Name: neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture
Uploaded: 2015-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture at JoVE.com

Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.

1. Preparação de mídia NOTA: O protocolo baseia-se na utilização de uma mistura de dois meios separados: DMEM / F12 suplementado com suplemento N2 modificado e Neurobasal suplementado com suplemento B27, tipicamente numa proporção de 1: 1. <ol><li> Prepara-se o suplemento N2 modificado por mistura dos componentes num tubo de 15 ml. Não vórtice ou filtrar este; misturar por inversão do tubo até a solução ficar clara. <ol><li> Iniciar pipetando 7,2 ml de DMEM / F12, em seguida adicionar 1 ml de 25 mg / ml de insulina (fez-se em 0,01 M de HCl) e misturar bem por inversão do tubo. É preciso um par de minutos até que a solução é clara. </li><li> Adicionar 1 ml de 100 mg / ml de apo-transferrina (preparados em água), 33 ul de 0,6 mg / ml progesternone (confeccionados a partir de etanol), 100 uL de 160 mg / ml (1 M) putrescina (preparados em água ), 10 ul de 3 mM de selenito de sódio (preparados em água) e 666 ul de 7,5% de albumina de soro bovino e misturar bem o tubo. Alíquota em 2,5 ml e armazenar a -20 °C por até 2 meses. </li></ol></li><li> Prepare a mídia. <ol><li> Para 250 ml de meio DMEM / F12 adicionar 2,5 ml de N2. Misture bem, mas não agite ou filtro. </li><li> Para 250 ml de Neurobasal meios adicionar 5 ml de suplemento de B27. Misture bem, mas não agite ou filtro. </li><li> Misture a mídia da passos 1.2.1 e 1.2.2 em uma proporção de 1: 1. Em alguns casos, uma mistura 1: mistura 3 pode ser necessárias (suplementado como o 1: 1 mistura no passo 1.2.4). </li><li> Para a mistura de adicionar 0,5 mL de L-glutamina (concentração final 0,2 mM) e 3,5 ul de 2-mercaptoetanol (concentração final 0,1 mM) e misturar bem, sem agitação. Armazene a mídia a 4 ° C por até 3 semanas e evitar a exposição à luz. Esta mistura final é chamada N2B27. </li></ol></li><li> Preparar a solução de gelatina. <ol><li> Prepara-se uma solução de gelatina a 1% em água ultrapura e autoclave a 121 ° C, 15 psi, durante 15 min. É importante que o frasco utilizado para este está completamente limpa de detergentes ou os desinfectantes, então recomenda-se que uma nova garrafa éutilizado para isso e é sempre apenas lavado em água ultrapura entre utilizações. Alíquota da solução a 1% em 50 ml de partes alíquotas e manter a 4 ° C, durante meses. </li><li> Aquece-se uma alíquota de 1% de gelatina em um banho de água a 37 C ° até se dissolver e adicionar a 500 ml de solução salina tamponada com fosfato quente (PBS). Misturar bem e pipetar suficiente para cobrir o fundo de cada poço ou placa. Permitir que a gelatina para revestir a superfície durante pelo menos 30 min. </li></ol></li></ol> 2. plaqueamento das células NOTA: Este protocolo se aplica igualmente a ESC rato cultivadas em 10% de soro com fator inibidor de leucemia (LIF), a substituição de soro com LIF ou meios livres de soro com proteína LIF e morfogenética óssea 4 (BMP4) ou inibidores de MEK e GSK3 (media 2i) com ou sem LIF. No entanto, o momento ea eficiência da diferenciação pode variar dependendo da mídia e células (ver discussão). Para os experimentos mostrados aqui usamos a linha 46C rato ESC (que tem um repórter EGFP batido om dos alelos Sox1 endógenos), cultivadas em GMEM com 10% de soro e LIF. Para melhores resultados, é importante que as células são dissociadas e replated na mídia N2B27; simplesmente mudando de mídia a partir de GMEM / soro / LIF para N2B27 sempre resulta em uma redução da eficiência de diferenciação em relação ao repique das células. <ol><li> Cresça as células em GMEM com 10% de soro, 1 mM de piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais 1x, 0,1 M de 2-mercaptoetanol, e 100 unidades / ml de LIF 13. Para obter uma cultura subconfluentes de rato ESC, placa 1 x 10 6 células em uma cultura frasco T25, que terá 2-3 dias. </li><li> Observar células sob microscópio de campo brilhante. Quando as células são subconfluentes e pronto para passagem, lave-os duas vezes em PBS. Adicionar 1 ml de reagente de dissociação de células e retornar para o incubador durante 2-5 min. Embora tripsina e outras enzimas podem também ser usados ​​para dissociação de células, podem ter um impacto negativo sobre a ligação de células de modo que as densidades de plaqueamento terá de ser ajustÃsted. </li><li> Uma vez que as células começam a levantar a partir da placa, toque no vaso para desalojar-los em uma suspensão de células individuais. Recolher as células para um total de 10 ml de meio de dissociação de células e reagente e pipeta para um tubo de centrífuga de 15 ml. </li><li> Rodar as células a 300 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de N2B27 pré-aquecido por pipetagem para cima e para baixo 3-5 vezes. Quando pipetando a suspensão para baixo, da pipeta contra o lado do tubo para evitar a criação de bolhas. Contar as células com um contador de células automatizado ou um hemocitómetro e registar a concentração. </li><li> Prepara-se uma suspensão de células contendo o número desejado de células por unidade de volume a ser plaqueadas por cavidade em N2B27 pré-aquecido. Uma densidade de 10.500 células por cm 2 de um prato de 6 poços (isto é, 1 x 10 5 células por poço de um prato de 6 poços) é o ideal. Ver Tabela 1 para o número de células sugerido por cm 2 e PLAting volumes de suporte para uma variedade de recipientes de cultura de célula. </li><li> Aspirar a gelatina a partir do vaso de cultura e placa a suspensão de células de acordo com a densidade e volume de sugerido na Tabela 1. Não rodar as placas de que este vai concentrar-se as células para o centro. Coloque as culturas numa incubadora húmida a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Mudança de mídia a cada 1-2 dias, a substituição de todos os meios de comunicação com N2B27 fresco. Pipeta suavemente como a lavagem das células pode afetar a densidade e diminuir a eficiência de diferenciação nos dias seguintes. Onde viabilidade inicial após o plaqueamento é pobre, placa as células em uma 1: 3 mistura dos meios de comunicação N2 e B27-suplementados e mudar isso para N2B27 após os dois primeiros dias. As células começam a diferenciar e deve mostrar expressão Sox1 (visível por fluorescência verde do repórter na linha celular utilizada aqui 46C) dentro de 4-6 dias. </li></ol> 3. Immunofluorescent Coloração NÃOTE: O protocolo pode ser aplicado a qualquer tipo de navio. O volume de cada reagente é descrito por poço da placa de 6 poços e pode ser dimensionada para qualquer área de superfície. Repique não é recomendada devido à viabilidade baixa depois. <ol><li> Remover meio de diferenciação e fixar as células por adição de 500 ul de 4% (v / v) de paraformaldeído, deixar durante 15 min. </li><li> Lavar e permeabilizar as células com 2 ml de PBS-T (solução salina tamponada com fosfato com 0,5% (v / v) de Tween-20) por duas vezes. As células podem ser mantidas em PBS-T, durante até 2 meses a 4 ° C. </li><li> Substituir PBS-T com 1 ml de PBS-T com 10% (v / v) de soro (a partir da mesma espécie que o anticorpo secundário). Incubar 1 hora sobre o roqueiro placa à temperatura ambiente para bloquear qualquer ligação não específica. </li><li> Após 1 h, lavar as células duas vezes com 2 ml de PBS-T, e incuba-se 500 ul de IgG de ratinho contra βIII-tubulina (diluída 1: 1000 em PBS-T, com 10% de soro). Colocar no prato oscilante, e deixar O / N a 4 ° C. </li><li> A partir deste passo, sempre proteger o vasoda luz. Lavar as células duas vezes com PBS-T, em seguida, adicionar 500 ul de anticorpo anti-IgG de ratinho marcado com fluorescência (diluída a 2 ug / ml em PBS-T, com 10% de soro). Colocá-lo sobre a placa oscilante durante 1 h à TA. </li><li> Lavar as células duas vezes com PBS-T, em seguida, adicionar 500 mL de DAPI (diluído para 0,5 ug / ml em PBS-T) e deixar durante 5 min. </li><li> Lavam-se as células novamente e mantê-las em PBS-T. As células estão prontas para ser fotografado e pode ser mantido por até 2 semanas a 4 ° C. Note que o sinal GFP desaparece ao longo do tempo, por isso é inadequado para comparar a intensidade GFP de células fixas e ao vivo ou de células fixadas em momentos diferentes. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

O protocolo de diferenciação neural monocamada tem sido usado por mais de uma década 6. O protocolo é altamente eficiente, composto de meio definido, e feito de um sistema de monocamada que torna o sistema mais aplicável para pré-clínica (por exemplo, o rastreio de fármacos) usa. No entanto, existem alguns factores críticos que determinam a eficiência de diferenciação. Este artigo aponta esses fatores ea solução para cada obstáculo. Densidade das células após o plaqueamento, no estado de diferenciação é, talvez, o factor mais crítico. Plaqueamento das células em demasiado alta densidade reduz a eficiência de diferenciação, enquanto que o plaqueamento em muito baixa densidade leva à morte celular. Este fenómeno é provavelmente devido à sinalização do factor de crescimento autócrino. FGF4 é um factor de crescimento autócrino que ativa a cascata de MAPK e dirige ESC diferenciação 11. LIF é outra citocina produzida por ESC. Ele ativa a via STAT3 e promove a auto-renovação &lt;sup&gt; 15. Este protocolo faz uso de N2B27 para fazer células neurais. N2B27 contém vários factores que permitem a sobrevivência ESC e promove o crescimento de células neurais, e não contém ou LIF ou BMP4 que inibem a diferenciação neural 6. No densidade adequada, um equilíbrio adequado de FGF4 e LIF de sinalização que permite que seja mantida ESC para diferenciar. Em alta densidade, quantidade excessiva de LIF autocrine e BMP diferenciação de inibição. Em contraste, as células em muito baixa densidade ter prejudicado a sobrevivência nestes meios mínimos. Assim, quando um grande número de células sem diferenciação aparecer o número de chapeamento deve ser reduzida, enquanto que é necessário um aumento do número de células chapeamento se morte celular significativa é observada. Além do número de células, existem alguns outros factores que afectam indirectamente densidade de plaqueamento. O primeiro factor é a concentração celular local, dependente da técnica usada para distribuir uniformemente as células sobre a superfícieárea. Descobrimos que roda o poço não é o ideal, uma vez que concentra as células para o centro do poço, e faz com que a densidade no centro demasiado elevado, enquanto que na periferia da densidade torna-se demasiado baixo. Outras técnicas de mistura, por exemplo, misturando os meios de comunicação com as células antes do plaqueamento, ou balançar o lado-a-lado prato são recomendados. Além disso, quando um recipiente é colocado na incubadora, aquecimento irregular do meio provoca uma força de convecção que atrai as células para o centro do poço, resultando na distribuição das células num padrão de anéis concêntricos. Um volume de suporte inferior no dia chapeamento é recomendada para reduzir este efeito. Deixando a placa fora da incubadora durante 30 minutos para permitir que as células fixar, assim como aquecer o meio antes da mistura também pode ajudar a conseguir uma densidade de revestimento homogénea. Em segundo lugar, o tipo de navio também afecta chapeamento de densidade. A Figura 1 mostra claramente que o número de células / poço pode ser não linearmente scaconduzido para a área de superfície de diferentes vasos (em outras palavras, o mesmo número de células / área de superfície não pode ser aplicada a cada tipo de navio). Um recipiente mais pequeno (com maior proporção de volume / área) é mais afectado pela tensão superficial meios de comunicação que faz com que uma superfície côncava de forma, o chamado menisco. A tensão superficial empurra as pilhas para a borda do poço e diminui a densidade no centro. Além disso, desde que o volume de mídia na pequena embarcação é baixa, media aquecer rapidamente, reduzindo a força de convecção. Portanto, as células em uma pequena embarcação passará para a borda pelo efeito menisco, e não irá se mover para o centro por forças de convecção. Assim, quanto menor for o recipiente, mais elevada a densidade de revestimento necessária para obter a densidade óptima no centro. Em terceiro lugar, a condição de as células antes do plaqueamento também afecta indirectamente densidade de plaqueamento e eficiência de diferenciação. Encontrámos uma variação da densidade óptima em algumas experiências. As experiências commaior taxa de mortalidade no primeiro dia necessária maior densidade de diferenciação eficiente. Culturas ESC no soro e LIF são compostas de uma população heterogênea de células pluripotentes virgens, células pluripotentes imunizadas, e até mesmo um pequeno número de células diferenciadas 16. As células deste tipo tem capacidade para sobreviver diferente e diferenciar sob condições de diferenciação. Uma vez que o protocolo dita no número, mas não o estado das células, algumas experiências pode começar com as células mais diferenciadas que morrem nos primeiros dias, levando a uma densidade mais baixa do que o esperado. Para evitar essa variação, cultura consistente de ESC é necessário para se certificar de que a proporção constante entre cada estado é mantida. Além de densidade, o tempo é outro fator para alcançar a diferenciação eficiente. Nesta publicação, descreve-se a geração de células progenitoras neurais dentro de 6 dias. No entanto, o tempo pode ser diferente, dependendo do estado dea cultura de partida ESC. Como descrito acima, as culturas são ESC populações mistas que podem responder de forma diferente para a condição de diferenciação. Não só a sobrevivência de células, mas também o momento de diferenciação vai ser afectada pela composição cultura. Este protocolo pode ser aplicado a mais condições de cultura CES por exemplo, em meio contendo LIF N2B27 e BMP4, ou 2i e LIF. No entanto, se houver mais células naive em cultura, um período mais longo pode ser necessária para a diferenciação eficiente. Isso ocorre porque as células naïve vai precisar de mais tempo para mudar para um estado preparado e, em seguida, para diferenciar progenitores neurais.

As células estaminais embrionárias são células pluripotentes derivadas do embrião com a capacidade de proliferar indefinidamente in vitro, mantendo a capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células dos adultos após reintrodução num embrião fase adequada (através da formação de uma quimera), injecção em hospedeiros singénicos ou imunocomprometidos (através da formação de um teratoma) ou in vitro sujeitos a estímulos apropriados 1. A diferenciação in vitro de células estaminais embrionárias de ratinho em linhagens neurais foi descrita pela primeira vez em 1995 e envolveu a formação de agregados multicelulares suspensão (corpos embrióides, EBS) em meio contendo soro suplementado com o ácido retinóico morfogénio 2-4. Uma vez que, em seguida, uma variedade de protocolos têm sido desenvolvidos para permitir a diferenciação neuronal 5. Muitos ainda utilizar agregação, os outros co-cultura com indução de tipos de células e vários envolvem a utilização de meios isentos de soro. Todos os protocolos tem vantagens umand desvantagens e a natureza precisa da neural ou células neuronais produzida também varia de acordo com o protocolo utilizado. O protocolo ideal seria robusta, escalável e fazer uso de meios totalmente definidos e substratos, ser passíveis de monitorização não invasiva do processo de diferenciação e resultar na geração de populações puras de células progenitoras neurais capazes de ser modelado por sinais externos e para diferenciar em todos os subtipos neuronais e gliais com elevada eficiência e rendimento em relativamente pouco tempo. Nos últimos doze anos, temos vindo a utilizar um método para gerar progenitores neurais e neurônios de rato ESC em uma baixa densidade, cultura monocamada aderente sem soro 6-10. Este protocolo cumpre muitos dos critérios enunciados anteriormente: em nossas mãos a eficiência de diferenciação tem sido bastante consistente ao longo de muitos anos e uma variedade de linhas de células, ele pode ser escalado para cima ou para baixo (que usamos com sucesso navios de placas de 96 poços para 15 cm de diâmetro diela é) e os meios usados ​​são bem definidos. O processo é passível de microscopia Timelapse para o controlo da diferenciação e uma variedade de padrões de sinais pode ser adicionado para induzir a geração de tipos distintos de subtipos neuronais (por exemplo, a Shh e Fgf8 para neurónios dopaminérgicos 6). No entanto, existem alguns desafios para o sucesso da aplicação deste protocolo. Um dos aspectos fundamentais é uma preparação cuidadosa da mídia. Nós sempre preparar a mídia in-house, apesar da disponibilidade de alternativas comerciais. Um dos suplementos usados ​​(N2; ver Protocol) tem modificações sobre o padrão versões disponíveis no mercado. Finalmente, uma das etapas mais importantes para a aplicação bem sucedida deste método é a densidade celular óptima para o chapeamento. Isto é principalmente devido ao passo que a natureza autócrina de um dos sinais indutores (FGF4 11) requer que as células estão presentes suficientes para permitir viabil óptimadade e diferenciação, em muito altas densidades diferenciação é prejudicada (possivelmente em parte devido à produção autócrina de LIF 12). Portanto, é importante que a preparação ambos os meios e revestimento celular são realizadas com cuidado e de forma consistente para assegurar os melhores resultados.

<table><tbody><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, serum free</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>Reconstitute with sterile 0.01 M HCl</td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>Reconstitute with sterile water</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>Reconstitute with ethanol</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Reconstitute with sterile water</td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td>Reconstitute with sterile water</td></tr><tr><td>Bovine albumin fraction V</td><td>Life Technologies</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>6-well tissue culture dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>24-well tissue culture dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids solution</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Leukaemia inhibitory factor</td><td>prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>Mouse anti &amp;beta;III tubulin IgG antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A31571</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture flask</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr></tbody></table>

neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture

A capacidade de diferenciação de células estaminais embrionárias de ratinho (ESC) para progenitores neurais permite o estudo dos mecanismos que controlam especificação neural, bem como a geração de tipos de células neuronais maduros para estudo posterior. Neste protocolo, descrevem um método para a diferenciação de ESC para progenitores neurais utilizando, cultura em monocamada sem soro. O método é escalável, eficiente e resulta num rendimento de ~ 70% de células progenitoras neurais dentro de 4-6 dias. Ele pode ser aplicado a partir de várias estirpes CES cultivadas sob uma variedade de condições. Progenitores neurais podem ser autorizados a diferenciar ainda mais em neurônios funcionais e glia ou analisados ​​por microscopia, técnicas de citometria de fluxo ou moleculares. O processo de diferenciação é passível de microscopia de lapso de tempo e pode ser combinada com o uso de linhas de repórter para monitorizar o processo de especificação neural. Nós fornecemos instruções detalhadas sobre a preparação de meios e optimização densidade celular para permitir que o processo abe aplicado a maioria das linhas de ESC e uma variedade de recipientes de cultura de célula.

Nesta experiência, utilizou-se a linha de células de 14 46C, células estaminais embrionárias de ratinho com um endógeno Sox1-repórter GFP, para controlar a diferenciação neuronal. Utilizando esta linha celular, expressão de Sox1, um marcador para células progenitoras neurais, pode ser detectado por fluorescência verde. Chapeamento de densidade é um fator crítico para alcançar a diferenciação neuronal. Células estaminais embrionárias de ratinho foram plaqueadas em placas de 6 poços em diferentes densidades variando de 10.500 a 88.500 células / cm2. A Figura 1A mostra a eficiência de diferenciação obtidos por diferentes densidades de plaqueamento em uma placa de 6 poços. No dia 6 de diferenciação, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% e coradas para o marcador neuronal βIII-tubulina. No densidade óptima (10.500 células / cm2), as células diferenciadas para progenitores neuronais e neurónios. Isso foi observado pelo sinal verde fluorescente de repórter Sox1-GFP e imunofluorescência contra o marcador neuronal, βIII-tubulina. A lower densidade de plaqueamento levado a morte de células dentro de 3 dias. No entanto, plaqueamento a muito alta densidade (&gt; 36.500 células / cm2) resultou numa diminuição da proporção de células verdes e células positivas βIII-tubulina. A Figura 1B mostra um experimento realizado numa placa de 96 poços que levou cerca de 10 vezes mais elevada densidade celular para atingir o óptimo (155.000 células / cm2) e o muito confluente (362.500 células / cm 2) nível. Densidade ideal pode ser diferente entre os preparativos da mídia, componente de mídia e lotes de células, tipos de células, ou condições de cultura anteriores. Recomenda-se para optimizar a densidade de revestimento para cada experiência. A Tabela 1 apresenta gamas de densidades de plaqueamento eficazes em diversas plataformas que devem ser incluídos no passo de optimização. Dentro desta gama, deve ser possível obter uma densidade que dá uma boa eficiência de diferenciação dentro de 4-6 dias. Durante a diferenciação ESC gradualmente mudar sua morfologia. A Figura 2 mostra células e de colônias morfologia do dia 1 ao dia 6 após o plaqueamento em 6 bem-placa em 10.500 células / cm 2. As células foram cultivadas em condições de diferenciação e fotografou todos os dias. Não é incomum ver a morte celular significativa nos primeiros dias, devido à extrema mudança na condição de cultura. No entanto, as células restantes são ainda capazes de se diferenciarem. No dia 4, as células começaram a tornar-se progenitores neurais como sinal fluorescente verde de Sox1-GFP repórter apareceram em primeiro lugar. No entanto, mesmo no dia 6, nem todas as células são Sox1-positiva. A existência de algumas células não-neuronais é esperado, no entanto, em condições apropriadas, a maioria das células será neural. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52823/52823fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1. O efeito da densidade de revestimento sobre a eficiência de diferenciação. Dois diferentedensidades de células repórter Sox1-GFP (46C) foram semeadas e diferenciadas de acordo com o protocolo durante 6 dias. (A) A diferenciação em uma placa de 6 poços. (B) A diferenciação numa placa de 96 poços. Barra de escala:. 100 mm <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52823/52823fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52823/52823fig2highres.jpg" width="450" /> Figura 2. morfologias celular durante o processo de diferenciação. 46C CES foram diferenciadas em 10.500 células por cm2 numa placa de cultura de 6 poços e fotografado diariamente para observação de mudanças na morfologia celular. Barra de escala:. 300 mm <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52823/52823fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Plataforma </td><td> Gama de densidade efectiva (células / cm2) </td><td> Faixa do número de células até ao prato </td><td> Volume de mídia inicial sugerido (ul) </td><td> Sugestão de volume de mídia após o dia 1 (ul) </td></tr><tr><td> 6-poços </td><td> 10.500 - 36.500 </td><td> 99.750 - 346.750 </td><td> 1000 </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> Placa de 24 poços </td><td> 15.600 - 46.800 </td><td> 29.640 - 88.920 </td><td> 500 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> Placa de 96 poços </td><td> 103.500 - 260.000 </td><td> 33.120 - 83.200 </td><td> 100 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. sugestão de chapeamento de densidades e volumes de mídia para diferentes tamanhos de vasos. As densidades de revestimento desta tabela foram determinados utilizando a linha de células 46C. Para melhores resultados, a densidade de revestimento de cada linha individual pode ter que ser adjusted.

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Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

neural-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-serum-free

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.0K visualizações.  University of Dundee. This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

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Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Biologia do Desenvolvimento

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Diferenciação e caracterização de progenitores neurais e neurônios de células-tronco embrionárias do rato

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

Diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias em neurônios motores

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Biologia

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Neurociência

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Rato Desenvolvimento Embrionário em todo um sistema de cultura de embriões sem soro

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Generating Neural Progenitors from Embryonic Stem Cells in Serum-Free Monolayer Cultures

Source: Wongpaiboonwattana, W., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/52823">Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture.</a> J. Vis. Exp.(2015)
The video demonstrates a protocol that uses serum-free media to generate neural progenitors from mouse embryonic stem cells. The desired concentration of embryonic stem cells, suspended in serum-free media, is plated on gelatin-coated coverslips. At an optimal cell density, cells produce autocrine signaling factors, which, along with the neural differentiation-inducing factors in the serum-free media, trigger the differentiation of embryonic stem cells into neural progenitors.

Geração de progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias em culturas monocamada sem soro

1. Media Preparation
NOTE: The protocol relies on using a mix of two separate media: DMEM/F12 supplemented with modified N2 supplement and Neurobasal ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

Generating Cortical Interneuron Precursors From Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Tischfield, D. J., et al <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56358">Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video presents a method for generating cortical interneuron precursors from mouse embryonic stem cells. The protocol entails culturing the stem cells in media containing specific small molecule inhibitors, which facilitate stem cell proliferation and aggregation into embryoid bodies (EBs). Subsequently, the EBs are dissociated with enzymes and plated on culture plate wells coated with adhesion proteins to promote their differentiation into cortical interneuron precursors.

Geração de precursores de interneurônios corticais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

1. Media Preparation
NOTE: Warm all media to 37 &#38;#176;C before use in cell culture.

	Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) media (for preparing 500 mL)
	
	...

Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into a Networked Neuron Population

Source: Hubbard, K. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/52361">Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a technique for embryonic stem cell differentiation into a networked population of neurons with functioning synapses. It outlines the steps involved in embryonic stem cell differentiation into neurons, induction of neuronal network formation, and enrichment of the culture with networked neurons.

Diferenciando células-tronco embrionárias de camundongos em uma população de neurônios em rede

1. Neuronal Differentiation
NOTE: Conduct steps 1.1 - 1.5 before noon and step 1.7 after noon. An overview of the differentiation procedures is presented ...