico ou de ADNc molde para obter a síntese de molde ARNcd flanqueado por uma sequência de promotor de T7 (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;) e prosseguir com a preparação e ARNdc limpar-se utilizando um kit comercial de transcrição in vitro de acordo com as instruções do fabricante. Use SRPN2 PCR condições de amplificação e informações iniciador, tal como apresentado em An et al. (2011) 22. </li><li> Quantificar os rendimentos de ARN amplicon purificado por espectroscopia de absorção de ultravioletas a comprimento de onda de 260 nm e ajustar-se a concentração desejada (por exemplo, 3 mg / mL) em água isenta de RNase. <ol><li> Para solucionar problemas de baixas concentrações de RNA, reduzir o volume de líquido por fiação amostras numa centrífuga de vácuo à temperatura ambiente ou por liofilização de amostras e reconstituindo em menores volumes de água. O tempo necessário para a liofilização da amostra irá variar dependendoem volumes de amostras iniciais e as concentrações de ARNdc. </li></ol></li><li> Verificar a qualidade ea duração do ARNcd num gel de agarose a 2% preparada com 1 x TBE ou TAE tampão e coradas com brometo de etídio (EtBr), juntamente com o ADN molde utilizado para a reacção de transcrição. O ARNcd migrarão mais lentamente do que o ADN molde. Qualidade e comprimento pode ser avaliada por assegurando que não há produtos não específicos de ARNdc e por com um marcador de ADN padrão comparando produtos, respectivamente. Nota: EtBr é um mutagênico potente e deve ser tratado em conformidade. Nota: Para uma concentração de ARNcd de 3 mg / mL, 0,5 mL da amostra é mais do que suficiente para a visualização do gel de agarose manchado-EtBr. </li><li> ARNcd armazenar a -20 ° C até ser necessário. Múltiplos ciclos de congelamento / descongelamento podem causar degradação, de modo alíquotas deve ser preparado para grandes volumes de ARNcd. </li></ol> 2. Prepare verde rápido Dye Tubes (FGD) <ol><li> Diluir rápida corante verde FCFa partir de solução-mãe (≥85% de teor de corante) a 0,1% (v / v) (solução de trabalho), em água isenta de RNase. </li><li> Pipetar 1 mL de corante no fundo de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Colocar os tubos em um bloco de calor a 65 ° C durante aproximadamente 3 horas para evaporar, em seguida Colocar os tubos líquidos à temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos, para arrefecer antes de usar. Este corante sólido seco irá reconstituir a ressuspensão em solução ARNcd. </li></ol> 3. Agulhas Pull injeção <ol><li> Puxar agulhas de vidro de borosilicato, utilizando um extrator de agulhas aquecido a uma diâmetro da ponta de 10-30 mm. Pull configurações correspondem a: ajuste aquecedor não. 1 = 100, o ajuste aquecedor não. 2 = 70. </li><li> Para evitar danos ao fina ponta da agulha, colocar todas as agulhas puxado horizontalmente numa placa de Petri sobre uma tira de moldagem de massa de vidraceiro. Nota: Informações adicionais para agulha capilar métodos puxando pode ser encontrada em mais detalhe na Malaria Research and Reference Reagent Resource Center MManual de R4 24. </li></ol> 4. Prepare Station Injection <ol><li> Recolha materiais necessários: agulhas microcapilares vidro puxado para ponta fina, microinjetor, papel de filtro fino e papel de filtro grosso, placas de Petri, pipetas de transferência, pincel e dissecando microscópio de luz. </li><li> Prepare o microinjetor conforme as instruções no manual microinjetor, e ajustar o volume de injeção de volume desejado por pulso (por exemplo, máximo de 69 nl por pulso). </li><li> Em uma plataforma que é fácil de manobrar sob um microscópio (por exemplo, o lado liso de um suporte de tubos de isopor), empilhar as duas folhas de papel de filtro com o papel de filtro fino no topo, e prenda com fita em torno das bordas. </li><li> Ressuspender 10 ml de cada solução de dsRNA em tubos de corante de cor separados, e colocar no gelo. </li></ol> 5. Recolher Pupae para Injecção <ol><li> Encha uma pequena 60 milímetros x 15 mm placa de Petri com 10 ml de água deionizada, e recolher ~ 50 pupas pálido (During a 24 h depois da primeira formação da pupa) a partir de uma bandeja insectary usando uma pipeta de transferência de plástico descartável. </li><li> Remova qualquer pupas que têm médio e escuro bronzeamento cutícula. Nota: Uma vez que a cutícula começa a curtir, torna-se mais difícil de penetrar a cutícula, e os resultados de injeção em muito maior letalidade. </li></ol> 6. Injeção de dsRNA <ol><li> Sob o microscópio de dissecação, parta a ponta distal da agulha de injecção com um par de fórceps finos. </li><li> Prepara-se o enchimento por agulha de injecção a agulha com óleo mineral (usando uma seringa com uma agulha de calibre 30 de 3 polegadas), e expelir o excesso de óleo com o microinjector. </li><li> Frente preencher agulha de injecção com uma quantidade máxima de dsRNA, e ejectar um impulso ao microscópio para assegurar a distribuição de líquido. No caso em que o líquido não é absorvido e / ou expelido, verificar a ponta distal da agulha para qualquer bloqueio e assegurar que a agulha está firmemente fixada na microinjector. </li><li> Escolha 1-3 pupas, e colocá-los no papel de filtro. </li><li> Usando o pincel, posicionar o pupas no papel de filtro com dorsal cutícula acessível, e usar o pincel para empurrar em papel de filtro e absorver qualquer excesso de água. </li><li> Estabilizar a pupa com a ponta do pincel, e inserir a agulha na cutícula dorsal entre o tórax e do abdómen, num ângulo de aproximadamente 30 ° em relação à superfície dorsal da pupa. A injecção deve ser dirigida para a extremidade posterior da pupa e agulha deve ser movido numa direcção anterior para posterior. </li><li> Injectar dois pulsos (69 nl por pulso) de solução de 3 mg / mL dsRNA na hemolinfa, e verificar se há a distribuição de cor ao longo do corpo. Se nenhuma cor é identificada, mudar a posição da agulha de injeção ligeiramente para limpar a ponta da obstrução e repetir a entrega líquido. </li><li> Use o pincel molhado para mover suavemente pupa da agulha na água para a cultura. Tele pupa deve ficar para o pincel em cima do contato luz. </li></ol> 7. Condições pós-injeção <ol><li> Coloque uma placa de Petri com pupas injectado numa gaiola de mosquitos com um fluxo de ar adequado (por exemplo, gaiola de malha ou recipiente com tampa de malha). condições de criação pupa deve permanecer consistentemente em 27 ± 3 ° C de temperatura, 75 ± 5% de umidade e estar sob uma luz: ciclo escuro de 16: 8 hr. </li><li> Prepara-se uma a 10% (w / v) de solução de glucose, e colocar uma bola de algodão saturado com solução na gaiola de mosquitos malha para a alimentação de adultos. </li></ol> 8. Avaliar Knockdown <ol><li> No ponto de tempo desejado (s), em avaliar os fenótipos experimentais insectos injectados com ARNcd, em comparação com os controlos. <ol><li> Avaliar dsSRPN2 e dsLacZ insectos diariamente por refrigeração para baixo adultos durante cerca de 2-3 min a -20 ° C, transferindo-os para uma placa fria a 2 ° C e a identificação de qualquer formação de pseudo-tumoral por utilização de um microscópio de dissecação em 15Xampliação com iluminação de campo claro. Após a avaliação, o retorno adultos às condições insetário (27 ± 3 ° C, 75 ± 5% de umidade). Nota: Os dsRNAs experimentais e de controlo utilizados neste protocolo são dsSRPN2 e dsLacZ, respectivamente. Há muitas opções adequadas para os controlos; no entanto, sugere-se que um controlo positivo para o qual fenótipo e / ou expressão é facilmente visualizado (por exemplo, por meio de dissecção microscopia) e / ou quantificada [por exemplo, quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR), Western blot] deve ser utilizada quando aprender esta técnica. SRPN2 proteína e quantificação transcrição através de Western blot e qRT-PCR, respectivamente, são descritos em Michel et al. (2005) 21. </li></ol></li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serpin+gene+family+in+Anopheles+gambiae.">The serpin gene family in Anopheles gambiae.</a> Gene. 442 (1-2), 47-54 (2009).</li><li>Araujo, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+of+the+salivary+gland+nitrophorin+2+in+the+triatomine+bug+Rhodnius+prolixus+(Hemiptera:+Reduviidae)+by+dsRNA+ingestion+or+injection.">RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 36 (9), 683-693 (2006).</li><li>Griebler, M., Westerlund, S. A., Hoffmann, K. H., Meyering-Vos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+with+the+allatoregulating+neuropeptide+genes+from+the+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda+and+its+effects+on+the+JH+titer+in+the+hemolymph.">RNA interference with the allatoregulating neuropeptide genes from the fall armyworm Spodoptera frugiperda and its effects on the JH titer in the hemolymph.</a> J. Insect Physiol. 54 (6), 997-1007 (2008).</li><li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi.">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> J. Insect Physiol. 59 (12), 1212-1221 (2013).</li></ol>

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Os métodos actuais para induzir RNAi não transgénicos em mosquitos envolver a injecção directa de ARNcd no hemocelo 12,13 adulto ou a alimentação das larvas de ARNi nanopartículas revestidas de gatilho ou 14-17-microalgas baseado ARNcd 18 moléculas. Segmentação do mosquito adulto, embora extremamente valioso, pode excluir um grande número de genes que funcionam durante períodos de desenvolvimento anteriores. Knockdown iniciado pela alimentação das larvas podem produzir fenótipos inconsistentes durante a fase adulta, devido, em parte, ao potencial de persistência proteína variável através da fase de pupa. Portanto, a introdução de um método adicional que é voltado especificamente para iniciar RNAi durante o desenvolvimento da pupa irá fornecer um meio para avaliar mais detalhadamente as funções dos genes durante estágios de desenvolvimento pré-adultos, bem como capacidades melhoradas para avaliar a função do gene durante os estágios adultos. Tal como com a abordagem de gene knockdown com base em injecção de ARNcd ou expressão, a persistência do gene knockdownnão pode ser prevista. Portanto, os níveis de transcritos ou proteínas devem ser avaliadas para o gene de interesse durante períodos de desenvolvimento de interesse. Embora observamos uma continuação da diminuição dos níveis de proteína no dia 5 pós-injeção para SRPN2 em animais SRPN2 dsRNA-injetados, fatores como a rotatividade de proteína e meia-vida pode ser diferente para diferentes alvos. É crítico para garantir, assim, que o ARNcd para ser utilizado para injecção é bem concentrada e parece intacto num gel de agarose. Recomendamos experimentadores reavaliar esses fatores se os resultados knockdown não são suficientes, e respectivas concentrações de dsRNA pode precisar de ser testado empiricamente para genes alvos específicos. Descreve-se um método para a iniciação da interferência de ARN durante a fase de pupa de An. desenvolvimento gambiae. Este método baseia-se na introdução através de micro-injecção de ARNcd directamente no hemocelo de pupas precoce e permite a avaliação da qualidade da injecção pelautilização de ARNcd marcado com corante. A habilidade de visualizar a qualidade injecção constitui uma melhoria importante para garantir uma knockdown bem sucedida e constitui um aspecto do silenciamento de genes com base em injecção que não tenha sido considerada em protocolos baseados em ARNcd mais previamente relatados centrados na fase adulta. Ao direccionar a pupa no início deste período de desenvolvimento, genes que podem desempenhar um papel no desenvolvimento durante este intervalo crítico, ou durante as fases iniciais da vida adulta pode ser avaliada funcionalmente. Além disso, este método pode permitir a entrega dsRNA para as células, e o estabelecimento de interferência de RNA em células que são acessíveis durante a metamorfose, mas menos acessível em mosquitos adultos completamente formados. Uma análise recente por microarranjo Harker et al. (2012) identificaram 560 An. transcrições gambiae que foram up-regulamentados ou para baixo-regulados por pelo menos 4 vezes durante diferentes estágios de desenvolvimento, desde o embrião a adulto. Dos 560 transcrições identificado, um conjunto de 309 foi up-regulada durante o desenvolvimento da pupa 27. Estas descobertas sugerem que há muitas exigências para expressão diferencial de genes ao longo do desenvolvimento do mosquito, incluindo aqueles que ocorrem durante a fase de pupa, um intervalo durante o qual o organismo sofre metamorfose. Em muitas espécies de insectos, incluindo uma. gambiae, os genes envolvidos em processos de desenvolvimento, tais como (ou seja, cuticular da pupa e proteínas de ligação a quitina) 27-31 e resposta imunitária (isto é, proteínas de receptores Toll-like) 27,32-34 são altamente expresso durante a fase de pupa. Uma vez que um adulto completamente formado emergiu, não é continuada a expressão do gene em resposta a alterações fisiológicas e ambientais 35. Nomeadamente, durante o desenvolvimento precoce de adultos, há um aumento na expressão de genes de desenvolvimento (isto é, adulto cuticular e proteínas sarcoplasmáticas) 36, bem como outros genes chave (ou seja </em&gt;, Proteína específica de esperma e citocromo P450 enzimas do metabolismo) 27,36. O controlo positivo utilizado no desenvolvimento deste protocolo, SRPN2, é um AN. gambiae inibidor de protease de serina (serpina). SRPN2 desempenha um papel importante na regulação negativa da melanização de insectos, um amplo espectro de resposta imune inata em insectos 21,22. Knockdown de SRPN2 em mosquitos adultos resulta na formação de pseudo-tumor de 21,22, um fenótipo que é facilmente observada por utilização de microscopia de luz. Tendo em conta que este fenótipo distinto pode ser facilmente marcado em insetos vivos, usamos SRPN2 para injectáveis ​​estágio RNAi pupa iniciais. Além disso, SRPN2 é expresso em todas as fases de desenvolvimento 37, proporcionando desse modo um bom alvo para a fase de pupa ARNi injecção e avaliação da função no início adulto. Nós demonstramos que o método que desenvolvemos é capaz de induzir adulto semelhante pseud melanótico<html> a formação de O-tumor como uma consequência de injecções de dsRNA executadas durante a fase de pupa de desenvolvimento. No desenvolvimento deste protocolo, temos observado que a injeção durante o desenvolvimento da pupa precoce (isto é, a primeira 24 horas após a muda larva-pupa) é fundamental para a obtenção de emergência de adultos ideal. No caso de má emergência é obtido após a injecção, recomendamos a encenação larvas com maior precisão, para obter pupas com menos extensa endurecimento cutícula e assegurar a injeção fase de pupa início é alcançado. Além disso, minimizar os danos aos resultados da cutícula das taxas de emergência óptimas e aumentando a ampliação durante a injeção pode ajudar a garantir que apenas a região pretendida do animal é perfurado. Se a agulha deve perfurar através da cutícula ventral, o agrupamento de líquido marcado com corante será evidente no exterior da pupa, ou vai saturar o papel de filtro. É altamente recomendável para descartar qualquer pupas que têm mais de uma punção cutícula. jove_content &quot;&gt; Com as extensas experiências de muitos laboratórios com o desempenho de injeções de mosquitos adultos, as abordagens microinjeção previamente identificados pode ser adaptada com modificações de protocolo simples para uso em experimentos RNAi pupa. No geral, o objetivo deste método é o de fornecer aos pesquisadores a capacidade de ampliar o prazo durante o qual reverter análises genéticas pode ser realizada, permitindo uma pesquisa mais adicional que irá apoiar o desenvolvimento de estratégias de controle de vetores novos. Curiosamente, as experiências em outras espécies, como Rhodnius prolixus e Spodoptera frugiperda, revelam que o gene efeitos silenciadores tendem a ser muito maior quando iniciado durante a pré-adulto estágios 38,39. durante todas as fases de desenvolvimento, gene RNAi mediada knockdown está sujeita a considerações sobre a rapidez ea persistência de silenciamento de genes, e a estabilidade das proteínas codificadas por genes-alvo. o alvo ideal RNAi genes tendem a ser aqueles que codificam uma protein ou de ARN que tem uma meia-vida curta e elevada taxa de rotação 11,40. Enquanto estratégias transgénicos ARNi também podem ser empregues para tratar as considerações sobre a rapidez e a persistência de ARNi durante as fases de pré-adulto, técnicas transgénicas têm muitos inconvenientes (por exemplo, o tempo necessário para a geração de linhas transgénicas, experimentais prazos de acasalamentos de mosquitos para gerar insectos com expressão dsRNA regulamentado, e manutenção de populações transgénicas). Por outro lado, o nosso protocolo proporciona um método mais fácil e mais rápido para iniciar silenciamento de genes durante o desenvolvimento da pupa e em tipos de células que se originam e são acessíveis durante a metamorfose, mas são menos acessíveis em adultos. A utilização de suspensões de dsRNA marcadas com corante permite a fácil avaliação do sucesso de injecção e a dispersão do material introduzido dentro de pupas. Os nossos dados sobre o início da formação de tumor em adultos pupa-injectado, em comparação com animais injectados como adultos, é consistente com o initiation de knockdown RNAi-mediada durante a fase de pupa. Usando nossa linha G3 mosquito e sob nossas condições insetário, observa-se o adulto melanotic formação de pseudo-tumor tão cedo quanto 10 dias após a injecção de adultos injetados três a cinco dias pós-emergência. Ao realizar a injeção início de pupa estágio, observamos a formação melanotic pseudo-tumor visível tão cedo quanto cinco dias após a injecção (ou seja, três a quatro dias após a emergência). Estes dados implicam que este método permite início de silenciamento de genes durante um período de desenvolvimento anteriormente sob estudado (ou seja, o desenvolvimento de pupa). O nosso método de marcação corante pode também ser útil para o desenvolvimento de novos protocolos de injecção larvais, devido à natureza translúcida da cutícula durante todas as fases larvares. Enquanto o controlo utilizadas neste estudo requer a progressão para a fase adulta para exibir um fenótipo de knockdown, futuras experiências para avaliar os fenótipos específicos da fase de pupa após a injecção de pupas cedo irá fornecerinformações valiosas sobre a expansão deste método em períodos de desenvolvimento adicionais, tais como o desenvolvimento de pupa tardia. Em resumo, este método fornece um protocolo de RNAi valiosa para a iniciação fase de pupa de silenciamento de genes RNAi-mediada e amplia as ferramentas de genômica funcional disponível para uso dentro da comunidade de investigação inseto vetor.

A malária é uma doença infecciosa transmitida por mosquitos que afeta muitos milhões de pessoas a cada ano. A Organização Mundial de Saúde (OMS) relata que em 2013 havia cerca de 584.000 mortes por malária, 78 por cento dos quais ocorreram em crianças com idade inferior a cinco anos 1. Os patógenos que causam a malária humana são parasitas apicomplexa dentro do Plasmodium género e são transmitidos entre seus hospedeiros humanos por mosquitos Anopheles fêmea. A transmissão ocorre quando o mosquito tem uma refeição de sangue de um indivíduo que está infectado e, em seguida depósitos parasitas infecciosos em um indivíduo não infectado em uma refeição de sangue subseqüente. Dentro do género Anopheles, Anopheles gambiae é a espécie com maior capacidade vetorial e é o vetor da malária mais proeminente na África sub-saariana 1-3. Atualmente, o controle de vetores de mosquito por implantação de inseticidas continua a bÊ O principal método utilizado para reduzir o fardo da malária humana. Embora o uso de insecticidas desde os anos 1960 demonstrou ser extremamente bem sucedida, o surgimento de resistência a insecticidas tem impulsionado uma necessidade para o desenvolvimento de novos insecticidas e estratégias de controlo alternativa vector 4-7. Em 2010, um total de 49 de 63 países que notificaram a OMS indicou a ocorrência de resistência a inseticidas em vetores da malária 1. Além disso, a ferramenta IR Mapper, que utiliza a literatura peer-reviewed para avaliar dados de resistência em regiões Afrotropicais, relata que entre 2001 e 2012 houve 46% e 27% de aumento na resistência aos piretróides e diclorodifeniltricloroetano (DDT), respectivamente 7. Interferência de RNA (RNAi) foi identificado na década de 1990, como uma técnica que pode ser empregue para inactivar genes na planta petúnia 8,9 e em que o fungo Neurospora crassa 9,10. Pouco depois,em 1998, ARNi foi documentada pela primeira vez em Caenorhabditis elegans como um meio de reduzir a expressão de genes num modelo animal pela introdução de anti-sentido ou ARN de cadeia dupla (ARNcd), através de injecção ou por métodos de alimentação 9,11. Desde a sua descoberta, RNAi revolucionou a busca da genómica funcional, permitindo que os pesquisadores utilizem genética reversa para investigar rapidamente os papéis funcionais de genes de interesse através de um mecanismo de silenciamento gênico pós-transcricional altamente seletivo. Em alguns organismos, tais como Drosophila melanogaster, o uso de organismos transgénicos que expressam as construções de ARN interferentes tem sido largamente usado com sucesso para silenciamento de genes (KD). Embora o uso de transgenes em An. gambiae para RNAi tem sido utilizada e pode ser útil para telas de grande escala, a geração de linhagens de mosquitos transgênicos é ao mesmo tempo de trabalho e tempo intensivo, geralmente tendo dois a três meses para ir a partir da identificação de um gene de interesse para os geraçãna de um estoque transgénico apropriado 12. Actualmente, o principal método de KD gene num. gambiae é por injecção na hemolinfa, durante a fase adulta, de ARNdc específico para um dado gene 12,13. Esse processo geralmente leva cerca de um mês para ir desde a identificação de um gene de interesse para avaliação da KD gene, provando ser muito mais rápida do que os métodos transgênicos 12. Métodos para larval estágio RNAi foram estabelecidos recentemente em um. baseada em microalgas gambiae e Aedes aegypti por meio de nanopartículas alimentação 14-17 ou por entrega oral de dsRNA moléculas 18, oferecendo oportunidades para realizar análise genômica funcional durante os estágios iniciais de desenvolvimento. Na injecção directa, a alimentação, e métodos de entrega de nanopartículas, o dsRNA é retomado por autonomamente na célula alvo e clivado pela enzima Dicer em 21-25 nucleótidos de comprimento &quot;curto ARN interferentes&quot; (ARNsi) 19,20. Estes são, em seguida, siRNAs IncorporATED para o silenciamento complexo (RISC) induzido por ARN, a partir da qual um fio vai ser descartado, permitindo que o complexo ligado RISC-RNA para se ligar e clivar o ARNm alvo e, assim, reduzir o seu nível e inibir a sua tradução 19,20. Muitas características intrínsecas da biologia básica mosquito modular a capacidade vetorial, incluindo preferências de acolhimento (por exemplo, olfato, gustação), acasalamento, reprodução e imunidade. Dada a importância destes processos biológicos, é provável que a sua modulação em um nível genético ou farmacológica vai oferecer novas oportunidades para o controle de vetores, incluindo a evasão de resistência a inseticidas, e fornecer novas ferramentas para abordagens mais amplamente integrados para controle de vetores. O uso de genômica funcional para avaliar os papéis de genes subjacentes a estas características biológicas intrínsecas vai permitir a identificação de novos alvos e fornecer novos insights sobre como podemos efetivamente criar novos strateg controle, mais eficazs. Nós descrevemos o desenvolvimento ea utilização de um método de injeção rápida para iniciar RNAi durante a fase de pupa de An. gambiae. Observamos que a injeção fase de pupa de um gatilho RNAi permite a observação de fenótipos resultantes em adultos em fase inicial, ou seja, mais cedo após a emergência do que seria observado caso gene knockdown foram iniciadas em adultos pós-emergência. Este métodos permite gene knockdown começando durante o intervalo de desenvolvimento de pupa e estendendo-se em estágios adultos, tais tipos de células que silenciamento de genes iniciado durante o desenvolvimento das pupas podem persistir e afetar início de adultos hemolinfa acessível, bem como tipos de células que são mais hemolinfa acessível durante a metamorfose do que no adulto, tais como neurónios sensoriais encontrados em apêndices adultos após a emergência.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MEGAscript RNAi kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II foot switch</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipette puller</td>
			<td>Narishigne</td>
			<td>PB-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7258</td>
			<td>Can substitute with a non-toxic food dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1371150</td>
			<td>&#188; inch cut from tip to create a wider opening.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman &#8220;thin&#8221; filter paper&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1001-090</td>
			<td>This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot &#8220;thick&#8221; filter paper</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>107-3931</td>
			<td>This is the filter paper generally used for Western blots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush (size 0)</td>
			<td>Michael&#8217;s Art</td>
			<td>10474940</td>
			<td>Brush size and brand can vary based on availability and user preference.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting light microscope</td>
			<td>&#160;----&#160;</td>
			<td>-----</td>
			<td>This can vary based on availability and user preference.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnai trigger delivery into anopheles gambiae pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

Injeção de pupa para os rendimentos KD gene óptimos resultados quando a injecção é realizada durante a fase de pupa precoce, quando os níveis de bronzeamento cutícula são baixos (Figura 1A, à esquerda, e 1B). Aumento de bronzeamento e endurecimento de cutícula, geralmente após 24 horas, resulta no aumento da morte de pupa após a injecção (Figura 1A, central e direito). A taxa de desenvolvimento de pupa pode variar dependendo das condições insetário e densidade de animais 24,25; Portanto, é melhor para avaliar visualmente a pigmentação. Durante o processo de injecção, a agulha capilar é inserido na cutícula dorsal com um ângulo de aproximadamente 30 ° na direcção anterior para posterior (Figura 2A). Uma vez que a agulha é inserida e o ARNcd + 0,01% (w / v) de FGD é distribuído, a distribuição de corante é evidente através da hemolinfa (Figure 2B). Avaliação de emergência dos adultos para pupas injectados com 0,01% (w / v) de DGC revelou uma taxa média de 70% de emergência, em comparação com 96,7% de emergência de controlos não injectados (Figura 3A). É de notar que foi observada a emergência parcial a partir do caso de pupa para um grande número de mosquitos não sobreviventes (Figura 3B). Animais injectados não apresentam atrasos no tempo de emergência (Figura 4A) ou impacto tendenciosa em ambos os sexos (Figura 4B). Avaliação adicional de sobrevivência de pacientes adultos realizadas até ao dia 10 pós-emergência revela nenhum impacto evidente no pós-emergência sobrevivência de pacientes adultos (Figura 4C). Validação de qualidade KD foi avaliada pelo fenótipo pseudo-tumoral melanótico (aglomerado de tecido pigmentadas) associado com SRPN2 21,22 knockdown como um controlo positivo para o knockdown e<html> ausência de fenótipos associados com injecção dsLacZ como um controlo negativo. mosquitos adultos que surgiram foram marcados no dia 8 após a injecção (dia 6-7 pós-emergência). Pseudo-melanotic tumores (Figura 5A e 5B) foram observadas através da cutícula de 93,5% do dsSRPN2 vs. 0% dos mosquitos adultos dsLacZ (Figura 6A). Clusters de tecido escuro melanizados foram identificados após a dissecação de manchas pigmentadas (Figura 5C). Pseudo-tumores eram visíveis sobre a cutícula adulto tão cedo como o dia 3 pós-emergência e também estavam presentes em um subconjunto de dsSRPN2 hemolinfa e tecidos do intestino (dados não mostrados). Em 5 de pós-injecção (fase adulta), diminuiu de forma significativa em níveis SRPN2 dsSRPN2, mas não foi observada dsLacZ ou isolados de proteína não-injectado hemolinfa (Figura 6B). ftp_upload / 53738 / 53738fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: preparo do Desenvolvimento para a injeção de pupa dsRNA injeção de pupa precoce de dsRNA resulta em sobrevivência e progressão ideal para a fase adulta.. Os baixos níveis de pigmentação cutícula (A, à esquerda, e B) pode ser observada na primeira 0-24 h pupation seguinte. Tanning da cutícula anterior injeção de pupa (A, central e direito) resultados de moderada a sobrevida. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig2.jpg" /> Figura 2:. Posição de injecção e a distribuição de injecção de ARNcd de agulha (A) Capilar marcadas com corante de ARNcd marcado com corante na cutícula dorsal em um ângulo de aproximadamente 30 °, na direcção anterior para posterior. (B) O corante é distribuída visivelmente na hemolinfa de pupas. O volume da injecção de ARNcd de 138 nl, marcado com 0,01% FGD (w / v). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig3.jpg" /> Figura 3:. Pós-injecção adulto emergência (a) 70% de pupas injectados com 0,01% FGD (w / v) surgiram com sucesso (n = 60), em comparação com 96,7% dos controlos não injectados (n = 60). Foram realizadas três réplicas biológicas. Observou-se (B) a emergência parcial a partir do caso de pupa para um grande número de mosquitos não sobreviventes. As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig4.jpg" /> Figura 4: velocidade de emergência, a avaliação sexo e adulto sobrevivência (A) foram observados tempos de despertar comparáveis ​​após a injecção de pupa com 0,01% FGD (24 HR = 80% e 48 HR = 20%), em comparação com pupas não injectada (24. HR = 83% e 48 HR = 17%). (B </strong&gt;) aproximadamente igual masculino e feminino adulto emergência foi observada para 0,01% FGD pupas injectado (feminino = 48% e masculino = 52%) e pupas não injectada (feminino = 52% e masculino = 48%). Análise (C) Survival revela que a injeção com 0,01% FGD não afeta a sobrevivência de adultos, avaliada até ao dia 10 pós-emergência. Os resultados representam dados de três experiências independentes com 0,01% FGD injectados (n = 60) e não injectada (n = 60) pupas (números iguais de machos e fêmeas). As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig5.jpg" /> Figura 5: Pseudo-tumor fenótipo controlo positivo reflete knockdown sucesso Pseudo-tumores foram observados no (A) abdominal e (B) cutícula torácica de dsSRPN2 -injected, mas não dsLacZ mosquitos adultos -injected no dia 8 após a injecção..(C) Maior ampliação (400X) de imagem (a) da cutícula e dissecção de manchas pigmentadas (b) revela aglomerados de células melanizadas escura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig6.jpg" /> Figura 6: A quantificação da formação de pseudo-tumor e diminuiu os níveis de proteína SRPN2 (A) injecções fase de pupa resultar na formação de pseudo-tumor em 93,5% dos adultos dsSRPN2 (n = 21), comparativamente com 0% dos controles dsLacZ (n = 19). . Os resultados obtidos dia 8 após a injecção. (B) Western blot (esquerda) mostra diminuiu SRPN2 níveis em dsSRPN2, mas não dsLacZ ou isolados não injectados proteína hemolinfa (dia 5 pós-injecção). Resultados obtidos em três experiências independentes. Anti-SRPN2 21 e anti-26 SRPN3 diluições de anticorpos utilizados foram 1: 1.000 e 1: 2.000, respectivamente. Cabra anti-rabbit IgG-HRP (Produto sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) foi utilizado a 1: 5000. Todos os níveis de proteína foram quantificados (direita) pela intensidade da banda (ImageJ Software, NIH, Bethesda, MD), normalizado para SRPN3 e comparados estatisticamente pelo teste t não pareado. P &lt;0,05: *, P ≥0.05: ns (não significativo). As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM).

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RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

RNAi gatilho para o interior<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; As pupas

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

rnai-trigger-delivery-into-anopheles-gambiae-pupae

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

9.0K visualizações.  Boston College. RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

Vídeo: RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Culturas primárias neuronais do cérebro de Tarde Stage Drosophila pupas

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Biologia

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

Protocolo para a Criação Mosquito (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocolo para Ensaios RNAi em mosquitos adultos (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to perturb gene expression patterns in selected segments of leech embryos, leaving the untreated segments as internal controls.
The pneumatic capillary gun can be used to reach internal layers of cells at early stages of development without opening the specimen. As a method for localized introduction of substances into living tissues, the biolistic delivery with the gun has several advantages: it is fast, contact-free and non-destructive. In addition, a single capillary gun can be used for independent delivery of different substances. The delivery region can have lateral dimensions of ~50-150 &#181;m and extends over ~15 &#181;m around the mean penetration depth, which is adjustable between 0 and 50 &#181;m. This delivery has the advantage of being able to target a limited number of cells in a selected location intermediate between single cell knock down by microinjection and systemic knockdown through extracellular injections or by means of genetic approaches.
For knocking down or knocking in the expression of the axon guidance molecule Netrin, which is naturally expressed by some central neurons and in the ventral body wall, but not the dorsal domain, we deliver molecules of dsRNA or plasmid-DNA into the body wall and central ganglia. This procedure includes the following steps: (i) preparation of the experimental setup for a specific assay (adjusting the accelerating pressure), (ii) coating the particles with molecules of dsRNA or DNA, (iii) loading the coated particles into the gun, up to two reagents in one assay, (iv) preparing the animals for the particle delivery, (v) delivery of coated particles into the target tissue (body wall or ganglia), and (vi) processing the embryos (immunostaining, immunohistochemistry and neuronal labeling) to visualize the results, usually 2 to 3 days after the delivery.
When the particles were coated with netrin dsRNA, they caused clearly visible knock-down of netrin expression that only occurred in cells containing particles (usually, 1-2 particles per cell). Particles coated with a plasmid encoding EGFP induced fluorescence in neuronal cells when they stopped in their nuclei.

In this video, we show a procedure for an accurate biolistic delivery of reagents into live tissue with a novel miniature gene gun. We are knocking down the expression of the axon guidance molecule Netrin in leech embryos by delivering molecules of dsRNA into the ventral body wall and ganglia of single segments.

Localizada RNAi e Expressão Gênica ectópica na sanguessuga medicinal

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Entrega bacteriana de RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Entrega direta da MIF Morpholinos Into the Otocyst Zebrafish por injeção e Eletroporação afeta o desenvolvimento da orelha interna

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi Interferência por injeção dsRNA em Drosophila Os embriões

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi Mediated Gene Knockdown e Transgénese por microinjeção no Nematóides Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...