Name: assessing bacterial invasion of cardiac cells in culture and heart colonization in infected mice using listeria monocytogenes
Uploaded: 2015-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do Serviço Público de Saúde AI41816 e AI099339 (N.E.F.) e pela F31AI094886-01 (P.D.M.) da NIAID. Os conteúdos são de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais das fontes de financiamento.

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Os autores não relatam interesses financeiros concorrentes.

L. monocytogenes é um patógeno humano generalizado e bem caracterizado, capaz de causar uma série de manifestações diferentes da doença15. A bactéria foi descrita anteriormente por sua capacidade de translocar através de barreiras, como a barreira hematoencefálica e as barreiras placentárias-fetais, a fim de alcançar e colonizar o sistema nervoso central e desenvolver feto, respectivamente. A capacidade in vivo do organismo de colonizar esses tecidos é muitas vezes complementada por uma capacidade in vitro de invadir as células representativas na cultura que compõem os órgãos visados. Por exemplo, a invasão de células epiteliais no plexo coroóide tem sido associada à capacidade do organismo de colonizar o CNS16; e explantos de trophoblasto villous têm sido usados para representar a barreira materno-fetal17. Neste protocolo, foram descritos métodos que são úteis para avaliar a invasão bacteriana de células cardíacas na cultura, bem como para comparação da colonização bacteriana do coração para isolados individuais em relação à colonização do fígado e do baço.
Este protocolo contém uma série de etapas críticas, mas entre as mais críticas estão aquelas que envolvem o uso da CFU bacteriana correta para a infecção de células de cultura tecidual cultivadas em deslizamentos de cobertura ou a infecção de animais. Se o número da UFC bacteriana não for corretamente controlado entre diferentes poços e animais, então comparações diretas entre amostras não podem ser feitas. É importante verificar novamente a série de diluição usada para gerar o inocula por meio do revestimento direto das diluições finais nas placas de mídia, a fim de garantir que o número da UFC bacteriana tenha sido estimado com precisão.
As células H9c2 utilizadas nestes ensaios são derivadas da metade inferior de um coração de rato embrionário de 13 dias que incluía principalmente tecido ventricular18. As células se propagam como myoblasts mononucleadas e ao atingir confluência em frascos ou pratos de cultura tecidual começam a formar estruturas tubulares multinucleadas. As células têm um tempo de geração de aproximadamente 30 horas18. A fome de soro das células H9c2 tem sido associada à diferenciação das células em células musculares esqueléticas, enquanto o tratamento dos míomos com ácido retinóicotrans de 10 nM tem sido associado à diferenciação do mioblast em miócitos cardíacos14. Este protocolo foi focado na invasão de células myoblast de L. monocytogenes, no entanto a linha celular H9c2 é uma linha celular versátil que poderia ser usada para investigar os efeitos da diferenciação celular controlada na invasão bacteriana.
A cepa L. monocytogenes 07PF0776 foi originalmente isolada de um paciente infectado pelo HIV que teve uma prisão assélica não resusitatável devido a uma infecção invasiva de L. monocytogenes do coração8. A análise subsequente dessa cepa em modelos de infecção por camundongos indicou que ela tinha uma capacidade aprimorada de atingir e invadir tecido cardíaco. Uma análise limitada de isolados aleatórios adicionais de L. monocytogenes sugere que sub-populações de isolados bacterianos são capazes de infectar os corações dos camundongos na ausência de qualquer dano prévio ao tecido cardíaco ou válvulas cardíacas8. Curiosamente, duas das melhores cepas de L. monocytogenes, 10403S e EGD, foram encontradas como colonizadoras pobres de células cardíacas e tecidos. O sequenciamento do genoma do isolado 07PF0776 não revelou a presença de nenhuma nova ilha de patogenicidade ou forneceu evidências de aglomerados genéticos únicos19; isso sugere que o 07PF0776 tem como alvo as células cardíacas para invasão através da modificação de seu arsenal existente de produtos genéticos de virulência. A análise histoquímica preliminar indica que 07PF0776 forma abscessos dentro de corações de camundongos infectados que parecem semelhantes ao abscesso observado dentro do paciente humano infectado original (dados não mostrados). Resta saber se outros isolados cardiotrópicos L. monocytogenes induzem formação de abscesso cardíaco semelhante.
Os ensaios aqui apresentados podem ser facilmente modificados para facilitar o exame de diferentes aspectos da infecção. As coberturas individuais podem ser fixadas e manchadas para microscopia à base de luz ou fluorescência, os tempos de incubação da cultura tecidual podem ser aumentados para a medição e comparação das taxas de crescimento intracelulares de bactérias, tecidos e órgãos podem ser incorporados e processados para exame microscópico para examinar a formação de abscessos e a distribuição bacteriana no nível celular. Ao avaliar os níveis de invasão bacteriana de células de cultura tecidual ou colonização de tecidos hospedeiros, há limitações em termos da quantidade mínima de bactérias que cada ensaio pode detectar. Ensaios de invasão in vitro têm um limite menor de detecção de aproximadamente 300 CFU por deslizamento de cobertura. Ajustar o volume de água usado para vórtices as manchas podem aumentar a detecção de baixo número de bactérias, com volumes de lise celular tão baixos quanto 500 μl provando ser úteis para detectar cepas mal invasivas. As manchas podem ser brevemente mergulhadas em água estéril para remover o excesso de gentamicina antes da lise das células hospedeiras em volumes menores. Níveis de volume de até 5 ml ou superior podem ser usados para enumerar adequadamente cepas altamente invasivas. Nos animais, os homogeneizadores de órgãos podem ser gerados em volumes de 5 ml ou 10 ml de ddH20, sendo menores volumes úteis para detectar níveis mais baixos de bactérias, e volumes mais elevados para melhor enumerar órgãos fortemente colonizados. A faixa mínima de detecção de órgãos infectados é de aproximadamente 100 UFC. Se os órgãos forem consistentemente colonizados em níveis elevados, considere usar um volume maior de água (10 ml) e realizar mais diluições dentro da placa de 96 poços.
Os métodos descritos podem ser aplicados a órgãos e tecidos fora do coração. Ensaios de invasão e infecções de camundongos como estes têm sido usados para avaliar a colonização em uma infinidade de locais, incluindo placenta, cérebro, vesícula biliar, fígado e intestino. Modificações dos protocolos descritos acima também podem ser feitas para acomodar cepas hiperinvasivas e/ou hipervirulentas, e a substituição de células cardíacas por outros tipos de células pode ser feita para avaliar fenótipos de invasão em locais fora do sistema cardiovascular. Uma vez que diferentes tipos de células alteraram as suscetibilidades à invasão de L. monocytogenes, o ajuste de parâmetros como MOI e tempos de incubação pode ser necessário para recuperar com precisão os dados dos ensaios.

Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular gram-positivo capaz de causar doenças graves em populações suscetíveis, incluindo idosos, gestantes, pessoas com HIV/AIDS e pessoas que recebem quimioterapia1. A infecção nessas populações é frequentemente resultado da ingestão de produtos alimentares contaminados, e a maioria das infecções estão associadas a surtos de alimentos em larga escala2,3. Em humanos e outros mamíferos, L. monocytogenes é capaz de translocar através da fronteira epitelial do intestino delgado, sendo posteriormente transportado para o fígado4,5. Modelos animais sugerem que as bactérias ingeridas se replicam dentro do villi intestinal e transitam para o fígado através da veia portal ou se espalham através dos linfonodos mesentéricos na corrente sanguínea, levando à disseminação hematógena no fígado e ao baço6,7. No fígado e no baço, a bactéria é capaz de mediar a absorção tanto em fagocitos profissionais quanto em células parenchímicas residentes, e rapidamente estabelece infecções dentro desses órgãos. À medida que a carga bacteriana aumenta, inúmeras bactérias são dispersas de volta ao sangue, onde são capazes de colonizar ainda mais tecidos suscetíveis, incluindo o sistema nervoso central e a placenta (onde estão presentes). A colonização desses locais impede manifestações mais comuns de listeriose em humanos, incluindo meningite, encefalite e aborto fetal2.
Subpopulações selecionadas de L. monocytogenes têm sido recentemente mostrados com uma capacidade aprimorada de invadir e replicar dentro do tecido cardíaco8. As manifestações de envolvimento cardíaco são variadas, e vão desde endocardite e pericárite, até miocardite fulminante completa com anormalidades de condução9-13. O número total de casos cardíacos de L. monocytogenes por ano é baixo, mas pode ser subestimado, pois essa faceta de infecção não é geralmente bem reconhecida. A colonização do coração por patógenos muitas vezes requer predisposições hospedeiras, como danos valvulares pré-existentes ou válvulas cardíacas artificiais. Há, no entanto, isolados de L. monocytogenes que foram identificados que são notáveis por sua capacidade de colonizar os corações dos animais infectados na ausência de qualquer dano cardíaco e/ou anormalidades8.
Aqui são descritos métodos in vitro e in vivo para avaliar a colonização bacteriana do tecido cardíaco dentro de animais infectados usando ensaios de invasão na cultura tecidual, bem como infecções animais vivos. Esses métodos têm se mostrado úteis não apenas para identificar cepas com potencial para colonizar tecido cardíaco em animais infectados, mas também devem ser úteis para a identificação de produtos genéticos bacterianos que servem para melhorar a invasão celular cardíaca e/ou resultar em alterações na patologia cardíaca. Esses métodos facilitam a comparação do cardiotropismo entre múltiplas cepas. Para os métodos aqui descritos, l. monocytogenes 10403S é usado como um representante bem estudado de uma cepa não cardiotrópica e o isolado clínico 07PF0776 é usado como um exemplo representativo de uma cepa cardiotrópica. Essas duas cepas foram escolhidas para fornecer uma comparação para a invasão bacteriana de células cardíacas in vitro e colonização de corações de camundongos infectados in vivo. O isolado 07PF0776 é um isolado clínico recuperado de um abscesso interventricular que causou uma arritmia fatal em um paciente HIV+8. L. os isolados de monocytogenes podem variar em seu potencial de virulência, e dada a propensão para listeria infectar pessoas com imunossupressão e gestantes, as pessoas dentro dessas populações devem ter cuidado ao avaliar diferentes isolados clínicos.

<table><tbody><tr><td>Difco</td><td>BHI Broth Base</td><td>237200</td><td>2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar)</td></tr><tr><td>Difco</td><td>Agar</td><td>214510</td><td>2 kg of Granulated Agar</td></tr><tr><td>Difco</td><td>BHI Agar</td><td>241810</td><td>2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar</td></tr><tr><td>in vitrogen</td><td>LB Broth Base</td><td>12975-084</td><td>2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Glass Coverslips</td><td>12-545-80</td><td>12 mm glass coverslips</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>24-well Tissue Culture Plate</td><td>35-3047</td><td>24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>14mL Polystyrene tube</td><td>352051</td><td>14 ml Polystyrene tubes</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>96-well U-bottom plate</td><td>35-3077</td><td>Non-tissue culture treated 96-well plate</td></tr><tr><td>Corning</td><td>0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X)</td><td>25-052-CI</td><td>Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture</td></tr><tr><td>Corning</td><td>DMEM (High glucose, high pyruvate)</td><td>15-013-CU</td><td>DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Pen/Strep/Glut Solution</td><td>30-009-CI</td><td>Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Gentamicin</td><td>30-005-CR</td><td>50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture</td></tr><tr><td>Cellgro (Corning)</td><td>L-Glutamine</td><td>25005197</td><td>Stock L-glutamine solution without antibiotics</td></tr><tr><td>Denville</td><td>75cm^2 Flask</td><td>T1225</td><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture treated flask</td></tr><tr><td>Denville</td><td>1.5mL microcentrifuge tubes</td><td>2013004</td><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>ATCC</td><td>H9c2 Cardiac Myoblasts</td><td>CRL-1446</td><td>Rat cardiac myoblasts</td></tr><tr><td>Hyclone</td><td>Fetal Bovine Serum</td><td>SH30070.63</td><td>Fetal Bovine Serum</td></tr></tbody></table>

assessing bacterial invasion of cardiac cells in culture and heart colonization in infected mice using listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular facultativo gram-positivo que é capaz de causar infecções invasivas graves em pacientes imunocomprometidos, idosos e gestantes. As manifestações mais comuns de listeriose em humanos incluem meningite, encefalite e aborto fetal. Uma sequência significativa, mas muito menos documentada de infecção invasiva de L. monocytogenes envolve o coração. A taxa de mortalidade por doença cardíaca pode ser de até 35% apesar do tratamento, porém muito pouco se sabe sobre a colonização de L. monocytogenes de tecido cardíaco e suas patologias resultantes. Além disso, tornou-se recentemente evidente que as subpopulações de L. monocytogenes têm uma capacidade aumentada de invadir e crescer dentro do tecido cardíaco. Este protocolo descreve em detalhes métodos in vitro e in vivo que podem ser usados para avaliar o cardiotropismo de L. monocytogenes isolados. Métodos são apresentados para a infecção de míbios cardíacos de rato H9c2 na cultura tecidual, bem como para a determinação da colonização bacteriana dos corações dos camundongos infectados. Esses métodos são úteis não apenas para identificar cepas com potencial para colonizar tecido cardíaco em animais infectados, mas também podem facilitar a identificação de produtos genéticos bacterianos que servem para melhorar a invasão de células cardíacas e/ou promover alterações na patologia cardíaca. Esses métodos também preveem a comparação direta do cardiotropismo entre múltiplas cepas de L. monocytogenes.

Isolados selecionados de L. monocytogenes exibem maior invasão de células cardíacas na cultura celular e em modelos de infecção de camundongos. A Figura 1 mostra um exemplo de como as colônias bacterianas podem aparecer após o revestimento de suspensões na mídia ágar. Este método permite uma avaliação precisa das CFUs dentro de uma amostra sem o uso de um grande número de placas de mídia ágar. A Figura 2 mostra um exemplo de um ensaio baseado em cultura tecidual comparando a capacidade da cepa 10403S de invadir células cardíacas com a da cepa 07PF0776. Mais do que o dobro da CFU bacteriana 07PF0776 pode ser recuperada de células cardíacas H9c2 infectadas após o tratamento de gentamicina em comparação com células infectadas com 10403S. Diferenças de 2 a 4 vezes são observadas rotineiramente para cepas cardiotrópicas usando este ensaio. A Figura 3 mostra um exemplo da recuperação de bactérias dos fígados, baços e corações de camundongos infectados aos 3 dias após a infecção. A infecção de camundongos com a cepa cardiotrópica 07PF0776 ou cepa 10403S resulta em número comparável de bactérias recuperadas dos fígados e baços de camundongos infectados, no entanto camundongos infectados com 07PF0776 são mais propensos a produzir números detectáveis de bactérias do coração e a apresentar maiores cargas bacterianas neste órgão.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52497/52497fig1.jpg"> Figura 1: Exemplo da técnica de revestimento de manchas para determinar cfus bacterianos. As células H9c2 cultivadas em tampas de vidro e infectadas com L. monocytogenes foram diluídas e as suspensões foram diluídas em série usando diluições de 1:10 até uma diluição de 1:1.000 (painel esquerdo). Um pipet multicanal foi usado para pipet 10 ul de cada poço diretamente em uma placa de ágar LB, e a placa foi incubada durante a noite a 37 °C (painel direito). O número de bactérias por deslizamento de cobertura é avaliado pela contagem da CFU bacteriana associada à diluição apropriada.
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52497/52497fig2.jpg"> Figura 2: L. monocytogenes tensão 07PF0776 exibe invasão aprimorada de células cardíacas na cultura tecidual. Os ensaios de invasão foram realizados em células H9c2 usando um MOI = 100. O gráfico mostra o número médio de CFUs bacterianas intracelulares recuperadas +/- SE de células infectadas com 10403S (preto) versus a cepa cardiotropica 07PF0776 (azul). ** indica um significado de p <0,01.
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52497/52497fig3.jpg"> Figura 3: L. monocytogenes tensão 07PF0776 exibe invasão aprimorada do coração em modelos de infecção por camundongos. Os animais foram vacinados com 10.000 UFC pela veia traseira. As infecções foram autorizadas a progredir por 72 horas, momento em que os animais foram sacrificados e os fígados, baços e corações foram coletados e processados para determinar a UFC bacteriana por órgão. Os círculos sólidos representam a UFC obtida a partir de camundongos individuais, com o valor médio para todos os animais dentro de um grupo indicado por uma linha +/- SE. Os valores percentuais indicam o número de animais contendo UFC bacteriana detectável dentro do coração. * indica um significado de p <0,05.

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Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causa infecções fetais em gestantes e meningite em populações suscetíveis. Subpopulações de bactérias podem colonizar tecido cardíaco, causando miocardite em pacientes e animais de laboratório. Aqui apresentamos um protocolo que descreve como avaliar a invasão de células cardíacas L. monocytogenes in vitro e colonização cardíaca em animais infectados.

Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas na cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

assessing-bacterial-invasion-cardiac-cells-culture-heart-colonization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

5.4K visualizações.  College of Medicine, University of Illinois at Chicago. Listeria monocytogenes causa infecções fetais em gestantes e meningite em populações suscetíveis. Subpopulações de bactérias podem colonizar tecido cardíaco, causando miocardite em pacientes e animais de laboratório. Aqui apresentamos um protocolo que descreve como avaliar a invasão de células cardíacas L. monocytogenes in vitro e colonização cardíaca em animais infectados. 

Vídeo: Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Imunologia e Infecção

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the gastrointestinal phase of listeriosis due to the lack of a small animal model that closely mimics human disease. This paper describes a novel mouse model for oral transmission of L. monocytogenes. Using this model, mice fed L. monocytogenes-contaminated bread have a discrete phase of gastrointestinal infection, followed by varying degrees of systemic spread in susceptible (BALB/c/By/J) or resistant (C57BL/6) mouse strains. During the later stages of the infection, dissemination to the gall bladder and brain is observed. The food borne model of listeriosis is highly reproducible, does not require specialized skills, and can be used with a wide variety of bacterial isolates and laboratory mouse strains. As such, it is the ideal model to study both virulence strategies used by L. monocytogenes to promote intestinal colonization, as well as the host response to invasive food borne bacterial infection.

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

This paper describes a novel method for oral infection of mice using Listeria monocytogenes-contaminated food. The protocol can readily be adapted for use with other food borne bacterial pathogens.

Transmissão Oral de<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Em camundongos através de ingestão de alimentos contaminados

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Infecção experimental com<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como um modelo para estudar o anfitrião Respostas interferão-y

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled microscopic lesions (microlesions) that are remarkable due to the absence of infiltrating immune cells. Due to their release of cardiotoxic products, S. pneumoniae within microlesions are thought to contribute to the heart failure that is frequently observed during fulminate invasive pneumococcal disease in adults. Herein is demonstrated a protocol for experimental mouse infection that leads to reproducible cardiac microlesion formation within 30 hr. Instruction is provided on microlesion identification in hematoxylin &#38; eosin stained heart sections and the morphological distinctions between early and late microlesions are highlighted. Instruction is provided on a protocol for verification of S. pneumoniae within microlesions using antibodies against pneumococcal capsular polysaccharide and immunofluorescent microscopy. Last, a protocol for antibiotic intervention that rescues infected mice and for the detection and assessment of scar formation in the hearts of convalescent mice is provided. Together, these protocols will facilitate the investigation of the molecular mechanisms underlying pneumococcal cardiac invasion, cardiomyocyte death, cardiac remodeling as a result of exposure to S. pneumoniae, and the immune response to the pneumococci in the heart.

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

Visualização de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Dentro Microle- cardíacas e remodelação cardíaca Subsequente

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Medicina

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.

Listeria monocytogenes Infecção do cérebro

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

Usando um patógeno bacteriano para sonda para celular e organísmica-nível Host respostas

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A Technique to Establish a Bacterial Infection Model in an Ex Vivo Organ Culture

Source: Rizzuto, G. A., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54237">Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates a method to establish an infection model in placental tissues to study infection propagation. An ex vivo placental organ culture is infected with Listeria monocytogenes, a facultative intracellular parasite. The bacteria invade extravillous trophoblasts (EVTs) to enter the placental tissue and then propagate to other cells via cell-to-cell spread.

Uma técnica para estabelecer um modelo de infecção bacteriana em uma cultura de órgãos ex vivo

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunologia

Imunopatologia

Modelos in vitro

Quantification of Bacterial Infection in Host Cells by the Colony-Forming Unit Assay

Source: Gayle, P. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/58775">Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2019).
This video demonstrates an in vitro quantification technique to determine Listeria monocytogenes infection of macrophages by the colony-forming unit assay. The bacterial colonies on the agar plate represent the intracellular bacterial population that escapes the host-defense mechanism and survives within the macrophages.

Quantificação da infecção bacteriana em células hospedeiras pelo ensaio da unidade formadora de colônias

Source: Gayle, P. et al., Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2019).
This video ...

Resposta Imune

Interação Hospedeiro-Patógeno

Flow Cytometry Analysis of Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes In Vitro

Source: Gayle, P. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/58775">Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we quantify intracellular and extracellular Listeria monocytogenes, an intracellular pathogenic bacteria, following their infection of cultured macrophages in vitro using flow cytometry.

Análise de citometria de fluxo de Listeria monocytogenes intracelular e extracelular emergente in vitro

Source: Gayle, P. et al., Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses. J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we ...

Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas na cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando listeria monocytogenes

Resumo

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Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes

Transmissão Oral de

Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano

Infecção experimental com

Visualização de

Listeria monocytogenes Infecção do cérebro

Usando um patógeno bacteriano para sonda para celular e organísmica-nível Host respostas

Uma técnica para estabelecer um modelo de infecção bacteriana em uma cultura de órgãos ex vivo

Quantificação da infecção bacteriana em células hospedeiras pelo ensaio da unidade formadora de colônias

Análise de citometria de fluxo de Listeria monocytogenes intracelular e extracelular emergente in vitro