Name: assessment of cocaine-induced behavioral sensitization and conditioned place preference in mice
Uploaded: 2016-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
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Os autores agradecem a Karen Dietz e Shari Birnbaum para a entrada anterior sobre considerações de design comportamentais e Lauren Peca para ajudar com testes de comportamento. Os autores também agradecer o apoio generoso da Simons Foundation (Simons Fundação Iniciativa Autism Research subvenção para CWC), NIDA (DA008277, DA027664 e DA030590 a CWC, F32DA027265 para LNS e F32DA036319 a RDP), a Fundação FRAXA Pesquisa e Eleanor e Miles Programa Shore Fellowship (suporte bolsa para LNS) e do Programa de Bolsas Kaneb John (suporte bolsa para MT).

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use o McLean Hospital. NOTA: O protocolo a seguir descreve uma única abordagem para a CPP e sensibilização locomotora, muitos detalhes dos quais diferem de outros protocolos de sucesso (testes de fase escura por exemplo, luz- vs., consecutiva vs. dosagem intermitente, etc.). Noviços podem querer começar com estes protocolos, ou simplesmente usá-los como guias, adaptando alterações a partir da literatura com base na pergunta experimental (s) em questão. métodos automáticos de medição são descritos; No entanto, é possível utilizar meios não automatizados para cada ensaio (isto é, a gravação vídeo, mão-de pontuação). 1. preferência por lugar condicionado <ol><li> Equipamentos e Room Set-Up: <ol><li> Pega ratinhos experimental para 1-3 min cada dia, durante pelo menos 3-5 dias antes do teste. Nota: Nunca-tratada camundongos pode achar remoção da câmara de stressful, o que pode interferir ou alterar condicionado. </li><li> Obter quatro ou mais aparelhos CPP três câmaras, de preferência, equipados com photobeams para coleta automatizada de dados 18. Certifique-se que cada câmara tem duas câmaras maiores, visually- e tactilely-distintas na conexão com uma câmara menor, neutro através de portas que podem ser levantado / descido para controlar o acesso. Tampas em cada câmara deve abrir para a inserção / remoção de ratos e ser montado com luzes pequenas, individualmente controláveis ​​(reguláveis) (um por câmara). Nota: Os projetos de câmara CPP variam e podem ser adquiridos comercialmente ou construídos pelos pesquisadores. Para o projeto &quot;equilibrado&quot;, um esquema recomendada é de uma maior câmara com paredes brancas e piso de grade de arame e outro com paredes pretas e piso bar. A câmara do meio deve ter paredes cinza e cinza piso Plexiglass sólida. Para fins de esclarecimento, estas câmaras vai ser referido como &quot;branco&quot;, &quot;preto&quot; e &quot;meio&quot;.As tampas devem ser claras Plexiglass. configurações do compartimento alternados (uma ou duas câmaras) também são possíveis e discutido em outro lugar (ver discussão). </li><li> Configuração da sala como será durante o teste: desligar ou definir luzes do teto para a configuração mais obtuso e feche a porta. Use um medidor de luz dentro de cada câmara e definir as luzes da tampa de modo que as câmaras de coração são ligeiramente mais brilhante (15-20 lux) do que as câmaras a preto e branco (6-10 lux) a fim de desencorajar os ratos de passar o tempo lá. NOTA: Se o tempo médio gasto no meio é tanto ou mais do que nas câmaras pretas ou brancas, aumentar ainda mais o contraste de iluminação descrito no Passo 1.1.3. Como alternativa, use piso menos atraente para o meio. (Por exemplo, ~ 220 furos de 0,5 cm de diâmetro, uniformemente espaçados em 6 x 3,5 x ¼ &quot;Plexiglas), mas evitar fazer essa câmara aversivo. Pilot quaisquer alterações para garantir que diminui com o tempo médio não são devido a reduções na exploração totais (cruzamentos) . </li><li> Programa coleta automática de dados ( &quot;procedimento&quot; Figura 1A) ou coletar dados manualmente de acordo com os seguintes parâmetros. Definir ensaios para começar após o primeiro intervalo feixe em qualquer câmara de condicionamento. Definir as sessões de &quot;teste&quot; para ser 20 min de comprimento e para controlar o tempo gasto e feixe breaks em cada câmara. Definir as sessões de &quot;condicionamento&quot; para ser 30 min longa e (opcionalmente) para medir intervalos de viga em cada câmara. Defina todas as luzes da câmara para iluminar durante o julgamento. </li><li> Prepare volume completo de solução de cocaína necessária para o experimento em questão. Dissolver o cloridrato de cocaína em 0,9% de NaCl (salina), baseando-se a concentração final num volume de injecção de 0,1 ml / 10 g de peso corporal (por exemplo, para uma dose de 5 mg / kg, a concentração da solução é de 0,5 mg / ml). mistura Vortex por 30-45 seg, filtro estéril (0,2 mm filtros de seringa) e armazenar a RT. </li></ol></li><li> Teste: NOTA: O cronograma geral para a CPP é pré-teste, condicionamento eem seguida, pós-teste. O pré-teste pode ser separado a partir condicionado por 1-3 dias; no entanto, condicionado e no dia pós-teste deverá ocorrer em dias consecutivos (Figura 2A). Este tempo deve ser mantida a mesma para todos os grupos na mesma experiência. <ol><li> Teste durante a fase de luz dos animais utilizando o mesmo aparelho para cada animal ao longo dos dias. </li><li> Cada dia de teste (ou seja, testes e dias de condicionamento), mova ratos à antecâmara comportamental e permitir-lhes para se sentar sem ser perturbado em suas gaiolas para 1-1,5 horas antes do julgamento. Escolha um local onde os ratos podem ser movidos rapidamente de sua gaiola para o aparelho, com o mínimo de interrupção, quando o julgamento começa. Ligue todos os equipamentos de modo que quaisquer ruídos associados com o teste (por exemplo, ventiladores equipamentos) estão presentes. </li><li> Limpe cuidadosamente cada aparelho (paredes internas, pisos e bandejas) com leve, álcool, glicol-ETHER- ou à base de amônia desinfecção limpa antes e depois de cada rato (use o same tipo de produto de limpeza durante todo o experimento). Não negligencie inferiores pavimentação. </li><li> Verifique se as luzes da sala são definidas de forma adequada (desligado ou desactivado) no início de cada dia. </li><li> Prosseguir com o seguinte de acordo com se é um &quot;teste&quot; ou o dia de &quot;condicionamento&quot;: <ol><li> Em julgamento Dias 1 e 6 (ou seja, o pré e pós-testes), coloque as portas inter-câmara na posição aberta (Figura 2B). </li><li> Carregar o programa de computador &quot;teste&quot; e digite IDs de origem animal (Figura 1A), em seguida, emitir comando de arranque (Figura 1B), se aplicável. </li><li> Suavemente inferior cada rato na câmara meio do seu aparato atribuído, de frente para a parede de trás, e suavemente feche a tampa. Uma vez que todas as câmaras são carregados, deixar a sala de testes e minimizar o ruído. </li><li> Deixar ratos dentro de cada aparelho até que ensaios para todos os ratos têm fechado / terminado (Figura 1C). dados de ensaios de exportação. </li></ol></li> &lt;li&gt; Pouco antes ou após o pré-teste, pesar os animais. Use estes pesos para cálculos de dose durante o condicionamento. </li><li> A fim de se preparar para ensaios condicionado, calcule pré-teste &quot;preferência&quot; de cada rato para as câmaras de preto e branco, subtraindo o tempo gasto em cada uma delas a partir do outro (isto é, &quot;black menos branco&quot; e &quot;menos branco preto&quot;; veja A Figura 3, colunas 9 e 10). </li><li> Desde camundongos com fortes preferências iniciais tornar equilíbrio difícil, estabelecer um limite aceitável para os escores de preferência (por exemplo, &lt;33% do tempo de ensaio total) e não incluem ratos que ultrapassá-lo a partir de cálculos. Use um limite liberal (&lt;66% do tempo de ensaio total) para maximizar a inclusão, quando a redução é provável após a conclusão do teste (por exemplo, devido a fora do alvo manipulações cirúrgicas). NOTA: Os ratos que excedam o limite ainda pode ser testado, com uma tentativa de manter as suas preferências pré-teste equilibrada. Mais tarde, tratinhos stas podem ser excluídos da análise, se necessário, para equilibrar a pontuação do pré-teste. Se extremas preconceitos pré-teste (isto é,&gt; 800 seg) afetam desproporcionalmente um grupo, considerar alterar os ambientes de condicionamento e / ou utilizar outros ensaios. </li><li> Escolha a câmara de preto ou branco como a câmara de fármaco-emparelhamento para cada rato, enquanto isso soma dos correspondentes pontuações de preferência pré-teste dentro de cada grupo com as seguintes prioridades em mente: NOTA: Tenha cuidado para equilibrar contas entre grupos dentro de cada coorte, bem como através de qualquer coortes anteriores. <ol><li> Faça as somas de todos os grupos como equivalentes possível. </li><li> Adicione as somas mais próximo de zero quanto possível (isto é, escolher o lado preferido para alguns ratinhos e o lado não-preferida para os outros). Se um quase zero soma é impossível para qualquer grupo, re-ajustar todos os outros para igualar a melhor pontuação obtida para o grupo limitante, favorecendo grupo ligeiramente negativo resume maispositivo. </li><li> Tanto quanto possível, manter as atribuições de negro contra branco e preferenciais em relação câmaras não preferidos para emparelhamentos de drogas, mesmo dentro de cada grupo. </li><li> Como nem sempre é possível cumprir os objetivos acima, corrigir eventuais desvios, fazendo opostas considerações de equilíbrio em coortes posteriores; no entanto, tentar evitar a produção de coortes com descontroladamente diferentes preferências médias pré-teste. </li></ol></li><li> No condicionamento Dias 2-5, coloque portas inter-câmara na posição fechada (Figura 2C). </li><li> Preparar seringas individuais com cocaína (Dias 2 e 4) ou solução salina (dias 3 e 5) de solução, conforme descrito no passo 1.1.5 e com base nos pesos corporais medidos no pré-teste. NOTA: A dose deve ser escolhido com relação às expectativas experimentais, as considerações mencionadas na introdução, e os efeitos potenciais piso e teto. Muitas vezes, é melhor para conduzir experimentos independentes, utilizando pelo menos duas doses diferentes. </li><li> Load &quot;conditioning programa &quot;computador e entrar IDs de origem animal (Figura 1A), em seguida, emitir comando de arranque (Figura 1B), se aplicável. </li><li> Nuca e injectar cada ratinho (IP), reduzindo-os imediatamente para a câmara de preto ou branco apropriada de atribuído o seu aparelho de frente para a parede traseira, então suavemente fechar a tampa. Uma vez que todas as câmaras são carregados, deixar a sala de testes e minimizar o ruído. </li><li> Remover os ratinhos a partir da sua câmara para o mais próximo exactamente 30 min quanto possível (isto é, o primeiro ratos são removidos das suas câmaras, enquanto outros ainda são ratinhos condicionado). Retirar os animais o mais silenciosamente possível, sem introduzir ruído. </li></ol></li><li> Análise estatística: <ol><li> Escolha um método de análise. De qualquer tempo subtrair gasto no lado emparelhado com soro fisiológico durante o pós-teste do tempo gasto no lado emparelhado ao uso de cocaína durante o pós-teste (cocaína - salina, sec) ou usar o tempo gasto na câmara emparelhado com a droga pós-testemenos o tempo de pré-teste gasto na câmara emparelhado com a droga. NOTA: se estiver usando o primeiro método, também os gráficos de linhas lote de tempo médio gasto no meio, câmaras saline- e emparelhado com a droga durante o pré e pós-testes para cada grupo. Em comparação com o pré-teste, pós-teste deve mostrar o aumento do tempo no lado emparelhado com a droga e diminuição do tempo gasto no lado emparelhado com solução salina (ver Figura 6, inferior e de discussão para explicação). </li><li> Dependendo da natureza e o número de grupos a ser comparados, usar um t-teste, com uma ou ANOVA de duas vias, como apropriado, possivelmente com a análise post-hoc, para analisar qualquer das pontuações subtração acima apresentada. NOTA: pontuação de preferência de cocaína tendem a ser variável, e, além disso, pode ser negativo (ou seja, indicar aversão ao lado do emparelhado com a droga). Os ratos que mostram aversão não deve ser removido (a menos que estejam de outliers estatísticos), uma vez que este resultado é normal e provavelmente importante para determinar diferenças entre groups. Esperar a necessidade tamanhos de amostra de 12 a 30 animais por grupo, dependendo do tamanho do efeito do tratamento. </li></ol></li></ol> 2. Locomotor Sensibilização <ol><li> Equipamentos e Room Set-Up <ol><li> Obter um photobeam matriz 4 x 8 (X x Y) (dimensões externas 11.5 &quot;x 20&quot;). Construir uma câmara de topo aberto feito de plexiglas preto (dimensões internas 22 1/6 &quot;X 13 ¾&quot; x 9 3/8 &quot;) para alojar a matriz (Figura 4A). </li><li> Preparar a sala de teste a fim de que uma luz vermelha (ceiling- ou montado na parede) pode ser usado durante o teste. </li><li> Prepare sessões de programa separado para ensaios de habituação e injeção diárias. <ol><li> Jogo ensaios de habituação ser entre 30-60 min e ensaios de injecção para ser entre 60-120 minutos (Figura 5B). O comprimento recomendado para cada um é de 60 min. Mantenha comprimento julgamento consistente em vários grupos dentro da mesma experiência. </li><li> Definir ensaios para começar recording após a primeira pausa feixe que ocorre após o sinal de partida foi iniciado (Figura 5B). Para o ensaio da injeção, defina o sinal de partida para que as caixas podem ser iniciado individualmente (não em uníssono), se possível. </li><li> Definir quebras de feixe a ser registrado nas definidos pelo usuário &quot;caixas&quot;, de preferência, 5 min cada (Figura 5B). </li></ol></li><li> Prepare volume completo de solução de cocaína necessária para o experimento em questão. Dissolver o cloridrato de cocaína em 0,9% de NaCl (salina), baseando-se a concentração final num volume de injecção de 0,1 ml / 10 g de peso corporal (por exemplo, para uma dose de 5 mg / kg, a concentração da solução é de 0,5 mg / ml). mistura Vortex por 30-45 seg, filtro estéril (0,2 mm filtros de seringa) e armazenar a RT. </li></ol></li><li> ensaio NOTA: A fase inicial de testes é executado por 10-11 dias consecutivos. Ratos receber dois ensaios por dia: habituação (sem injecção) e injeção. Administrar solução salina durante os primeiros três a fnossos dias (ver discussão para importância de habituação solução salina), e cocaína para o próximo sete utilizando a mesma dose (por ex., 15 mg / kg / dia). <ol><li> Cada dia, aclimatar os ratos nas suas gaiolas para a antecâmara comportamental durante 30 min a 1 h. </li><li> Prepare limpas gaiolas de habitação de tamanho padrão do rato acrílico transparente com uma camada extremamente fina de roupas de cama (por exemplo, chips de pinheiros), de modo a não photobeams obscuras, se for o caso (Figura 4C &amp; D). </li><li> Coloque gaiolas contra o eixo Y da matriz photobeam perto de uma extremidade, de modo que cinco feixes são espaçados uniformemente ao longo do seu comprimento. Feixes de eixo-X não são usados ​​neste ensaio (Figura 4C e D). </li><li> Tome ratos de sua gaiola, no aleatório ordem, nuca e pesar. Remova cada rato do barco pesar pela base de sua cauda (com suporte) e coloque diretamente em sua gaiola locomotor atribuído. Cubra cada gaiola com uma tampa de filtro-top padrão. </li><li> Prepare seringas individuais wom solução salina ou solução de cocaína, tal como descrito no passo 2.1.7, com base nos pesos corporais do dia atual. Começar com uma dose de 15 ou 20 mg / kg, e considerar uma segunda experiência utilizando uma dose mais elevada ou mais baixa (ver a discussão para factores relevantes). </li><li> Uma vez que os ensaios de habituação ter terminado para todas as gaiolas, carregar o programa de injeção. </li><li> Um de cada vez, remover os ratos de sua gaiola teste, nuca e dar sua injeção (ip). Antes de devolver o mouse para sua gaiola teste, rapidamente iniciar o sinal de partida para essa gaiola (Figura 5C, em baixo). </li><li> Depois de todos os ensaios de injecção ter terminado, retorne ratos para suas gaiolas e sua sala de habitação. </li><li> Se desejado, permitir que os ratos a sofrer uma série de intervalos de segurança e os desafios de drogas, tais como as seguintes: a mesma dose, a metade da dose original, dose dupla, em seguida, solução salina, permitindo que sete dias antes do desafio mesma dose e 3-7 dias antes de cada desafio adicional. Seja qual for a escolha de desafios, manutenn períodos de abstinência semelhantes em coortes dentro de um experimento. NOTA: Se a dose inicial é elevada (por exemplo, 30 mg / kg ou acima), o dobro da dose deve ser ignorado ou substituído com uma dose mais baixa. O desafio salina revela qualquer activação locomotora condicionada pelo ambiente emparelhado-cocaína sozinho, e no processo, a quantidade de locomoção sensibilizada que é dependente de cocaína (ver discussão). </li></ol></li><li> Análise estatística <ol><li> Escolha da porção (s) de cada ensaio que vai ser utilizado para a análise. A maioria locomoção induzida por cocaína em roedores ocorre dentro da primeira injeção de drogas ~ 15-30 min depois. Dependendo de variáveis ​​envolvidas, considere a análise locomoção cumulativa para múltiplas janelas de tempo (por exemplo, os primeiros 15, 30, 60 e / ou 120 min) ou se concentrar em segmentos independentes do julgamento. </li><li> Usando o tempo de estrutura escolhida, resumir as quebras de feixe para cada animal por dia, durante os ensaios de habituação e de injecção separadamente e depois umverage os montantes para cada grupo. Plot médias e erros padrão da média (SEM) em um gráfico de linha sobre todos os dias. Como tratamentos podem alterar a forma como os ratinhos responderam à droga no início e / ou no final de cada estudo diário, também traçar médios quebras feixe grupo de 5-min escaninho ao longo de cada ensaio diária. NOTA: Traçando médias de atividade diária para ensaios de habituação e de injecção (por exemplo, em primeiro lugar 15 min) faz com que seja artificialmente parecer que a locomoção é atenuada pela injeção de solução salina, mas lembre-se que a atividade tem (mais provável) recusou-se a este nível até o final de habituação a cada dia . </li><li> Analisar salinas e tratamento da toxicodependência dias consecutivos separadamente usando medidas repetidas (RM) ANOVAs tendo o fator intra-sujeitos do dia / hora e incluindo todos os fatores entre-indivíduos no projeto, conforme o caso. Use um teste t ou One-Way ANOVA para investigar diferenças entre os grupos no dia 1 de cocaína (exposição aguda), e uma análise de variância multivariada para os desafios. Quando for o caso, siga significance com testes post-hoc ou univariada ANOVAs. </li></ol></li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo demonstra métodos para a preferência local condicionado e sensibilização locomotora, cada um dos quais pode ser utilizado pelo laboratório de média para avaliar aspectos da plasticidade comportamental induzida por drogas. Tal como acontece com a maioria dos testes comportamentais, existem considerações dignos adicionais para além do protocolo básico. Em primeiro lugar, cada uma destas técnicas pode ser concebido como tendo duas fases, a indução e a expressão. &quot;Indução&quot; abrange o desenvolvimento do comportamento de CPP que ocorre durante o condicionamento, e para a sensibilização é o período inicial de exposição à droga (normalmente consecutivos). &quot;Expressão&quot; para CPP é o pós-teste, enquanto que para a sensibilização pode ser definida como um desafio dada droga, quer após a retirada ou simplesmente como a última exposição consecutiva. Vale a pena considerar as manipulações que limitam a uma destas fases contra as outras para melhor analisar os efeitos potenciais. Vírus com eficácia temporal limitada (por exemplo, de HSV) ou drogas co-administrações / pré-tratamentos (por exemplo, agonistas / antagonistas) são úteis em tais esforços. Quando esta abordagem, pode ainda ser necessário o uso de protocolos de comprimidos de modo que uma fase particular irá coincidir com melhor expressão virai. Para CPP, é possível levar a cabo um método de condicionamento de dois dias, como já anteriormente descrito 37. Especialmente para a sensibilização locomotora, mudanças no intervalo de segurança entre a indução e expressão combinada com estes métodos, pode descobrir processos envolvidos na manutenção ou a estabilidade do comportamento. Além disso, tais métodos podem ser utilizados para estudar o fenómeno da sensibilização cruzada, em que o comportamento sensibilizados é induzida utilizando um medicamento, mas pode ser expressa pela exposição a uma droga diferente. Desde sensibilização cruzada não ocorre entre todas as drogas de sensibilização de abuso, pode provocar um comportamento de sensibilizados que difere um pouco do original, e não é necessariamente bidirecional paraqualquer dado conjunto de medicamentos, a análise pode oferecer oportunidades únicas para entender onde e como diferentes drogas afetam a plasticidade do cérebro e função. interpretação correcta do CPP, em particular, depende de descartar explicações alternativas para as descobertas. Os dados gerados num aparelho de três compartimentos deve ser uma análise mais exaustiva antes de definir subtracção do tempo gasto no lado emparelhado com solução salina a partir do lado do emparelhamento de cocaína no pós-teste, conforme preferência, uma vez que um aumento em uma preferência para o lado de emparelhado-droga que resulta exclusivamente a partir de uma diminuição do tempo gasto no compartimento emparelhado com solução salina é provável impróprios para uma tal interpretação. A câmara do meio permite a este resultado uma vez que o rato pode alterar o tempo gasto lá em vez da câmara emparelhado com a droga. Também é possível observar o aumento do tempo gasto no lado a emparelhado-droga à custa da câmara secundária, em vez de o lado emparelhado com solução salina; sem dúvida, este resultado ainda pode ser aceitável interpreTed como um aumento na preferência de drogas. A inclusão do terceiro compartimento fornece uma câmara neutra que permite a colocação imparcial do animal durante as sessões de pré e pós-teste 41. Embora útil para abordar preconceitos colocação iniciais que contribuem para os resultados dos testes-dia, a terceira câmara não é necessária para o condicionamento. Projetos alternativos CPP que possuem dois compartimentos distintos ou um único compartimento com configurações de estímulos variados são discutidos em outros lugares 41-42. Qualquer déficit no lugar preferência por uma droga também devem ser acompanhadas de avaliações de ambos capacidade de aprender associações contextuais e função geral recompensa. Há um número de ajustes que podem ser feitos para o paradigma CPP que pode auxiliar na interpretação de preferência alterada, incluindo a modificação da saliência do UCS (droga), aumentando (ou diminuindo) o número de emparelhamentos ou utilizando mais elevada ou mais baixa de droga dose. CPP pode ser realizada utilizando fo palatávelOD (por exemplo, alto teor de gordura, sacarose) ou interacções sociais para avaliar se a alteração observada é específica para a droga ou é relevante para recompensas naturais; não-CPP abordagens úteis para este fim incluem a auto-estimulação intracraniana, de preferência sacarose, e / ou funções de abordagem apetitivas. No entanto, todas estas opções variam em sua capacidade de tratar adequadamente a questão desejado. CPP-base alimentar pode ser particularmente benéfico, já que respostas normais demonstrar a capacidade de aprender e formar associações contextuais apropriadas com uma recompensa natural. controles adicionais para avaliar a capacidade de aprendizagem incluem tarefas que dependem de aprendizagem contextual / memória (medo contextual condicionado e CPA). CPA tem a vantagem de poder ser executado de forma semelhante à CPP, muitas vezes na mesma câmaras, substituindo a droga apetitivos com uma experiência aversivo (por exemplo, injecção de cloreto de lítio). Animais que apresentam déficits no CPP, mas CPA normal, demonstrar a capacidade de formar associações contextuais apropriadass, o que indica que as deficiências no CPP droga mais provável relacionar para recompensar (ou de outra forma específica de drogas). Um cuidado para CPA usando cloreto de lítio a considerar é se esta droga é um tratamento conhecido para qualquer condição que pode ser modelada pelos animais experimentais. Por exemplo, o tratamento de lítio foi mostrado para neutralizar os défices de aprendizagem no modelo de ratinho de 43 X frágil, que este método de controlo confundir. Além do paradigma clássico CPP, existem potenciais extensões de usuários podem ser úteis, tais como testes de extinção da associação de drogas ao contexto aprendeu e sua reintegração após CPP. Respostas condicionadas (CRS), uma vez estabelecido, pode ser mantida por longos períodos 19,20 quando os animais são deixados sem perturbações. Apesar de a persistência relativa do CR, ela pode ser eficazmente utilizadas extinta por apresentações do CS (contexto) na ausência do UCS (droga). Dois métodos de extinção CPP aparecem no litratura: exposição do ensaio repetido sem injeção de 21 ou re-pares de lado anteriormente emparelhado com a droga com o veículo 22. processos de extinção refletir a nova aprendizagem, em oposição a &quot;desaprender&quot; do condicionamento original, uma ideia efetivamente demonstrada através de &quot;reintegração&quot;. Reposição é classicamente desencadeada por re-exposição ao UCS, que produz a recuperação da CR. No contexto do CPP, uma única injecção da droga irá provocar a formação animais para mostrar preferência lugar. Curiosamente muitas pistas de drogas não-treinamento também pode produzir reintegração do CPP, incluindo priming com medicamentos alternativos 22 e uma variedade de estressores 23-26. Extinção e reintegração experimentos são de particular interesse para o campo da toxicodependência como modelos de tratamento de drogas e recaída. As intervenções que melhoram a taxa de desaparecimento e / ou reduzir a magnitude de restabelecimento pode ser alvos valiosos para farmacoterapias humanos. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Em comparação com CPP, sensibilização locomotora é considerado muito menos dependente de aprendizagem, e, por conseguinte, pode ser um método preferido para a avaliação da plasticidade induzida por drogas em modelos de roedores com dificuldades cognitivas conhecidos. Dito isto, não é, certamente, provas de que, pelo menos em alguns paradigmas de sensibilização, uma associação de drogas ao contexto aprendeu desenvolve e contribui para a resposta sensibilizada. Os comprovantes inclui uma maior sensibilização observadas quando a droga é administrada em um ambiente de teste fora de casa-gaiola, e, por vezes, a falta de sensibilização por completo quando a dosagem ocorre na casa-cage (por exemplo, 27-29). Nomeadamente no entanto, sensibilização independente de contexto foi claramente demonstrado em outros estudos (por exemplo, 30-32). Os detalhes experimentais que se podem contribuir para um aumento dependente do contexto em sensibilização é observável incluem dose de fármaco, a duração da exposição, se qualquer grupo deve ser transportada para o ensaio óf sensibilização e certos aspectos da pré-exposição para a câmara de testes; no entanto, estes detalhes permanecem pouco claras. Um método para determinar a contribuição de sensibilização contextual é dar um desafio salina seguinte sensibilização de drogas 33. A utilização do paradigma descrito minimiza a contribuição de sensibilização dependente do contexto como evidenciado por muito pouco activação locomotora em estudos anteriores após desafio com solução salina. A contribuição contextual à sensibilização foi revisto em uma série de documentos, muitas vezes incluindo discussões sobre outros do que a atividade locomotora 34 comportamentos. Para limitar a contaminação da activação induzida por droga e sensibilização com o locomotora efeitos induzidos por um ambiente novo estímulo, os ratos são aclimatados às injecções de soro fisiológico durante três a quatro dias no início de cada experiência. Como pode ser visto na Figura 7, os ratos mostram tipicamente locomoção reduzida entre a primeira eaúltimo dia de aclimatação de solução salina. Além disso, os ratinhos são visivelmente mais calmos e mais fácil de manusear e injectar por a última exposição salina. Trabalhos anteriores testaram várias estirpes e genótipos de ratos usando este paradigma e não vê grande variação na actividade de aclimatação solução salina através deles; No entanto, é possível observar ocasionalmente hiperactividade fenótipos muito fortes associadas com os genótipos particulares que não são superados utilizando este método. Nestes casos, pode ser desejável para realizar vários dias de aclimatação de solução salina (até planaltos locomoção no grupo hiperactiva), e, em seguida, normalizar o grupo hiperactivo para o grupo de controlo utilizando os dados do dia da injecção de solução salina última. Embora não seja ideal, ele permite uma comparação mais razoável dos efeitos de um fármaco na locomoção entre estes grupos. Outras opções que podem diminuir hiperactividade extremo são para estender o comprimento de teste de habituação antes da injecção todos os dias por um a cinco horas, e / ou usar ensaios de injecção mais longos (2-4 h) edia ach. Existem considerações adicionais que são importantes para a interpretação do comportamento locomotor. Tal como ilustrado na Figura 7C, as diferenças observadas grupo pode ser conduzido principalmente por disparidades na resposta locomotora aguda, a taxa de sensibilização ao longo de dias, o limite máximo de sensibilidade, ou alguma combinação destes factores. Analisar as contribuições desses fatores individualmente pode ser útil. Para este efeito, a resposta locomotora aguda podem ser analisados ​​estatisticamente sozinho. Em seguida, a taxa de sensibilização pode ser avaliada utilizando um programa capaz de ajuste de curva e um processo de normalização taxa que desconta quaisquer diferenças locomotoras agudas. sensibilização máxima alterada normalmente é revelado em um RM ANOVA ao longo dos dias de exposição de drogas consecutivos, onde as comparações post-hoc de acompanhamento do dia-a-dia são significativas em dias após a respostas do grupo ter estabilizado. Um deve estar ciente que a sensibilização máxima não pode ser determinadapara qualquer grupo que mantém uma resposta locomotora linear ao longo de dias de exposição à droga, como mostrado na Figura 7C (média; linha azul). Em tal caso, a exposição ao fármaco pode ser estendido para tentar e determinar sensibilização máxima. Por último, é tipicamente melhor comparar sensibilização entre os grupos, utilizando pelo menos duas doses de droga primária realizada em coortes separados de animais. Diferenças em qualquer dos aspectos acima de activação locomotora, em uma dose de, ou ambos, deve ser utilizada para orientar o teste para excluir outras explicações, incluindo alterações no desenvolvimento de estereotipia. A exposição repetida a algumas drogas, como a cocaína e anfetamina, não só produz a locomoção sensibilizada de uma maneira dependente da dose, mas também sensibiliza comportamentos estereotipados concorrentes. Estes estereótipos tornam-se particularmente evidente em doses elevadas, de tal forma que locomotor sensibilização é muitas vezes obscurecida parcialmente ou completamente, mas revelou novamente com a administração deuma dose mais baixa. Por esta razão, um &quot;déficit&quot; na sensibilização locomotora em um grupo experimental, na verdade, pode reflectir a elevada sensibilidade do desenvolvimento induzido por drogas de estereotipias. A avaliação da estereotipia pode ser um desafio, mas há uma série de tabelas publicadas 35 e 36 outras abordagens. Usando tanto uma escala estereotipia geral e uma avaliação dos comportamentos específicos é recomendado, conforme publicado anteriormente 18. Em conclusão, uma série de testes comportamentais foram desenvolvidos em modelos animais, numa tentativa para analisar a complexidade da dependência humana. preferência local condicionado e sensibilização locomotora são dois testes básicos amplamente utilizado em roedores e, respectivamente, que pode ser particularmente útil na avaliação de recompensa associado com a droga e o início de plasticidade persistente induzida pelo uso repetido. Há uma série de considerações para a concepção e interpretação de cada tipo de estudo, tornando-worthwhile considerar cuidadosamente os objetivos experimentais e da literatura anterior ao planejar essas avaliações.

Research aimed at understanding drug addiction using animal models must take a variety of approaches to address each of the assorted components that obstruct treatment success, including reward/reinforcement/motivation and withdrawal and relapse, as well as the general persistence that further complicates these issues in addiction. Since rewarding experiences associated with taking a drug of abuse are thought to motivate subsequent use, studies focusing on drug-context associations may be particularly useful for understanding brain mechanisms that contribute to drug taking and seeking. One such assay, conditioned place preference (CPP) is a high-throughput method for comparing group differences in reward sensitivity. The traditional interpretation of the task involves classical, or Pavlovian, conditioning, where a conditioned stimulus (CS) is paired with an unconditioned stimulus (UCS), and after multiple pairings, the CS elicits the same behavior as the UCS (however, see39,40). Theoretically, animals learn to associate an interoceptive state (reward or aversion) with contextual cues. The relative aversive or appetitive intensity of the interoceptive state is then assessed by then determining the animal's preference for the contextual cues. The use of place conditioning to measure drug-reward associations dates back to at least 1957, to a study using morphine on rats in a Y-maze3,4. Over the past several decades, variations on this method have been widely used to study place preference and aversion in rodents to various stimuli, and it remains particularly useful in the study of associations induced by drugs of abuse. In drug-addiction research, the assay has been used to assess the rewarding properties of a number of drugs and the contribution of different brain systems and proteins to drug reward (for reviews, see5-7,44). While there are superior methods of assessing factors that contribute to drug addiction, namely drug self-administration, CPP is a simple and much more accessible approach to measuring reward function. 
Most current protocols for conditioned place preference and aversion (CPA) use an apparatus that allows rodents to have access to two distinct chambers, either via a doorway or smaller connecting chamber. Distinctions between the two chambers are often based, at a minimum, on visual and tactile cues, including wall color and floor texture, but sometimes include other elements, such as olfactory cues. "Biased" designs typically attempt to reverse a pre-existing, innate preference for one chamber over the other, such as the one that rodents generally show for a black chamber over white. "Unbiased" designs aim to create a preference to one of two chambers that were initially equally appealing by randomly counterbalancing assignment to either chamber within a group. A "balanced" design is used when animals show small preferences, but do not, as a group, favor the same chamber. Goals of this latter design are to produce 1) pre-test preference scores for the (eventual) cocaine-paired chamber that are not significantly different between experimental groups and 2) negligible preference for the cocaine-paired chamber at pre-test, either positive or negative8. The balanced design is ideal for use with the described chambers, which utilize contradicting biases for wall color (black over white) and flooring (wire over bar), resulting in a roughly equal distribution of small preferences for both the black and white sides in different animals. Balancing calculations are described in further detail below.
During conditioning, animals are exposed to a drug and quickly placed into one of these two environments for a limited time period. Exposure is typically via intraperitoneal (i.p.) or sometimes subcutaneous (s.c.) injection, although paradigms for intravenous (i.v.) self-administration9, and intracranial infusions38 in a place preference apparatus have also been developed. These pairings are complemented by non-drug (vehicle) pairings of the same length conducted in the opposite chamber, which can take place on the same day as drug pairings or on separate days. In general, when allowed to explore the apparatus after conditioning, animals will spend more time where they received a rewarding drug (i.e., one that humans and animals will voluntarily self-administer), while they will avoid a place where they were given a drug that induced illness (e.g., lithium chloride). Several studies have been dedicated to optimizing the conditions for place preference to different drugs of abuse (for review, see7). Cocaine doses (i.p.) for mice generally range from 1 to 20 mg/kg, with doses less than 5 mg/kg often used to parse high sensitivity in one group. Two or more drug pairings are typically required for adult mice10, and the length of these pairings is an important consideration. Very low doses of cocaine require an immediate and brief conditioning, likely because this method captures the most rewarding period of the exposure. Delayed or very long conditioning periods can result in no preference, or may even induce aversion11,12. Here is presented a basic method for obtaining conditioned place preference to cocaine in adult mice.
While the CPP assay is an ideal method for assessing reward-related learning and memory of drug-context associations, behavioral sensitization is arguably easier to perform and allows the assessment of changes that develop over repeated treatment. Also known as reverse-tolerance, behaviors undergoing sensitization are incrementally enhanced over repeated exposures to a particular drug of abuse, especially psychostimulants, and cross-sensitization is known to occur between some, but not all, of these drugs. One of the first assessments of cocaine-induced locomotor sensitization, in particular, in rodents was published in 197613. A number of labs have shown that sensitized locomotion is detectable long after drug cessation, depending on the original length, location and dose of exposure14-17, and the current protocol has been used to detect sensitization as long as 10 months following seven days (30 mg/kg) of cocaine treatment in mice18. The test can be performed using either photobeam or video-tracking technologies, in apparatuses of differing sizes and shapes, making it simple for many labs to perform. The robust nature, simplicity and persistence of locomotor sensitization makes its assessment an ideal part of examining basic mechanisms of long-lasting changes in drug-induced behavior. 
As is expanded upon in the discussion, an important consideration when performing the locomotor sensitization assay is whether drug is given in the home- or test-cage environment. To take advantage of the robust sensitization that occurs when drug administration occurs outside of the home cage, this protocol employs this method. However, it has been observed that when animals are not adequately habituated to a new environment before drug exposure, a novelty-induced ceiling effect occurs on Day 1, which can partially or fully mask the progressive nature of sensitization. It is likely that this represents synergistic locomotor-activating effects of the drug together with novelty, and while the mechanisms underlying such effects may be interesting, the method described is designed to reduce the role of novelty and allow the effects of the drug to be measured more independently. While it is expected this method will be useful in the assessment of other locomotor-sensitizing drugs, it has primarily evaluated its effectiveness with cocaine in C57BL/6 mice.

<table><tbody><tr><td>Cocaine Hydrochloride USP</td><td>Mallinckrodt Pharmaceuticals</td><td>0406-1520</td><td>Purchase and use (Schedule II controlled substance) for research purposes requires compliance and licensure according to state and federal law.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Conditioned Place Preference,&amp;nbsp; Three Compartment Apparatus with Manual Doors and Lights for Mouse</td><td>Med-Associates Inc.</td><td>MED-CPP-MS &amp;amp; MED-CPP-3013</td><td>Our laboratory has used these boxes; however, many alternative boxes are available &amp;amp; acceptable.</td></tr><tr><td>PAS-Home Cage Activity Monitoring Photobeam Arrays</td><td>San Diego Instruments</td><td>2325-0223 &amp;amp; 7500-0221</td><td>Our lab houses these arrays inside of custom built chambers, as described in the text.&amp;nbsp; There are alternatives available.</td></tr><tr><td>Disposable Sani-Cloth disenfecting wipes</td><td>PDI</td><td>13872</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of cocaine-induced behavioral sensitization and conditioned place preference in mice

It is thought that rewarding experiences with drugs create strong contextual associations and encourage repeated intake. In turn, repeated exposures to drugs of abuse make lasting alterations in the brain function of vulnerable individuals, and these persistent alterations likely serve to maintain the maladaptive drug seeking and taking behaviors characteristic of addiction/dependence2. In rodents, reward experience and contextual associations are frequently measured using the conditioned place preference assay, or CPP, wherein preference for a previously drug-paired context is measured. Behavioral sensitization, on the other hand, is an increase in a drug-induced behavior that develops progressively over repeated exposures. Since sensitized behaviors can often be measured after several months of drug abstinence, depending on the dose and length of initial exposure, they are considered observable correlates of lasting drug-induced plasticity. Researchers have found these assays useful in determining the neurobiological substrates mediating aspects of addiction as well as assessing the potential of different interventions in disrupting these behaviors. This manuscript describes basic, effective protocols for mouse CPP and locomotor behavioral sensitization to cocaine.

Os resultados representativos do ensaio de CPP são mostrados na Figura 6 do tipo selvagem utilizando ratinhos C57BL / 6N a cerca de nove semanas de idade. O desenho do estudo foi um factorial mista 2 x 3, com uma variável dentro-sujeitos de teste (pré e pós) e um entre-sujeitos variável de tratamento (solução salina e cocaína 5 e 10 mg / kg). A RM ANOVA mostrou uma interação significativa entre o teste eo tratamento (F 2,20 = 3,68, p &lt;0,05), o que foi interpretado no lugar de efeitos principais significativos observados tanto para Test (F 1,20 = 9,86, p &lt;0,01) e O tratamento (F 1,20 = 4,37, P &lt;0,05). comparações post hoc mostraram que nenhum dos grupos diferiam uns dos outros durante o pré-teste. No pós-teste, a 5 mg / kg e 10 mg / kg não diferiram significativamente um do outro; No entanto, ambos os grupos mostraram significativamente maior preferência para a câmara de emparelhamento de cocaína do que o grupo de controlo apenas com solução salina (de Tukey: 5 mg / kg, p &lt;0,5; 10 mg / kg, p &amp;# 60; 0,01). Além disso, os testes post hoc de Bonferroni mostraram que tanto a 5 (p &lt;0,05) e 10 (p &lt;0,05) mg / grupos kg mostrou maior preferência para o lado do emparelhado-cocaína no pós-teste em relação ao pré-teste, enquanto a solução salina grupo -saline não mostrou nenhuma mudança do pré ao pós-teste. Os resultados representativos do ensaio locomotor são mostrados na Figura 7A e B do tipo selvagem utilizando ratinhos C57BL / 6N de controlo da mesma ninhada de uma série de experiências separadas que foram previamente publicados 18. Após aclimatação a injecções de solução salina durante 3-4 dias, os ratinhos receberam uma injecção de cocaína (ip) aos 5, 10, 15 ou 30 mg / kg por dia durante sete dias. Na sequência de um período de espera de sete ou 14 dias, cada grupo recebeu um desafio de cocaína na dose original, em seguida, depois de mais (variável) períodos de espera, alguns receberam desafios cocaína adicionais em outras doses, como mostrado. Para a finalidade de demonstrar o efeito da dose de cocaína em LOCOMotor sensibilização na publicação atual, os quatro grupos com doses diferentes foram combinados em um 4 x 7 projeto mixed-factorial, com uma intra-sujeitos variável do Dia (7 primeiras injeções de cocaína) e um factor entre sujeitos de Dose. A RM ANOVA mostrou uma interação significativa entre a dose e Dia (F 18,276 = 12,53, p &lt;0,0001), o que foi interpretado em vez de principais efeitos significativos que foram também observadas para ambos Day (F 6,276 = 18,25, p &lt;0,0001) e Dose ( F 3,46 = 22,63, p &lt;0,0001). Tukey post hoc de análise mostrou diferenças significativas em geral entre 5 e 15 mg / kg (p &lt;0,0001), 5 e 30 mg / kg (p &lt;0,0001), e 10 e 15 mg / kg (p &lt;0,01). Uma série de diferenças significativas foram observadas quando os grupos foram comparados a cada dia. Notado aqui são diferenças para o dia 1 de cocaína (5 vs 30 mg / kg, p &lt;0,01; 10 vs 30 mg / kg, p &lt;0,05; 15 vs 30 mg / kg, p &lt;0,01) e Dia 7 (cocaína 5 x 10 mg / kg, p &lt;0,05; 5 x 15 mg / kg, p &lt;0,0001; 10 vs. 15 mg / kg, p &lt;0,01; 15 vs. 30 mg / kg, p &lt;0,0001). Figura 7C mostra figuras simuladas que ilustram os principais aspectos da sensibilização locomotora que pode diferir grupos quantidade de tratamento. Embora estas características são ilustrados aqui de forma independente, é também possível observar diferenças nas suas combinações. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53107/53107fig1.jpg" /> Figura 1. Med PC CPP controle de sessão de base. (A) A indicação Padrão, ícone sessão aberta (caixa vermelha), e caixa de diálogo de sessão aberta (no detalhe). Selecione &quot;nome personalizado&quot; e usar a janela de pastas para navegar até a pasta de dados e o nome da sessão. Selecionar o programa apropriado na lista drop-down &quot;procedimento&quot;. Para cada caixa em uso, verifique o número da caixa e insira a informação pertinente em caixas assunto, experiência, e de grupo. (B) visor câmara de carga, começar ícone de sinal (caixa azul), e enviar sinalcaixa de diálogo al (inserção). Uma vez que todos os dados da câmara tem sido inseridos, selecione câmaras para ser carregado e emissão iniciar sinal. Chambers vai agora ser desencadeada por feixe-break para iniciar o temporizador da sessão e recolher dados. (C) visor sessão terminou. À medida que cada câmara concluir o programa designado, a área de coleta de dados (caixa verde) irá tornar-se estático e área de informação da câmara (caixa de laranja) vai mostrar câmaras como &quot;fechada&quot;. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53107/53107fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53107/53107fig2.jpg" /> Figura 2. Configuração câmara de CPP. (A) Sample linha do tempo experimental. Pré-teste é seguido por cocaína diária alternada (cinzento) e sessões de condicionamento salina (branco). Pós-teste é realizado 24 horas após a última sessão de condicionamento. (<html> B) de configuração câmara aberta para uso em sessões de pré e pós-teste. Note-se que as portas entre as câmaras estão em posição levantada / aberta. (C) de configuração câmara fechada para uso em sessões de condicionamento. Note-se que as portas manuais são reduzidos, sem acesso entre as câmaras. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53107/53107fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53107/53107fig3.jpg" /> Figura 3. cálculos de projecto equilibrado para CPP. Exemplo mostrando cálculos e objetivos quando equilibrando escores do pré-teste no CPP. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53107/53107fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> ig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Locomotor Câmara de configuração. (A) câmara exterior consiste na caixa preto opaco dentro do qual a matriz feixe se encaixa perfeitamente (B). Câmaras de tamanho Housing / caixa de sapato deve ser preenchido com uma fina camada de roupa de cama (C) e alinhados de forma que vigas estão uniformemente distribuídas ao longo do eixo (D). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53107/53107fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53107/53107fig5.jpg" /> Figura 5. Locomotor Operação. Programa de computador (A) padrão de computador Câmara. Inicie uma nova base de dados de sessão (caixa azul e inserção). Renomear arquivos e diretórios para cada experimento (azul sub-inserção). Criar uma nova sessão (caixa vermelha e inserção) com o identificador exclusivo. Editar Sessão (inserção vermelho) e enter informações identificador animal na guia câmara (caixa verde e inserção) e configurar start / stop de controle para cada tipo de sessão (caixa de laranja). (B) Selecione controle de parada de início apropriado para cada tipo de sessão. Definir duração do intervalo de 300 segundos (por 5 min bin) e 12 intervalos por fase (para 1 sessão hr). Para as sessões de habituação (à esquerda), câmaras será acionado para iniciar em uníssono (habilitar manualmente Fase ... Tudo em Unison) e começará o monitoramento para a atividade imediatamente após o primeiro intervalo de feixe. Para as sessões de injecção (à direita), câmaras serão acionados individualmente (habilitar manualmente fase ... Individualmente Botões tela) e começará o monitoramento para a atividade imediatamente após o primeiro intervalo de feixe. Ambos os tipos de sessão terminará quando o tempo total de fase expirou para cada câmara individualmente. (C) Uma vez que a sessão foi iniciada, sessões de habituação pode ser iniciado selecionando o botão &quot;start all&quot; (em cima). Note-se que após TriggEring, todas as câmaras estará esperando por primeira pausa feixe para começar a sessão. Para as sessões de injeção, cada câmara pode ser iniciado de forma independente (parte inferior). Note-se que após a activação câmaras individuais (enquanto que o animal está fora de câmara para injecção), câmaras estará esperando para o primeiro intervalo feixe para começar a sessão. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53107/53107fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53107/53107fig6.jpg" /> Figura 6. Os resultados representativos CPP. (Top) Em CPP, ratos mostraram preferência significativa para uma câmara previamente emparelhado com cocaína (5 ou 10 mg / kg), enquanto os ratos que receberam pares salino em ambas as câmaras não desenvolveram qualquer preferência. Coluna abreviaturas denotam diferenças significativas entre os grupos a partir da barra marcado em comparação com o grupo observou no mesmo teste TIapontar-me. (Inferior) Representando graficamente o tempo gasto em cocaína contra câmaras emparelhado com solução salina durante o pré e pós-teste, os aumentos no lado do emparelhamento de cocaína pode ser visto nas 5 e 10 mg / kg grupos que são à custa do tempo de gasto em ambas as câmaras emparelhado com solução salina e médio. Em contraste, não houve diferenças marcantes no tempo gasto em qualquer câmara entre pré e pós-teste no grupo controle soro fisiológico. Dados apresentados como média ± SEM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53107/53107fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53107/53107fig7.jpg" /> Figura 7. Os resultados representativos locomotor de sensibilização (A) quebras de feixe acumulados durante os primeiros 20 min de cada ensaio por dia durante quatro doses separadas:. 5, 10, 15 e 30 mg / kg em camundongos selvagens seguidos por mesmo-, meia , o dobro da dose de umd desafios salinas, modificados a partir de (18). Todos os grupos receberam desafios mesma dose,-ona (10, 15, 30 mg / kg) ou duas semanas (5 mg / kg) após a última exposição a cocaína. Alguns grupos receberam novos desafios, que foram realizadas em intervalos de segurança variáveis. (B) Lote de dados do aparelho locomotor (quebras de feixe) somados por 5-min bin para ensaios diários durante o 15 mg kg experiência / cocaína sensibilização. (C) Ilustrações que apresentam diferenças de sensibilização locomotora para dois grupos de tratamento que são movidos principalmente por diferenças (esquerda) de resposta de cocaína aguda, (meio) a diferença da taxa de sensibilização ou (direita) As diferenças de sensibilização máxima. Dados apresentados como média ± SEM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53107/53107fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Assessment of Cocaine-induced Behavioral Sensitization and Conditioned Place Preference in Mice

This protocol is intended to enable researchers to conduct experiments designed to test these aspects of addiction using the conditioned place preference and locomotor behavioral sensitization assays.

Avaliação da sensibilização comportamental induzida por cocaína e preferência por lugar condicionado em Ratos

It is thought that rewarding experiences with drugs create strong contextual associations and encourage repeated intake. In turn, repeated exposures to ...

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Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Behavior

Unit 1

Drug Abuse and Addiction

SCIENTISTS IN ACTION

16.9K visualizações.  Harvard Medical School, McLean Hospital. This protocol is intended to enable researchers to conduct experiments designed to test these aspects of addiction using the conditioned place preference and locomotor behavioral sensitization assays.

Vídeo: Assessment of Cocaine-induced Behavioral Sensitization and Conditioned Place Preference in Mice

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes of interest allows for enhanced temporally- and regionally-specific control of gene deletion, compared to existing methods. While conditional deletion can also be achieved by mating mice that express Cre recombinase under the control of specific gene promoters with mice carrying a floxed gene, stereotaxic microinjection allows for targeting of discrete brain areas at experimenter-determined time points of interest. In the context of cocaine conditioned place preference, and other cocaine behavioral paradigms such as self-administration or psychomotor sensitization that can involve withdrawal, extinction and/or reinstatement phases, this technique is particularly useful in exploring the unique contribution of target genes to these distinct phases of behavioral models of cocaine-induced plasticity. Specifically, this technique allows for selective ablation of target genes during discrete phases of a behavior to test their contribution to the behavior across time. Ultimately, this understanding allows for more targeted therapeutics that are best able to address the most potent risk factors that present themselves during each phase of addictive behavior.

This article describes how to microinject viral vectors into mouse brain and then test in a conditioned place preference paradigm that includes an acquisition, extinction and reinstatement phase.

Microinjeção estereotáxica de vetores virais Expressando Cre Recombinase para estudar o papel de genes alvo em cocaína condicionado Lugar de Preferência

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Comportamento

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction. Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in animal research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. For this study, we used a novel approach to studying drug reinforcement in rats by combining traditional CPP and self-administration methodologies. We assembled an apparatus using two Med Associate operant chambers, sensory stimuli, and a Plexiglas-constructed neutral zone. These modifications allowed our experiments to encompass motivational aspects of drug intake through self-administration and drug-free assessment of drug/cue conditioning strength with the CPP test. In our experiments, rats self-administered cocaine (0.75 mg/kg/inj, i.v.) during either four (e.g., the "short-term") or eight (e.g., the "long-term") alternating-day sessions in an operant environment containing distinctive sensory cues (e.g., olfactory and visual). On the alternate days, in the other (differently-cued) operant environment, saline was available for self-infusion (0.1 ml, i.v.). Twenty-four hours after the last self-administration/cue-pairing session, a CPP test was conducted. Consistent with typical CPP findings, there was a significant preference for the chamber associated with cocaine self-administration. In addition, in animals undergoing the long-term experiment, a significant positive correlation between CPP magnitude and the number of cocaine-reinforced lever responses. In conclusion, this apparatus and approach is time and cost effective, can be used to examine a wide array of topics pertaining to drug abuse, and provides more flexibility in experimental design than CPP or self-administration methods alone.

Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. In this report, we combined traditional CPP and self-administration methods as a novel approach to studying drug reinforcement and addiction in rats.

Aparelho novo e Método para Reforço de Drogas

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

Neurociência

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of studies show changes in balance phenotype with age in rodents, very few isolate the vestibular contribution to balance under either normal conditions or during senescence. We use two standard behavioral tests to characterize the balance performance of mice at defined age points over the lifespan: the rotarod test and the inclined balance beam test. Importantly though, a custom built rotator is also used to stimulate the vestibular system of mice (without inducing overt signs of motion sickness). These two tests have been used to show that changes in vestibular mediated-balance performance are present over the murine lifespan. Preliminary results show that both the rotarod test and the modified balance beam test can be used to identify changes in balance performance during aging as an alternative to more difficult and invasive techniques such as vestibulo-ocular (VOR) measurements.

Motor control and balance performance are known to deteriorate with age. This paper presents a number of standard noninvasive behavioral tests with the addition of a simple rotary stimulus to challenge the vestibular system and show changes in balance performance in a murine model of aging.

Avaliação Comportamental do Envelhecimento Rato Sistema Vestibular

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific genes in encoding experience is one of the main objectives of molecular neuroscience. Furthermore, the functional association of defined genes with specific behaviors has implications for understanding the basis of neuropsychiatric disorders. Induction of robust transcription programs has been observed in the brains of mice following various behavioral manipulations. While some genetic elements are utilized recurrently following different behavioral manipulations and in different brain nuclei, transcriptional programs are overall unique to the inducing stimuli and the structure in which they are studied1,2.
In this publication, a protocol is described for robust and comprehensive transcriptional profiling from brain nuclei of mice in response to behavioral manipulation. The protocol is demonstrated in the context of analysis of gene expression dynamics in the nucleus accumbens following acute cocaine experience. Subsequent to a defined in vivo experience, the target neural tissue is dissected; followed by RNA purification, reverse transcription and utilization of microfluidic arrays for comprehensive qPCR analysis of multiple target genes. This protocol is geared towards comprehensive analysis (addressing 50-500 genes) of limiting quantities of starting material, such as small brain samples or even single cells.
The protocol is most advantageous for parallel analysis of multiple samples (e.g. single cells, dynamic analysis following pharmaceutical, viral or behavioral perturbations). However, the protocol could also serve for the characterization and quality assurance of samples prior to whole-genome studies by microarrays or RNAseq, as well as validation of data obtained from whole-genome studies.

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

Análise abrangente de Transcrição Dynamics de amostras de cérebro seguinte experiência Behavioral

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate drug-seeking behavior and prompt relapse in abstinent drug users. We have developed a procedure to study the behavioral and neural processes that mediate the impact of context on alcohol-seeking behavior in rats. Following acclimation to the taste and pharmacological effects of 15% ethanol in the home cage, male Long-Evans rats receive Pavlovian discrimination training (PDT) in conditioning chambers. In each daily (Mon-Fri) PDT session, 16 trials each of two different 10 sec auditory conditioned stimuli occur. During one stimulus, the CS+, 0.2 ml of 15% ethanol is delivered into a fluid port for oral consumption. The second stimulus, the CS-, is not paired with ethanol. Across sessions, entries into the fluid port during the CS+ increase, whereas entries during the CS- stabilize at a lower level, indicating that a predictive association between the CS+ and ethanol is acquired. During PDT each chamber is equipped with a specific configuration of visual, olfactory and tactile contextual stimuli. Following PDT, extinction training is conducted in the same chamber that is now equipped with a different configuration of contextual stimuli. The CS+ and CS- are presented as before, but ethanol is withheld, which causes a gradual decline in port entries during the CS+. At test, rats are placed back into the PDT context and presented with the CS+ and CS- as before, but without ethanol. This manipulation triggers a robust and selective increase in the number of port entries made during the alcohol predictive CS+, with no change in responding during the CS-. This effect, referred to as context-induced renewal, illustrates the powerful capacity of contexts associated with alcohol consumption to stimulate alcohol-seeking behavior in response to Pavlovian alcohol cues.

A procedure to study the capacity of an alcohol associated environmental context to trigger the renewal of alcohol-seeking behavior in rats is described.

Um procedimento para Observar Renovação induzida por Contexto de pavloviano condicionado Comportamento Álcool-seeking em Ratos

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

Operant Sensation Seeking in the Mouse

Operant methods are powerful behavioral tools for the study of motivated behavior. These 'self-administration' methods have been used extensively in drug addiction research due to their high construct validity. Operant studies provide researchers a tool for preclinical investigation of several aspects of the addiction process. For example, mechanisms of acute reinforcement (both drug and non-drug) can be tested using pharmacological or genetic tools to determine the ability of a molecular target to influence self-administration behavior1-6. Additionally, drug or food seeking behaviors can be studied in the absence of the primary reinforcer, and the ability of pharmacological compounds to disrupt this process is a preclinical model for discovery of molecular targets and compounds that may be useful for the treatment of addiction3,7-9. One problem with performing intravenous drug self-administration studies in the mouse is the technical difficulty of maintaining catheter patency. Attrition rates in these experiments are high and can reach 40% or higher10-15. Another general problem with drug self-administration is discerning which pharmacologically-induced effects of the reinforcer produce specific behaviors. For example, measurement of the reinforcing and neurological effects of psychostimulants can be confounded by their psychomotor effects. Operant methods using food reinforcement can avoid these pitfalls, although their utility in studying drug addiction is limited by the fact that some manipulations that alter drug self-administration have a minimal impact on food self-administration. For example, mesolimbic dopamine lesion or knockout of the D1 dopamine receptor reduce cocaine self-administration without having a significant impact on food self-administration 12,16. 
Sensory stimuli have been described for their ability to support operant responding as primary reinforcers (i.e. not conditioned reinforcers)17-22. Auditory and visual stimuli are self-administered by several species18,21,23, although surprisingly little is known about the neural mechanisms underlying this reinforcement. The operant sensation seeking (OSS) model is a robust model for obtaining sensory self-administration in the mouse, allowing the study of neural mechanisms important in sensory reinforcement24. An additional advantage of OSS is the ability to screen mutant mice for differences in operant behavior that may be relevant to addiction. We have reported that dopamine D1 receptor knockout mice, previously shown to be deficient in psychostimulant self-administration, also fail to acquire OSS24. This is a unique finding in that these mice are capable of learning an operant task when food is used as a reinforcer. While operant studies using food reinforcement can be useful in the study of general motivated behavior and the mechanisms underlying food reinforcement, as mentioned above, these studies are limited in their application to studying molecular mechanisms of drug addiction. Thus, there may be similar neural substrates mediating sensory and psychostimulant reinforcement that are distinct from food reinforcement, which would make OSS a particularly attractive model for the study of drug addiction processes. The degree of overlap between other molecular targets of OSS and drug reinforcers is unclear, but is a topic that we are currently pursuing. While some aspects of addiction such as resistance to extinction may be observed with OSS, we have found that escalation 25 is not observed in this model24. Interestingly, escalation of intake and some other aspects of addiction are observed with self-administration of sucrose26. Thus, when non-drug operant procedures are desired to study addiction-related processes, food or sensory reinforcers can be chosen to best fit the particular question being asked. 
In conclusion, both food self-administration and OSS in the mouse have the advantage of not requiring an intravenous catheter, which allows a higher throughput means to study the effects of pharmacological or genetic manipulation of neural targets involved in motivation. While operant testing using food as a reinforcer is particularly useful in the study of the regulation of food intake, OSS is particularly apt for studying reinforcement mechanisms of sensory stimuli and may have broad applicability to novelty seeking and addiction.

In this protocol we describe a method of operant learning using sensory stimuli as a reinforcer in the mouse. It requires no prior training or food restriction, and it allows the study of motivated behavior without the use of a pharmacological or natural reinforcer such as food.

Sensation operante que procura no mouse

Operant methods are powerful behavioral tools for the study of motivated behavior.  These 'self-administration' methods have been used extensively in drug ...

Reinstatement of Drug-seeking in Mice Using the Conditioned Place Preference Paradigm

The present protocol describes the Conditioned Place Preference (CPP) as a model of relapse in drug addiction. In this model, animals are first trained to acquire a conditioned place preference in a drug-paired compartment, and after the post-conditioning test, they perform several sessions to extinguish the established preference. The CPP permits the evaluation of the conditioned rewarding effects of drugs related to environmental cues. Then, the extinguished CPP can be robustly reinstated by the non-contingent administration of a priming dose of the drug, and by exposure to stressful stimuli. Both methods will be explained here. When the animal reinitiates the behavioral response, a reinstatement of the conditioned reward is considered to have taken place.
The main advantages of this protocol are that it is non-invasive, inexpensive, and simple with good validity criteria. In addition, it allows the study of different environmental manipulations, such as stress or diet, which can modulate relapse into drug seeking behaviors. However, one limitation is that if the researcher aims to explore the motivation and primary reinforcing effects of the drug, it should be complemented with self-administration procedures, as they involve operant responses of animals.

This protocol describes the Conditioned Place Preference (CPP) as a model of relapse. This procedure permits the measurement of relapse in laboratory animals, considering the impact of drug-associated environmental cues as craving and relapse in abstaining addicts is currently the focus of drug-abuse treatment programs.

Reintegração de busca de drogas em ratos utilizando o paradigma de preferência lugar condicionado

The present protocol describes the Conditioned Place Preference (CPP) as a model of relapse in drug addiction. In this model, animals are first trained to ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

Métodos de auto-administração intravenosa em um modelo de camundongo

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

A Conditioned Place Preference Protocol for Measuring Incubation of Craving in Rats

A major cause of repeated relapses is a craving for the drug. Drug craving increases progressively during the abstinence period, a phenomenon termed incubation of drug craving. Here, we describe a morphine conditioned place preference (CPP) protocol for measuring the incubation of craving in rats. In this protocol, a CPP paradigm mainly employing somatosensory cues is used to establish a long-term reward memory of morphine. A three-chamber CPP box that differs in the texture of the chamber floor is constructed. First, the animals are tested for their baseline preference to the two side chambers for three consecutive days. Then, they are injected intraperitoneally with morphine/saline and put into their non-preferred/preferred chamber for 45 min. After 6 days of conditioning, their preference to the side chambers is tested for 15 min at different time points after the last conditioning session. With this paradigm, the reward memory of morphine could last for at least 18 days. To test whether the above-mentioned protocol can model increased craving, the number of entrances into the two side chambers are counted during the abstinence period. The results show that the entrances increased, suggesting that the CPP paradigm could mimic the incubation of craving. Future studies can employ this model to study neural mechanisms underlying long-term memory and incubation of craving.

Here, a morphine conditioned place preference (CPP) protocol is described to measure incubation of craving in rats.

Um protocolo de preferência condicionada lugar para medir a incubação do desejo em ratos

A major cause of repeated relapses is a craving for the drug. Drug craving increases progressively during the abstinence period, a phenomenon termed ...

A Protocol for Measuring Cue Reactivity in a Rat Model of Cocaine Use Disorder

Cocaine use disorder (CUD) follows a trajectory of repetitive self-administration during which previously neutral stimuli gain incentive value. Cue reactivity, the sensitivity to cues previously linked with the drug-taking experience, plays a prominent role in human craving during abstinence. Cue reactivity can be assessed as the attentional orientation toward drug-associated cues that is measurable as appetitive approach behavior in both preclinical and human studies. Herein describes an assessment of cue reactivity in rats trained to self-administer cocaine. Cocaine self-administration is paired with the presentation of discrete cues that act as conditioned reinforcers (i.e., house light, stimulus light, infusion pump sounds). Following a period of abstinence, lever presses in the cocaine self-administration context accompanied by the discrete cues previously paired with cocaine infusion are measured as cue reactivity. This model is useful to explore neurobiological mechanisms underlying cue reactivity processes as well as to assess pharmacotherapies to suppress cue reactivity and therefore, modify relapse vulnerability. Advantages of the model include its translational relevance, and its face and predictive validities.&#160;The primary limitation of the model is that the cue reactivity task can only be performed infrequently and must only be used in short duration (e.g., 1 hour), otherwise rats will begin to extinguish the pairing of the discrete cues with the cocaine stimulus. The model is extendable to any positively reinforcing stimulus paired with discrete cues; though particularly applicable to drugs of abuse, this model may hold future applications in fields such as obesity, where palatable food rewards can act as positively reinforcing stimuli.

Cue reactivity is conceptualized as sensitivity to cues linked with drug-taking experiences that contribute to craving and relapse in abstinent humans. Cue reactivity is modeled in rats by measuring attentional orientation toward drug-associated cues that results in appetitive approach behavior in a cue reactivity test following self-administration and forced abstinence.

Um protocolo para medição de reatividade de Cue em um modelo do rato do transtorno de uso de cocaína

Cocaine use disorder (CUD) follows a trajectory of repetitive self-administration during which previously neutral stimuli gain incentive value. Cue ...