Clinical and Translational Science Award program of NCATS UL1 TR0000427 and KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 to the UW ICTR from NIH/NCATS and funds from Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 from NINDS (Cengiz P) and NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). We would like to thank Albee Messing, PhD, for providing us the GFAP knockout mice.

NOTA: Este estudo foi realizado de acordo com a recomendação do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde. O protocolo animal foi aprovado pela Universidade de Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care e do Comitê Use. Protocolo de Cultura Astrocyte primário que é apresentado aqui é adotada a partir dos protocolos apresentados por Zhang Y 19 et al. E Cengiz P 20 et al., Com algumas modificações. 1. hipocampo Dissecção e Cultura Astrocyte <ol><li> Prepare todos os reagentes e materiais necessários, incluindo tesouras cirúrgicas, fórceps finos lisos, uma pinça ponta plana, toalhas de papel, saco de lixo, 70% de etanol e 2 pratos de dissecação (3,5 cm de diâmetro) no gelo cheias de 2 Solução Salina Equilibrada de mL Hank (HBSS) cada . Certifique-se do equipamento cirúrgico são estéreis (autoclave) antes do procedimento e utilizar todos os outros materiais (Astrocyte chapeamento meio: soro DMEM + 5% + cavalo1% de penicilina-estreptomicina, soro de cavalo, de HBSS, 0,25% de tripsina, lamelas de vidro, placas de Petri, 15/50 mL tubos, frascos T25, etc.) como pré-esterilizado. </li><li> Pressione cuidadosamente e pulverizar a cabeça e pescoço do cachorro rato com 70% de etanol e decapitar usando uma tesoura esterilizada afiadas [Figura 1 (1)]. </li><li> Realizar uma incisão mediana de posterior para anterior crânio com uma tesoura pequena ao longo do couro cabeludo para expor o cérebro [Figura 1 (2-3)]. </li><li> Cortar o crânio com cuidado desde o pescoço até o nariz com uma tesoura pequena. Em seguida, corte crânio anterior para os bulbos olfatórios e inferior ao cerebelo para desconectar o crânio da base do crânio. </li><li> Fazer uma pequena incisão na base do crânio e cortar ao longo da linha média. Use uma pinça de ponta chata estéreis para descascar o crânio. Remover o tronco cerebral com a ajuda de uma pinça curvos. Remover o cérebro do crânio e colocar para o primeiro prato de dissecação [Figura 1 (4-9)] 21. </li><li> Usando uma pinça curva, virar o cérebro de modo que a superfície ventral do cérebro é voltado para cima e, em seguida, separar os dois hemisférios com uma lâmina cirúrgica estéril afiada [Figura 1 (10,11)] </li><li> Retire os hemisférios cerebrais e remova cuidadosamente o tecido mesencéfalo e tálamo abaulamento com um estéreis pinças curvas planas para revelar o hipocampo, uma estrutura pequena, cavalo marinho em forma no lobo temporal medial [Figura 1 (12-14)]. </li><li> Remova ambos os lóbulos do hipocampo [Figura 1 (15,16)] e dissecar cuidadosamente as meninges de lobos puxando com a pinça fina. Este passo evita a contaminação da cultura final do astrócito por células meníngeas e fibroblastos. </li><li> Transferir os lóbulos do hipocampo preparados para o segundo prato cheio com HBSS e devolvê-lo em gelo [Figura 1 (17,18)]. Piscina ambos hipocampo lóbulos de um único rato (P0 - P2) para preparação de hipopótamoculturas Campal astrócitos. Isto dá a densidade apropriada dos astrócitos. Picar lobos do hipocampo, utilizando uma lâmina cirúrgica estéril afiada (aproximadamente 4 vezes). </li><li> Aspirar HBSS de prato usando uma ponta estéril ligada a uma pipeta de 1 mL e adicionar 3 ml de 0,25% de tripsina, misturar e transferir para um tubo cónico de 15 ml estéril e a incubação do tecido a 37 ° C durante 20 min com agitação suave. </li><li> tubo de centrifugação a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante cuidadosamente, utilizando uma pipeta de vidro estéril ligada a uma linha de vácuo. Adicionar 10 ml de astrócitos chapeamento médio e triturado (20 - 30 vezes) usando um fogo polido pipeta de vidro até pedaços de tecido homogeneizar. </li><li> tubo de centrifugação a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e adicionar 2 mL de meio de astrócitos chapeamento pré-aquecido fresco. Passar as células através de um filtro de malha de 70 um (filtro de células) para um novo tubo cónico de 50 mL. </li><li> suspensão de células em placa inteira num frasco de cultura T25 estéril poli-D-lisina / laminina, contendo 3 mL revestido demeios de astrócitos plaqueamento, depois incubar o balão a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. </li><li> Toda Aspirar mídia na dia- i n-vitro (DIV) 1, DIV 3 e DIV 7, e substituir com 2 mL de meio de astrócitos chapeamento frescos. Observe a progressão e confluência astrocitária sob microscópio de luz cada vez que ao substituir a mídia astrócitos chapeamento. NOTA: A DIV 1, todos os astrócitos viáveis ​​são ligadas à superfície do frasco de cultura e as células mortas ou a morrer que incluem neurónios estão a flutuar no sobrenadante. No DIV 3, as células ligadas começar a dividir para formar a camada de células de astrócitos. Na ausência de condições favoráveis, a cultura é quase desprovida de qualquer crescimento neuronal. No DIV 7, astrócitos camada é de cerca de 80 - 90% confluentes e alguns microglia, bem como células precursoras de oligodendrócitos estão presentes no topo da camada de astrócitos. </li><li> Aspirar o meio chapeamento do frasco, adicionar 2 mL de meio de astrócitos chapeamento pré-aquecido fresco, lavar and remover novamente no DIV 11, quando os astrócitos são confluentes e pronto para a sub cultura. </li><li> Adicionar 2 mL de tripsina a 0,25%, rode suavemente o frasco algumas vezes e aspirado de tripsina usando uma pipeta de vidro esterilizado. </li><li> Adicionar 2 mL de tripsina a 0,25% e deixar que o balão se sentar na capa de cultura de tecidos para 4-5 min a RT. </li><li> Remover a tripsina e manter o balão a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5% durante 10 min. Adicionar 5 mL pré-aquecido astrócitos chapeamento médio e retirar a camada de astrócitos tocando o frasco contra a palma da sua mão (3 - 4 vezes) seguido por trituração suave para conseguir separação completa e recolher os astrócitos em um tubo cônico de 15 mL. </li><li> tubo de centrifugação a 300 xg durante 5 min, aspirar o sobrenadante e adicionar 1 mL de meio fresco astrócitos chapeamento. </li><li> Adicionam-se 10 uL da suspensão de células para um hemocitómetro e contar as células na grande superfície reticulada central (1 mm2), utilizando um microscópio de contraste de fase invertida (objectiva 10X). Multiply por 10 4 para estimar o número de células por mL. Um balão T25 produzirá ~ 1 x 10 6 células totais dissociado. Semente ~ 1 x 10 5 células em 2 ml de astrócitos do plaqueamento em meio de um diâmetro de Poli-D-Lisina lamela de vidro pré-revestidas com 12 mm de o poço de uma placa de cultura de 24 poços. </li><li> Incubar a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. Execute OGD / Reox na DIV 12-14 (seção 2). </li><li> Tratar as culturas de astrócitos na DIV 3 com cloridrato de 5 mM L-leucina éster metílico (LME) até DIV 11 se culturas de hipocampo desprovidas de microglia são desejados. Após LME incubação, as culturas sujeitas a agitação (300 rpm durante 1 h) para remover contaminantes microglia. NOTA: LME é um agente citotóxico da microglia que tem sido amplamente utilizado como um método para eliminar a proliferação microglia 22. </li></ol> 2. OGD / Reox Tratamento <ol><li> media aspirado de lamela contendo cultura de astrócitos aderente (DIV 12-14) e lavar 3 vezespor rotação suave a 24 poços de cultura prato que prende a lamela algumas vezes com 1 mL de solução isotónica OGD (pH 7,4) contendo (em mM): 0 de glucose, 21 de NaHCO3, 120 NaCl, 5.36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,27 de CaCl2, e 0,81 MgSO 4. </li><li> Adicionar 0,2 mL de solução a OGD bem para cobrir a lamela e incubar durante 2 h numa incubadora hipóxico contendo 94% de N 2, 1% de O2, e 5% de CO 2. Misturar suavemente com um agitador orbital (50 rpm) durante os primeiros 30 minutos de hipoxia para facilitar o intercâmbio de gás. </li><li> Incubar as células de controlo normóxicas durante 2 h em 5% de CO 2 e o ar atmosférico em um tampão idêntica à solução OGD, excepto a adição de 5,5 mM de glucose. </li><li> Para Reox, aspirado solução OGD e adicionar 2 mL de astrócitos chapeamento médio. Incubar em 5% de CO 2 e o ar atmosférico, a 37 ° C durante 5 h. </li></ol> 3. imunocitoquímica Coloração &lt;/ P&gt; <ol><li> Aspirar o meio de cultura usando uma pipeta de vidro estéril ligada a uma linha de vácuo e rapidamente enxaguar lamela uma vez por adição de 1 mL de 0,1 M de Tris salino tamponado (TBS) (NaCl 154 mM, 16 mM, de Trizma base, Tris-HCl a 84, pH 7,4) para o poço. Aspirar e juntar 2 ml de paraformaldeído a 4% (PFA) em 1x tampão fosfato salino (PBS). Incubar durante 15 minutos à TA. </li><li> Aspirar e adicionar 1 mL de 0,1 M TBS, em seguida, coloque em um agitador de balanço por 2 min. Repita 3 vezes. Adicionar 1 ml de solução (soro de cabra a 10%, 10 mg / mL de BSA, 0,025% de Triton X-100 a 0,1 M em TBS) de bloqueio e incubar durante 30 min a 37 ° C num agitador de balanço. </li><li> Aspirar solução de bloqueio e adicionar anticorpo-GFAP monoclonal anti-primário do rato (0,2 mL de uma diluição de 1: 500 em solução de bloqueio) e soro policlonal de coelho anti-S100B (1: 500) ou anticorpo policlonal de coelho anti-HIF1α (1: 200) durante 60 min a 37 ° C num agitador de balanço. </li><li> Alternativamente, alguns astrócitos são incubadas com anticorpo policlonal de coelho anti-IBA1 (1: 200) e seg ratooclonal anti-MAP2 para acessar a pureza da cultura. </li><li> Aspirar anticorpo primário e enxaguar lamela pela adição de 1 mL de 0,1 M TBS e colocação num agitador de balanço por 2 min e depois aspirar. Repita duas vezes. </li><li> Adicionar 0,2 ml de uma diluição 1: 200 dos anticorpos anti-coelho conjugados 568-488-conjugados e anti-ratinho de cabra secundário em solução de bloqueio durante 60 minutos a 37 ° C num agitador de balanço. </li><li> Aspirar anticorpo secundário e enxaguar lamela pela adição de 1 mL de 0,1 M TBS e coloque num agitador de balanço por 2 min e depois aspirar. Repita duas vezes. </li><li> Remover lamela de bem e seco, colocando em um slide posicionado sobre uma lâmina de cabelo. Mount lamela em um novo slide, invertendo em uma única gota de Vectashield hardset meio de montagem com DAPI (1,5 ng / mL). </li><li> lamelas de imagem em um microscópio confocal usando 20X objetivo óleo seco ou 60X. Aquisição de imagens (512 x 512) para DAPI (405 nm ex / 450 nm em) e fluorocromo 488 etiquetado anticorpo GFAP (488 nm ex / 515 nmem). Manter parâmetros de aquisição constantes dentro do 20X e 60X grupos. </li></ol> 4. A determinação do sexo Usando PCR <ol><li> Calor pup dedo do pé ou dedo para recortes de 95 ° C durante 45 min em NaOH 50 mM e neutraliza-se com igual volume de Tris 1 M, pH 6,8. </li><li> Adicionar 1 mL da solução de ADN extraído a 19 uL da mistura seguinte: 5 pmol de iniciadores para os genes Myog e Sry, 1x tampão de reacção, 0,2 mM de cada desoxinucleótido e 8 U de Taq polimerase. </li><li> Use sequências de primers; Sry 5&#39;TCATGAGACTGCCAACCACAG3 &#39;, 5&#39;CATGACCACCACCACCACCAA3&#39; e Myog 5&#39;TTACGTCCATCGTGGACAGC3 &#39;, 5&#39;TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3&#39; 23. </li><li> Executar o seguinte protocolo de PCR: 95 ° C durante 3 min, depois 30 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 s, emparelhamento a 58 ° C durante 15 s, e alongamento a 72 ° C durante 1 min. Seguindo esta 30 ciclos, a reacção termina com um final de 72 ° C alongamento durante 1 min. </li><li> PC separadoProdutos R electroforeticamente num gel de brometo de etidio contendo 2% de agarose e visualização sob luz UV. (Figura 2A). CUIDADO! O brometo de etídio é um potencial cancerígeno e deve ser manuseado com cuidado e descartados de forma apropriada de acordo com os regulamentos da instituição. </li></ol>

<ol>
	<li>Powell, E. M., Geller, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+astrocyte-mediated+cues+in+neuronal+guidance+and+process+extension.">Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension.</a> Glia. 26, 73-83 (1999).</li><li>Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+the+regulation+of+cerebral+blood+flow.">Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow.</a> Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).</li><li>Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+dysfunction+in+neurological+disorders:+a+molecular+perspective.">Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).</li><li>Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier:+an+overview:+structure,+regulation,+and+clinical+implications.">The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications.</a> Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).</li><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tripartite+synapses:+glia,+the+unacknowledged+partner.">Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).</li><li>Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+reactive+astrocytes.">Heterogeneity of reactive astrocytes.</a> Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).</li><li>Cengiz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Na+/H++exchanger+isoform+1+is+neuroprotective+in+neonatal+hypoxic+ischemic+brain+injury.">Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury.</a> Antioxidants &amp; redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).</li><li>Ferriero, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+brain+injury.">Neonatal brain injury.</a> The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).</li><li>Hill, C. A., Fitch, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+mechanisms+and+outcome+of+neonatal+hypoxia-ischemia+in+rodent+models:+implications+for+sex-specific+neuroprotection+in+clinical+neonatal+practice.">Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice.</a> Neurol Res Int. , 1-9 (2012).</li><li>Cikla, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERalpha+Signaling+Is+Required+for+TrkB-Mediated+Hippocampal+Neuroprotection+in+Female+Neonatal+Mice+after+Hypoxic+Ischemic+Encephalopathy(1,2,3).">ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3).</a> eNeuro. 3, (2016).</li><li>Uluc, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+receptor+agonist+7,+8+dihydroxyflavone+triggers+profound+gender-+dependent+neuroprotection+in+mice+after+perinatal+hypoxia+and+ischemia.">TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).</li><li>Cikla, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+microglia+activation+after+hypoxia-ischemia+results+in+age-dependent+improvements+in+neurologic+injury.">Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury.</a> J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).</li><li>McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+in+the+developing+central+nervous+system.">Selective vulnerability in the developing central nervous system.</a> Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).</li><li>Morken, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+astrocyte-neuronal+interactions+after+hypoxia-ischemia+in+the+neonatal+brain+in+female+and+male+rats.">Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).</li><li>Chisholm, N. C., Sohrabji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+response+to+cerebral+ischemia+is+influenced+by+sex+differences+and+impaired+by+aging.">Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging.</a> Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).</li><li>Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+assessing+sex-specific+and+genotype-specific+response+to+injury+in+astrocyte+culture.">A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture.</a> Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+biological+contributions+to+human+health:+does+sex+matter?.">Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?.</a> Journal of women's health &amp; gender-based. 10, 433-439 (2001).</li><li>Collins, F. S., Tabak, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Policy:+NIH+plans+to+enhance+reproducibility.">Policy: NIH plans to enhance reproducibility.</a> Nature. 505, 612-613 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78, 785-798 (2013).</li><li>Cengiz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+Na+/H++exchanger+activation+promotes+gliotransmitter+release+from+reactive+hippocampal+astrocytes+following+oxygen-glucose+deprivation.">Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation.</a> PloS one. 9, e84294 (2014).</li><li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research.">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490, 187-191 (2012).</li><li>Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+improved+procedure+for+the+removal+of+microglia+from+confluent+monolayers+of+primary+astrocytes.">Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes.</a> J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).</li><li>McClive, P. J., Sinclair, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+DNA+extraction+and+PCR-sexing+of+mouse+embryos.">Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos.</a> Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).</li><li>Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+gender+determination+in+newborn+dark+pigmented+mice.">A method for gender determination in newborn dark pigmented mice.</a> Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).</li><li>Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+primary+astrocyte+cultures+devoid+of+contaminating+microglia.">Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia.</a> Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).</li><li>Raponi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100B+expression+defines+a+state+in+which+GFAP-expressing+cells+lose+their+neural+stem+cell+potential+and+acquire+a+more+mature+developmental+stage.">S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage.</a> Glia. 55, 165-177 (2007).</li><li>Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+adult+rat+astrocyte+cultures.">Characterization of adult rat astrocyte cultures.</a> PloS one. 8, e60282 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+differences+in+reactivity+of+mouse+and+rat+astrocytes+in+vitro.">Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro.</a> Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li><li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+in+astroglial+cultures:+a+cautionary+note.">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).</li></ol>

Nenhum dos autores têm interesses concorrentes ou conflitantes.

Para estudar as diferenças entre os sexos nas propriedades e função de astrócitos em condições fisiológicas e patológicas, preparação de astrócitos primários sexado em cultura celular é uma ferramenta importante para utilizar. No presente estudo relatamos um altamente eficiente e um método reprodutível à cultura uma população homogénea altamente enriquecido de astrócitos do hipocampo sexado de recém-nascidos (P0-P2) C57BL / 6 (tipo selvagem) ou K19F (GFAP null) filhotes de rato in vitro. Estabelecer esta metodologia ajuda os pesquisadores a entender as funções fisiológicas e patológicas de astrócitos do hipocampo sexado após isquemia in-vitro. Existem dois passos críticos para estabelecer esta metodologia, incluindo a manutenção de esterilidade e uma digestão adequada de lóbulos do hipocampo durante tripsinização seguido por trituração do tecido digerido, a fim de atingir a suspensão de célula única. Prevenção de astrócitos primários a partir deficando contaminada é um dos maiores desafios ao longo do processo de cultura. Bacteriana e / ou fúngica dois modos comuns de contaminação que pode tornar as células de cultura inútil se os cuidados adequados não é adotada durante a realização da técnica. Assim, a fim de garantir o sucesso experimental, é imperativo para realizar o processo sob um ambiente de trabalho estéril que inclui, desinfecção do local de trabalho, antes da utilização, utilizando um equipamento cirúrgico estéril e materiais, evitar o contacto dos materiais estéreis com superfícies não esterilizadas, utilizando um capela de fluxo laminar e evitar tomar frascos de cultura não niveladas para fora da capa laminar. Além disso, durante a dissociação enzimática, mais tempo de incubação de tecido do hipocampo com tripsina seguida por trituração física extensa pode levar à sua sobre-digestão resultante da viabilidade celular pobre e ineficiente ligação de células dissociadas de frascos de cultura. Pelo contrário, underdigestion do tecido cerebral fornece insuficientedissociação de células da glia, assim, resultando em rendimento pobre e semeadura de células como grandes aglomerações. Por conseguinte, a fim de se obter culturas de astrócitos saudáveis, é necessário optimizar a concentração em tripsina, o tempo de incubação e a trituração para conseguir uma óptima digestão do tecido do hipocampo. Nas nossas mãos, a incubação de lóbulos de hipocampo com a concentração de trabalho de 0,25% de tripsina por 20 min à temperatura ambiente, seguido por trituração suave durante 20 - 30 vezes produziu aderente forte, saudável e culturas de astrócitos altamente reprodutíveis. Além disso, repetiu congelamento e descongelamento de reagentes antes de usar cada vez que pode reduzir a sua eficácia. Portanto, é muito importante para os reagentes da alíquota em pequenas quantidades desejáveis ​​e congelar. Por exemplo, armazenar tripsina, penicilina / estreptomicina como alíquotas de 5 ml e soro fetal de bovino como alíquotas de 50 mL em numerosos tubos cónicos estéreis a -20 ° C até à sua utilização. Aconselhamos a não usar antibióticos para além da data de validade. GFAP é awmarcador de astrócitos fibrosos reativas ell caracterizado. Seguindo POG / Reox, supra-regulação da expressão de GFAP em resposta a astrogliose reactiva foi avaliado 20. Embora, tem sido proposto que a sobre-expressão de GFAP poderia ser utilizado como alvo específico para as estratégias de reparação neuronal 27 o seu papel no dano do hipocampo depois de HI em recém-nascidos ainda é incerto. a coloração imuno-histoquímica de astrócitos GFAP com permite identificar e caracterizar estas células sob condições fisiológicas e patológicas. coloração GFAP como qualquer outro marcador tem algumas limitações que precisam ser reconhecidos. Uma das limitações da coloração GFAP dos astrócitos é que nem todos os astrócitos expressam GFAP sob condições fisiológicas. Especialmente a taxa de expressão astrócitos imaturos de GFAP não exceda 40% sob condições fisiológicas 28. Dependendo da idade e uso de tipo específico dos astrócitos, outros marcadores de escolha pode ser considerado como GLAST, ALDH1L1, BLBP, Aquaporin-4 e S100B 29. Além disso, a presença de NSCs disfarçado como astrócitos nas culturas primárias não pode ser descartada. Estes NSC foram mostrados para apresentar características fenotípicas e ultra-estruturais semelhantes a amadurecer astrócitos, incluindo a expressão de GFAP. Portanto, a identificação de marcadores moleculares que são específicos para os astrócitos totalmente diferenciados e maturados é uma obrigação. Astrócitos foram relatados para S100B expressa em seus estágios de desenvolvimento mais tarde totalmente diferenciadas. Recentemente, foi relatado que neonatal cortical GFAP + astrócitos perdem o seu potencial de células-tronco progenitoras com o início da expressão de S100B que acontecer em torno DIV 15 26. Da mesma forma, nas nossas condições de cultura com uma DIV 14, 91% de células que expressam GFAP foram encontrados para co-expressar S100B, o que sugere que as culturas consistem em astrócitos do hipocampo amadureceram principalmente terminalmente diferenciadas. É quase impossível obter puras culturas de astrócitos primários do hipocampo totalmente desprovidas de contaminante células microgliais que residem acima e abaixo da monocamada de astrócitos. Portanto, é importante saber a proporção de contaminante em culturas astrogliais microglia e também para manter esta proporção tão baixa quanto possível. No presente estudo, manchado cultura de astrócitos com microglia IBA1 marcador específico ou MAP2 marcador neuronal, a fim de determinar a presença de quaisquer microglia ou neurônios como potenciais contaminantes. A proporção da microglia em cultura de astrócitos roedor podem variar de 1% a 30% dependendo de vários factores que incluem a idade do animal, espécie, região, meio de cultura, o método de subcultura e agitando 30. Nas nossas culturas observou-se aproximadamente 6% de contaminação da microglia que é comparável com outros relatórios 25. Se o uso pretendido da cultura de astrócitos é estudar o papel de astrócitos do hipocampo na inflamação é imperativopara o tratamento das culturas com LME 5 mM, durante 10 d para eliminar a possibilidade de contaminação da microglia nas culturas de astrócitos a partir de DIV 3. LME é um agente citotóxico da microglia que tem sido amplamente utilizado como um método para remover a proliferar microglia 20,22. Além disso, as culturas tratadas com LME deve ser submetido a um protocolo de agitação (300 rpm durante 1 h). Um outro desafio técnico na realização de POG / Reox é para determinar se um grau suficiente de hipoxia foi conseguido para induzir astrogliose. Os marcadores para hipoxia em astrócitos incluem a sobre-regulação de GFAP e a indução de HIF-1α. Assim, no presente estudo hipoxia foi confirmada pelo aumento da imuno-reactividade GFAP (dados não apresentados) e a regulação positiva de coloração HIF1-α (Figura 4). Em resumo, os resultados obtidos a partir de culturas de astrócitos do hipocampo neonatais sexado mostrou fixação celular bem sucedida com saudável astrócitos homogénea di camadasplaying morfologia típica em lamelas e a manifestação do maior reactivo marcadores GFAP astrocíticos e S100B após indução de isquemia in vitro. Acreditamos que o protocolo adoptada aqui tem o potencial para responder a perguntas mecanicistas e traducionais importantes relativos ao papel de astrócitos no desenvolvimento de cérebros masculinos e femininos. O procedimento de cultura inteiro, em oposição à maioria das técnicas existentes gera astrócitos do hipocampo maduros e confluentes sexuado em duas semanas, concedendo um retorno rápido dos experimentos e a simplicidade da técnica irá facilitar a utilização do método de cultura de astrócitos como uma ferramenta para estudar o sexo papel específico das células da glia no desenvolvimento do cérebro, assim, permitindo a sua ampla divulgação na pesquisa do cérebro.

Os astrócitos são um dos principais intervenientes mais importantes no sistema nervoso central (SNC). Crescente corpo de evidências indica que os papéis de astrócitos são mais do que apoio neuronal. Na verdade, o papel dos astrócitos em condições fisiológicas pode ser muito complexo, tais como guiar a migração de axónios em desenvolvimento 1, regulando SNC fluxo de sangue 2, a manutenção da homeostase do sináptica fluido intersticial 3 pH, e participam na barreira hemato-encefálica 4 e 5 da transmissão sináptica. Em condições patológicas, astrócitos responder a uma lesão com um processo chamado astrogliose reactivo em que a morfologia, número, localização, topografia (em relação à distância do insulto) e a função dos astrocitos podem mudar de uma forma heterogénea 6,7. Astrogliosis visto seguinte encefalopatia hipóxico-isquémica neonatal talvez contribuindo para a morbidade e mortalidade de recém-nascidos <saté&gt; 8. estudos clínicos e experimentais recentes indicam que a gravidade da lesão cerebral parece ser dependente do sexo e que os machos recém-nascidos são mais susceptíveis aos efeitos de hipoxia / isquemia (HI) lesão cerebral -relacionados, resultando nos resultados neurológicos mais graves, em comparação com mulheres com lesões cerebrais comparáveis 9-11. Embora a localização da lesão depende da idade gestacional e a duração e a gravidade da lesão, hipocampo é uma das regiões mais vulgarmente efectuada no SNC após HI neonatal prazo, e aumentou astrogliose hipocampo foi confirmada por super-regulação de a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) 3 d após a HI neonatal 7,10,12,13. Diferenças sexuais em função de astrócitos foram mostrados em ambos os recém-nascidos e roedores adultos após isquemia cerebral 14,15. Além disso, a susceptibilidade de astrócitos do sexo masculino de isquemia in vitro foi demonstrado por um aumento da CELl morte em comparação com astrócitos corticais do sexo feminino na cultura 16. Diferenças sexuais começar no útero e continuam até a morte 17. Durante a última década, a importância de incluir os sexos em condições experimentais em cultura celular e in vivo estudos têm sido a ênfase do Instituto de Medicina e NIH para buscar conhecimentos fundamentais nas diferenças de sexo visto em condições fisiológicas e patológicas 17,18 . Desenvolvimento de métodos confiáveis ​​para isolar e manter populações de astrócitos do hipocampo sexuado é essencial para compreender a base celular das diferenças sexuais nas consequências patológicas de HI neonatal. O presente estudo foi desenhado para proporcionar as técnicas para preparar culturas de astrócitos do hipocampo específicas do sexo enriquecidos de ratos recém-nascidos, a fim de avaliar os papéis de astrócitos GFAP-imunoreativos seguintes Oxygen / Glucose Privação (OGD) e reoxigenação (Reox), induzindoHl em meio de cultura de células. Esta técnica pode ser usado para testar qualquer hipótese referente a astrócitos do hipocampo em machos e fêmeas neonatais sob condições de normóxia e isquémicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Astrocyte culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-070</td>
			<td>Final Concentration: 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Cellgro&#160;</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Final Concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">L-Leucine methyl ester hydrochloride</td>
			<td rowspan="2">Aldrich</td>
			<td rowspan="2">L1002-25G</td>
			<td rowspan="2">Final Concentration: 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Solution for brain tissue digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>cellgro</td>
			<td>25-050-CI</td>
			<td>Final Concentration: 0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% (vol/vol) ethanol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 12mm round coverslips&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Sterile cell strainer&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 cm petri dish</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, fine&#160;</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>2-1032; 2-1033</td>
			<td># 3c; # 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, flat tip</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>12-120-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 cm surgical scissors</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BC-140-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1RSi&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5805000.017</td>
			<td>Centrifuge5804R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE 4450-1CE</td>
			<td>MaxQ 4450&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IBA1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2320</td>
			<td>Mouse monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIF1alpha</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab179483</td>
			<td>rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-S100B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HPA015768</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP (cocktail)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>837602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-6101</td>
			<td>Contains 4 Reagents&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sex differences in mouse hippocampal astrocytes after in-vitro ischemia

Astrogliosis seguinte hipóxia / isquemia (HI) lesão cerebral -relacionados desempenha um papel no aumento da morbidade e mortalidade em recém-nascidos. Estudos clínicos recentes indicam que a gravidade da lesão cerebral parece ser dependente do sexo, e que os machos recém-nascidos são mais susceptíveis aos efeitos de lesões cerebrais relacionadas-HI, resultando nos resultados neurológicos mais graves, em comparação com mulheres com lesões cerebrais comparáveis. O desenvolvimento de métodos confiáveis ​​para isolar e manter populações altamente enriquecido de astrócitos do hipocampo sexuado é essencial para compreender a base celular das diferenças sexuais nas consequências patológicas de HI neonatal. Neste estudo, descrevemos um método para a criação de culturas de astrócitos do sexo específicos do hipocampo que são submetidos a um modelo de isquemia in vitro, a privação de oxigénio-glicose, seguida por reoxigenação. astrogliosis reactiva subsequente foi examinado por immunostaiNing para a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e a S100B. Este método fornece uma ferramenta útil para estudar o papel do sexo masculino e astrócitos do hipocampo do sexo feminino seguinte HI neonatal, separadamente.

Compreender os papéis de funções de astrócitos sexado em condições fisiológicas ou fisiopatológicas foram imensamente elucidada por cultura destas células sob condições in vitro. O aspecto importante da cultura realizando sexuado é para determinar o sexo do filhote de rato antes da sua utilização. Determinou-se o sexo do ratinho geneticamente por PCR e por avaliação visual (Figura 2) 16. A metodologia de determinação do sexo usando PCR foi aprovado com modificações de McClive e Sinclair, é rápido, simples e altamente reprodutível método 23. A Figura 2A mostra os resultados representativos de determinação do sexo usando PCR. Os produtos de PCR foram gerados com ADN extraído a partir de dois recortes representativos P1 masculinos e femininos cauda. A reação inclui pares de primers multiplexados para genes Sry e Myog que geram bandas específicas do sexo masculino de 441 pb e especi femininabandas ic de 245 pb, respectivamente. Determinação visual da neonatal (P 1 - 3) sexo rato com olho nu foi estabelecida por procurando a presença de uma pequena mancha escurecida entre aberturas anogenitais apenas em machos (Figura 2b) 16,24. Embora, a cultura de astrócitos é conveniente e relativamente fácil de definir em laboratório montado, esta vantagem pode ser prejudicada pela sua contaminação, principalmente com microglia ou neurônios, em menor medida. A contaminação dos astrócitos podem ser facilmente determinadas por imunomarcação das células cultivadas com marcadores específicos de células, quer para a microglia (IBA1) ou neurónios (MAP2). No presente estudo, foram observados astrócitos do hipocampo que crescem em culturas em monocamada primários ter ~ 6% de contaminantes na microglia DIV 14, tal como sugerido por algumas células que expressavam IBA1 (Figura 3). Pelo contrário, nenhuma das células foram encontrados para expressar MAP2 sugerindoa cultura foi totalmente desprovida de qualquer contaminação neuronal (Figura 3). A contaminação da microglia menores observadas nas nossas culturas está de acordo com outros relatórios, em que os autores relataram uma contaminação da microglia 5% em suas culturas de astrócitos corticais primárias derivadas de 1 - filhotes de rato de 3 dias de idade 25. Astrócitos possuem um citoarquitetura específico que lhes permitem responder às mudanças no seu microambiente incluindo hipóxia. A fim de determinar qualquer resposta astrocitária específica sexo para vitro in-isquemia, que sujeita os astrócitos do hipocampo sexado para OGD / Reox. Indução bem sucedida de POG / Reox foi determinada pela expressão nuclear aumento de hipoxia fator induzível 1 alfa (HIF1α observada em astrócitos GFAP + submetidas a 2 horas OGD seguido por 5 h Reox, em comparação com as expressões HIF1α em células sob condições de normóxia (Figura 4 ). <p class="jove_content" fo:keep-together.dentro-de-página = &quot;1&quot;&gt; coloração imunocitoquímica de astrócitos em cultura do hipocampo sexado com GFAP ou S100B (marcador de astrócitos maduros) resultou num padrão de coloração altamente selectiva e reproduzível (Figura 5). GFAP e S100B foram colocalized nos corpos citoplasma e células de astrócitos, caracterizando um estágio de desenvolvimento astrocitário amadureceu, onde estas células tendem a perder seu células estaminais neuronais (NSC) potencial 26. A morfologia ea densidade de GFAP ou imunoreatividades S100B foram semelhantes em ambas as culturas de astrócitos masculinos e femininos como observado em seus respectivos grupos de tratamento OGD / Reox normóxica e. Em condições de normóxia, astrócitos do hipocampo apresentou uma poligonal para fusiforme e morfologia plana [Figura 5A, B (normoxia 60X; seta)], tal como avaliadas através de microscopia confocal. Estas células foram capazes de se dividir até à confluência durante aproximadamente 2 semanas antes da indução de POG / Reox. Após 2 h de OGD e 5 h Reox, astrócitos exibiu Reacti clássicosve morfologia dos astrócitos exibindo processos primários retraídos, hipertrofia da soma e processos e aumento da expressão de GFAP ou S100B [Figura 5A, B (OGD / Reox, 60X; seta)]. Seguindo o POG / Reox, a coloração GFAP / S100B também exibiu uma extensa rede trabecular que se prolonga através do citoplasma em ambos os sexos masculino e feminino astrócitos do hipocampo. A falta de coloração GFAP observada nos astrócitos do hipocampo em cultura a partir de ratinhos nulos para GFAP serviu como um controlo negativo (Figura 5B, inserção). Os resultados acima proporcionam evidência directa de que a morfologia de astrócitos GFAP / S100B-imunorreactivas sofre alterações significativas quando submetido a OGD-Reox. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53695/53695fig1.jpg" /> Figura 1. Ilustrações de a técnica de remoção do hipocampo de ratos P1. 1. Decapitar cachorro para remover a cabeça.2, 3. Utilizando uma tesoura fina, fazer uma incisão na linha média da pele, posterior para anterior, e descascar a pele com a ajuda de uma pinça de ponta plana. 4, 5, 6. Fazer uma pequena incisão na base do crânio. Cortar o crânio ao longo da linha média e descascar duas metades para expor o cérebro. 7, 8. Remover cerebelo com a ajuda de uma pinça curvos. 9. Retire cuidadosamente o cérebro do crânio e colocar em uma placa de Petri estéril. 10, 11. Virar o cérebro de modo que a superfície ventral do cérebro está virada para cima usando um fórceps curvos, em seguida, separar os dois hemisférios com uma lâmina cirúrgica estéril afiada. 12, 13, 14. Remover o tecido do mesencéfalo e tálamo abaulamento deixando intacta subjacente o hemisfério e revelando o hipocampo. 15, 16. Remover o hipocampo (pequena estrutura em forma de C). 17, 18. imediatamente coloque os lóbulos do hipocampo obtidos a partir tanto do hemisférios numa<html> placa de Petri separado contendo estéril HBSS. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53695/53695fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53695/53695fig2.jpg" /> Figura 2. Determinação do Sexo de Ratinhos Neonatais. Uma. Rato de sexo foi geneticamente determinada por PCR com primers específicos para o Myog (cromossoma X) e os genes Sry (cromossoma Y) utilizando ADN extraído a partir do dedo ou do dedo do pé recortes (F 1; H 1). As bandas de PCR foram visualizados num gel de agarose a 2% com brometo de etídio sob iluminação UV. F 2 e M 2 serviram como controlos positivos para o sexo feminino e masculino, respectivamente. B. determinação visual do macho da fêmea foi estabelecida através da identificação de um local escurecido entre as aberturas anogenitais (seta).urce.jove.com/files/ftp_upload/53695/53695fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53695/53695fig3.jpg" /> Figura 3. A pureza do rato Primária do hipocampo Astrocyte Cultura. Imunocoloração da cultura de astrócitos com MAP2 neuronal marcador (vermelho) e IBA1 microglia marcador (verde). Os núcleos são corados com 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (azul). A seta indica a contaminação microglia. Barra de escala:. 50 mm <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53695/53695fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53695/53695fig4.jpg" /> Figura 4. HIF1α Expressão era Emvincadas no hipocampo Cultivadas astrócitos Expostos a OGD / Reox. imagens de imunofluorescência representativas que mostram GFAP (vermelho) e HIF1α (verde) rotulagem em astrócitos sujeitos a (A) normoxia ou (B) OGD (2 h) / Reox (5 h). Os núcleos são corados com 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (azul). Seta, baixa expressão HIF1α; seta, elevada expressão nuclear HIF1α. Barra de escala:. 25 um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53695/53695fig4large.jpg" target="_blank">favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53695/53695fig5.jpg" /> Figura 5. Up-regulação da S100B ou expressão GFAP em Culturas Sexed hipocampo Astrocyte seguinte OGD-Reox. Astrócitos do hipocampo em cultura Sexado foram coradas para S110b ou expressão GFAP em condições de normóxia ou após 2h OGD seguido por 5 h de Reox (OGD / Reox). Detalhe: imagem 60X de astrócitos do hipocampo em cultura de ratinhos nulos GFAP. Barra de escala: 30 ^ m.

Watch this Scientific Journal Video about Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia at JoVE.com

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Os astrócitos são um dos principais intervenientes mais importantes no sistema nervoso central (SNC). Aqui, nós estamos relatando um método prático de protocolo de cultura de astrócitos do hipocampo sexuado, a fim de estudar os mecanismos subjacentes a função de astrócitos em filhotes recém-nascidos do sexo masculino e feminino após isquemia in-vitro.

As diferenças sexuais no mouse do hipocampo astrócitos após<em&gt; In-Vitro</em&gt; Isquemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

sex-differences-mouse-hippocampal-astrocytes-after-vitro

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

13.3K visualizações.  University of Wisconsin.  Os astrócitos são um dos principais intervenientes mais importantes no sistema nervoso central (SNC). Aqui, nós estamos relatando um método prático de protocolo de cultura de astrócitos do hipocampo sexuado, a fim de estudar os mecanismos subjacentes a função de astrócitos em filhotes recém-nascidos do sexo masculino e feminino após isquemia in-vitro. 

Vídeo: Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) de fluorescência Proteínas Tagged em espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo Cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neurociência

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Isolamento e Cultura de astrócitos corticais de rato

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms responsible for those differences remain unclear. Primary disassociated embryonic neuronal culture provides a simplified experimental model with which to investigate the neuronal cell signaling involved in cell death as a result of ischemia or disease; however, most neuronal cultures used in research today are mixed sex. Researchers can and do test the effects of sex steroid treatment in mixed sex neuronal cultures in models of neuronal injury and disease, but accumulating evidence suggests that the female brain responds to androgens, estrogens, and progesterone differently than the male brain. Furthermore, neonate male and female rodents respond differently to ischemic injury, with males experiencing greater injury following cerebral ischemia than females. Thus, mixed sex neuronal cultures might obscure and confound the experimental results; important information might be missed. For this reason, the Herson Lab at the University of Colorado School of Medicine routinely prepares sex-stratified primary disassociated embryonic neuronal cultures from both hippocampus and cortex. Embryos are sexed before harvesting of brain tissue and male and female tissue are disassociated separately, plated separately, and maintained separately. Using this method, the Herson Lab has demonstrated a male-specific role for the ion channel TRPM2 in ischemic cell death. In this manuscript, we share and discuss our protocol for sexing embryonic mice and preparing sex-stratified hippocampal primary disassociated neuron cultures. This method can be adapted to prepare sex-stratified cortical cultures and the method for embryo sexing can be used in conjunction with other protocols for any study in which sex is thought to be an important determinant of outcome.

Primary disassociated embryonic hippocampal neuronal cultures are useful for investigating the signaling mechanisms involved in neuron death. Sexing the embryos before the isolation and dissociation of the hippocampus allows the preparation of separate male and female cultures, which enables the researcher to identify and investigate sex-specific cell signaling.

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modelagem astrocitoma Patogênese<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

A visualização imuno-histoquímica de Hippocampal Neuron Atividade Após Spatial Aprendizagem em um rato modelo de desordens do desenvolvimento neurológico

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent improvements in methodologies and applications for the study of theta oscillations. A simple characterization of the isolated hippocampal preparation is presented whereby the relationship between internal hippocampal theta oscillators is examined together with the activity of pyramidal cells, and GABAergic interneurons, of the cornu ammonis-1 (CA1) and subiculum (SUB) areas. Overall, we show that the isolated hippocampus is capable of generating intrinsic theta oscillations in vitro and that rhythmicity generated within the hippocampus can be precisely manipulated by optogenetic stimulation of parvalbumin-positive (PV) interneurons. The in vitro isolated hippocampal preparation offers a unique opportunity to use simultaneous field and intracellular patch-clamp recordings from visually-identified neurons to better understand the mechanisms underlying theta rhythm generation.

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Here, we present a protocol for recording rhythmic neuronal network theta and gamma oscillations from an isolated whole hippocampal preparation. We describe the experimental steps from extraction of the hippocampus to details of field, unitary and whole-cell patch clamp recordings as well as optogenetic pacing of the theta rhythm.

Tuning na banda Theta do hipocampo<em&gt; In Vitro</em&gt;: Metodologias para gravação a partir do Circuito de Septohippocampal de Roedores Isolado

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at adult stages. Thus far, no immunostaining strategy can single them out and segment their morphology in mature animals and over the course of corticogenesis. Cortical PrA originate from progenitors located in the dorsal pallium and can easily be targeted using in utero electroporation of integrative vectors. A protocol is presented here to label these cells with the multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) Markers strategy, which relies on piggyBac/Tol2 transposition and Cre/lox recombination to stochastically express distinct fluorescent proteins (blue, cyan, yellow, and red) addressed to specific subcellular compartments. This multicolor fate mapping strategy enables to mark in situ nearby cortical progenitors with combinations of color markers prior to the start of gliogenesis and to track their descendants, including astrocytes, from embryonic to adult stages at the individual cell level. Semi-sparse labeling achieved by adjusting the concentration of electroporated vectors and color contrasts provided by the Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers or MM) enable to individualize astrocytes and single out their territory and complex morphology despite their dense anatomical arrangement. Presented here is a comprehensive experimental workflow including the details of the electroporation procedure, multichannel image stacks acquisition by confocal microscopy, and computer-assisted three-dimensional segmentation that will enable the experimenter to assess individual PrA volume and morphology. In summary, electroporation of MAGIC Markers provides a convenient method to individually label numerous astrocytes and gain access to their anatomical features at different developmental stages. This technique will be useful to analyze cortical astrocyte morphological properties in various mouse models without resorting to complex crosses with transgenic reporter lines.

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Astrocytes tile the cerebral cortex uniformly, making the analysis of their complex morphology challenging at the cellular level. The protocol provided here uses multicolor labeling based on in utero electroporation to single out cortical astrocytes and analyze their volume and morphology with a user-friendly image analysis pipeline.

Em Utero Eletroporation de Marcadores de Cor Multiaddressable (MAGIC) para Individualizar Astrócitos de Ratos Cortical

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

As diferenças sexuais no mouse do hipocampo astrócitos após

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo