The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.

NOTA: Consulte a Figura 2 para uma visão geral do fluxo do processo que compreende a preparação, as etapas de aquisição de dados e análise de dados. 1. Instalação do Reagente NOTA: Todos os produtos químicos devem ser manuseados com cuidado, e, portanto, um jaleco, luvas e proteção para os olhos devem ser usados. Todas as operações devem ser realizadas numa hote de laboratório. Em particular, as luvas especiais devem ser usados ​​em caso de utilização de clorofórmio. <ol><li> Use produtos químicos com baixo teor de água, tais como clorofórmio seca rapidamente e armazenar seco, mas não mais de uma semana. Armazenar os produtos químicos a -20 ° C e sob atmosfera de azoto ou árgon no estado gasoso, porque APTES ((3-aminopropil) triethoxysilan) (ver Tabela 1) e PEG (polietilenoglicol) são higroscópicos e PEG é sujeito a oxidação no ar. </li><li> Para evitar a exposição freqüente do estoque de oxigênio atmosférico e umidade, preparar alíquotas menores, de preferência dentro de um sistema de porta-luvas com uma atmosphe nitrogêniore. </li></ol> 2. Preparação do Equipamento NOTA: Para evitar uma possível contaminação cruzada, use vasos frescas e limpas para cada etapa. <ol><li> Limpa vidros e uma pinça em solução detergente durante 30 minutos num banho de ultra-sons a 60 ° C. </li><li> Enxágüe e equipamentos sonicate do passo 2.1 duas vezes com água ultrapura. </li><li> Equipamento de calor a partir do passo 2.1 em solução RCA (água ultrapura, peróxido de hidrogénio e amoníaco (5: 1: 1)) a 75 ° C num forno durante 45 minutos e, subsequentemente, lavar com água ultrapura. </li><li> Finalmente, secar os utensílios de vidro e pinças sob uma corrente de azoto seco ou num forno (100 ° C, 3 h). </li></ol> 3. Dica funcionalização NOTA: Use uma pinça, navios, etc. feita a partir de aço inoxidável, PTFE, vidro ou qualquer outro material que seja quimicamente estável em soluções orgânicas, se aplicável. Salvo disposição em contrário, realizar todas as etapas em RT. A quantidade de solução de incubação necessário depende do número de fichas de cantilever. Certifique-se de que as consolas estão imersos nas respectivas soluções em todos os tempos. NOTA: Use um capuz para evitar a inalação de vapores orgânicos. <ol><li> A formação de grupos OH na superfície do cantilever (&quot;activação&quot;) (aproximadamente 0,5 horas): <ol><li> Use uma pinça para colocar fichas frescos cantilever (materiais: o pecado, constante da mola: 10-100 PN / nm) sobre uma lâmina de vidro limpa e colocá-los em uma câmara de plasma (100 W). </li><li> Evacuar câmara (~ 0,1 mbar). </li><li> Flood câmara com gás oxigênio e evacuar novamente. </li><li> Ative o processo de plasma (poder: 20%, duração: 15 min, a pressão do processo: 0,25 mbar). </li></ol></li><li> Amino-silanização de consolas (aproximadamente 1 hr): <ol><li> Prepare os 2,5 ml de solução de APTES (ver Tabela 1) numa placa de Petri de vidro - fazer isso idealmente durante o processo de plasma. </li><li> Immediately após o processo de plasma, mergulhe cada cantilever por 1 segundo em acetona e colocá-los logo em seguida na solução APTES. </li><li> Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Cuidadosamente lavar os chips cantilever duas vezes em 10 ml de acetona e uma vez com 10 ml de clorofórmio. </li><li> Opcionais etapa final: fichas Lugar cantilever a partir da etapa anterior em uma lâmina de vidro limpa e asse por 30 minutos a 70 ° C. Note-se que também existem estratégias alternativas para a ativação de superfície, por exemplo, o tratamento UV 12. </li></ol></li><li> PEGuilação (aproximadamente 2 horas): NOTA: Execute as operações de 3.3.1-3.3.4 durante amino-silanização. NHS e grupos maleimida estão sujeitas a hidrólise em ambientes aquosos e PEG em si é sujeito a oxidação no ar. Portanto, o tempo (em especial entre as etapas) é um parâmetro crítico. Consulte a 13 para obter mais informações. <ol><li> Preparar a solução de clorofórmio (ver Tabela 1). </li><li> Para evitar a condensação, Quente PEG pulveriza até RT antes de abrir a alíquota e pesando a quantidade apropriada. </li><li> Para o acoplamento de polímeros ou de lípidos com grupos amino, resolver separadamente NHS-PEG-NHS (6 kDa) e metil-PEG-NHS (5 kDa) em solução de clorofórmio com vortex até que eles estão completamente resolvido. Consulte a Tabela 1 para concentrações. <ol><li> Alternativamente. para o acoplamento de polímeros com grupos tiol resolver separadamente NHS- PEG-Mal e metil-PEG-NHS em solução de clorofórmio. </li></ol></li><li> Misturar as soluções como necessária para ajustar uma determinada relação entre o número ou o NHS- maleimide- e as moléculas de PEG terminado em metilo (tipicamente 1: 500). Note-se que a proporção ideal tem de ser determinada de forma iterativa em uma série de ciclos de preparação-experimentais. </li><li> Incubar fichas cantilever na solução de PEG durante 1 hora num ambiente saturado de clorofórmio para evitar a evaporação do clorofórmio. </li></ol></li><li> Sonda conjugação molécula(&gt; 1 hora): NOTA: No seguinte 3.4.1-3.4.3, três exemplos para o acoplamento covalente de diferentes moléculas sonda para a ponta do AFM são descritos. Para cada molécula do protocolo tem de ser ajustada. Além disso, note, que no exemplo 1 e 3 do SNS-química é utilizada ao passo que no exemplo 2, o polímero funcionalizado tiol PI-g-PS é acoplado ao PEG por meio de maleimida-química. Para mais detalhes ver 14. <ol><li> Para poli (aminoácido) poli-D-tirosina (40-100 kDa) <ol><li> Dissolver o polytyrosine conjugado molécula sonda em NaOH 1 M. Ajustar a concentração de 1 mg / ml. </li><li> Troque o NaOH para tampão de borato de sódio (pH 8,1), utilizando colunas de spin dessalinização (7 kDa MWCO) imediatamente antes da funcionalização </li><li> Lavar as consolas primeiro com 5 ml de clorofórmio, em seguida, com 5 ml de etanol e finalmente com 5 ml de tampão de borato. </li><li> Incubar os chips cantilever durante 1 hora na solução tampão polytyrosine borato e depois enxaguar com tampão boratoe água ultrapura. Guarde em água ultrapura até que a medição. </li></ol></li><li> Para polímeros com uma espinha dorsal linear (poli-isopreno, 119 kDa), que tem cadeias laterais enxertadas (poliestireno, 88 kDa) 14 <ol><li> Dissolve-se o PI- g -PS em clorofórmio seco. Ajustar a concentração da solução de conjugação a 4 mg / ml. </li><li> Lavar as consolas com 5 ml de clorofórmio e incubar durante pelo menos 1 h na solução de conjugação. </li><li> Lavar novamente em 5 ml de clorofórmio e armazenar em clorofórmio num ambiente saturado-clorofórmio (para evitar a evaporação clorofórmio) até que a medição. </li></ol></li><li> Para o Papa lipídico <ol><li> Dissolver PAPA em clorofórmio seco. Ajustar a concentração para 20 mM. </li><li> Lavar as consolas com 5 ml de etanol e 5 ml de água ultrapura antes da incubação das consolas de 1 h na solução de lípidos. </li><li> Após a incubação, lavar consolas com 5 ml de clorofórmio, 5 ml de etanol e 5 ml de, água ultrapura quente (por esta ordem) para remover moléculas de sonda não ligados e se livrar de resíduos de clorofórmio. Use dicas funcionalizados imediatamente. Alternativamente, armazená-los em clorofórmio até ser necessário. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig1.jpg" /> Figura 1. (A) esquemático, mostrando o processo de funcionalização ponta usando o exemplo de NHS química. Ligação (B) Chemical empregada para anexar uma molécula sonda para a ponta através de um grupo amino. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52456/52456fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Preparação 4. Superfície <ol><li> Auto-montado monocamada (SAM) NOTA: Como a superfície para o primeiro exemplo, uma monocamada auto-montada foi escolhido. Consulte a literatura 15 </sup&gt; para mais detalhes. <ol><li> Lâminas de vidro limpas com uma solução de detergente e em seguida, duas vezes em água ultrapura num banho de ultra-sons durante 30 min cada. Em seguida, como um passo adicional de limpeza, colocá-los na solução de RCA (ver passo 2.3) a 75 ° C durante 15 min. </li><li> Brasão as lâminas com 10 níquel cromo nm e 100 nm de ouro em um coater vácuo. Então guarde na geladeira e limpo novamente na solução RCA diretamente antes da próxima etapa. </li><li> Incubar as lâminas do passo anterior em 2 mM de solução de 1-dodecanthiol / etanol durante 12 horas. Os grupos tiol que se ligam a superfície de ouro e uma monocamada auto hidrofóbico monta. Lavar as lâminas com etanol e água ultrapura e depois seco por uma corrente de azoto gasoso. Confirme a hidrofobicidade da superfície preparada com medidas de ângulo de contato estáticos em um goniômetro com uma câmera CCD de 10. </li></ol></li><li> Hydrogen diamante encerrado NOTA: Como uma superfície para o segundo exemplo, um diamante terminada hidrogénio foi escolhido. A preparação da superfície foi realizada como descrito anteriormente 16. </li><li> Bicamada lipídica Compatível NOTA: No último exemplo, uma superfície apoiada bicamada lipídica (SLB), foi utilizado como uma superfície. Para obter uma tal superfície, uma solução (0,1 mg / ml) de vesículas unilamelares grandes (LUV), contendo o fosfolipido POPC foram formados pelo método de extrusão. Em seguida, 50 ul da solução LUV foram colocadas sobre uma folha de mica clivada de fresco (A = 1 cm) e incubadas durante 30 min. Finalmente a solução foi lavada com 20 ml de água ultrapura. Veja 17,18 para uma descrição detalhada da preparação do SLBS. </li></ol> 5. Aquisição de Dados NOTA: Para os experimentos, use um AFM, que oferece a capacidade de medir em líquidos. Os procedimentos de aquisição de dados e análise de dados são aplicáveis ​​independentemente do modelo de AFM usado. Além disso, em algumas experiências, é vantajoso ter a possibilidade de controlar a temperature líquido no interior da célula. Cantilever deflexão foi detectado através do método de deflexão do feixe de laser 19. Constantes de flexão foram determinados com o método térmico ruído 20. <ol><li> Inserir o braço de suporte funcionalizado em um suporte de AFM cantilever que é adequado para a medição de fluidos. </li><li> Colocar a superfície (preparação ver acima) para ser amostrada na AFM e cobri-lo com o líquido. Ambos, o braço de suporte e a superfície deve agora ser imerso no líquido com a ponta cantilever que aponta na direcção da superfície. Note-se que, em muitos casos, uma gota de líquido é suficiente. Em qualquer caso, a evaporação do fluido deve ser evitado, por exemplo, usando uma célula de fluido em circuito fechado. </li><li> Se for o caso, ajustar a temperatura desejada no controlador. </li><li> Deixar o sistema equilibrar durante pelo menos meia hora. </li><li> Gravar um espectro de ruído térmico do cantilever com o cantilever longe a partir da superfície, a fim de excluir quaisquer efeitos de amortecimento superfície. Note-se que geralmente 10 ou mais espectros têm de ser acumulados para obter uma razão sinal-para-ruído suficiente. </li><li> Aproxime-se da superfície. Note-se que, a fim de conservar a geometria da ponta e ponta funcionalização o processo de abordagem tem de ser realizada com cuidado. Isto pode ser conseguido através de, por exemplo, aproximando-se em modo de contacto intermitente. </li><li> Determinar a sensibilidade inversa óptica alavanca (InvOLS) medido em nm / volt. Para fazer isso, empurrando a ponta cantilever contra uma superfície dura. <ol><li> Determinar os InvOLS medindo a inclinação da distância do curso de piezo versus a mudança na tensão fotodiodo. Unir a parte da curva de força-distância, em que a ponta do braço de suporte se encontra em contacto com a superfície. Em experimentos envolvendo uma superfície macia como bicamadas lipídicas, realizar esta etapa em áreas que não são cobertas com uma bicamada lipídica (&quot;pontos de defeitos&quot;). </li></ol></li><li> Determinar a constante da mola (pN / nm) por montagem de um oscilador de harmónica do espectro de ruído térmico. Usofunção de software automatizado para a primavera determinação constante; caso contrário, consultar a literatura 20. </li><li> Iniciar a experiência. <ol><li> Curvas numerosos força-recorde distância em cada condição experimental. Normalmente, usar os seguintes valores para os parâmetros experimentais: Taxa de amostragem de 5 kHz, velocidade de ponta de 1 mm / s, retrair distância de 1 m. NOTA: Por vezes, dependendo da dinâmica do experimento estudado, pode ser necessário esperar uma certa quantidade de tempo com a sua extremidade em contacto com a superfície (&quot;Tempo paragem&quot;). NOTA: O experimento parâmetros específicos pode desviar-se substancialmente dos valores indicados acima. </li><li> Durante a medição a longo prazo, de zero a posição do laser sobre o fotodíodo de tempos a tempos, reposicionando o fotodiodo. </li><li> Opcional: Depois de cada curva de força, mudar o local da AFM-ponta para outra posição xy. </li><li> No final da experiência, determinam a sensibilidade e a mola CONSTAnt novamente para verificar a consistência e estabilidade do sistema. NOTA: Comparando a constante da mola e sensibilidade antes e depois da experiência é também um meio para assegurar que as propriedades do sistema e as propriedades da ponta permaneceu inalterada ao longo do curso do experimento. Se a diferença das constantes de mola não é demasiado grande (&lt;= 15%), que pode ser calculada a média, uma vez que a incerteza intrínseca da mola determinação constante é também cerca de 15%. Para diferenças maiores, é aconselhável primeiro encontrar e eliminar a causa para a constante de mola aparente mudança antes de prosseguir com mais experiências. </li></ol></li></ol> 6. Data Preparation NOTA: Nesta seção geral etapas de preparação de dados que são tipicamente realizadas independente do tipo específico de experiência para converter unidades de Newton e nanométrica, bem como para corrigir os dados são descritos. As análises de dados específicos da experiência estão briefly descrito mais abaixo na respectiva seção exemplo representativo. <ol><li> Normalmente, realizar toda a preparação e análise de dados passos automaticamente por um algoritmo de home-escrita, por exemplo, com base no software IGOR Pro 6. </li><li> Converter o sinal de deflexão raw (Defl) [V] em vigor, multiplicando-o com os InvOLS [nm / V] e primavera constante [nN / nm]. </li><li> Compensar a força de tal forma que a força sobre o braço de suporte de uma distância suficiente da superfície (cantilever descarregada) torna-se 0 nN. </li><li> Calcula-se a posição real da ponta (também chamado de separação, quando medido em relação à superfície) z *, o que leva a flexão do braço de suporte em conta: <img alt="Equação 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52456/52456eq1.jpg" /></li><li> Deslocamento z *, de tal maneira que z * = 0 corresponde à posição z da superfície. NOTA: Aqui, F é a força que actua sobre a ponta e, por conseguinte, curvaé o braço de suporte (determinado no passo 6.2.), z é a posição medida do sensor z (determinado directamente pelo instrumento) e o símbolo k representa a constante da mola (determinado no passo 5.8). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig2.jpg" /> Figura 2. Processo de diagrama de fluxo mostrando a preparação da amostra, a aquisição de dados e análise dos dados. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52456/52456fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor.">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li><li>Morfill, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-matured+recombinant+antibody+fragments+analyzed+by+single-molecule+force+spectroscopy.">Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Durante as últimas décadas, os experimentos única molécula ter fornecido informações sem precedentes sobre mecanismos moleculares e acabou por ser uma abordagem de valor inestimável em ciências da vida e além. Para alcançar bons e estatísticas significativas de experiências SMFS, de preferência uma e a mesma molécula é usado ao longo de todo o decurso da experiência. Em contraste com as experiências com conjuntos de moléculas, as experiências SMFS são capazes de detectar eventos raros e estados moleculares escondidos. Outra vantagem dos experimentos única molécula é que eles podem ser modelados por meio de simulações de dinâmicas moleculares 24,25. O protocolo de funcionalização cantilever descrito acima é uma versão modificada de procedimentos publicados anteriormente 26 - 28. Após a activação e a silanização, o cantilever AFM é funcionalizado com uma mistura de dois tipos diferentes de polietileno-glicol (PEG) moléculas (moléculas de ligação). N- amino-reativa grupo (NHS) (ou um grupo maleimide reativa tiol), onde mais tarde na molécula sonda é conjugado (&quot;NHS-PEG&quot;, &quot;Mal-PEG&quot;). Ver Figura 1 para uma representação esquemática da funcionalização ponta. O propósito do PEG é triplo: Em primeiro lugar, passivantes superfície da ponta e, por conseguinte, impede que a adsorção inespecífica. Em segundo lugar, usando uma determinada relação de metil-PEG / NHS-PEG permite o ajustamento da concentração de NHS-PEG na superfície da ponta. E em terceiro lugar, que separa a ponta da sonda a partir da molécula e, portanto, permite a quantificação da interacção molécula de superfície, sem interferência da interacção directa ponta da superfície. Em seguida, a molécula sonda está covalentemente acoplada à ponta através do NHS-PEG (ou Mal-PEG). Este protocolo garante que todas as obrigações (*) no &amp; #8220; ponta da cadeia de acoplamento &quot;* OH * * silano PEG * molécula sonda são ligações covalentes e, portanto, muito forte. Este, por sua vez, permite que uma e a mesma molécula de sonda é medida ao longo de toda a duração da experiência. Isto foi exemplificado acima, na seção representante resultados mostrando verdadeiro espectroscopia de força molécula única. Como pode-se verificar que verdadeiramente uma única molécula é medido? Para traços individuais com platôs de força constante, uma única gota para a linha de base é suficiente. Se mais do que um polímero é dessorvido, ao mesmo tempo, a força cai para zero em vários passos discretos, como cada polímero separa num ponto diferente. Mais difícil é decidir se é cada vez que a mesma molécula única. Por conseguinte, a distribuição de comprimentos de descolamento deve ser avaliada. Uma distribuição estreita de um único pico é uma boa indicação de que uma e a mesma molécula única foi sondado em todos os vestígios de força de extensão. Para traços individuais com rupteventos ure, a sobreposição de todos os vestígios é o melhor método para decidir se (uma e a mesma) numa molécula única foi medido. Alternativamente, cada traço pode ser equipado com um modelo (WLC) e, em seguida, o comprimento de persistência e os comprimentos de ruptura na uma força definida pode ser traçada. A distribuição destes dois parâmetros deve ser estreita e único pico. Em conclusão, um procedimento de preparação para a fixação de uma grande variedade de moléculas individuais a sonda de AFM foi apresentado. Pequena ponta do AFM (raio ~ 10 nm), as suas capacidades de posicionamento lateral e sua sensibilidade vigor tornam a ferramenta ideal para estudar as propriedades de adesão de moléculas individuais em superfícies biológicas e não biológicas em quase todo o líquido.

Ao longo dos últimos 30 anos, microscopia de força atômica (AFM) acabou por ser uma técnica valiosa imagem para estudar biológicos 1,2 e sintéticas 3 materiais e superfícies, uma vez que fornece resolução espacial molecular em todas as três dimensões e pode ser operado em vários solvente ambientes. Além disso, a força molécula espectroscopia AFM-single (SMFS) permite medir forças que vão desde o PN a μN regime e deu uma visão sem precedentes por exemplo em proteína dobrar 4,5, física polímero 6-8, e interação molécula de superfície única 9 - 12 .A lógica por trás estudar moléculas individuais, em vez de um conjunto de moléculas é para evitar efeitos que muitas vezes mascaram eventos raros ou estados moleculares escondidos em média. Além disso, um grande número de parâmetros moleculares, tais como o comprimento do contorno, o comprimento Kuhn, a energia livre de adesão, etc., podem serobtida. Este é detalhado nos exemplos abaixo. Numa experiência típica AFM-SMFS, a molécula de sonda é acoplada a uma ponta muito afiada através de uma molécula ligante. A ponta em si está localizado na extremidade de um braço de suporte flexível. Se a ponta é colocada em contacto com a superfície da molécula de sonda irá interagir com esta superfície. Observando-se a deflexão do braço de suporte à retracção da ponta, a força, e, por conseguinte, a energia livre, para separar a molécula de superfície pode ser determinada. Para obter estatísticas significativas, um grande número de chamadas curvas força-distância tem que ser adquirido. Além disso, para ter verdadeiros experimentos única molécula (isto é, utilizando uma e a mesma molécula sonda ao longo da duração de todo o experimento) a molécula sonda deve ser acoplado de forma covalente à ponta de AFM. Aqui, um protocolo experimental para a funcionalização cantilever com uma única molécula através de uma ligação covalente é apresentado. A única molécula ou pode ser acoplada por via de um grupo amino ou um tiol grupo para a ponta do AFM. O processo de conjugação pode ser realizada numa ampla variedade de solventes orgânicos e aquosos () para ter em conta as propriedades de solvatação dos polímeros usados. Na primeira parte, um protocolo geral para ligar covalentemente uma molécula única (&quot;molécula sonda&quot;) através de uma molécula ligante de uma ponta de AFM é descrito. Para este fim, NHS- orgânico ou maleimida-química é utilizado 13. Junto com o protocolo por três moléculas de exemplo, os processos de aquisição de dados e análise de dados são descritos e referências para leitura são fornecidos. Os exemplos de moléculas são: o (linear) tirosina polímero, o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA lipídica. Isto inclui ligeiras variações do protocolo, por exemplo, para ligar covalentemente cisteínas. Além disso, uma secção dedicada à preparação de superfícies diferentes, tais como uma superfície de diamante, um CH3 montado -auto-monocamada e bicamadas lipídicas. Essas interfaces tem proven ser boas referências e exemplos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution)</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v))</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Vectorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry acetone (&#60; 50 ppm H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry chloroform (&#62; 99.9 %)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Biochrom, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodium tetraborate (&#62; 99.5 %)</td>
			<td>Biochrom, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Biochrom, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monofunctional &#945;-methoxy-&#969;-NHS PEG, 5kDa, &#8220;methyl-PEG-NHS&#8221;</td>
			<td>Rapp, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterobifunctional &#945;,&#969;-bis-NHS PEG, 6 kDa, &#8220;NHS-PEG-NHS&#8221;</td>
			<td>Rapp, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterobifunctional &#945;-maleimidohexanoic- &#969;-NHS PEG, 5 kDa, &#8220;Mal-PEG-NHS&#8221;</td>
			<td>Rapp, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule (polymer, lipid, etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 &#181;l) and glass lids</td>
			<td>VWR International GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory oven model UF30</td>
			<td>Memmert, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled sonicator</td>
			<td>VWR International GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma system &#34;Femto&#34;, 100 W</td>
			<td>Diener, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One separate glass syringe for each organic solvent</td>
			<td>VWR International GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR International GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes: 10-100 &#181;l, 50-200 &#181;l and 100-1000 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater)</td>
			<td>Asylulm Research, Santa Barbara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT)</td>
			<td>Bruker AXS, Santa Barbara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating single molecule adhesion by atomic force spectroscopy

Espectroscopia de força atômica é uma ferramenta ideal para estudar moléculas em superfícies e interfaces. Um protocolo experimental para acoplar uma grande variedade de moléculas individuais de forma covalente para uma ponta de AFM é apresentado. Ao mesmo tempo, a ponta de AFM é passivado para evitar interacções não específicas entre a ponta e o substrato, o que é um pré-requisito para estudar moléculas individuais ligados à ponta de AFM. As análises para determinar a força de adesão, o comprimento de aderência, e a energia livre destas moléculas em superfícies sólidas e bio-interfaces são pouco apresentados e referências externas para leitura são fornecidos. Exemplos são as moléculas a polytyrosine poli (aminoácidos), o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA fosfolípido (1-palmitoil-2-oleoyl--sn-glicero-3-fosfoetanolamina). Estas moléculas são dessorvida a partir de diferentes superfícies como CH 3 -SAMs, hidrogénio terminada diamante e suportado bicamadas lipídicas sob várias condições do solvente. Finalmente, ovantagens da força espectroscópicas experiências de moléculas individuais são discutidas, incluindo meios para decidir se verdadeiramente uma única molécula tem sido estudada no experimento.

No que se segue, os resultados para o exemplo acima descrito, ou seja, a moléculas polytyrosine polímeros de poli (aminoácidos), o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA fosfolípido, são apresentados. Primeiro para cada exemplo, experimentar detalhes específicos para a aquisição de dados e preparação de dados são fornecidos. Em seguida, os resultados exemplares para experimentos onde essas moléculas foram dessorvidas de superfícies diferentes (CH3 -SAMs, hidrogênio encerrado diamante e lipídios bicamadas) são mostrados. Determinação da força de adesão, o comprimento de aderência e a energia livre são introduzidos. Exemplo 1: A dessorção dos polytyrosine de monocamada auto-montada A dessorção de polytyrosine de um SAM hidrofóbico em soluções diferentes, com um teor variável de etanol foi medido. Em cada solução InvOLS as constantes de mola cantilever e foram determinados tal como descrito acima e, pelo menos, 300 d forçavestígios istance foram registrados para cada solução. Todas as experiências de um conjunto experimental foi feito com um único braço de suporte num único dia, para garantir que uma e a mesma único poli (aminoácido) foi medido. A velocidade de extensão / retração do cantilever foi de 0,5 mm / segundo e o tempo de permanência na superfície foi de 1 seg. Os traços vigor distância mostrou planaltos de força constante. Cada patamar foi equipado com uma curva sigmoidal e a força de planalto, bem como o comprimento do planalto foram determinados e representados num histograma. Os histogramas foram equipadas com uma gaussiana e o valor de pico, bem como a variação do padrão (erro) de distribuição foi extraída. Até ao final do patamar de força, o sistema está em equilíbrio e a área por baixo do planalto, portanto, igual à energia livre por comprimento de polímero. Apenas o próprio processo de desprendimento na extremidade do planalto está em não-equilíbrio. Devido a isso, para experiências típicas do comprimento patamar é mais longo do que o equilibri<html> hum comprimento (cerca de 30%) e a área sob o sigmoidal adapta uma estimativa superior para a energia livre de aderência 21. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig3.jpg" /> Figura 3. (A) Força trace distância (retração) do polytyrosine em um metil-SAM em água pura (mostrado em vermelho). Apenas uma única molécula é dessorvido como pode ser visto na etapa única gota de força para a linha de base (força zero). O ajuste sigmoidal é mostrado em preto e o comprimento do planalto e extraída força planalto são indicados por setas. (B) Os histogramas da força de planalto extraído para medições em água pura e em misturas de água / etanol com diferente teor de etanol molar. histogramas de comprimento (C) Plateau do mesmo conjunto experimental. (D) comprimento Peak planalto vs. pico de força plateau &quot;.456 / &quot;target =&quot; _ 52456fig3large.jpg blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3A mostra um único vestígio de força-distância de polytyrosine medido em água pura. Força Plateau e comprimento planalto são extraídos. Se houver apenas uma molécula na ponta que é dessorvido da SAM, o histograma comprimento planalto mostra uma distribuição estreita e monomodal (tipicamente em experiências o desvio padrão em um ajuste gauss do histograma comprimento é de cerca de 5-20 nm). Vice-versa, se há apenas um pico estreito no histograma comprimento planalto, pode ser relativamente certeza de que todo o conjunto experimental foi feito com um único e mesmo polímero. A razão para isto é que os polytyrosines são altamente polydispersive em tamanho (de 50 a 100 kDa). Portanto, dois polímeros de exactamente o mesmo comprimento são altamente improvável. A adição de etanol enfraquece a interacção hidrofóbica entre polytyrosine e a superfície e 10,22conduz a uma menor energia livre de adsorção e, portanto, a uma força de patamar mais baixo, como pode ser visto nos histogramas de força patamar para as diferentes condições do solvente mostrado na Figura 3B. Agora ele pode ser investigado como o comprimento planalto de um único polytyrosine muda para energias livres de adsorção diferentes. Como pode ser visto na Figura 3C o comprimento planalto diminui com a adição de etanol. Ao mesmo tempo, as diminuições da força planalto (Figura 3D). A fim de obter todos os parâmetros relevantes do processo de dessorção a saber, o comprimento do contorno, o comprimento Kuhn, a energia livre de adsorção e de dessorção, a taxa intrínseca monomérica, tem de se combinar as medições acima descritas com experiências à distância constante. Para mais detalhes ver 21. Exemplo 2: A dessorção do polímero de enxerto PI- -PS g de um diamante hidrofóbico Na Figura 4A </strong&gt; e 4B curvas típicas força-distância obtida com PI- g -PS no diamante hidrogenada em água à temperatura ambiente são mostrados. O tempo de permanência na superfície foi de 1 segundo e a velocidade do cantilever era de 1 mm / seg. Ou os planaltos de força constante (Figura 4A) ou eventos de ruptura foram observadas (Figura 4B). Para os planaltos de força constante, a altura dos planaltos foi determinada com um ajuste sigmoidal e os resultados foram representados num histograma (Figura 4C). Para excluir o pico de adesão inespecífica causada por interacção directa da ponta com a superfície (primeiro pico na curva de força-distância na Figura 4B), a força máxima em alguma distância a partir da superfície foi determinada. Os valores obtidos para esses eventos de ruptura foram então representados num histograma (Figura 4D). Para posterior análise dos histogramas foram equipadas com uma gaussiana e a altura máxima foi escolhido como um valor médio para oponto de dados. Com este tipo de experiência, a influência da presença de cadeias laterais e a sua arquitectura foi investigada 14. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig4.jpg" /> Figura 4. Curvas de retração Force-distância percorrida com um backbone polisopreno linear enxertado com cadeias laterais de poliestireno (PI- g -PS). Ou os planaltos de força constante (A) ou eventos de ruptura (B) são observados. Para planaltos de força constante, a altura dos platôs é determinada com um ajuste sigmoidal e plotados em um histograma (C), enquanto que para os eventos de ruptura, a força de ruptura máxima é determinada (D). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52456/52456fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Exemplo 3: Extracção de uma única phospholipid (POPE) a partir de uma bicamada lipídica A Figura 5A mostra uma representação esquemática do processo de extracção de molécula única. Extracção medições foram realizadas por verticalmente aproximando-se da ponta de AFM POPE-funcionalizado para a bicamada lipídica suportado (não mostrado). Após o contacto da ponta com a bicamada POPC, uma pequena força (~ 100 pN) é mantido constante por um circuito de retroalimentação durante cerca de 4 seg. Se a molécula PAPA insere na bicamada durante este tempo de permanência, que é puxado para fora ou &quot;extraído &#39;a partir da bicamada ao retrair a ponta do AFM a partir da bicamada. Isso resulta em curvas características vigor distância. Sua forma é basicamente determinada pela elasticidade estiramento do vinculador PEG e pode ser equipado por um modelo de 23 cadeia wormlike (WLC). A sobreposição de mais de 50 curvas é mostrado na Figura 5B. Eventos única molécula verdadeiros podem ser reconhecidos por histogramas individuais força pontiagudos (Figura 5C </str<html> ong&gt;). Note-se que, a fim de obter mais conhecimentos sobre o tamanho de certo parâmetro molecular (por exemplo, o tempo de vida médio de lípidos em bicamada), é necessário efectuar medições com diferentes taxas de força de carga. Para uma análise mais aprofundada da única lipídico experimentos de extração ver 24. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig5.jpg" /> Figura 5. (A) Diagrama esquemático para a extracção de uma molécula única a partir de uma bicamada lipídica. Note-se que a molécula de lípido está ligada covalentemente à ponta. Portanto, muitas centenas ou mesmo milhares de ciclos de força de extracção pode ser realizada com uma única e mesma molécula. (B) A sobreposição de mais de 50 curvas de extracção 9. (C) Histograma da distribuição da força de extracção do exemplo mostrado em (B).&quot;target =&quot; _ blank .jpg &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Propósito </td><td> Soluto </td><td> Solvente </td><td> Proporção ou concentração típica </td></tr><tr><td> Silanização </td><td> Criar grupos amino na superfície cantilever </td><td> APTES (3-aminopropil) tri-ethoxysilane (por exemplo, Vectabond ™) </td><td> acetona seca </td><td> 01:50 (v / v) - 1: 100 (v / v) </td></tr><tr><td> PEGylation </td><td> Fornecer superfície cantilever com amino ou grupos tiol reactivos </td><td> NHS-PEG-Mal ou NHS-PEG-NHS </td><td> clorofórmio seco </td><td> 0,25-25 mM </td></tr><tr><td> PEGylation </td><td> Superfície cantilever passivate </td><td> metil-PEG-NHS </td><td> clorofórmio seco </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> Conjugação de molécula sonda </td><td> Pares molécula sonda através de um grupo amino ou tiol para PEG bi-funcional </td><td> molécula de sonda (polímero, de lípidos, etc.) </td><td> clorofórmio seco ou tampão borato </td><td> 0,1-10 mM </td></tr></tbody></table> Tabela 1. soluções necessárias para a funcionalização ponta.

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Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Investigando única molécula de adesão de Força Atômica Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Engineering

10.3K visualizações.  Technische Universität München. A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

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Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging is an important tool for understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the spatial and temporal heterogeneity of molecular behaviors that underlie cellular biology 1-4. To image an individual molecule of interest, it is typically conjugated to a fluorescent tag (dye, protein, bead, or quantum dot) and observed with epifluorescence or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. While dyes and fluorescent proteins have been the mainstay of fluorescence imaging for decades, their fluorescence is unstable under high photon fluxes necessary to observe individual molecules, yielding only a few seconds of observation before complete loss of signal. Latex beads and dye-labeled beads provide improved signal stability but at the expense of drastically larger hydrodynamic size, which can deleteriously alter the diffusion and behavior of the molecule under study.
Quantum dots (QDs) offer a balance between these two problematic regimes. These nanoparticles are composed of semiconductor materials and can be engineered with a hydrodynamically compact size with exceptional resistance to photodegradation 5. Thus in recent years QDs have been instrumental in enabling long-term observation of complex macromolecular behavior on the single molecule level. However these particles have still been found to exhibit impaired diffusion in crowded molecular environments such as the cellular cytoplasm and the neuronal synaptic cleft, where their sizes are still too large 4,6,7.
Recently we have engineered the cores and surface coatings of QDs for minimized hydrodynamic size, while balancing offsets to colloidal stability, photostability, brightness, and nonspecific binding that have hindered the utility of compact QDs in the past 8,9. The goal of this article is to demonstrate the synthesis, modification, and characterization of these optimized nanocrystals, composed of an alloyed HgxCd1-xSe core coated with an insulating CdyZn1-yS shell, further coated with a multidentate polymer ligand modified with short polyethylene glycol (PEG) chains (Figure 1). Compared with conventional CdSe nanocrystals, HgxCd1-xSe alloys offer greater quantum yields of fluorescence, fluorescence at red and near-infrared wavelengths for enhanced signal-to-noise in cells, and excitation at non-cytotoxic visible wavelengths. Multidentate polymer coatings bind to the nanocrystal surface in a closed and flat conformation to minimize hydrodynamic size, and PEG neutralizes the surface charge to minimize nonspecific binding to cells and biomolecules. The end result is a brightly fluorescent nanocrystal with emission between 550-800 nm and a total hydrodynamic size near 12 nm. This is in the same size range as many soluble globular proteins in cells, and substantially smaller than conventional PEGylated QDs (25-35 nm).

We describe the preparation of colloidal quantum dots with minimized hydrodynamic size for single-molecule fluorescence imaging. Compared to conventional quantum dots, these nanoparticles are similar in size to globular proteins and are optimized for single-molecule brightness, stability against photodegradation, and resistance to nonspecific binding to proteins and cells.

Compactas pontos quânticos para uma única molécula de imagem

Single-molecule imaging is an important tool for  understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the  spatial and temporal ...

Engenharia

Scanning-probe Single-electron Capacitance Spectroscopy

The integration of low-temperature scanning-probe techniques and single-electron capacitance spectroscopy represents a powerful tool to study the electronic quantum structure of small systems - including individual atomic dopants in semiconductors. Here we present a capacitance-based method, known as Subsurface Charge Accumulation (SCA) imaging, which is capable of resolving single-electron charging while achieving sufficient spatial resolution to image individual atomic dopants. The use of a capacitance technique enables observation of subsurface features, such as dopants buried many nanometers beneath the surface of a semiconductor material1,2,3. In principle, this technique can be applied to any system to resolve electron motion below an insulating surface.
As in other electric-field-sensitive scanned-probe techniques4, the lateral spatial resolution of the measurement depends in part on the radius of curvature of the probe tip. Using tips with a small radius of curvature can enable spatial resolution of a few tens of nanometers. This fine spatial resolution allows investigations of small numbers (down to one) of subsurface dopants1,2. The charge resolution depends greatly on the sensitivity of the charge detection circuitry; using high electron mobility transistors (HEMT) in such circuits at cryogenic temperatures enables a sensitivity of approximately 0.01 electrons/Hz&frac12; at 0.3 K 5.

Scanning-probe single-electron capacitance spectroscopy facilitates the study of single-electron motion in localized subsurface regions. A sensitive charge-detection circuit is incorporated into a cryogenic scanning probe microscope to investigate small systems of dopant atoms beneath the surface of semiconductor samples.

-Sonda de varredura único elétron Espectroscopia de capacitância

The integration of low-temperature scanning-probe techniques and single-electron capacitance spectroscopy represents a powerful tool to study the ...

Quantum State Engineering of Light with Continuous-wave Optical Parametric Oscillators

Engineering non-classical states of the electromagnetic field is a central quest for quantum optics1,2. Beyond their fundamental significance, such states are indeed the resources for implementing various protocols, ranging from enhanced metrology to quantum communication and computing. A variety of devices can be used to generate non-classical states, such as single emitters, light-matter interfaces or non-linear systems3. We focus here on the use of a continuous-wave optical parametric oscillator3,4. This system is based on a non-linear &#967;2 crystal inserted inside an optical cavity and it is now well-known as a very efficient source of non-classical light, such as single-mode or two-mode squeezed vacuum depending on the crystal phase matching. 
Squeezed vacuum is a Gaussian state as its quadrature distributions follow a Gaussian statistics. However, it has been shown that number of protocols require non-Gaussian states5. Generating directly such states is a difficult task and would require strong &#967;3 non-linearities. Another procedure, probabilistic but heralded, consists in using a measurement-induced non-linearity via a conditional preparation technique operated on Gaussian states. Here, we detail this generation protocol for two non-Gaussian states, the single-photon state and a superposition of coherent states, using two differently phase-matched parametric oscillators as primary resources. This technique enables achievement of a high fidelity with the targeted state and generation of the state in a well-controlled spatiotemporal mode.

We describe the reliable generation of non-Gaussian states of traveling optical fields, including single-photon states and coherent state superpositions, using a conditional preparation method operated on the non-classical light emitted by optical parametric oscillators. Type-I and type-II phase-matched oscillators are considered and common procedures, such as the required frequency filtering or the high-efficiency quantum state characterization by homodyning, are detailed.

Quantum Estadual de Engenharia de Luz com onda contínua Optical Parametric osciladores

Engineering non-classical states of the electromagnetic field is a central quest for quantum optics1,2. Beyond their fundamental significance, such states ...

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

Comprimento de Onda Único Sombra Imagem de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Locomotion incluindo a força Estimativas

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be measured to ~10 pN by a laser and sectored detector, which can be converted to image topography. Amplitude modulation or &#8220;tapping mode&#8221; AFM involves the probe making intermittent contact with the surface while oscillating at its resonant frequency to produce an image. Used in conjunction with a fluid cell, tapping-mode AFM enables the imaging of biological macromolecules such as proteins in physiologically relevant conditions. Tapping-mode AFM requires manual tuning of the probe and frequent adjustments of a multitude of scanning parameters which can be challenging for inexperienced users. To obtain high-quality images, these adjustments are the most time consuming.
PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) produces an image by measuring a force response curve for every point of contact with the sample. With ScanAsyst software, PF-QNM can be automated. This software adjusts the set-point, drive frequency, scan rate, gains, and other important scanning parameters automatically for a given sample. Not only does this process protect both fragile probes and samples, it significantly reduces the time required to obtain high resolution images. PF-QNM is compatible for AFM imaging in fluid; therefore, it has extensive application for imaging biologically relevant materials.
The method presented in this paper describes the application of PF-QNM to obtain images of a bacterial red-light photoreceptor, RpBphP3 (P3), from photosynthetic R. palustris in its light-adapted state. Using this method, individual protein dimers of P3 and aggregates of dimers have been observed on a mica surface in the presence of an imaging buffer. With appropriate adjustments to surface and/or solution concentration, this method may be generally applied to other biologically relevant macromolecules and soft materials.

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

Microscopia de Força Atômica da Red-Light fotorreceptores Usando Mapeamento PeakForce Quantitative nanomecânicos Propriedade

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

Making Record-efficiency SnS Solar Cells by Thermal Evaporation and Atomic Layer Deposition

Tin sulfide (SnS) is a candidate absorber material for Earth-abundant, non-toxic solar cells. SnS offers easy phase control and rapid growth by congruent thermal evaporation, and it absorbs visible light strongly. However, for a long time the record power conversion efficiency of SnS solar cells remained below 2%. Recently we demonstrated new certified record efficiencies of 4.36% using SnS deposited by atomic layer deposition, and 3.88% using thermal evaporation. Here the fabrication procedure for these record solar cells is described, and the statistical distribution of the fabrication process is reported. The standard deviation of efficiency measured on a single substrate is typically over 0.5%. All steps including substrate selection and cleaning, Mo sputtering for the rear contact (cathode), SnS deposition, annealing, surface passivation, Zn(O,S) buffer layer selection and deposition, transparent conductor (anode) deposition, and metallization are described. On each substrate we fabricate 11 individual devices, each with active area 0.25 cm2. Further, a system for high throughput measurements of current-voltage curves under simulated solar light, and external quantum efficiency measurement with variable light bias is described. With this system we are able to measure full data sets on all 11 devices in an automated manner and in minimal time. These results illustrate the value of studying large sample sets, rather than focusing narrowly on the highest performing devices. Large data sets help us to distinguish and remedy individual loss mechanisms affecting our devices.

Tin sulfide (SnS) is a candidate material for Earth-abundant, non-toxic solar cells. Here, we demonstrate the fabrication procedure of the SnS solar cells employing atomic layer deposition, which yields 4.36% certified power conversion efficiency, and thermal evaporation which yields 3.88%.

Fazendo Record-eficiência SnS Células solares por evaporação térmica e Deposição Camada Atómica

Tin sulfide (SnS) is a candidate absorber material for Earth-abundant, non-toxic solar cells. SnS offers easy phase control and rapid growth by congruent ...

Free-form Light Actuators &#8212; Fabrication and Control of Actuation in Microscopic Scale

Liquid crystalline elastomers (LCEs) are smart materials capable of reversible shape-change in response to external stimuli, and have attracted researchers&#39; attention in many fields. Most of the studies focused on macroscopic LCE structures (films, fibers) and their miniaturization is still in its infancy. Recently developed lithography techniques, e.g., mask exposure and replica molding, only allow for creating 2D structures on LCE thin films. Direct laser writing (DLW) opens access to truly 3D fabrication in the microscopic scale. However, controlling the actuation topology and dynamics at the same length scale remains a challenge.
In this paper we report on a method to control the liquid crystal (LC) molecular alignment in the LCE microstructures of arbitrary three-dimensional shape. This was made possible by a combination of direct laser writing for both the LCE structures as well as for micrograting patterns inducing local LC alignment. Several types of grating patterns were used to introduce different LC alignments, which can be subsequently patterned into the LCE structures. This protocol allows one to obtain LCE microstructures with engineered alignments able to perform multiple opto-mechanical actuation, thus being capable of multiple functionalities. Applications can be foreseen in the fields of tunable photonics, micro-robotics, lab-on-chip technology and others.

Here, we fabricate 3D polymeric micro/nano structures in which both the shape and the molecular alignment can be engineered with nanometer scale accuracy by the use of direct laser writing. Light induced deformation of several types of liquid crystalline elastomer microstructures can be controlled in the microscopic scale.

Atuadores de luz de forma livre - Fabricação e Controle de atuação em escala microscópica

Liquid crystalline elastomers (LCEs) are smart materials capable of reversible shape-change in response to external stimuli, and have attracted ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

Sub-nanômetros de imagem resolução com Amplitude modulação Microscopia de Força Atômica no líquido

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Quantitative Analysis of Vacuum Induction Melting by Laser-induced Breakdown Spectroscopy

Vacuum induction melting is a popular method for refining high purity metal and alloys. Traditionally, standard process control in metallurgy involves several steps, include drawing samples, cooling, cutting, transport to the laboratory, and analysis. The whole analysis process requires more than 30 minutes, which hinders on-line process control. Laser-induced breakdown spectroscopy is an excellent on-line analysis method that can satisfy the requirements of vacuum induction melting because it is fast and noncontact and does not require sample preparation. The experimental facility uses a lamp-pumped Q-switched laser to ablate melted liquid steel with an output energy of 80 mJ, a frequency of 5 Hz, a FWHM pulse width of 20 ns, and a working wavelength of 1,064 nm. A multi-channel linear charge coupled device (CCD) spectrometer is used to measure the emission spectrum in real time, with a spectral range from 190 to 600 nm and a resolution of 0.06 nm at a wavelength of 200 nm. The protocol includes several steps: standard alloy sample preparation and an ingredient test, smelting of standard samples and determination of the laser breakdown spectrum, and construction of the elements concentration quantitative analysis curve of each element. To realize the concentration analysis of unknown samples, the spectrum of a sample also needs to be measured and disposed with the same process. The composition of all main elements in the melted alloy can be quantitatively analyzed with an internal standard method. The calibration curve shows that the limit of detection of most metal elements ranges from 20-250 ppm. The concentration of elements, such as Ti, Mo, Nb, V, and Cu, can be lower than 100 ppm, and the concentrations of Cr, Al, Co, Fe, Mn, C, and Si range from 100-200 ppm. The R2 of some calibration curves can exceed 0.94.

During vacuum induction melting, laser-induced breakdown spectroscopy is used to perform real-time quantitative analysis of the main-ingredient elements of a molten alloy.

Análise quantitativa de indução a vácuo de fusão por espectroscopia de degradação induzida por laser

Vacuum induction melting is a popular method for refining high purity metal and alloys. Traditionally, standard process control in metallurgy involves ...

An Efficient Method for Selective Desalination of Radioactive Iodine Anions by Using Gold Nanoparticles-Embedded Membrane Filter

Here, we demonstrate a detail protocol for the preparation of nanomaterials-embedded composite membranes and its application to the efficient and ion-selective removal of radioactive iodines. By using citrate-stabilized gold nanoparticles (mean diameter: 13 nm) and cellulose acetate membranes, gold nanoparticle-embedded cellulose acetate membranes (Au-CAM) have easily been fabricated. The nano-adsorbents on Au-CAM were highly stable in the presence of high concentration of inorganic salts and organic molecules. The iodide ions in aqueous solutions could rapidly be captured by this engineered membrane. Through a filtration process using an Au-CAM containing filter unit, excellent removal efficiency (&gt;99%) as well as ion-selective desalination result was achieved in a short time. Moreover, Au-CAM provided good reusability without significant decrease of its performances. These results suggested that the present technology using the engineered hybrid membrane will be a promising process for the large-scale decontamination of radioactive iodine from liquid wastes.

An efficient method for the rapid and ion-selective desalination of radioactive iodine in several aqueous solutions is described by using gold nanoparticles-immobilized cellulose acetate membrane filters.