Name: a "patient-like" orthotopic syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma metastasis
Uploaded: 2015-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
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We would like to thank Pascal DuBois for proof-reading the article. The authors would also like to thank the personnel of the Animal Facility at Hunter College of The City University of New York. This work was supported by a NIH RCMI grant to Hunter College.

Declaração de ética Todos os estudos com animais foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Hunter College of The City University of New York. Nota: Oito ratos BALB / c foram utilizados neste procedimento experimental. Cinco ratinhos BALB / c foram implantados com 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 carcinoma hepatocelular células de rato para produzir os tumores primários. Três ratinhos BALB / c sem implantes foram usadas como controlos. BNL A.7R.1 1ME é uma linha celular de carcinoma hepatocelular murino que foi derivada através de transformação química a partir da linha celular de hepatócitos não tumorigénico murino BNL CL.2. BNL 1ME A.7R.1 foi obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC). 1. Pré-cirurgia <ol><li> Certifique-se de que os ratos para todas as cirurgias de sobrevivência são saudáveis. Para assegurar que os ratos são saudáveis, inspeccionar sinais de desidratação por tenting da pele. Não utilize ratos com qualquer evidência de doença ou distress nestas experiências. </li><li> Pesar ratos para garantir que eles não estão abaixo do peso. Assegure-se que o peso é, pelo menos, 16-20 gramas. </li><li> Prepare 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 células do rato HCC para a implantação per mouse: <ol><li> Aspirar media de 10 ml de 60% - 70% de cultura de células confluentes prato de células HCC A.7R.1 rato BNL 1ME. Lavar duas vezes com 5 ml de PBS. Adicionar 2 ml de tripsina para o prato e incubar a 37 ° C numa incubadora humidificada com ar e 5% de CO 2 durante 5 min. </li><li> Subsequentemente, pipeta de 10 uL de células tripsinizadas em um hemocitómetro manual para contagem de células sob um microscópio com uma ampliação de 10X. Contar o número total de células encontradas nas quatro grandes quadrados de canto e multiplicar pelo factor de diluição pelo número total de células. Em seguida, divida pelo número de quadrados contados e multiplicar por 10 6 para a concentração de células (células por ml). </li><li> Usando o cálculo, coletar 5 milhões de células por rato em estéril1,5 ml tubos de microcentrífuga. Rotular 1,5 ml microtubos. </li></ol></li><li> Ressuspender as 5 x 10 6 células BNL 1ME A.7R.1 rato HCC em 100 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Mantenha estas células em gelo até a implantação em cirurgia. </li><li> Executar as atividades necessárias para a preparação de ratos para a cirurgia, tais como a indução da anestesia e cabelo recorte longe de equipamentos e materiais esterilizados para evitar a contaminação. </li><li> Induzir a anestesia geral em ratos por inalação de isoflurano utilizando um vaporizador de isoflurano, juntamente com oxigénio a uma taxa de fluxo constante de 1 concentração L por min (aprox. 2,1%). Nota: O sistema é auto-suficiente, e inclui um vaporizador de precisão, um suprimento de oxigênio e um botijão de carvão que está ligado a um circuito de respiração necessária para o gás / anestésico limpeza. </li><li> Certifique-se de que a anestesia é adequada para impedir o animal de sofrer dor durante a cirurgia. Execute-toe pitada e observar animais para não-responsiveness para confirmar a anestesia. </li><li> Naquele tempo, mudar a linha de válvula, vedação à caixa e aberto ao cone do nariz. </li><li> Assim que o rato é anestesiado, aplicar uma pequena quantidade de uma pomada oftálmica para as córneas como uma medida preventiva a secagem e danos. </li><li> Subsequentemente, o animal se mover para a área de preparação, com o cone do nariz adequadamente colocado e ligado (para a manutenção da anestesia). Prepare o local da incisão cirúrgica para a cirurgia por depilação a esta área de preparação. </li><li> Certifique-se de que a área de cirurgia é em um local livre de todas as outras atividades. </li><li> Certifique-se de que a superfície de trabalho é resistente e adequadamente higienizado, unsoiled e antes da cirurgia livre de desordem. Coloque um pedaço estéril de linho ou bandeja cirúrgica sobre ele. </li><li> Certifique-se de que o campo operatório está disponível apenas para pessoas que exercem a cirurgia. Certifique-se de que a sala cirúrgica é limpo e varreu com um limpador adequado e aspergidos com um disinfe apropriadoctant. </li><li> Assegure-se que também é posicionada afastada da portas e janelas, como correntes de ar podem espalhar pó levando à contaminação do sítio. </li><li> Realizar a cirurgia sobrevivência com instrumentos esterilizados. Ou mergulhar instrumentos num desinfectante de acordo com a recomendação do fabricante ou autoclave. Use suprimentos básicos que são estéreis pronto para uso. </li><li> Instrumentos distintos de acordo com a função de ajudar a prevenir a contaminação de áreas estéreis. </li><li> Raspar aproximadamente 1 polegada em torno do local da incisão (incisão na linha média) para aceder ao fígado do animal. Remover o cabelo a partir do animal para longe do local da cirurgia. </li><li> Após a depilação, esfregue a área com um desinfetante e sabão (betadine cirúrgica matagal) e lavar o excesso com uma solução desinfetante de distância PBS estéril. Realizar isso várias vezes, com todo o processo de esfoliação com duração de aproximadamente 5 min. Remover e descartado as luvas utilizadas. </li><li> Depois, mude para roupas protetoras como Surgical vestido, top matagal, e máscara facial. Em seguida, higienizar as mãos com esfoliação solução adequada antes de colocar luvas cirúrgicas. Nota: Este é um passo necessário para evitar derramamento e contaminar o local da cirurgia com potenciais contaminantes. </li></ol> 2. Cirurgia <ol><li> Fornecer uma fonte externa de calor para o calor durante todo o período da anestesia. O animal pode experimentar alguns hipotermia porque anestesia provoca distúrbios da termorregulação; portanto, manter a temperatura do corpo. </li><li> Coloque o mouse sobre as suas costas durante toda a cirurgia. </li><li> Corrigir os membros dianteiros, membros posteriores e cauda do mouse na tabela de cirurgia com pedaços de fitas cirúrgicas. </li><li> Faça uma linha reta incisão imediatamente inferior ao xyphisternum. </li><li> Usar um afastador cirúrgico auto-retenção estéril para expor o fígado. </li><li> Com uma seringa com uma agulha de 20G, lentamente e cuidadosamente, injectar 100 ul de PBS contendo 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1células de rato HCC no lobo direito do fígado. </li><li> Após a remoção da agulha, aplicar um cotonete esterilizado durante pelo menos 1 min para parar qualquer sangramento potencial devido à alta vascularização do fígado. </li><li> Feche o tecido subcutâneo com uma sutura absorvível seguido de fechamento da pele usando grampos cirúrgicos. Posteriormente, limpar a ferida mais uma vez com betadine matagal. Nota: Isso irá garantir o fechamento da ferida cirúrgica. </li><li> Subcutaneamente dar 100 ul de solução salina normal. </li></ol> 3. Pós-cirurgia <ol><li> Imediatamente após a cirurgia, transferir o mouse para uma gaiola limpa com um cartão de identificação pós-cirurgia para notificar cuidadores da condição mouse. Fornecer alimentos e água. Nota: Em nossa experiência, um rato que acaba de passar por cirurgia se sairá melhor se alojado sozinho com o alimento úmido e água para o período inicial de 24 horas pós-cirurgia. </li><li> Manter o animal aquecido com uma lâmpada de calor que gera calor, não ultrapassando 38 ºC. vcif um termômetro para medir a temperatura até que o mouse está totalmente recuperado. </li><li> Casa do animal em uma gaiola de preferência com roupa de cama de papel para garantir conforto. </li><li> Após a recuperação inicial, monitorar o animal para sinais de desconforto, sangramento, dor e angústia. Dê buprenorfina (0,05 -0,1 mg / kg) para aliviar a dor. Estreitamente monitorizar a actividade, comportamento e aparência, assim como água e o consumo de alimentos durante cerca de 2 horas. Se ambulatorial, mover o animal de volta para a área de habitação periódica normal dos ratos e continuar a acompanhar em intervalos de 6-12 h para 24 horas pós-cirurgia. Executar uma verificação de peso se o desejar. </li><li> No entanto, se o animal está tendo problemas de recuperação, tomar medidas de cuidados de suporte apropriados. Se os ratos são incapazes de recuperar, humanamente euthanize camundongos através de asfixia com CO2 e deslocamento cervical. Siga as orientações institucionais aprovados para a eutanásia. </li><li> Pós-cirurgia, verifique se há evidência clínica de HCC que normalmente é observable redução tão significativa no escore de condição corporal. Nota: Neste ponto, um tumor primário tem provavelmente desenvolvido no fígado e depósitos metastáticos têm probabilidade desenvolvidas nos pulmões. </li><li> Neste ponto, sacrificar todos os ratos (experimental e controle) envolvidos no experimento por eutanásia humanitária. Sujeitar os ratinhos para o dióxido de carbono asfixia: libertação muito lenta de dióxido de carbono no interior da câmara ao longo de um período de 5 a 10 minutos. Isto fará com parada respiratória. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Neste artigo, uma descrição detalhada do método é dado que foi relatado recentemente por Ogunwobi e colegas de concretizar a criação de um modelo de camundongo singênico orthotopic de HCC metástase (Figura 2) 3. A taxa de absorção de tumores para este procedimento é geralmente elevada. Nós já observamos uma taxa de take tumor de 100% 3. No entanto, a taxa de absorção pode ser variável dependendo da competência do investigador. Em um experimento recente realizado por um novo aluno de pós-graduação em formação, a taxa de absorção tumor era tão baixa quanto 40%. Embora a maioria das experiências são terminadas em 4 - 6 semanas devido a declinar no escore de condição corporal, acreditamos que a partir da experiência com o implante subcutâneo das mesmas células na mesma ratos que tumores primários pode ser estabelecida por 2 - 3 semanas. Nós geralmente esperar para ver um nódulo tumoral a partir de uma experiência bem sucedida. E embora nós esperamos metástase pulmonar para desenvolver entre 4 - 6 semanas, é conceivque capaz de tumor no fígado pode ocorrer muito mais cedo. Boas técnicas cirúrgicas e condições assépticas são essenciais para o sucesso deste método de cirurgia sobrevivência. Os ratos utilizados para a cirurgia de sobrevivência deve ser saudável. Pesando pré e pós-cirurgia é uma boa prática. Os pesos médios pré-operatórios dos ratos usados ​​no experimento ou mais recente foi de 18 gramas, e no ponto final experimental (63 dias pós implantação cirúrgica) o seu peso médio foi de apenas 22 gramas. Um ganho de apenas 4 gramas de peso durante esse período de tempo é provável porque houve algum declínio no ganho de peso devido a uma doença sistêmica do tumor. Nós teria tido uma avaliação mais objectiva do que teve medimos o peso do mouse uma vez ou duas vezes por semana durante todo o experimento. Isto é recomendado melhores práticas. Tal como resumido na Figura 2, os murganhos devem ser adequadamente anestesiados antes da cirurgia e durante todo o período da cirurgia, para evitar uma dor<html> aflição nd. A área deve ser livre de toda a desordem, e acesso deve ser disponível apenas para aqueles a realização da cirurgia. Tanto a área de cirurgia, bem como os instrumentos utilizados devem todos ser estéril. Um passo vital para o sucesso da implantação, é a preparação das células de rato HCC BNL 1ME A.7R.1 para ser implantado. Durante a preparação, é fundamental para evitar a contaminação da recolha das células de culturas de células confluentes pratos. Estes passos devem ser executados em uma capa de cultura celular sob condições estéreis. Uma contagem de células deve ser também feito para garantir que as células 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 rato HCC foram recolhidos num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril por ratinho que é ressuspenso em 100 ul de solução salina tamponada de fosfato (PBS). Azul corante Trypan também pode ser opcionalmente realizada para confirmar a viabilidade das células. Estas células devem ser mantidos em gelo não mais de 2 horas antes da implantação em fígados de ratos. _content &quot;&gt; A implantação das células cancerosas devem ser manuseados com cuidado devido à natureza delicada do fígado (Figura 2). Durante a injecção das células cancerosas, evitar muito profundo de uma punção que pode resultar em que a agulha passar por todo o fígado . É essencial para injectar as células cancerosas lentamente e cuidadosamente. Por outro lado, demasiado raso um punção com a agulha antes da injecção irá provavelmente provocar derrame das células cancerosas injectadas para dentro da cavidade peritoneal. Além disso, após a remoção da agulha, há sempre um potencial de o órgão de sangramento devido a sua alta vascularização. Portanto, é recomendável a aplicação de uma mecha de algodão estéril, durante pelo menos 1 min. cuidado e atenção vai garantir a maior taxa de sucesso da implantação. O animal também deve ser fornecida uma fonte externa de calor ao longo do processo como hipotermia é uma grande preocupação provocar perturbações de regulação térmica durante a anestesia. pós-cirurgia, o animal deve ser monitorizado paraquaisquer sinais de desconforto ou dor em que deve ser administrado ponto de cuidados adequados. Se o mouse não é capaz de se recuperar da cirurgia, ele deve ser humanamente eutanasiados. Como a metástase do câncer é a principal causa de mortalidade por câncer, é fundamental para delinear os mecanismos de disseminação hematogênica 2-4. Novas células tumorais circulantes foram estabelecidos a partir deste modelo de camundongo singênico orthotopic de HCC metástase 3. Além disso, os CTC derivados deste modelo mostram consistentemente iniciação do tumor e aumentou a capacidade metastática 3. As células tumorais em circulação isolado utilizando este método, pode revelar-se muito importante, pois ajudam a desvendar factores específicos, os marcadores moleculares e possíveis alvos terapêuticos da metástase do cancro 2-4. Esta metodologia já identificados que há um aumento da regulação positiva do factor de crescimento de hepatócitos (HGF) e o seu receptor, c-Met em células tumorais circulantes em comparação comas células de tumor primário de HCC 3. Estes resultados baseiam em trabalhos anteriores demonstrando que um aspecto importante da metástase tumoral é o processo celular epitelial-mesenquimal de transição 2-4,10. Mais de caracterização circulam células tumorais usando este novo modelo irá aumentar a nossa compreensão dos intrincados mecanismos de fatores que promovem o processo que conduz assim para o desenvolvimento de uma gestão mais eficaz de HCC 1-3,10. Actualmente, os modelos de tumor animal mais largamente utilizados são modelos de tumor de xenoenxerto de ratinho, em que as células tumorais humanas são implantadas em ratinhos imunodeficientes. O modelo descrito neste artigo tem vantagens importantes porque é singeneicos e é, portanto, adequado para estudar o papel do sistema imunológico em metástase tumoral 3. Este modelo provou ser altamente reprodutível para o isolamento, a cultura, e o estudo de células tumorais circulantes viáveis ​​3. É, por conseguinte, tem tremendous potencial para avaliar aplicações clínicas, como triagem, diagnóstico, prognóstico, terapêutica e monitorização descoberta de novas estratégias terapêuticas. Uma limitação da metodologia descrita acima, é que uma porção significativa de células CHC A.7R.1 BNL 1ME rato implantado em ratinhos será incapaz de sobreviver e, assim, apenas uma pequena porção das células será viável e adaptado a introdução em tumores 3 sites secundários. Contabilizamos essa limitação implantação inicial de 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 células do rato HCC por rato. Em conclusão, este modelo de rato singeneico ortotópico de cancro metastático de órgão sólido proporciona uma boa plataforma para elucidar os mecanismos subjacentes biológicos a capacidade metastática de células de tumor que circulam no sangue de pacientes com cancro 3. Este, por sua vez, provavelmente, lançar novos insights sobre os mecanismos da metástase do câncer, porque a metástase do câncer ocorre principalmente via hematogenous espalhar 11-13. Introspecções novas assim obtidos nos mecanismos da metástase do câncer será fundamental para o desenvolvimento de novas aplicações clínicas benéficas 3,14,15.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most lethal cancers, with poor prognosis and low life expectancy. Nearly all cancer-related deaths are due to the metastatic spread of the disease from the originating organ to additional distant organs2-6.HCC progression is a complex process. Therefore, being able to model the tumor microenvironment that is naturally found in metastatic HCC in animal models can prove to be a successful and useful way to reveal relevant mechanisms in humans.7Unfortunately, the mechanisms of cancer metastasis are still largely unclear. Therefore, there is a need to establish animal models that will enable us to elucidate the underlying molecular mechanisms of metastases of cancers such as HCC3,5.
Mouse model systems are a very useful approach for delineating mechanisms and evaluating novel strategies for treatment of metastatic human cancers5,8. The various mouse model systems that presently exist are a testament to efforts of researchers to correctly depict the complexity of the disease5,8,9.
Ogunwobi and colleagues recently used a survival surgical approach to demonstrate establishment of a novel orthotopic syngeneic mouse model for the study of metastasis in HCC3. Their work established a &#8220;patient-like&#8221; mouse model that recapitulates features of aggressive and metastatic HCCs3. They further demonstrated that this mouse model system can be used to study the biology of circulating tumor cells, and that this holds potential for gaining novel insights into the mechanisms of cancer metastasis3.
The aim of this paper is to describe in detail the methodology used in establishing this &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model of HCC metastasis3. The methodology of how to implant BNL 1ME A.7R.1 mouse HCC cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c3 using survival surgery will be described. Unlike other mouse xenograft tumor models where human tumor cells are implanted into immune deficient mice, this system is syngeneic and is, therefore, suitable for studying the role of the immune system in tumor metastasis3,5,8. This approach will likely gain widespread use for studying the mechanisms of metastasis in solid organ cancers.

<table><tbody><tr><td>Micro Dissecting Tweezer&amp;nbsp;</td><td>Roboz</td><td>(RS-5040)</td><td>Tip 0.20 x 0.12 mm</td></tr><tr><td>Graefe Micro Dissecting Forceps, serrated curved tip</td><td>Roboz</td><td>(RS-5111)</td><td>1 X 2 teeth, curved tip width 0.6 mm</td></tr><tr><td>Micro Dissecting Retractor-Agricola (3 by 3 prongs)</td><td>Roboz</td><td>(RS-6501)</td><td>Blunt 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 25 mm</td></tr><tr><td>Micro Dissecting Retractor-Goldstein (3 by 3 prongs)</td><td>Roboz</td><td>(RS-6503)</td><td>Blunt, 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 19 mm</td></tr><tr><td>Jameson Caliper (Measures tumors)</td><td>Roboz</td><td>(RS-6466)</td><td>80 mm/3 inch scale, chrome plated&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors, large ring sissors, straight and sharp</td><td>Roboz</td><td>(RS-5852)</td><td>23 mm blades, length 4 inches, flat shanks and large rings</td></tr><tr><td>Scalpel with blades, for delicate dissecting procedures</td><td>Roboz</td><td>(RS-9861-36)</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handle&amp;nbsp;</td><td>Roboz</td><td>(RS-9884)</td><td>Solid</td></tr><tr><td>Littauer Stitch Sissors</td><td>Roboz</td><td>(RS-7074)</td><td>Length 4.5 inches</td></tr><tr><td>Brown needle holder, for easy suture tying</td><td>Roboz</td><td>(RS-7960)</td><td>Convex jaw, fine serrations</td></tr><tr><td>Reflex 7MM wound clips with reflex 7 clip applier</td><td>Roboz</td><td>(RS-9262)</td><td>safe, secure alternative method of wound closure</td></tr><tr><td>Instrument tray and lid</td><td>Roboz</td><td>RT-1350S</td><td></td></tr><tr><td>Mini-clipper with detachable blade</td><td>Roboz</td><td>(RS-5903)</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 (the Germ Terminator) Dry Sterilizer</td><td>Roboz</td><td>Ds-400, Ds-401, DS-501</td><td>For fast decontamination of micro-dissecting instruments.&amp;nbsp;&amp;nbsp; Instruments decontaminate within 15 sec.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microinjection needles</td><td>VWR</td><td>BD305125</td><td>25G Needle</td></tr></tbody></table>

a "patient-like" orthotopic syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

Os fígados de ratos Balb / c foram implantados com 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 células rato HCC. Evidência clínica de desenvolvimento HCC foi observado 63 dias pós-cirurgia. Consequentemente, os ratos foram humanamente eutanasiados. A necropsia foi realizada nos ratos sacrificados. Os pulmões eo fígado foram ressecados e um exame cuidadoso bruta foi realizada para identificar tumores macroscópicos. Em um rato, um tumor superficial foi observada sobre a superfície do fígado com alguma ligação à parede abdominal (Figura 1A). Em um segundo rato, um fígado anormalmente aparência foi observada. A anormalidade parece muito fortemente como um tumor superficial (Figura 1B). Como esperado, os ratinhos no grupo de controlo sem implantação de células BNL 1ME A.7R.1 HCC desenvolvido nenhum tumor, como evidenciado por um fígado (Figura 1D) e pulmões (Figura 1E) a partir de um ratinho de controlo. Além disso, os pulmões de ratinhos com tumores pareciam ligeiramente anormal, exposiçãoing áreas de necrose hemorrágica (Figura 1C). Com base na experiência anterior, esses pulmões podem abrigar depósitos metastáticos 3. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52858/52858fig1.jpg" /> Figura 1. O exame macroscópico de tumor e metástases. Ratinhos Balb / c foram implantados com 5 X 10 6 células tumorais BNL 1ME A.7R.1 e sacrificados 63 dias mais tarde. Tumores representativos do fígado observados foram fotografados e exibidos aqui. (A e B) ambos mostram tumores hepáticos superficial. (C) é pulmões a partir de células tumorais camundongos implantados. (D) mostra fígado de um rato controle. (E) indica pulmões de um controle mouse. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52858/52858fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 2. Diagrama esquemático da metodologia de um modelo de camundongo singênico &quot;paciente-like&quot; ortotópico de carcinoma hepatocelular metástase. Uma vez anestesiados, rato fígado é implantado com 5 X 106 BNL 1ME carcinoma hepatocelular A.7R.1 rato células (HCC). Quando evidência clínica de HCC é observável, animal é sacrificado por eutanásia humanitária (sujeito a dióxido de carbono asfixia, seguido de sangria intracardíaca percutânea e deslocamento cervical). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52858/52858fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

A propagação metastática do câncer é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer. Nós fornecemos uma descrição detalhada da nossa metodologia cirurgia sobrevivência para o estabelecimento de um sistema modelo singï¿½ico rato &quot;paciente-like&quot; orthotopic para o estudo dos mecanismos de metástases em tumores de órgãos sólidos.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Singênico Rato Modelo de carcinoma hepatocelular Metástase

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

12.2K visualizações.  Hunter College of the City University of New York.  A propagação metastática do câncer é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer. Nós fornecemos uma descrição detalhada da nossa metodologia cirurgia sobrevivência para o estabelecimento de um sistema modelo singï¿½ico rato "paciente-like" orthotopic para o estudo dos mecanismos de metástases em tumores de órgãos sólidos. 

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Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. However, little is known about the heterogeneity of liver metastases, and animal models capable of evaluating the development of individual metastatic colonies are needed. Here, we present an advanced model of hepatic metastases that provides the ability to quantitatively visualize the development of individual tumor clones in the liver and estimate their growth kinetics and colonization efficiency. We generated a panel of monoclonal derivatives of HCT116 human colorectal cancer cells stably labeled with luciferase and tdTomato and possessing different growth properties. With a splenic injection followed by a splenectomy, the majority of these clones are able to generate hepatic metastases, but with different frequencies of colonization and varying growth rates. Using the In Vivo&#160;Imaging System (IVIS), it is possible to visualize and quantify metastasis development with in vivo luminescent and ex vivo fluorescent imaging. In addition, Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) provides a 3D distribution of liver metastases in vivo. Ex vivo fluorescent imaging of harvested livers provides quantitative measurements of individual hepatic metastatic colonies, allowing for the evaluation of the frequency of liver colonization and the growth kinetics of metastases. Since the model is similar to clinically observed liver metastases, it can serve as a modality for detecting genes associated with liver metastasis and for testing potential ablative or adjuvant treatments for liver metastatic disease.

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

Modelo Animal avançado de Colorectal metástase no fígado: técnicas de imagem e Propriedades de metastáticos Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Pesquisa do câncer

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Um modelo de injeção da veia porta para o Estudo do Fígado metástase do câncer de mama

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of diagnosis. Metastatic RCC (mRCC) is incurable, with a median survival time of only 18 months. Immune-based interventions (e.g., interferon (IFN) and interleukin (IL)-2) induce durable responses in a fraction of mRCC patients, and multikinase inhibitors (e.g., sunitinib or sorafenib) or anti-VEGF receptor monoclonal antibodies (mAb) are largely palliative, as complete remissions are rare. Such shortcomings in current therapies for mRCC patients provide the rationale for the development of novel treatment protocols. A key component in the preclinical testing of new therapies for mRCC is a suitable animal model. Beneficial features that recapitulate the human condition include a primary renal tumor, renal tumor metastases, and an intact immune system to investigate any therapy-driven immune effector responses and the formation of tumor-induced immunosuppressive factors. This report describes an orthotopic mRCC mouse model that has all of these features. We describe an intrarenal implantation technique using the mouse renal adenocarcinoma cell line Renca, followed by the assessment of tumor growth in the kidney (primary site) and lungs (metastatic site).

Implementation of an orthotopic model of renal cell carcinoma in immunocompetent mice affords the investigator a clinically-relevant system defined by the presence of a primary renal tumor and lung metastases in the same animal. This system can be used to preclinically test a variety of treatments in vivo.

Um carcinoma de células Singênico Rato Modelo de metastático renal para Quantitativa e Longitudinal Avaliação da pré-clínicos Terapias

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature cancer cells growing in their natural location, replicate human disease with high fidelity. Two techniques can be used to establish this model. Both techniques are similar and require mouse anesthesia and laparotomy for exposure of the cecum. One technique involves injection of a colorectal cancer cell suspension into the cecal wall. Cancer cells are first grown in culture, harvested when subconfluent and prepared as a single cell suspension. A small volume of cells is injected slowly to avoid leakage. The other technique involves transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. A mouse with a previously established subcutaneous colorectal tumor is euthanized and the tumor is removed using sterile technique. The tumor piece is divided into small pieces for transplantation to another mouse. Prior to transplantation, the cecal wall is lightly damaged to facilitate tumor cell infiltration. The time to developing primary tumors and liver metastases will vary depending on the technique, cell line, and mouse species used. This orthotopic mouse model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Two techniques can be used to establish this model: injection of a cancer cell suspension into the cecal wall or transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. This model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Modelo rato ortotópico de câncer colorretal

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature ...

Biologia

An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded elucidation of the underlying mechanisms and development of innovative immunotherapeutic strategies. To develop an ideal animal model recapitulating human HCC, immunocompetent male C57BL/6J mice first receive a carbon tetrachloride (CCl4) injection to induce liver fibrosis, then receive histologically-normal oncogenic hepatocytes from young male SV40 T antigen (TAg)-transgenic mice (MTD2) by intra-splenic (ISPL) inoculation. Androgen generated in recipient male mice at puberty initiates TAg expression under control of a liver-specific promoter. As a result, the transferred hepatocytes become cancer cells and form tumor masses in the setting of liver fibrosis/cirrhosis. This novel model mimics human HCC initiation and progression in the context of liver fibrosis/cirrhosis and reflects the most typical features of human HCC including immune dysfunction.

Here, we describe the development of a clinically relevant murine model of liver cancer recapitulating the typical immune features of hepatocellular cancer (HCC).

Um modelo de camundongo de câncer hepatocelular induzido por hepatócitos oncogênico, decorrente do ajuste da inflamação e fibrose hepática

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce multiple tissue and organ damage. Despite recent advances and therapeutic approaches, the overall morbidity has remained unsatisfactory especially in patients with underlying parenchymal abnormalities. In the context of aggressive cancer growth and metastasis, surgical I/R is suspected to be the promoter regulating tumor recurrence. This article aims to describe a clinically relevant murine model of liver I/R and colorectal liver metastasis. In doing so, we aim to assist other investigators in establishing and perfecting this model for their routine research practice to better understand the effects of liver I/R on promoting liver metastases.

We describe in detail a clinically relevant colorectal cancer liver metastases (CRLM) tumor model and the influence of liver ischemia reperfusion (I/R) in tumor growth and metastasis. This model can help to better understand the mechanisms underlying surgery-induced promotion of liver metastatic growth.

Modelo murino de tumores hepáticos metastáticos no cenário de lesão de reperfusão de isquemia

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

Geração de subcutânea e intra-hepática Humanos carcinoma hepatocelular Xenoenxertos em Immunodeficient Ratos

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Medicina

Non-Invasive PET/MR Imaging in an Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma

Preclinical experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate human disease represent an important tool to study tumorigenesis and evaluate novel therapeutic approaches. Non-invasive whole-body imaging using positron emission tomography (PET) provides critical insights into the in vivo characteristics of tissues at the molecular level in real-time. We present here a protocol for orthotopic HCC xenograft creation with and without hepatic artery ligation (HAL) to induce tumor hypoxia and the assessment of their tumor metabolism in vivo using [18F]Fluoromisonidazole ([18F]FMISO) and [18F]Fluorodeoxyglucose ([18F]FDG) PET/magnetic resonance (MR) imaging. Tumor hypoxia could be readily visualized using the hypoxia marker [18F]FMISO, and it was found that the [18F]FMISO uptake was higher in HCC mice that underwent HAL than in the non-HAL group, whereas [18F]FDG could not distinguish tumor hypoxia between the two groups. HAL tumors also displayed a higher level of hypoxia-inducible factor (HIF)-1&#945; expression in response to hypoxia. Quantification of HAL tumors showed a 2.3-fold increase in [18F]FMISO uptake based on the standardized value uptake (SUV) approach.

Here, we present a protocol to create orthotopic hepatocellular carcinoma xenografts with and without hepatic artery ligation and perform non-invasive positron emission tomography (PET) imaging of tumor hypoxia using [18F]Fluoromisonidazole ([18F]FMISO) and [18F]Fluorodeoxyglucose ([18F]FDG).

Imagem PET/MR não invasiva em um modelo ortotópico de carcinoma hepatocelular em camundongo

Preclinical experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate human disease represent an important tool to study tumorigenesis and ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

Um Modelo murino de metástases hepáticas pré-clínica

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

A "Patient-Like" Orthotopic Singênico Rato Modelo de carcinoma hepatocelular Metástase

Resumo

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