This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.

Todos os experimentos com animais foram executados em conformidade com todas as diretrizes e regulamentos relevantes e agências reguladoras. O protocolo que está sendo demonstrada foi realizada sob a orientação e aprovação do regulamento escritório UK Home 1. Perfusão e Cobrança celular (Figura 1) <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig1.jpg" /> Figura 1:. Perfusão do fígado Após anestesia do rato, o tracto digestivo está deslocado lateralmente para a esquerda do abdómen de modo a tornar a veia porta (VP) acessível. O PV é canulada usando uma taxa de fluxo lento (1-3 mL / min) de solução de EGTA / HBSS e a veia veina inferior (IVC) é rompido imediatamente para evitar qualquer excesso de pressão dentro do fígado. Dentro da primeira hora de perfusão, a taxa de fluxo é aumentada gradualmente até 7 ml / min. A solução de colagenase é então perfundido a 10 ml / min, até que a sua digestão completa seja alcançada. <ol><li> Prepare recém todos os reagentes descritos na tabela de material. </li><li> Aquece-se a EGTA (etileno-glicol Tetra-ácido acético) / HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hank) de solução (50 ml por ratinho) e a solução de colagenase (100 ml por rato) durante 30 min a 40 ° C. </li><li> Lavar a bomba de tubo flexível primeiro com etanol 70%. Pour 40 ml de EGTA / solução de HBSS para um tubo de centrífuga imerso no banho de água e lavar a tubagem flexível com bomba de pré-aquecida de EGTA / solução de HBSS. </li><li> Realizar anestesia terminal usando um barbitúrico para produzir de forma confiável inconsciência antes que a depressão respiratória e morte. Injectar fenobarbitona a 1 mg / kg, ip num ratinho CD1 macho ou fêmea (35-45 g). Confirme a anestesia por beliscar dedo do pé. </li><li> Raspar os pêlos abdominais e esterilizar a superfície abdominal utilizando uma solução de etanol a 70%. </li><li> Cortar através da cavidade abdominal e expor a veia porta e veia cava inferior, movendo o intestino lateralmente para a esquerda do abdómen. </li><li> Estrelat a bomba a uma velocidade de 1-3 ml / min com solução de EGTA / HBSS e canular a veia portal usando uma agulha de borboleta de 23 g (asas corte). Prender a secção da veia porta canulada com a agulha 23 G e em seguida virar a pinça serrefine na superfície do abdómen aberto rato. O fígado deve rapidamente pálido nos primeiros 30 segundos de EGTA / Solução HBSS perfusão. </li><li> Rapidamente incisar a parte inferior da veia cava inferior para evitar a formação de excesso de pressão no fígado, e em seguida aumentar progressivamente o caudal de 7 ml / min, ao longo do primeiro minuto de perfusão. O animal morre devido a hemorragia secundária à da veia cava punção venosa. </li><li> Quando menos de 5 ml de EGTA / Solução HBSS é remanescente no tubo de centrífuga, encha-o com solução de colagenase (40-50 ml). Aumentar a taxa de fluxo gradualmente para 10 ml / min, ao longo de 30 seg. </li><li> Faça o swell fígado, aplicando pressão para a veia cava inferior, usando uma pinça, por 5-10 intervalos seg. This pode ser feito periodicamente (5-10 vezes durante a digestão). Este passo vai melhorar a dissociação das células do fígado e reduzir o tempo de perfusão com colagenase. </li><li> Quando menos do que 10 ml de solução de colagenase permanece dentro do tubo de centrifugação, derrame 40-50 mL de solução pré-aquecida de colagenase no tubo de centrífuga. </li><li> Após 10-15 min de perfusão e cerca de 70-80 ml de solução de colagenase perfundidos, aplicar uma pequena pressão sobre a superfície do fígado com uma pinça. Uma cópia da pressão indica que as células do fígado são dissociados. </li><li> Remover o fígado a partir da cavidade abdominal como uma só peça e colocá-lo em um tubo de centrífuga contendo 20-30 ml de células de Kupffer de isolamento médio. Mantenha as células do fígado em gelo ou a 4 ° C por um período máximo de 3 horas para evitar que afetam a viabilidade das células do fígado. </li><li> Repetir o procedimento de perfusão em vários animais, se necessário, ao mesmo tempo manter o fígado perfundido em gelo. Piscina 1-3 fígados para purificação e prosseguir com a fase 3. </li></ol> 2. Preparação do por centrifugação em gradiente de densidade (Figura 2) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig2.jpg" /> Figura 2:. Preparação do gradiente de densidade Todos os procedimentos são realizados sob condições estéreis. O SIP é preparado por mistura de 15,3 ml de solução de partículas de sílica revestidas com 1,7 mL de 10 x PBS. A 5 ml de SIP são misturados com 15 ml de PBS para fazer uma solução SIP 20 ml de 25%. 10 ml de SIP são misturados com 10 ml de PBS para fazer uma solução SIP 20 ml de 50%. Um tubo de centrífuga contendo a solução de 50% de SIP (20 ml) é inclinada e a solução SIP 25% (20 ml) é adicionado lentamente, utilizando uma pipeta serológica 25 ml. <ol><li> Continue com as seguintes etapas (seção 2., 3. e 5.) sob condições estéreis e manter as células em gelo ou a 4 ° C. Prepara-se o SIP (Solução isotónica de partículas de sílica revestidas) por mistura de 15,3 ml de solução de partículas de sílica revestidas com 1,7 mL de 10 x PBS. </li&gt; <li> Para fazer 20 ml de solução SIP 25%, mistura 5 ml de SIP com 15 ml de PBS. Para fazer 20 ml de solução SIP 50%, mistura de 10 ml de SIP com 10 ml de PBS. </li><li> Encher um tubo de centrífuga com 20 ml de solução a 50% de SIP. Inclinar o tubo de centrifugação com um ângulo próximo de 90 ° e adiciona-se lentamente a solução SIP 25% (20 ml) na parede lateral do tubo utilizando uma pipeta de 25 ml serológico, sem tocar na superfície da camada de SIP 50%. Quando a adição da solução SIP 25%, reduzir progressivamente o ângulo do tubo. Manter o gradiente de densidade em gelo até à utilização. </li></ol> 3. Purificação de Kupffer celular (Figura 3) <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig3.jpg" /> Figura 3:. Purificação de Kupfer células por centrifugação em gradiente de densidade e adesão celular Todos os procedimentos são realizados sob condições estéreis. (A) após a ruptura da cápsula de Glisson, células do fígado são filtrados através de um 100 mm filtro. A suspensão é centrifugada a 50 x g para descartar hepatócitos (granulados) e recolher a fracção de células não-parenquimatosas (sobrenadante). Este passo é repetido três vezes. As células não-parenquimatosas são adicionadas no topo de um gradiente descontínuo isotónica e centrifugado a 800 xg durante 15 min. Células de Kupffer recolhidos a partir da almofada SIP 25% são purificados adicionalmente por selecção de adesão celular. (B) As células foram semeadas em placa de 24 poços e incubou-se a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 30 min. As células não aderentes são lavadas uma vez com 500 ul de HBSS. Células de Kupffer exibir a sua morfologia aderente 4 h após o plaqueamento, quando -CNTs f pode ser adicionado às células. A barra de escala representa 25 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52989/52989fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Coloque um fígado perfundido em uma placa de Petri com 15 ml de Kupffer isolamento celular Médio. A ruptura da cápsula de Glisson (membrana do fígado), utilizando tesouras e libertar todas as células do fígado para o meio de isolamento de células de Kupffer. Filtrar a solução através de uma filtro de células 100 um a ser coletado em um tubo de centrífuga. Repita o procedimento de perfusão em fígados perfundidos adicionais e reunir as células no mesmo tubo de centrífuga (15 ml de um rato, até 45 ml de três ratos). </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 50 xg durante 2 min a 4 ° C. Células parenquimatosas (hepatócitos) será no sedimento e células não-parenquimatosas (incluindo células de Kupffer) será no sobrenadante. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante num tubo de centrífuga limpo e centrifuga-se a 50 x g durante 2 minutos cada. Repita este passo três vezes mais. </li><li> Centrifugar a 1.350 xg durante 15 min para sedimentar as células não-parenquimatosas. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de isolamento de células de Kupffer Médio. </li><li> Adicionar a solução de células não-parenquimatosas sobre o gradiente descontínuo isotónica 25/50%, tal como descrito em 2.3. Centavorifuge a 850 g durante 15 min sem aceleração ou pausa. </li><li> Localizar a fracção de célula de Kupffer enriquecido turvas na fracção SIP 25% nas proximidades da interface de SIP 25/50% (Figura 3). Utilizando uma pipeta de 10 mL serológico, aspirado de cerca de 12 ml da fracção de células enriquecida de Kupffer. Transferência de células para um tubo de centrífuga contendo 35-40 ml de isolamento de células de Kupffer meio. Misturar suavemente e centrifugar a 1350 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar as células. </li><li> Descarte as células sobrenadante e ressuspender em 5-10 ml de pré-aquecido celular Kupffer Meio de Cultura. Contagem de células (hemocitï¿½etro) e medir a viabilidade utilizando a coloração azul de tripano. </li><li> Placa as células não-parenquimatosas purificados em placas de 24 poços a uma densidade de 5 x 10 5 células / poço. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 (Figura 3). Após 30 min, remover suavemente o meio, lava-se com pré-aquecido Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS), em seguida, uma vez substituircom 500 ul de fresco e pré-aqueceu-se Meio de Cultura celular de Kupffer (por poço). </li><li> Deixar as células de Kupffer durante pelo menos 4 horas a 37 ° C e 5% de CO 2 antes do tratamento com nanopartículas, para permitir que eles adquirem a sua morfologia aderente. </li></ol> 4. Caracterização <ol><li> As células Kupffer Pureza <ol><li> Preparar a solução de PBS / BSA fresca utilizada para manter a viabilidade das células de Kupffer. Lave as células uma vez com 500 ul de solução de PBS / BSA. Remover a solução de PBS / BSA e separar as células de Kupffer em 500 uL de solução de PBS / BSA fresco utilizando raspagem suave. Quando as células são plaqueadas em placas de 24 poços, encurtam as extremidades de lâminas de raspagem com uma tesoura para fazer a separação mais fácil de prosseguir. Transferência de células em tubos de citometria de fluxo. </li><li> Contagem de células de Kupffer, utilizando um hemocitómetro e centrifuga-se 1 x 10 5 células a 1350 x g. Ressuspender as células de Kupffer em 30 ul de F4 / 80 anticorpo (puro). Misturar bem e incubar à temperatura ambiente durante 30 min. Manter as células não coradas (não incubadas com o anticorpo) em gelo. </li><li> Adicionar 2 ml de solução de PBS / BSA em células coradas, centrifugar a 1350 g durante 5 min e desprezar o sobrenadante resultante. Ressuspender as células coradas em 200 ul de PBS / BSA. </li><li> Para análise de citometria de fluxo, porta 10.000 unstained células de Kupffer acordo com seu tamanho (dispersão para a frente) e granularidade (dispersão lateral). Analisar fluorescência de células fechadas na FL-1 canal. </li><li> Repita o procedimento para as células de Kupffer manchadas mantendo as mesmas configurações utilizadas para a análise de citometria de fluxo de células de Kupffer não coradas. Escolher e quantificar a fluorescência de células coradas para avaliar a pureza de célula de Kupffer. </li></ol></li><li> Kupffer células fagocíticas Atividade <ol><li> Substituir meios com 0,5% (v / v) de partículas fluorescentes de Kupffer em meio de cultura celular e incubar durante 4 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> A fim de remover os grânulos não-internalizados, centrifugar as células de Kupffer em 1350 xg, diScard o sobrenadante e ressuspender as células em 500 ul de PBS / BSA. Repita este passo mais 2 vezes. </li><li> Raspe células de Kupffer em 500 ul de células e de transferência de solução de PBS / BSA para um tubo de citometria de fluxo. </li><li> Centrifugar as células de Kupffer em 1350 xg, descartar as células sobrenadante e ressuspender em 200 ul de PBS / BSA. </li><li> Para análise de citometria de fluxo, porta 10.000 unstained células de Kupffer acordo com seu tamanho (dispersão para a frente) e granularidade (dispersão lateral). Analisar fluorescência de células fechadas na FL-2 canais. </li></ol></li></ol> 5. Incubação de Quimicamente nanotubos de carbono funcionalizados (f -CNTs) <ol><li> Prepara-se uma dispersão de -CNTs f (1 mg / ml) em água por sonicação durante 15 min antes da utilização. -CNTs F são preparados em casa 22. </li><li> Prepare 2x CNTs concentrados f- dispersão em Kupffer meio de cultura celular. CNT f- sonicate dispersos em meio para2 min antes de prosseguir com o passo 5.3). </li><li> Para cada bem, substituir 250 ï¿½ de meio de idade com 250 ul de 2x dispersão -CNTs f. Poços não tratados (250 ul de meio condicionado + 250 ul de células de Kupffer fresco meio de cultura) e os poços tratados com 10% de DMSO são utilizados como controlo negativo e positivo, respectivamente. </li><li> Incubar as células de Kupffer a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 ou 72 h. </li></ol> 6. Avaliação da Toxicidade -CNTs f em células de Kupffer pela lactato desidrogenase (LDH) Ensaio de modificação <ol><li> Desprezar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 200 uL (por poço da placa de 24 poços) de tampão de lise e incubar a 37 ° C durante 30 min-1 h. </li><li> Após a realização de pipetagem vigorosa, recolher lisadas células de Kupffer em tubos de microcentrifugação e centrifugar a 40000 xg durante 10 min para sedimentar -CNTs f que foram absorvidos pelas células e os restos celulares. </li><li> Recolher os sobrenadantes (ƒ-CNT livre) emmicrotubos e armazenar a -20 ° C ou vá para o passo 6.5). </li><li> Transferir 50 ul numa placa de 96 cavidades e adicionar um volume igual da solução de mistura de substrato (kit de LDH) a cada poço. Cobrir a placa e incubar a temperatura ambiente durante 15 min antes da adição de 50 ul da solução de paragem (kit de LDH). Adicionar triplicados de poços em branco, contendo 50 ul de tampão de lise, 50 ul de solução de mistura de substrato e 50 ul de solução de paragem. </li><li> Ler a absorvância a 490 nm num leitor de microplacas e utilizar a seguinte fórmula para calcular a (%) de viabilidade celular. </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989eq1.JPG" />

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Os passos seguintes são fundamentais para alcançar alta produtividade e alta viabilidade das células de Kupffer. Condições assépticas devem ser usadas para limitar o risco de contaminação bacteriana e fúngica. Todos os instrumentos devem ser esterilizados antes da utilização. Os reagentes devem ser preparadas antes de realizar o procedimento de isolamento. A escolha de colagenase IV, com baixa atividade tríptico, é crucial. Lotes diferentes do mesmo fornecedor tem actividade enzimática diferente e podem ter de ser comparado inicialmente para seleccionar o lote mais adequada para o isolamento de células de Kupffer. Isto pode ser julgado por avaliar rendimento das células e viabilidade celular. Também é recomendável entrar em contato com o fornecedor para fornecer lotes que foram utilizados para aplicações similares. Uma vez decidido sobre o lote a ser utilizado, reservá-lo para uso futuro. O procedimento de punção requer treinamento. Plano do uso de vários animais para se tornar confiante com a veia portaprocedimento de punção. Com a prática, a canulação sucesso será conseguido facilmente eo procedimento pode ser manuseada por uma pessoa. Note-se que o uso de animais pesados ​​aumenta o diâmetro da veia porta e, por conseguinte, facilita o processo. Quando a parede de trás da veia porta é perfurado, é tecnicamente difícil de acessar a veia novamente, especialmente se você é novo com este procedimento e, por conseguinte, é preferível começar com um novo animal. As soluções HBSS e colagenase deve ter o seu pH ajustado para 7,4 e ser pré-aquecido a 40 ° C para atingir uma temperatura de saída a partir da bomba peristáltica de 37 ° C. A perfusão com EGTA / solução de HBSS (Ca 2+ e Mg 2+ livre) é necessária contendo EGTA para o rompimento de Ca2 + dependentes de moléculas de adesão, desmossoma nomeado, o enfraquecimento da interacção célula-célula. Colagenase de tipo IV é usado para separar as células do fígado a partir da matriz extracelular e assim levar a fígadodissociação de células. O tempo de perfusão para as duas soluções não deve exceder 15 min para ratinhos CD1, mas outras estirpes, tais como C57BL / 6, exigem ligeiramente mais longo do tempo de digestão de fígado. Para conseguir um isolamento bem sucedido, é necessário para se obter um rendimento elevado e viabilidade celular. Se o pesquisador não tem nenhuma experiência em isolamento das células do fígado, é aconselhável combinar pelotas hepatócitos desde os primeiros três centrifugações a 50 xg e contagem de células por ensaio de exclusão de azul de tripano. O rendimento de hepatócitos deve ser&gt; 20 x 10 6 células e a viabilidade dos hepatócitos&gt; 50%. Rendimentos baixos resultam fundamentalmente de pobres dissociação celular levando indiretamente a baixar rendimento das células Kupffer. Deve ser confirmado que o fígado é adequadamente digerido no final do passo de perfusão. Quando o rendimento dos hepatócitos adequado é alcançado em combinação com baixa viabilidade dos hepatócitos, isso pode resultar de uma digestão com colagenase excessivo, mas é mais provável explicada por um fígado inadequadoprocedimento de perfusão ou o uso de um reagente / materiais contaminados. Após o plaqueamento, as células de Kupffer são sensíveis e deve ser lavado suavemente. Pelo menos 4 h são necessários para células de Kupffer para adquirir sua morfologia aderente. O tratamento é geralmente realizada a 4-24 horas após o plaqueamento, as células de Kupffer mostram a sua actividade fagocítica máximo dentro de 1 dia após o plaqueamento. No nosso protocolo, descreve-se a dissociação de células de fígado de ratinho CD1, seguida por purificação de células de Kupffer por centrifugação de gradiente de densidade e selecção por adesão. A caracterização de células de Kupffer, por citometria de fluxo, que demonstra rendimento e pureza elevados de células de Kupffer pode ser conseguida utilizando este método. Este método de isolamento de células de Kupffer representa um compromisso útil entre a complexidade e o rendimento da célula. No entanto, foi relatado que certos métodos de célula de Kupffer pode ser mais fácil de realizar, tais como o protocolo descrito porWu et ai., Onde o fígado é digerido ex vivo 23. No entanto, o método descrito por Wu et ai. leva a uma quantidade limitada de células e grau de pureza inferior célula. Maior rendimento e a pureza pode ser obtido, mas requer equipamento caro e / ou sofisticado e pode ser demorado. O protocolo original desenvolvido por Smedsrød et al., 16 utilizado um protocolo comparável com base no método de perfusão de 2 passos (HBSS + digestão com colagenase) seguido por centrifugação em gradiente de Percoll e selecção da almofada inferior de Percoll para a purificação adicional por adesão superficial. Ao modificar o procedimento de centrifugação e recolher a almofada Percoll superior, que aumentou a fracção de célula de Kupffer enriquecido a partir de 5,25 x 10 6-8,2 x 10 6 culas por grama de fígado. Esta melhoria pode ser atribuída ao uso de EGTA durante a etapa de início da perfusão, a fim de facilitar a dissociação de células de fígado. Mlém disso, o uso de análise de citometria de fluxo permitiu a caracterização quantitativa fiável de Kupffer pureza de células e a actividade fagocitária. Com um rendimento máximo de 14 x 10 6 purificadas células não parenquimatosas do fígado por ratinho. O presente método de isolamento de alcançar maior quantidade de células de Kupffer do fígado por ratinho para o que tem sido relatado na literatura 24. Esta melhoria pode ser explicado pela utilização de rato mais pesado (35-45 g), em comparação com outros métodos 24. Ao lado deste aumento no rendimento celular, a utilização de animais maiores facilita notavelmente o procedimento de canulação da veia porta. De alta capacidade de ensaio in vitro pode ser realizada utilizando este modelo fagocítica primário, portanto, que imita o impacto toxicológico in vivo de nanopartículas. A compreensão global do nanotoxicology poderiam se beneficiar de tais modelos, tornando a seleção de nanopartículas para a tradução clínica mais eficiente. Além disso, está em consonância comimplementação do conceito de 3R (redução, refinamento e substituição) na pesquisa biomédica animal.

O campo da pesquisa nanotoxicology tem como objetivo caracterizar o efeito biológico das nanopartículas. Estudos toxicológicos in vivo com base em investigações continuam a ser os métodos mais precisos. No entanto, seu uso é limitado pelo seu custo, trabalho e requisitos de tempo um. Como alternativas, em ensaios in vitro têm sido utilizados por causa da sua simplicidade e da possibilidade de desenvolvimento de alto rendimento em plataformas de ensaios in vitro, 2 - estendendo-se assim o número de condições testadas. A maioria dos estudos nanotoxicological são realizados utilizando ensaios in vitro com linhas de células imortalizadas. Contudo, existem preocupações em relação à extrapolação destes resultados experimentais in vivo para efeitos toxicológicos 3. Na verdade, as propriedades das linhas celulares imortalizadas pode ser significativamente diferentes dos tecidos que foram derivados a partir de, por exemplo, transformação genética 4, deterioração das características morfológicas principais5, perda da polaridade celular 6 e alterações funcionais, tais como a regulação de mediadores inflamatórios 7. Células de Kupffer são a população de macrófagos mais abundante no corpo e estão em contacto directo com o sangue, forrando a parede de sinusóides do fígado. Como parte do sistema reticulo-endotelial (RES), estes macrófagos são responsáveis ​​para a captura de nanopartículas de circulação e, por conseguinte, constituir um modelo altamente adequado para estudar a toxicidade de nanopartículas. In vivo 8 9 e in vitro estudos de respostas inflamatórias associadas com as células de Kupffer expostos a nanopartículas ter sido publicado anteriormente. Células de Kupffer também foram envolvidos na patogênese de doenças do fígado, como a doença hepática alcoólica 10, 11 fibrose hepática ou hepatite viral 12. Foi relatado que células de Kupffer isolado fornecer indicações úteis para descrever os mecanismos celulares involved em perturbações do fígado 13,14. Vários métodos têm sido relatados para isolar e purificar as células de Kupffer. Isolamento das células pode resultar de dissociação mecânica ou enzimática 15. Digestão de colagenase mostra a vantagem de conservar a integridade funcional das células de Kupffer, enquanto conduzindo a elevada produção de células de Kupffer 16. Muitas abordagens experimentais, que variam em complexidade e custos, foram usados ​​para separar células de Kupffer de outras populações de células de fígado. Por exemplo, células de Kupffer pureza pode ser conseguida por imunoafinidade 17, electroforese de fluxo 18, 16 a adesão selectiva ou por técnicas de centrífugas 16, que seleccionam as células de acordo com o seu tamanho e densidade. Uma combinação destes métodos podem ser escolhidos para aumentar a pureza da população 16. Não há consenso sobre o método ideal para o isolamento de células Kupffer, uma vez que na maior parte depende das aplicações e equipmen disponíveist. No entanto, no caso dos ensaios de toxicidade de nanopartículas, a simplicidade e elevado rendimento da técnica associada com a preservação funcional das células de Kupffer parecia ser mais adequado para esta aplicação. O método de isolamento de células de Kupffer relatado aqui baseia-se num método de perfusão 2-passo, seguido por purificação em gradiente de densidade. O método foi modificado a partir do protocolo original desenvolvido por Smedsrød et al. 16 concebido para o isolamento de células de fígado de rato. A maioria dos estudos relatados e descrito o isolamento de células de Kupffer do fígado de ratos. Aqui, nós descrevemos um método para isolar as células de Kupffer do fígado de rato, com um rendimento elevado e pureza. A utilização de ratinhos reduz o custo experimento e permite o processamento de vários fígados para obter grandes quantidades de células de Kupffer para testes de toxicidade de nanopartículas. No protocolo seguinte, as células de Kupffer foram incubadas com os nanotubos de carbono funcionalizadas (f </em&gt; -CNTs). As propriedades físico-químicas únicas de nanotubos de carbono - ou seja, alta proporção de comprimento para diâmetro e grande área superficial, fez CNT candidatos interessantes como vectores para fins de terapia e de diagnóstico. No entanto, têm surgido preocupações quanto à toxicidade dos nanotubos de carbono 19, e o desenvolvimento de novos ensaios in vitro destina-se a aumentar a compreensão das CNT efeito biológico. Toxicidade em células de Kupffer é associada com uma falta de integridade estrutural da membrana celular. Isto é medido pela perda da enzima LDH do citoplasma da célula para o sobrenadante. O princípio deste método é, portanto, para remover qualquer LDH libertada e medir o que é deixado nas células 20. Isto é feito, de preferência a medição do LDH libertado no sobrenadante, pois a presença de nanotubos de carbono no sobrenadante interfere com o ensaio de 21. Propomos o uso deste eficaz meto Kupffer isolamento de células simples e de custod para isolar elevado número de células de Kupffer funcionais. Isto permite o rastreio de toxicidade de uma grande variedade de nanopartículas, num modelo relevante macrófagos primários.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td dir="LTR">Euthatal (pentobarbital sodium)</td>
			<td dir="LTR">Merial</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">CD1 mice</td>
			<td dir="LTR">Charles River&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">-</td>
			<td dir="LTR">Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate)&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">14175-053</td>
			<td dir="LTR">HBSS must be&#160; Ca2+ free.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt&#160;</td>
			<td dir="LTR">Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">E8145&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">HEPES (1M)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">15630-056&#160;</td>
			<td dir="LTR">100 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Collagenase type IV&#160;</td>
			<td dir="LTR">Worthington&#160;</td>
			<td dir="LTR">CSL-4&#160;</td>
			<td dir="LTR">It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">&#160;Low glucose DMEM&#160;</td>
			<td dir="LTR">Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">D5523&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax&#174;)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">12633-012&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Penicillin/Steptomycin&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">15140-122</td>
			<td dir="LTR">100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td dir="LTR">First-Link&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">60-00-850&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Trypan blue solution&#160;</td>
			<td dir="LTR">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR">T8154&#160;</td>
			<td dir="LTR">100 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Coated silica particle solution (Percoll&#174;)</td>
			<td dir="LTR">GE Healtcare&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">17-0891-02&#160;</td>
			<td dir="LTR">Percoll&#174; is very stable and can be kept for several years&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">1x Phosphate Buffered Saline&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">10010-023</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">10x Phosphate Buffered Saline&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">70011-036</td>
			<td dir="LTR">500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td dir="LTR">Fisher&#160;</td>
			<td dir="LTR">D/4120/PB08&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">LDH kit (CytoTox 96&#174;)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Promega&#160;</td>
			<td dir="LTR">G1781&#160;</td>
			<td dir="LTR">Keep protected from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">DMEM phenol red free</td>
			<td dir="LTR">Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">31053-028&#160;</td>
			<td dir="LTR">500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">F4/80 antibody (Alexa 488)</td>
			<td dir="LTR">AbD Serotec</td>
			<td dir="LTR">MCA497A488</td>
			<td dir="LTR">Do not dilute, used neat for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Fluorescent beads</td>
			<td dir="LTR">Sigma</td>
			<td dir="LTR">L2778</td>
			<td dir="LTR">Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of the Material</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog number&#160;</td>
			<td>Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing)&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">BD&#160;</td>
			<td dir="LTR">367288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Syringe Filters (0.22 &#956;m Blue Rim)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Minisart&#160;</td>
			<td dir="LTR">16534-K&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap)&#160;</td>
			<td dir="LTR">BD Biosciences, Falcon&#160;</td>
			<td dir="LTR">35 2070&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Petri dish (90 x 15 mm)&#160;</td>
			<td dir="LTR">Thermo Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">BSN 101VR20&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">100 &#956;m cell strainer&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">BD&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Peristaltic pump&#160;</td>
			<td dir="LTR">Watson Marlow&#160;</td>
			<td dir="LTR">SciQ 300&#160;&#160;</td>
			<td>Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">24-well plates</td>
			<td dir="LTR">Corning&#160;&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">96-well plates&#160;</td>
			<td dir="LTR">Corning&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Plate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Serrefine forceps</td>
			<td>Hammacher GmbH&#160;</td>
			<td>Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051</td>
			<td>The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Flow cytometry tubes</td>
			<td>BD Biosciences, Falcon&#160;</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Elkay</td>
			<td>&#160; 000-MICR-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Cell scraper</td>
			<td>BD Biosciences, Falcon</td>
			<td>353086</td>
			<td>Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Name of the Reagent</td>
			<td dir="LTR">Company&#160;</td>
			<td dir="LTR">Catalog number&#160;</td>
			<td dir="LTR">Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">&#160;EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank&#39;s Balanced Salt Solution) Solution&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Collagenase Solution&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Kupffer Cell Isolation Medium&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax&#174; (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Kupffer Cell Culture Medium&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax&#174; (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">SIP (solution of isotonic coated silica particles)</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline&#160; with 15.3 ml of Percoll&#174; to obtain 17mL of SIP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">25% SIP solution&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">50% SIP solution&#160;</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td></td>
			<td dir="LTR">Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">Lysis Buffer</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR">DMEM media with 0.9% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR">PBS/BSA Solution</td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td></td>
			<td dir="LTR">Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
			<td dir="LTR"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kupffer cell isolation for nanoparticle toxicity testing

A grande maioria dos estudos in vitro nanotoxicological usaram linhas celulares imortalizadas para a sua viabilidade. No entanto, os resultados de testes de toxicidade de nanopartículas em linhas de células imortalizadas ou células primárias têm mostrado discrepâncias, destacando a necessidade de estender o uso de pilhas para ensaios in vitro. Este protocolo descreve o isolamento de macrófagos de fígado de rato, células de Kupffer nomeados, e a sua utilização para estudar a toxicidade das nanopartículas. Células de Kupffer são a população de macrófagos mais abundante no corpo e fazem parte do sistema retículo endotelial (RES), responsável pela captura de nanopartículas de circulação. O método de isolamento de células de Kupffer relatado aqui baseia-se num método de perfusão 2-passo, seguido por purificação em gradiente de densidade. O método, baseado na digestão com colagenase e centrifugação de densidade, é uma adaptação do protocolo original desenvolvido por Smedsrød et ai. projetado para rato isolatio células do fígadon e proporciona um rendimento elevado (até 14 x 10 6 culas por ratinho) e de alta pureza (&gt; 95%) das células de Kupffer. Este método de isolamento não requer equipamento sofisticado e caro e, por conseguinte, representa um compromisso ideal entre a complexidade e de rendimento celular. A utilização de ratos mais pesados ​​(35-45 g) melhora o rendimento do método de isolamento, mas também facilita notavelmente o procedimento de canulação da veia porta. A toxicidade de nanotubos de carbono funcionalizadas f -CNTs foi medido neste modelo pelo ensaio de LDH modificado. Este método avalia a viabilidade das células medindo a falta de integridade estrutural da membrana da célula de Kupffer, após incubação com -CNTs f. Toxicidade induzida pelo -CNTs f pode ser medido de forma consistente com este ensaio, destacando que as células de Kupffer isoladas são úteis para testes de toxicidade das nanopartículas. A compreensão global do nanotoxicology poderiam se beneficiar de tais modelos, tornando a seleção de nanopartículas para tradução clínica mais eficient.

O número de células não-parenquimatosas purificadas foi consistente e variou entre 8 e 14 x 10 6 culas por rato (17 isolamentos foram realizadas). Cada isolamento do mouse foi suficiente para a chapa 16-28 poços. A viabilidade das células por coloração com azul de tripano demonstrou a viabilidade das células ~ 95%. Células de Kupffer mostrou uma forma redonda dentro de 30 min de incubação a 37 ° C, relacionada com a sua morfologia aderente incompleta (Figura 4A). Às 4 horas de incubação e, posteriormente, as células foram espalhadas e aglomerados de células começaram a se formar. Células de Kupffer foram então caracterizados para confirmar sua pureza e atividade fagocítica. As células foram coradas com F4 / 80 anticorpo para demonstrar a pureza célula de Kupffer. A citometria de fluxo mostrou a análise de Kupffer pureza acima de 95% de células (Figura 4B). As células foram incubadas com 1 mm partículas fluorescentes, 12 horas após o plaqueamento, para confirmar a sua capacidade para assumir as partículas grandes. A citometria de fluxo análise mostrou that mais de 85% das células de Kupffer são fagocitária, ou seja, pode tomar-se os grânulos de 1 uM (Figura 4C). Após 72 horas de cultura, 40% das células de Kupffer foram phagocytic, indicando que células de Kupffer perdido parcialmente sua atividade fagocitária. Microscopia de imagem das células incubadas com Kupffer -CNTs F durante 24 e 72 horas revelaram a morfologia celular de forma semelhante às células naive (Figura 5A). Células de Kupffer incubadas com 10% de DMSO (controlo positivo) exibido morfologia necrótica (Figura 5A). Após a análise do ensaio de LDH modificado, células de Kupffer tratada com 10% de DMSO (controlo positivo) durante 24 e 72 horas apresentaram elevada toxicidade (Figura 5B). Em comparação, -CNTs f induzida ligeira mas significativa redução na viabilidade das células apenas quando as células foram expostas a 50 ng / ml, durante 72 h (Figura 5B). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig4.jpg" /> Figura 4: Pureza e absorção Capacidades de células de Kupffer (A) As imagens microscópicas de células de Kupffer plaqueadas após 30 min ou 24 h a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO 2.. A barra de escala apresenta 50 um. (B) a análise de citometria de fluxo de células de Kupffer foi realizada seguindo FSC / SSC gating células. Kupffer pureza de células foi determinada utilizando F4 / 80 e coloração com anticorpo mostrou ser superior a 95%. Células (C) de Kupffer foram incubadas durante 4 horas na presença de 1 uM esferas fluorescentes para avaliar a sua actividade fagocitária. As propriedades funcionais de Kupffer foram mantidas melhor em células isoladas de fresco (12 h após o plaqueamento) em comparação com células testadas após 3 dias. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig5.jpg" /> Figura 5: A absorção e toxicidade de &lt;em&gt; CNT f- em células de Kupffer. (A) As imagens microscópicas de células de Kupffer. Imagens mostram as células de Kupffer tratadas com DMSO a 10% e 50 ug / ml de f -CNTs a 37 ° C durante 24 e 72 h. A barra de escala apresenta 50 um. (B) ensaio LDH Modificada. Viabilidade celular de baixo foi visto em 10% de DMSO células tratadas (controles positivos), enquanto -CNTs f afetadas significativamente a viabilidade celular apenas após exposição a 50 ug / ml durante 72 horas. * P &lt;0,05 em relação à condição ingénuos (excluindo 10% condição DMSO) usando análise de variância (ANOVA unidireccional) com análise post hoc pelo teste de Tukey. A barra de escala corresponde a 50 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52989/52989fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

Kupffer isolamento celular para Nanoparticle Toxicity Testing

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

kupffer-cell-isolation-for-nanoparticle-toxicity-testing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.6K visualizações.  King's College London. Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells. 

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Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Isolamento de células do sistema imunológico funcional cardíaca

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolamento de precursor de células B subconjuntos de Sangue do Cordão Umbilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Células

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

Isolamento, caracterização e exploração funcional da célula de rede gengival Imune

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...