Os autores agradecem à facilidade núcleo imagiologia INRA MIMA2 (INRA, UMR1198, Jouy-en-Josas) e ao pessoal da unidade IERP (UE 0907, INRA, Jouy-en-Josas) por cuidar dos animais e instalações. Gostaríamos também de agradecer a IH Mather, MC Neville e S. Tooze por nos fornecer antibodie muito útil.

Ratinhos CD1 foram criados pelo INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, França). Todos os aspectos éticos de cuidados com animais cumprido com as orientações pertinentes e requisitos de licenciamento estabelecidos pelo Ministério da Agricultura francês. Os procedimentos utilizados foram aprovados pelo comitê de ética local (12/097 acordo do Comethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech). 1. glândula mamária Preparação de Amostras <ol><li> Glândula mamaria do rato dissecção <ol><li> Euthanize ratos no dia 10 da lactação por deslocamento cervical e prender o animal para baixo com o seu abdômen virado para cima. </li><li> Umedecer a área ventral com etanol e seque com uma toalha de papel. </li><li> Utilizando uma pinça, puxe a pele abdominal entre as duas patas traseiras e fazer uma incisão (somente através da pele) de cerca de 1 cm com uma tesoura afiada. A partir desta primeira incisão, em seguida, usar uma tesoura para cortar a pele até o pescoço no mouse. Puxe a pele longe do peritônio e pin abaixo de um lado da pele de cada vez, estendendo-se ensinou. </li><li> Recolher o abdominal e as glândulas mamárias inguinais, empurrando-os para longe da pele com um cotonete e, finalmente, puxar ou cortar-los longe do peritônio. Nota: Neste passo Carmine coloração pode ser realizada a fim de visualizar o epitélio mamário dentro de toda a glândula 43. Esta abordagem pode ser útil para analisar a morfologia global da glândula mamária sob várias condições fisiológicas (estádios de desenvolvimento, doenças, in vivo tratamentos). </li><li> Remover o nódulo linfático localizado na junção da abdominal e os gânglios inguinais 44. </li></ol></li><li> Fixação do tecido mamário <ol><li> Cortar o tecido mamário em 3 mm 3 fragmentos com um bisturi e enxaguar imediatamente estes fragmentos em uma solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4, de modo a remover tanto quanto possível o leite. </li><li> Secar rapidamente os fragmentos em um papeltoalha e colocá-los em uma solução fria PBS contendo paraformaldeído 4% (PFA, HCHO, 32% solução de formaldeído, CUIDADO) por 10 a 15 min em gelo. Nota: Este é o tempo suficiente para permitir análise posterior em fatias de tecido mamário por IIF36 e / ou hibridização in situ 45. No entanto, como fixadores de aldeído penetrar muito lentamente em pedaços de tecido (~ 1-3 mm por hora), este período pode ser prolongado para assegurar uma fixação óptima da amostra de tecido. Em alternativa, fixar tecidos in vivo irrigando um animal anestesiado com uma solução fixadora (não detalhados no presente estudo). </li></ol></li><li> Infusão de sacarose <ol><li> Enxaguar rapidamente os fragmentos mamárias em PBS frio e mergulhe-os em uma solução de PBS frio contendo 40% de sacarose (D-sacarose, C12H22O11, Sr. 342,3 g / mol) durante 16 a 48 h a 4 ° C sob agitação suave. </li></ol></li><li> Incorporação de tecidos Nota: Neste passo, os fragmentos mamarias podem ser re-cortado, a fim de fazer fragmentos mais pequenos (2-3 mm 3) Ou para ajustar sua forma. <ol><li> Adequadamente rotular os moldes de plástico e encher um terço do volume do molde com o composto OCT, mantida à temperatura ambiente. Coloque um fragmento (2-3 mm 3) do tecido mamário por mofo e cobri-lo com composto outubro </li><li> Colocar os moldes na superfície do azoto líquido (numa folha de alumínio ou usando um peneiro metálico) e permitir que o produto a congelar. Nota: Deve tornar-se sólido branco e antes imergindo o molde em azoto líquido. </li></ol></li><li> Armazenar as amostras congeladas a -80 ° C, até secções de tecido são realizados. </li></ol> 2. Seccionamento tecido congelado Nota: um criostato, que é essencialmente um micrótomo no interior de um congelador, é necessário para fazer secções de tecido congelado. A temperatura mais baixa é muitas vezes necessária para tecidos de gordura ou ricos em lipídios, como glândula mamária virgem. <ol><li> Ajuste a temperatura do criostato a -26 ° C e esperar até que ele tem Stabicivilizada. Manter o bloco de tecido congelado a -26 ° C durante todo o processo de corte inteira. Absolutamente evitar o descongelamento do tecido em qualquer momento durante o procedimento. </li><li> Arrefece-se a lâmina de barbear, o suporte de corte, o dispositivo de barras estabilizadoras e a escova para -26 ° C, colocando-os no criostato durante pelo menos 10 min. Também colocar uma caixa de deslizar no interior do criostato, de modo a ser capaz de armazenar as lâminas de vidro como as secções são feitas. </li><li> Adequadamente rotular as lâminas de vidro que vai ser utilizado para recolher as secções de tecido e mantê-las na RT; de outro modo as secções de tecido não irá aderir a elas. Retirar a amostra do molde no interior do criostato. Nota: Usando lâminas de vidro carregados positivamente irá favorecer grandemente a adesão de secções frescas de tecido congelado devido à maior atração eletrostática. </li><li> Cobrir a superfície de um disco de tecido de metal com composto OCT (mantida a RT) e empurrar a amostra congelada para ele. Coloque o molhado montar no interior do criostato e deixá-lo cool durante pelo menos 15 min. </li><li> Coloque a montagem líquida no suporte do disco do criostato. Ajustar a espessura do corte de 5-6 ^ m e, se possível, usar uma nova lâmina afiada ou pelo menos modificar a área sobre a lâmina usada para cortar cada amostra uma vez que alguns tecidos que irá rapidamente aborrecido. </li><li> Ajustar a posição do dispositivo de barras estabilizadoras sobre a lâmina de barbear fazendo cortes de o meio de montagem até que as fatias são formadas uniformemente e correctamente. Idealmente, o dispositivo de barras estabilizadoras vai passar por cima da lâmina de corte em cerca de 1 mm. </li><li> Uma vez que as configurações estão corretas, execute cortes de tecido, girando a roda em um movimento uniforme contínua. A menos que a temperatura é ideal, uma secção de tecido vai, por natureza, tente enrolar. <ol><li> Utilize uma escova para agarrar e manobrar a secção através do estágio de modo a colocá-lo como desejado na lâmina de vidro. Utilizar a escova para limpar os restos possivelmente presentes no bloco de tecido congelado e / ou a lâmina de barbear. </li></ol></li><li> Puxea secção de tecido para o usuário e evitar pressioná-la para o palco criostato. Evitar pressionar a secção de tecido na fase de criostato, pois pode levar à adesão da fatia de tecido na fase e, portanto, a incapacidade de recuperar-o com a lâmina de vidro. </li><li> Recuperar secções de tecido, um por um por ir buscá-los na superfície de uma lâmina de vidro, segurando-o acima da seção e dobrando-o para baixo para tocar a secção de tecido. Nota: As secções de tecido rapidamente aderir ao vidro quente devido à atração estática. Se várias secções de tecido são colocados no mesmo slide, tenha cuidado para não sobrepor-los e espaço-los o suficiente para ser capaz de colocá-los individualmente em um círculo hidrofóbico (ver secção 3.1.1.). </li></ol> 3. Imunofluorescência Indireta <ol><li> Localizando seções <ol><li> Use uma caneta barreira hidrofóbica para desenhar um círculo em torno de tecido hidrofóbico montado no slide. Deixe o círculo seco durante cerca de 1 min a RT. Desenhar uma linha em torno do tsecções problema com um marcador permanente preto fino, bem como, mas no lado da placa de vidro oposta àquela em que as secções de tecido são. Nota: Este círculo é repelente de água e acetona e álcool insolúvel. É, por conseguinte, proporciona uma barreira para soluções aquosas utilizadas durante o processo de IHC e reduz o volume de reagentes necessários. </li><li> Rehidratar secções de tecido, cobrindo-os com uma queda de ~ 250 ul de PBS durante alguns minutos à temperatura ambiente. Fix secções de tecido, cobrindo-os com ~ 250 mL de uma solução recentemente preparada de PFA a 3% em PBS durante 10 a 15 min. Nota: Opcionalmente, neste caso, usar uma solução de aldeído de têmpera (50 mM de cloreto de amónio (NH4CI, Sr. 53,5 g / mol) em PBS ou glicina 0,1 M (C 2 H 5 NO 2, Mr 75,07 g / mol) em PBS ) para parar a reacção de fixação. Lavagem PBS simples e abundante é geralmente suficiente para remover aldeído que não reagiu. </li></ol></li><li> Recuperação antigênica (opcional) <br/&gt; Nota: Embora a maioria dos antigénios podem ser detectados sem recuperação de antigénios (AR), outros irão ser observado apenas no caso este passo é executado. Em alguns casos, AR também permite o aumento do sinal observado. <ol><li> Coloque a solução AR (100 mM de Tris (C 4 H 11 NO 3, Mr 121,14) 5% de ureia (NH2 CONH2, Sr. 60,06), pH 9,6) num copo. O volume de solução de AR deve ser suficiente para cobrir completamente as lâminas de vidro colocadas num suporte de vidro. </li><li> Pré-aqueça o AR solução a 95 ° C por monitorização da temperatura com um termómetro e, em seguida, colocar as lâminas de vidro sobre um suporte adequado, imergir a cremalheira no tampão quente, tampa para limitar a evaporação e incubar durante 10 min a 95 ° C. </li><li> Retirar o recipiente do banho de água e deixar as lâminas de vidro durante mais 10 min no buffer. </li></ol></li><li> Imunodetecção <ol><li> Lavar as secções de tecido com PBS (~ 250? L / secção) e saturar os com uma solução dede 3% de albumina de soro bovino (BSA, ~ 250? l / secção) em PBS durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Coloque 30-50 ul do anticorpo primário diluído em PBS contendo BSA a 2% em cada secção de tecido. Nota: Este volume é suficiente para formar uma gota, que cobre completamente a secção de tecido. </li><li> Coloque o mesmo volume de diluente (2% de BSA em PBS) sozinho em uma secção de tecido para realizar um controlo negativo sem anticorpo primário. <ol><li> Sistematicamente incluem este controlo negativo em cada experiência IHC e executar para cada anticorpo secundário utilizado para estimar o fundo da experiência (marcação não-específica devido ao anticorpo secundário e / ou o tecido auto-fluorescência). Outros tipos de controlos positivos ou negativos também podem ser realizados para assegurar a especificidade da marcação (ver discussão). </li></ol></li><li> Coloque as lâminas de vidro em uma caixa O umidificado / N a 4 ° C. Nota: Os anticorpos primários utilizados foram monoclonal de ratinho anti-citoqueratina8 (CK8, diluição 1:50), anticorpo monoclonal anti-citoqueratina 14 (CK14, diluição 1:50), anticorpo policlonal de coelho anti-ratinho de caseína (# 7781, diluição 1:50, generosamente fornecida por MC Neville, Universidade do Colorado Saúde Centro de Ciências, CO, EUA), policlonal de coelho anti-btn1 (1: 300 diluição, generosamente fornecida pelo IH Mather, do Departamento de Animais e Avian Ciências da Universidade de Maryland, College Park, MD, EUA), policlonal de coelho anti-Stx6 ( diluição 1:50, generosamente fornecido por S. Tooze, Cancer Research UK, Instituto de Pesquisa de Londres, Londres, Reino Unido) e policlonal de coelho anti-VAMP4 (diluição 1:50). </li><li> Lavar exaustivamente secções de tecido com PBS, pelo menos, quatro vezes durante 10 min à TA. </li><li> Dilui-se o anticorpo secundário apropriado (de cabra conjugada com rodamina IgG anti-coelho (H + L), 1: 300 de diluição) em PBS contendo 2% de BSA, colocar 30-50 uL desta solução em todas as secções de tecido, e incuba-se durante 1,5 h à TA. <ol><li> Desde fluorocromos são moléculas sensíveis à luz, nãoexpor secções de tecido à luz até sua análise. Para IIF em secções de tecido, favorecer anticorpos secundários acoplados a um fluoróforo vermelho desde membranas celulares tendem a gerar um auto-fluorescência verde que pode interferir com baixo rotulagem. Além disso, a escolha de um anticorpo secundário acoplado a fluoróforo vermelho permite a rotulagem concomitante de lípidos neutros (ver abaixo). </li></ol></li><li> Lavar exaustivamente as secções de tecido com PBS, pelo menos, quatro vezes durante 10 min à TA. </li></ol></li><li> Pós-fixação (opcional) <ol><li> Para algumas experiências, realizar pós-fixação por incubação das amostras com 2% de PFA em PBS diluídos durante 10 min à temperatura ambiente, a fim de estabilizar os andaimes antigénio / anticorpo. No entanto, este passo pode ser dispensado na maioria dos casos. </li></ol></li><li> Lipídios neutros e counterstaining DNA <ol><li> Para visualizar CLD e MFG, cor lípidos neutros por incubação secções de tecido em 30-50 ul de uma solução de PBS contendo 3 ng / ml de BODIPY 493/ 503 durante 10 min à TA. Enxaguar rapidamente secções de tecido duas vezes com PBS. </li><li> Contracoloração ADN nuclear, com 30-50 ul de uma solução de PBS contendo 3 uM de DAPI (4-6-diamidino-2-fenilindole, / solução stock 5 mg mL) durante 10 min à TA. Lavar as secções de tecido duas vezes com PBS antes de montar as lâminas para observação. </li></ol></li><li> Montagem secção <ol><li> Remover PBS e colocar uma gota de meio de montagem na secção de cada tecido. </li><li> Coloque um lado da lâmina de cobertura em ângulo contra a corrediça, fazendo contacto com a aresta exterior da gota de líquido e, em seguida, baixar a tampa lentamente, evitar bolhas de ar. Deixe o líquido se espalhou entre a lâmina de vidro e lamínula por alguns minutos e depois remover o excesso de meio de montagem com uma toalha de papel. </li><li> Selar a lamínula para a lâmina de vidro com seções de esmaltes e tecidos armazenar a 4 ° C para evitar a sua exposição à luz até observação. </li></ol></li></ol>4. Fluorescência Observação e Aquisição de Imagem Nota: Um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera controlada por um software de aquisição de imagem é necessário para observar os resultados IHC. <ol><li> Antes de adquirir imagens, verificar a intensidade da rotulagem e avaliar o plano de fundo do experimento, olhando para os controlos negativos. Adquirir imagens de cada marcador fluorescente (canal de cor) individualmente. </li><li> Adquirir todas as imagens, incluindo as dos controles correspondentes, nas mesmas condições (exposição e configurações gerais) para cada canal de cor. </li><li> Microscopia convencional <ol><li> Execute microscopia de epifluorescência, com um microscópio equipado com filtros padrão para isotiocianato de fluoresceína (FITC, verde), rodamina (vermelho) e DAPI (azul) emissões, × 20 a × 63 (de imersão em óleo, NA 1.3) objectivos e uma câmera de imagens DP50. </li></ol></li><li> A microscopia confocal </li><li> Execute microscopia confocal com microspluvial equipado com o software ZEN, utilizando × 20 × 63 a (óleo-imersão, NA 1.4) objectivos e os comprimentos de onda de excitação e de 488- 568 nm do laser. </li></ol> 5. Tratamento de Imagem Nota: Todas as imagens pós-tratamentos são realizados usando o software livre ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). <ol><li> Sobrepor imagem (fusão) <ol><li> Abra as imagens adquiridas em cada canal que será combinado (File / Open). Se trabalhar com imagens em tons de cinza de 8 bits, atribuem cor artificial para cada canal usando a tabela de referência (quadros Imagem / Pesquisa). </li><li> Gere a imagem composta a partir de imagens em tons de cinza ou coloridas usando o comando &quot;Unir canais&quot; (Imagem / Cor / Mesclar Canais) e, em seguida, atribuir uma cor para cada canal. </li><li> Execute imagem empilha sobreposição da mesma forma por pilhas adquiridas em cada canal que será combinado (File / Open) abrindo e usando o comando &quot;Unir canais &amp;# 8221; (Imagem / Cor / Mesclar Canais) atribuir uma cor para cada canal. Salve a pilha de composto como uma seqüência de imagens ou como um filme (ver secção 5.4). </li></ol></li><li> Projeção pilha Z imagem <ol><li> Use a função de projeção Z (Imagem / Stack / Zproject, Max Intensity) para fornecer uma visão bidimensional de todas as fotos de uma pilha de imagens, projetando-os ao longo do eixo perpendicular ao plano de imagem (eixo z). A opção &quot;intensidade máxima&quot; cria uma imagem na qual cada pixel contém o valor máximo sobre todas as imagens da pilha. Isto gera uma imagem única que permite a visualização de todo o coloração observada através de toda a pilha de imagens para um canal em particular ou após a sobreposição de vários canais. </li></ol></li><li> Imagem projeção pilha 3D <ol><li> Use o comando de projeção em 3D (projeto Imagem / Stack / 3D, Brightest Point, eixo-y) para gerar uma seqüência de projeções de um volume girando em um avião. O processamento visual de surfaces e estruturas internas depende tanto do método de projeção (ponto mais próximo, ponto mais brilhante (usado aqui), ou dizer-valor) e os parâmetros de visualização selecionado. Cada quadro da seqüência de animação é o resultado de se projetar a partir de um ângulo de visão diferente. </li><li> Girar a imagem 3D criado em redor de cada um dos três eixos ortogonais (o eixo y foi escolhida aqui). Salve a seqüência produzida como uma única imagem ou um filme. </li></ol></li><li> Pilha de imagens para conversão de filme <ol><li> Abra uma pilha de imagens (File / Open) e salve-o como um filme em formato .AVI usando o comando &quot;AVI&quot; (Arquivo / Salvar como / AVI). </li></ol></li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A glândula mamária é um órgão de mamíferos exócrina atípica cuja principal função é produzir leite para alimentar recém-nascidos. O desenvolvimento do tecido mamário ocorre principalmente após o nascimento e é caracterizada por um processo único, em que o epitélio invade o estroma circundante. Este tecido sofre muitas mudanças (crescimento, diferenciação e regressão), especialmente durante a vida adulta, concomitantemente com variações no estado reprodutivo (Figura 1). Além da morfologia geral do tecido, as proporções de tipos de células diferentes, bem como a sua disposição no interior da glândula mamaria mudar dramaticamente durante o desenvolvimento 1-5. Durante a vida embrionária, o epitélio mamário deriva de linhas de leite mamarias, que é definido por um ligeiro espessamento e estratificação da ectoderme, entre as partes dianteiras e traseiras dos membros de cada lado da linha média por volta do dia embrionário 10,5 (E10.5) (Figura 1A ).Em E11.5, a linha do leite se divide em placodes individuais, que são posicionados simetricamente ao longo da linha de leite mamário em locais reprodutíveis, eo mesênquima circundante começa a condensar. Os placodes começar a afundar-se mais profundamente na derme e no mesênquima mamária organiza em camadas concêntricas ao redor do broto mamário (E12.5-E14.5). Em E15.5, o epitélio mamário, começa a proliferar e alongada para formar o rebento principal que empurra através do mesênquima mamária para a almofada de gordura. O rebento principal desenvolve um lúmen oco com uma abertura para a pele, caracterizado por a formação da bainha de mamilo. Em E18.5, o ducto alongando tem crescido na almofada de gordura e tem ramificações em um pequeno sistema ductal arborized englobadas na almofada de gordura. O desenvolvimento é essencialmente preso e da glândula mamária rudimentar permanece morphogenetically de repouso até a puberdade. No embrião do sexo masculino, a activação de receptores de androgénio conduz à degeneração dos gomos, que desaparecempor E15.5. Em E18, desenvolvimento mamário cessa puberdade até 6-9. Ao nascer, a glândula mamária abriga um sistema ductal rudimentar que alonga e ramos lentamente (crescimento isométrico). No início da puberdade, as estruturas esféricas localizadas nas pontas dos ductos chamado as papilas extremidade terminal (TEBS), são formadas por uma camada externa de células do tampão e um núcleo interior de várias camadas de células (células do corpo). Estas estruturas são altamente proliferativo e infiltrar o tecido do estroma circundante, em resposta a estímulos hormonais. Proliferação dentro dos resultados TEBS em alongamento ductal, juntamente com ramificação morfogênese. Este processo leva ao estabelecimento de uma rede de base epitelial arborized que emana do bocal (Figura 1B, a puberdade). A ~ 10-12 semanas após o nascimento, quando o epitélio invadiu toda a almofada de gordura, a sua expansão pára e a TEBS desaparecer. Desenvolvimento ductal, em seguida, passa por mudanças dinâmicas, ou seja, successive proliferação e regressão de células epiteliais de acordo com ciclos estrais 10 (Figura 1B, adulto). Desde o início da gestação, o tecido mamário de crescimento sofre alterações morfológicas e importante para se preparar para a lactação. O epitélio mamário extensivamente proliferam e se diferenciam, levando a uma rede túbulo-alveolar altamente ramificada. Concomitantemente, as células epiteliais mamárias (SAMU) tornam-se polarizado e capaz de sintetizar e secretar produtos lácteos. MECs organizar-se em numerosas estruturas alveolares (acini) que são cercados por células mioepiteliais contráteis e incorporadas em um estroma composto por tecidos conectivos e adiposos, vasos sanguíneos e terminações nervosas (Figura 1B, a gravidez). Além disso, o lado basal de MECs está em estreito contato com a membrana basal (matriz extracelular), e as interações entre estas duas entidades com força regular tanto a função morfogênese e secretora do mammary epitélio 11-13. Todos estes processos dependem da acção de várias sugestões ambientais, das quais as mais importantes são hormones14, factores parácrinos e a matriz extracelular. Por exemplo, a progesterona induz extensa alveologenesis 15 e que, em combinação com a prolactina (PRL) lateral ramificando-16,17, promove a diferenciação e mantém dos alvéolos. Em adição aos esteróides e PRL18, citoquinas e as vias de sinalização associadas ao desenvolvimento (Wnt e Notch vias de sinalização) também estão envolvidos em compromisso e desenvolvimento mamário linhagem 19-21. No final da gravidez, as MECs luminais começar a produzir um leite rico em proteína conhecida como colostro no lúmen dos alvéolos. Além disso, a progesterona actua sobre a permeabilidade epitelial e uma vez que as junções apertadas são ainda aberta, colostro também é encontrado na corrente sanguínea da mãe. Após o parto, a Mammary epitélio ocupa quase todo o volume da glândula mamaria e é altamente organizada (Figura 2, epitélio mamário). Unidades de produção de leite, nomeadamente alvéolos (Figura 2, alvéolo), são formadas por uma monocamada de células epiteliais mamarias secretórias polarizados (MESCs), com a sua membrana plasmática apical que delimita o lúmen. Alvéolos organizar-se em lóbulos que são agrupados em lobos ligados a condutas que drenam o leite para o meio exterior (Figura 2, lobo). Lactação ocorre, isto é., MESCs começar a secretar grandes quantidades de leite, provocados principalmente pela queda de hormonas da placenta (principalmente progesterona) (Figura 1B, lactação). Genes de proteínas do leite são activados de um curso de tempo variando temporais definido desde a gravidez até lactação 9,22,23, principalmente em resposta a pituitária PRL libertado no momento da sucção. Concomitantemente, os contactos entre MESCs e da matriz extracelular tanto estimular a proteína do leite synthesis através de sinais que são mediadas através das interacções entre integrinas celulares e laminina 24,25, e suprimir a apoptose em MESCs 26,27. Estas vias de sinalização como resultado a activação de promotores de genes de proteínas do leite 28 através da activação da transcrição de factores específicos 29. Contatos célula-célula também são importantes para alguns aspectos de diferenciação, incluindo o estabelecimento de polaridade apical ea secreção vectorial de produtos lácteos. Tight junctions fechar rapidamente após o início da lactação e MESCs finamente orquestrar a absorção de moléculas a partir do sangue, bem como a síntese, o transporte e a secreção de componentes de leite, em resposta aos requisitos nutricionais dos recém-nascidos. No momento da sucção, a contracção das células mioepiteliais que rodeiam os alvéolos ocorre em resposta à oxitocina e leva a ejecção de leite através das condutas e para dentro do mamilo. O leite é um fluido que contém complexo de proteínas (principalmentecaseínas), açúcares (principalmente lactose), lípidos e minerais, assim como moléculas bioactivas, tais como imunoglobulinas A (IgA), factores de crescimento e hormonas. As caseínas são sintetizados, montados em estruturas supramoleculares, ou seja micelas de caseína, transportados ao longo da via secretora, e, em seguida, libertada por exocitose, isto é, a fusão de vesículas secretoras contendo caseína (SVS) com a membrana plasmática apical de MESC (Figura 2). Tráfego intracelular depende de trocas materiais entre os compartimentos membranosos e envolve Solúvel N-etilmaleimida Sensitive Fusion (NSF) Protein Anexo (SNAP) Receptor (SNARE) 30,31. A família de proteínas SNARE é subdividida em SNAREs vesiculares (v-SNAREs), presentes na membrana da vesícula, e laços alvo (t-armadilhas), localizadas nas membranas alvo. Ao fechar através dos seus domínios em espiral espiralada, V- e t-SNARE montar para formar um complexo de feixe de quatro hélices altamente estável, referido como thcomplexo e SNARE. Este complexo promove a fusão de duas camadas duplas lipídicas opostos gradualmente trazê-los em estreita proximidade 30,32. Em seguida, os complexos SNARE são dissociados pelo triphosphatase adenosina NSF e suas proteínas SNAP e SNARE proteína adaptador são reciclados de volta ao seu compartimento de origem 33. Interessantemente, cada proteína SNARE reside predominantemente em compartimentos celulares distintas e SNARE emparelhamento pode contribuir para a especificidade de eventos intracelulares de fusão 34. Estudos anteriores sugerem que, pelo menos, Protein 23 (SNAP23) e vesículas com Associated proteína de membrana 8 (VAMP8), e syntaxins (STX) sinaptosomal Associada -7 e -12 desempenhar um papel na caseína exocitose 35,36. Estas proteínas também foram encontrados em associação com a fracção lipídica de leite, isto é, gordura de leite (MFG glóbulos) 37. O modelo predominante atual postula que gotículas lipídicas citoplasmáticas (CLDS) são formados pela acumulação de neutro lIPIDs (principalmente triacilgliceróis e ésteres de esteróis) e colesterol derivado da dieta materna entre os dois folhetos do retículo endoplasmático (ER) da membrana 38-41. Grandes CLD são formados, pelo menos em parte, pela fusão de CLD menor enquanto está a ser transportado para o lado apical de MESCs onde eles são libertados como MFG (1-10 um de diâmetro) por germinação, sendo envolta pela membrana plasmática apical MESC 40-42. Aleitamento cessa após os filhotes são desmamados e os MESCs morrem progressivamente por apoptose, levando à regressão do tecido mamário volta a um estado puberal (Figura 1B, involução). Imunofluorescência (IF) é um método de laboratório analítico comum usado em quase todos os aspectos da biologia, tanto em pesquisas como em diagnósticos clínicos. SE técnicas podem ser realizadas em secções de tecido (imuno-histoquímica, IHC) ou imunocitoquímica (ICC), amostras de células. Esta poderosa abordagem baseia-se na utilização de fluorescent-anticorpos marcados que se ligam especificamente (directa ou indirectamente) para o antigénio de interesse, permitindo assim a visualização da sua distribuição nos tecidos através de microscopia de fluorescência. Principalmente sinais de fluorescência dependem da qualidade e concentração dos anticorpos e tratamento adequado da amostra. Um protocolo simples de imunofluorescência indirecta (IIF) é apresentada para detectar produtos de leite (caseínas e MFG) e proteínas envolvidas na secreção do produto de leite (butyrophilin (btn1), proteínas SNARE) em secções congeladas de tecido mamário de ratinho (Figura 3). Embora este protocolo fornece uma visão completa IHC, que vão desde coleta de tecido para a imagem de pós-tratamento, crítica e passos opcionais, bem como algumas recomendações técnicas também são apresentados e discutidos.

<table><tbody><tr><td>Dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel and adapted blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Towel paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue sample preparation</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (pH7.4)</td><td>Sigma</td><td>P-3813</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td>personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer</td></tr><tr><td>OCT compound/Tissue Tek</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (D-saccharose)</td><td>VWR</td><td>27480.294</td><td></td></tr><tr><td>Plastic molds</td><td>Dominique Dutscher</td><td>39910</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat/sample support</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades (SEC35)</td><td>Thermo Scientific</td><td>152200</td><td></td></tr><tr><td>Slide box</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143560W90/1014356190</td><td></td></tr><tr><td>Brushes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IHC</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Super Pap Pen</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Permanent marker (black)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl in PBS</td><td>Sigma</td><td>A-0171</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M glycine in PBS</td><td>VWR</td><td>24403.367</td><td></td></tr><tr><td>Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heater (up to 100&amp;deg;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000/H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)</td><td>VWR</td><td>CORN2980-225</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)</td><td>generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences&lt;br/&gt; Center, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)</td><td>Biolegend (Covance)</td><td>MMS-162P</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-115-P0/P1</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)</td><td>generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)</td><td>generously gifted S. Tooze&lt;br/&gt; (Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)</td><td>Abcam</td><td>ab3348</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-025-003</td><td></td></tr><tr><td>Counterstains</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Bodipy 493/503</td><td>Life Technologies (Molecular Probes)</td><td>D-3922</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>Life Technologies (Molecular Probes)</td><td>D-1306</td><td></td></tr><tr><td>Observation/Image capture</td><td>&lt;span style=&quot;line-height: 20.8px;&quot;&gt;Company&lt;/span&gt;</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>conventional fluorescence microscope</td><td>Leica Leitz DMRB&lt;br/&gt; microscope</td><td></td><td>Standard filters for FITC, Rhodamine&lt;br/&gt; and DAPI emissions,&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;times;63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), Cell&amp;circ;F software (Olympus)</td></tr><tr><td>Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)</td><td>Zeiss LSM&lt;br/&gt; 510 microscope</td><td></td><td>Plan-Apochromat &amp;times;63 oil-immersion objective (NA 1.4),&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; CLSM 510 software,&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)</td></tr><tr><td>Image treatment</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>ImageJ 1.49k software</td><td></td><td></td><td>Free software</td></tr></tbody></table>

indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland

A imunofluorescência indirecta é utilizado para detectar e localizar as proteínas de interesse num tecido. O protocolo aqui apresentado descreve um método completo e simples para a detecção imunológica de proteínas, o rato lactantes glândula mamária ser tomado como um exemplo. Um protocolo para a preparação das amostras de tecidos, especialmente em relação a dissecção da glândula mamária do mouse, fixação do tecido e corte de tecido congelado, são detalhados. Um protocolo padrão para executar imunofluorescência indireta, incluindo uma etapa de recuperação antigênica opcional, também é apresentada. A observação de as secções de tecido etiquetados, bem como a aquisição de imagem e os pós-tratamentos também são apresentados. Este procedimento dá uma visão geral completa, desde a coleta de tecido animal para a localização celular de uma proteína. Embora este método geral pode ser aplicada a outras amostras de tecido, deve ser adaptada a cada tecido / anticorpo primário par estudado.

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Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

36.7K visualizações.  INRA.  O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens. 

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Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and genetic alterations. Mammary gland whole mounts are an inexpensive method to capture the progression of morphological changes that may arise after exposure. However, in later life, when abnormalities are more prone to develop, sole reliance on this one method may not always provide enough information to make a proper diagnosis of the abnormality. Historically, in chemical test guideline studies, a single mammary gland is removed at necropsy and prepared as a hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained section. The incorporation of contralateral mammary whole-mount collection and analysis decreases the likelihood of a false-negative assessment. Evaluation of the whole mount is limited by the presence of one or two entire mammary glands on a slide, and in some cases, the abnormalities observed in the whole mount are not uniformly represented in the H&#38;E section.&#160; The goal of this study was to develop a protocol for converting coverslipped mammary whole mounts to H&#38;E-stained sections so that lesions that would otherwise have been missed or that are difficult to diagnose can be identified. Here, we detail a method to produce a high-quality, paraffin-embedded H&#38;E section from a mammary gland that was initially prepared as a whole mount. In comparison to a tissue that was intentionally prepared for H&#38;E sectioning, the whole mount requires additional preparation for tissue removal and processing. However, this method is considered inexpensive, as it requires common lab reagents and little additional time. As a result, this method can provide invaluable information on how chemical and environmental exposures alter normal mammary development, as well as display changes that occur because of genetic modifications.

We developed a method to successfully remove, process, section, and stain, for histopathological evaluation, mammary tissue that had originally been fixed on slides as whole mounts. This method may promote the collection and evaluation of mammary gland whole mounts in reproductive and developmental test guideline studies.

Seção de mamíferos mamários completos para identificação de lesões

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Pesquisa do câncer

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Imuno-histoquímica em parafina da epiderme do rato utilizando anticorpos fluorescentes

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Biologia

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These interactions are provided by junctional proteins that form nexuses between adjacent cells. Junctional protein mislocalization and reduced physical associations with their binding partners can result in the loss of function and, consequently, to organ dysfunction. Thus, identifying protein localization and protein-protein interactions (PPIs) in normal and disease-related tissues is essential to finding new evidences and mechanisms leading to the progression of diseases or alterations in developmental status. This manuscript presents a two-step method to evaluate PPIs in murine mammary glands. In protocol section 1, a method to perform co-immunofluorescence (co-IF) using antibodies raised against the proteins of interest, followed by secondary antibodies labeled with fluorochromes, is described. Although co-IF allows for the demonstration of the proximity of the proteins, it does make it possible to study their physical interactions. Therefore, a detailed protocol for co-immunoprecipitation (co-IP) is provided in protocol section 2. This method is used to determine the physical interactions between proteins, without confirming whether these interactions are direct or indirect. In the last few years, co-IF and co-IP techniques have demonstrated that certain components of intercellular junctions co-localize and interact together, creating stage-dependent junctional nexuses that vary during mammary gland development.

Intercellular junctions are requisites for mammary gland stage-specific functions and development. This manuscript provides a detailed protocol for the study of protein-protein interactions (PPIs) and co-localization using murine mammary glands. These techniques allow for the investigation of the dynamics of the physical association between intercellular junctions at different developmental stages.

Análise das Interações Proteína-Proteína e Co-localização entre Componentes das Juntas Abertas, Apertadas e Aderentes nas Glândulas Mamárias Murinas

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Biologia do Desenvolvimento

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play a major role in mammary gland function and are the origin of most mammary tumors. Introducing genes of interest into mouse mammary epithelial cells is a critical step in evaluating gene function in epithelial cells and generating mouse mammary tumor models. This goal can be accomplished through the intraductal injection of a viral vector carrying the genes of interest into the mouse mammary ductal tree. The injected virus subsequently infects mammary epithelial cells, bringing in the genes of interest. The viral vector can be lentiviral, retroviral, adenoviral, or adenovirus-associated viral (AAV). This study demonstrates how a gene of interest is delivered into mammary epithelial cells through mouse mammary intraductal injection of a viral vector. A lentivirus carrying GFP is used to show stable expression of a delivered gene, and a retrovirus carrying Erbb2 (HER2/Neu) is used to demonstrate oncogene-induced atypical hyperplastic lesions and mammary tumors.

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

The present protocol describes intraductal injection of viral vectors via the teat to deliver genes of interest into the mammary epithelial cells.

In vivo Entrega de Genes em Células Epiteliais Mamárias de Camundongos Através de Injeção Intraductal Mamária

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

Isolamento, fixação e imagem de imunofluorescência de glândulas supra-renais de Mouse

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Imunologia e Infecção

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample that can provide information about antigen coexpression and spatial distribution of the markers. However, a lack of suitable antibodies for formalin-fixed tissues may restrict the nature of markers that can be detected. In addition, the staining method is time-consuming. Here we describe a rapid method to perform multispectral fluorescence imaging on frozen tissues. The method includes the fluorophore combinations used, detailed steps for the staining of mouse and human frozen tissues, and the scanning, acquisition, and analysis procedures. For staining analysis, a commercially available semiautomated multispectral fluorescence imaging system is used. Through this method, up to six different markers were stained and detected in a single frozen tissue section. The machine learning analysis software can phenotype cells that can be used for quantitative analysis. The method described here for frozen tissues is useful for the detection of markers that cannot be detected in FFPE tissues or for which antibodies are not available for FFPE tissues.

We describe a rapid staining method to perform multispectral imaging on frozen tissues.

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolamento de glândulas mamárias de Mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in combination with skin flap surgery or implantation of imaging windows has been used to study the dynamics of the healthy mammary gland at different developmental stages. Most mammary imaging technologies are limited to a time frame of hours to days, whereas the majority of mammary gland remodeling processes occur in time frames of days to weeks. To study mammary gland remodeling, methods that allow optical access to the tissue of interest for extended time frames are required. Here, an improved version of the titanium mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW) is described that allows high-resolution imaging of the mammary gland with a cellular resolution for up to several weeks. Importantly, the R.MIW provides tissue access over the entire duration of the intravital imaging experiment and could therefore be used for local tissue manipulation, labeling, drug administration, or image-guided microdissection. Taken together, the R.MIW enables high-resolution characterization of the cellular dynamics during mammary gland development, homeostasis, and disease.

This protocol describes a novel mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW). Intravital microscopy after implantation of the R.MIW allows for longitudinal and multi-day imaging of the healthy and diseased mammary gland with a cellular resolution during the different developmental stages.

Microscopia intravital longitudinal usando uma janela de imagem mamária com tampa substituível

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>Microscopia Subcelular Intravital da Glândula Mamária

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

Microscopia Subcelular Intravital da Glândula Mamária

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

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Seção de mamíferos mamários completos para identificação de lesões

Imuno-histoquímica em parafina da epiderme do rato utilizando anticorpos fluorescentes

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Isolamento, fixação e imagem de imunofluorescência de glândulas supra-renais de Mouse

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Microscopia Subcelular Intravital da Glândula Mamária

Microscopia Subcelular Intravital da Glândula Mamária