This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.

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The authors have nothing to disclose.

O crescimento de algas em um formato miniaturizado. A miniaturização de culturas de algas a um volume de 1 ml de cultura numa placa de microtitulação permite a replicação dentro de uma experiência para ser aumentado. É importante garantir a alga é saudável durante todo um experimento; executar uma curva de crescimento (Figura 2), utilizando o formato de placa de microtitulação para avaliar vários meios de algas, para garantir o cumprimento dos requisitos nutricionais da alga. Adicionalmente, pode ser importante para optimizar o ciclo diurno (períodos de luz e escuro) e temperatura. Otimização adequada para uma determinada alga pode permitir a manutenção de culturas de algas saudáveis ​​em fluorescência de pico para 26 d e para a detecção de rendimento quântico potencial depois de 140 dias (Figura 2). Minimizando os efeitos de evaporação. É importante para minimizar os efeitos de evaporação dos ensaios baseados em líquidos como um &quot;efeito de margem&quot; é geralmente observed onde há maior evaporação em cavidades na borda da placa de microtítulo de poços localizados em direcção ao meio do prato. Enquanto evaporação foi observado na borda de placas, a taxa de evaporação não se limita a duração experimental como culturas de algas saudáveis, com pico de fluorescência a 26 d foi mantida neste formato (Figura 2). Para minimizar qualquer potencial &quot;efeito de borda&quot;, 1x PBS (pH 7,4), ou outra solução estéril, é dividido em alíquotas em poços ao longo de todas as quatro bordas (colunas A e H, as linhas 1 e 6, Figura 1). Iluminação dentro de uma incubadora diurna. As placas de microtitulação deve ter todos a mesma orientação na incubadora diurna. Por exemplo, a orientação no sentido do comprimento das placas de microtitulação em uma incubadora significa que as placas são colocadas ao longo do eixo curto. Se essa orientação é usado, as culturas de algas ao longo do eixo longo BG (Figura 1) pode experienceA ligeira luz e um gradiente de temperatura em função da variação da distância da fonte de luz (lâmpada é uma fonte de luz e de calor). Isto tem sido observado para influenciar os ensaios de temperatura de algas no extremo da sua gama de temperatura. Por conseguinte, é improvável que afetam a maioria dos algas cultivadas em sua temperatura ideal. Para minimizar o impacto desta luz e temperatura gradiente de garantir que as garrafas maiores não estão a criar sombreamento, placas lugar a uma distância consistente das luzes, use sombra pano para reduzir o nível de luz, se necessário, e verificar a intensidade da luz em todo o longo eixo do incubadora diurna para garantir que ele se desloca de maneira uniforme. A adaptação ao escuro de amostras de algas para ÁGUA-PAM fluorometria. Antes de proceder a ÁGUA-PAM leituras é importante adaptar-escuro as amostras de algas, de modo que os centros reaccionais Station II são totalmente aberta e a induzida pela luz transtilacoidal gradiente de pH seja dissipada thdando-nos verdadeiro o F e valores de F m de partida para calcular F v / F m. Amostragem da alga a partir do ensaio para as medições ÁGUA-PAM no meio da fase de escuridão do ciclo diurno (isto é, para um 16: 8 hr de luz: ciclo escuro, uma sessão de 2 horas de amostragem deve ser executada a partir de T (escuro) = 3-5 h) faz tempo escuro adaptação mais curto (3-5 minutos) em comparação com o meio do ciclo de luz (T (luz) = 7-9 h) quando a adaptação ao escuro é mais longa (&gt; 20 min) 17. Tempo de adaptação escuro da alga também irá variar dependendo das espécies de algas, as condições de crescimento e as condições de luz de sua gama de habitat natural. Sensibilidade de leituras fluorometria WATER-PAM. A água-PAM foi projetado para ser um fluorometer ultrasensitive capaz de detectar F, F 0 e F m de amostras de baixa clorofila como o oceano superfície de água 16. Por conseguinte, é ideal para um miniatuzado bioensaio em que as amostras podem ser diluídas. Devido a esta sensibilidade é importante compreender que a máquina ÁGUA-PAM tem um limite superior de leituras de fluorescência (isto é, F, F 0 e / ou F m) se a amostra não é suficientemente diluído (Figura 4). Dentro do software WinControl os valores máximos são de primeira perceptível depois de pressionar F 0 e lendo a F 0 (logo após a adaptação ao escuro). Por conseguinte, o F e F m são no valor máximo 4056 (Figura 4, no. 2286). Os valores máximos de F e F m depender do tipo de meio de algas que é usado para calibrar o ÁGUA-PAM, mas as amostras acima do limite de detecção pode ser facilmente identificado por leituras repetidas com o mesmo valor máximo ocorre até que a amostra está suficientemente diluído . Depois de uma diluição de 1: 1 em meios de algas, a menos concentrada é adaptado ao escuro novamente e a medição F 0 foi repetido. O valor de F umppears a ser medido correctamente, mas o m M ainda está a ler o valor máximo de 4056 (Figura 4, no. 2287). Esta amostra foi de novo diluído a 1: (. Figura 4, não 2288) 1 em meios de algas e novamente escuro adaptados para mais 3 minutos antes de tomar uma outra F 0 leitura e leituras válidas foram obtidas, de modo que a próxima medição (M) é tomada e o / m cálculo F F v é válido. Neste exemplo, a amostra foi diluída duas vezes em uma proporção de 1: 1 com meio, que deve ser tido em conta no cálculo de F e F 0 m. É importante notar que F v / F m, como uma função directa do F 0 e F m, é calculado de forma incorrecta se as amostras são muito concentrada, apesar de ser uma expressão adimensional de saúde fotossintética. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52455/52455fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4. WinControl exibição de várias leituras ÁGUA-PAM fluorometria de uma amostra de algas sendo sequencialmente diluído para atingir a diluição correta. Esta figura apresenta leituras de fluorescência de algas que alcançam o limite superior da máquina de água-PAM (caixa vermelha) e aqueles em que a diluição adequada da amostra foi alcançado (caixa verde). Além disso, esta figura ilustra algumas das outras variáveis ​​que este método calcula, mas estes não são discutidos em detalhe aqui (ver comentários 13,16,20-22). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52455/52455fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A contaminação bacteriana. Em todos os experimentos de algas, os controles de algas são necessárias como uma linha de base de saúde de algas, por isso é imperativo que se mantenha livre de contaminação bacteriana durante todo o experimento. A contaminação bacteriana ocorre facilmente como não existe nenhumselecção (como antibióticos) e fotossíntese produz constantemente novos carbono orgânico para o crescimento bacteriano. As duas formas mais importantes para evitar a contaminação é assegurar a esterilidade de todas as soluções (por exemplo, meios de algas, 1x PBS, pH 7,4) e equipamentos a T = 0 d do experimento e para manter a técnica asséptica durante o manuseamento das placas de microtitulação. A experiência deve ser monitorizado para a contaminação em cada ponto de tempo através do plaqueamento de uma aliquota de 20 ul de todos os poços de controlo de algas. Se a contaminação é observada a partir de qualquer dos poços de controlo de algas, em seguida, essas leituras fluorometria ÁGUA-PAM deve notar-se e excluídos da análise dos dados. Se uma solução usado para configurar a experiência faz com que toda a experiência de estarem contaminados, em seguida, descartar a experiência e todos os reagentes contaminados e começar de novo. Os controles de bactérias e algas bacteriana-co-culturas também podem contaminar-se e placas de agar utilizados para contagem de ufc bacterianas devem ser monitorados para Morphol colônia suplentegias. Bem-a-poço contaminação cruzada pode ocorrer ao remover a tampa da placa de microtitulação, mas é facilmente evitado não basculante ou agitação das placas e utilizando uma técnica asséptica numa campânula de fluxo laminar ou perto de uma chama. Aplicações futuras. Este pequeno bioassay volume fornece um método rápido de rastreio para microalgas através da combinação de um formato de placa de microtitulação com água-PAM fluorometria. Exemplos de futuras aplicações são várias, e poderia incluir fluorometria Imagem PAM, que fornece insights sobre variação célula-célula de saúde PSII dentro de uma população como ele executa PAM fluorometria em células individuais 24. O bioensaio também pode ser combinado com microscopia e citometria de fluxo, como discutido anteriormente. Outra combinação com o potencial de proporcionar uma visão mais é coloração de células para citometria de fluxo e microscopia para elucidar a variação morfológica no subpopulações da cultura de algas.

Fisiologia fitoplâncton tem sido tradicionalmente estudadas em experimentos meso-escala que varia de 20 ml em frascos cónicos de 5 L em garrafões 1-7. Esta escala experimental requer subsampling para o monitoramento experimental, como sacrificar amostras idênticas, para cada ponto de tempo cria uma montagem experimental incontrolável. A capacidade para aumentar o número de experiências independentes utilizando o mesmo espaço incubadora diurna ao miniaturizar o volume experimental para experiências fisiológicas algas vai reduzir ou eliminar as limitações de sub-amostragem e pseudo-replicação a partir de grandes volumes. Um formato de placa de microtitulação foi desenvolvido para bioensaios de algas, utilizando um volume de 1 ml de cultura para manipulação experimental algas em condições variáveis. Este pequeno volume experimental permite o número de repetições de ser aumentada, aumenta a reprodutibilidade experimental devido a uma menor variabilidade entre as amostras replicadas eexperiências, e permite a replicação verdadeira, mantendo controles experimentais (ou seja, culturas de algas axênicos) para 140 dias (Figura 2) 12. Este formato de placa de microtitulação é facilmente adaptado para uma variedade de questões experimentais, tais como: não uma bactéria ter uma interacção simbiótica, neutro ou patogénica com o seu hospedeiro de algas? É a adição de um composto estimulante ou tóxico para uma alga? Estas e outras questões podem ser abordadas de uma forma de alto rendimento rápido, utilizando este novo formato 9-11. Uma placa de 48 poços de cultura de microtitulação permite a cada poço 1 ml de ser uma montagem experimental independente que é amostrada num único ponto de tempo. Vários parâmetros podem ser amostrados a partir desse volume de 1 ml, incluindo, mas não limitados a: a fluorescência e os parâmetros fotoquímicos utilizando-amplitude modulada ÁGUA-Pulse (WATER-PAM) fluorometria (ver Materiais e Equipamento tabela) 13. ÁGUA-PAM fluorometria é uma técnica rápida e não-invasiva, que pode ser utilizado para monitorizar as experiências realizadas com 13 algas. Ele permite a medição da eficiência fotossintética e saúde PSII de um pequeno volume de cultura (150-300 mL de cultura diluída em meio a um 2 - Volume 4 ml de água-PAM) 14,15. Além ÁGUA-PAM fluorometria, esta configuração pode ser usada para medir uma variedade de outros parâmetros, incluindo, mas não limitados a: a microscopia para visualizar as bactérias associadas às células de algas e as alterações na morfologia de células de algas; colônia de bactérias (UFC) contagens de unidade; e citometria de fluxo para a contagem de células de algas e as subpopulações de identificação.

<table><tbody><tr><td>10 cu. ft. Diurnal incubator (6012-1)</td><td>Caron Corporate</td><td>112310-6012-1-11</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.caronproducts.com&quot;&gt;www.caronproducts.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, Vent/Close Cap, 7 ml working volume, 200/cs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N156340</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.ca&quot;&gt;www.fishersci.ca&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Multiwell TC Plates &amp;ndash; 48-well</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>353078</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com/&quot;&gt;www.bdbiosciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>P1000 Gilson The Pipetting Standard&amp;mdash;Gilson&#039;s Pipetman</td><td>Mandel Scientific Company Inc.</td><td>GF-F123602</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mandel.ca&quot;&gt;www.mandel.ca&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>P10mL Gilson The Pipetting Standard&amp;mdash;Gilson&#039;s Pipetman</td><td>Mandel Scientific Company Inc.</td><td>GF-F161201</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mandel.ca&quot;&gt;www.mandel.ca&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Wide Orifice Tips nonsterile [100&amp;ndash;1,250 &amp;micro;l]</td><td>VWR International</td><td>89079-468</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ca.vwr.com&quot;&gt;www.ca.vwr.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ultrafine Tips nonsterile [100&amp;ndash;1,250 &amp;micro;l]</td><td>VWR International</td><td>89079-470</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ca.vwr.com&quot;&gt;www.ca.vwr.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml]</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9402151</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.ca&quot;&gt;www.fishersci.ca&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED)</td><td>Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany</td><td>EDEE0232</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.walz.com&quot;&gt;www.walz.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K)</td><td>Caron Corporate</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.caronproducts.com&quot;&gt;www.caronproducts.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Sodium chloride (crystalline/certified ACS), Fisher Chemical</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.ca&quot;&gt;www.fishersci.ca&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BD Difco Marine Broth 2216</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com&quot;&gt;www.bdbiosciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BD Bacto Agar</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com&quot;&gt;www.bdbiosciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>L1 Medium Kit, 50 L</td><td>NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota</td><td>NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ncma.bigelow.org&quot;&gt;www.ncma.bigelow.org&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

a small volume bioassay to assess bacterial/phytoplankton co-culture using water-pulse-amplitude-modulated (water-pam) fluorometry

Os métodos convencionais para manipulação experimental de microalgas têm empregado grandes volumes de cultura (20 ml a 5 L), de modo que a cultura pode ser sub-amostrado ao longo da experiência 1-7. A subamostragem de grandes volumes pode ser problemática por várias razões: 1) que provoca variação no volume total e a área superficial: proporção em volume da cultura durante a experiência; 2) pseudo-replicação (isto é, a partir de duplicados de amostras ao mesmo balão de tratamento 8) é muitas vezes utilizados em vez de repetições verdadeiras (isto é, a amostragem de tratamentos replicados); 3) A duração da experiência é limitado pelo volume total; e 4) culturas axênicas ou a microbiota bacteriana normal são difíceis de manter, durante experimentos de longa duração como a contaminação geralmente ocorre durante subamostragem. A utilização de placas de microtitulação permite volumes de 1 ml de cultura a serem utilizados para cada replicado, com até 48 tratamentos separados dentrouma placa de 12,65 cm x 8,5 x 2,2, diminuindo desse modo o volume e permitindo experimental para replicação extensiva subamostragem sem qualquer tratamento. Além disso, esta técnica pode ser modificado para caber uma variedade de formatos, incluindo: experimentais bacteriana-co-culturas de algas, algas, exames de fisiologia e toxina de rastreio 9-11. Pode ser amostrado poços individuais com uma alga, bactéria e / ou co-culturas para numerosos procedimentos laboratoriais, incluindo, mas não limitados a: ÁGUA-Pulse-amplitude modulada (WATER-PAM) fluorometria, microscopia, colónia bacteriana forming unit (ufc) condes e citometria de fluxo. A combinação do formato de placa de microtitulação e água-PAM fluorometria permite múltiplas medições rápidas de rendimento fotoquímico e outros parâmetros fotoquímicos com baixa variabilidade entre as amostras, de alta reprodutibilidade e evita as muitas armadilhas de subamostragem um garrafão ou erlenmeyer sobre o curso de um experimento .

Leituras fluorometria WATER-PAM. ÁGUA-Pulse-Amplitude Modulada (PAM) fluorometria é um método rápido e eficiente para determinar a fluorescência (um proxy para o teor de clorofila) e produção fotossintética (saúde PSII) de culturas de algas. O software PAM WinControl gera uma planilha de valores de dados em bruto para (a seguir estão os parâmetros básicos para escuras adaptado amostras de algas): F 0 = fluorescência das células de adaptação ao escuro F = fluorescência máxima m após saturação diodos emissores de luz (LED) de pulso F v / F m = (F m -F 0) / F m = rendimento quântico potencial de um escuro adaptado amostra 19 PAM fluorometria tem muitos usos e pode dar um monte de informações sobre o fotossistema e saúde da alGAE. Além disso, existem outros parâmetros que são importantes quando da análise de amostras de luz adaptado. Para continuar a ler estes são discutidos em detalhe nestes comentários 13,16,20-23. Estes dados podem ser transferidos para um software de folha de cálculo ou de gráficos, para gerar gráficos da fluorescência de algas inicial (0 F), de algas a fluorescência máxima (F m), e o potencial de rendimento quântico (F v / F m; Figuras 2 e 3) . Os gráficos na Figura 3 ilustram como a fluorescência de algas e F v / F m são influenciados pela bactéria através da comparação da alga cultivadas isoladamente (controlo) a que fosse cultivado com a bactéria em co-cultura durante todo o dia 10 de co-cultura experimento (Figura 3C). Neste exemplo, foi utilizado um teste t de duas amostras para comparar os parâmetros estatisticamente entre os dois tratamentos em cada dia. Do mesmo modo, para as experiências em que mais do que dois tratamentos estão presentes, uma ANOVA poderiaser utilizado. O F m leitura (Figura 3B) é levado diretamente após a saturação de pulso LED, o que significa o PSII QA receptor de elétrons primário é completamente reduzido e não pode aceitar mais elétrons do PSII centro de reação P680 e, como tal, todos os centros de reação são &#39; fechado &quot;17. Isso dificulta o uso fotoquímica de energia da luz, trazendo emissão de fluorescência a um máximo. Este, em seguida, dá a leitura de fluorescência máxima (F m). A Figura 3C ilustra um declínio dramático na saúde FSII entre 5 e d 10 d quando co-cultivadas com a bactéria em comparação com o crescimento apenas (controlo). As barras de erro padrão são derivados a partir de poços de microtitulação em triplicado, os quais são experiências independentes das mesmas culturas de bactérias e de algas parentais. O erro padrão pequeno consistentemente confirma a robustez e reprodutibilidade do formato de placa de microtitulação, para bioensaios de algas, pois permite experiências independentes para ser utilizado como replicados e elimina a necessidade de subamostra da unidade experimental ao longo da duração da experiência. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52455/52455fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. Gráficos representativos ÁGUA-PAM fluorometria de uma curva de crescimento de 140 d huxleyi Emiliania axênica (CCMP3266). (A) Leituras de fluorescência de algas inicial (0 F), (B) de fluorescência máxima de algas (F m), e ( C) rendimento quântico potencial (F v / F m) para E. huxleyi são mostrados como círculos pretos. A linha de melhor ajuste para F 0 e F m foi parâmetro normal de log 3 (SigmaPlot) R 2 = 0,94, 0,95, respectivamente. Rendimento potencial quântico (F v / F m) é uma expressão sem dimensão da saúde fotossintética, que é calculado como (F m - F 0) / F m. A linha de melhor ajuste para o / F m curva F v foi um 3 fator polinomial R 2 = 0,6. As barras de erro representam o erro padrão entre os poços em triplicado. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52455/52455fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52455/52455fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. O representante gráficos ÁGUA-PAM fluorometria de 10 d co-cultura experimento de Emiliania huxleyi (CCMP3266) com Phaeobacter gallaeciensis BS107. (A) A fluorescência de algas inicial (F 0), (B) de fluorescência de algas máxima (F m) e (C) rendimento quântico potencial (F v / F m) são representados graficamente para control de algas (círculos abertos) e da alga co-cultivadas com uma bactéria (círculos pretos). Rendimento quântico potencial (F v / F m) é uma expressão sem dimensão da saúde fotossintética, que é calculado como (F m - F 0) / F m. As barras de erro representam o erro padrão entre poços em triplicado. Um asterisco (*) indica os dias em que os parâmetros para os tratamentos de controle e co-cultura difere significativamente. As diferenças entre tratamentos para todos os dias não foi significativo, excepto para 10 d em todos os três parâmetros (10 d - F 0: t-teste, df = 2,5, t-rácio = -15, p = 0,0017 *; F m: t- teste, df = 2,1, t-ratio = -16,15, p = 0,003 *; F v / F m:. t-test, df = -18,68, t-ratio = 2,0, p = 0,0028 *) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52455/52455fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.

A Volume Bioassay pequeno para avaliar Bacteriana / fitoplâncton Co-cultura utilizando água-Pulse-Amplitude Modulada (água-PAM) Fluorometria

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

10.5K visualizações.  University of Alberta. The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Imunologia e Infecção

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling protocols include the assessment of resources available to the microbial community (dissolved organic carbon, particulate organic matter, inorganic nutrients), and a comprehensive description of the viral and bacterial communities (via direct viral and microbial counts, enumeration of autofluorescent microbes, and construction of viral and microbial metagenomes). We use a combination of methods, which represent a dispersed field of scientific disciplines comprising already established protocols and some of the most recent techniques developed. Especially metagenomic sequencing techniques used for viral and bacterial community characterization, have been established only in recent years, and are thus still subjected to constant improvement. This has led to a variety of sampling and sample processing procedures currently in use. The set of methods presented here provides an up to date approach to collect and process environmental samples. Parameters addressed with these protocols yield the minimum on information essential to characterize and understand the underlying mechanisms of viral and microbial community dynamics. It gives easy to follow guidelines to conduct comprehensive surveys and discusses critical steps and potential caveats pertinent to each technique.

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

Desvendando os jogadores invisíveis no Oceano - Um Guia de Campo para Química da Água e Microbiologia Marinha

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

Ambiente

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Dish microtitulação Assay formação de biofilme

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Bioengenharia

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

Caracterização de biofilmes aquáticos com citometria de fluxo

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

Bactérias rotuladas fluorescently como um Tracer para revelar novas vias de fluxo de carbono orgânico em ecossistemas aquáticos

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of antibiotic-tolerant infections. Biofilms have displayed an exceptionally high tolerance for chemotherapy, which is thought to be multifactorial. For instance, the matrix provides a physical barrier that decreases the penetration of antibiotics into the biofilm. Also, cells within the biofilms are phenotypically diverse. Likely, biofilm resilience arises from a combination of these and other, yet unknown, mechanisms. All of the currently existing antibiotics have been developed against single-cells (planktonic) bacteria. Therefore, so far, a very limited repertoire of molecules exists that can selectively act on mature biofilms. This situation has driven a progressive paradigm shift in drug discovery, in which searching for anti-biofilms has been urged to occupy a more prominent place. An additional challenge is that there are a very limited number of standardized methods for biofilm research, especially those that can be used for large-throughput screening of chemical libraries. Here, an experimental anti-biofilm platform for chemical screening is presented. It uses three assays to measure biofilm viability (with resazurin staining), total biomass (with crystal violet staining), and biofilm matrix (using a wheat germ agglutinin, WGA-fluorescence-based staining of the poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG, fraction). All the assays were developed using Staphylococcus aureus as the model bacteria. Examples of how the platform can be used for primary screening as well as for functional characterization of identified anti-biofilm hits are presented. This experimental sequence further allows for the classification of the hits based upon the measured end-points. It also provides information on their mode of action, especially on long-term versus short-term chemotherapeutic effects. Thus, it is very advantageous for the quick identification of high-quality hit compounds that can serve as starting points for various biomedical applications.

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

A Plataforma de Ensaios Anti-biofilme adequado para a Exploração de bibliotecas de compostos naturais

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Operation of Laboratory Photobioreactors with Online Growth Measurements and Customizable Light Regimes

The laboratory study of microalgae can be experimentally challenging. In addition to the cultivation requirements of non-photosynthetic microorganisms, phototrophs also require illumination. Routinely, researchers seek to provide custom light supplies, i.e., vary the light intensity and time over which it is delivered. Such flexibility is difficult with standard benchtop lights. Usually, cultivation studies also require growth comparisons between experimental treatments. Frequently, growth is assessed over an extended duration, e.g., multiple times a day over a week-long trial. Manual measurements can be time-consuming and lack data resolution. Therefore, photobioreactors (PBRs) with automatic growth monitoring and customizable light supply are useful for replicated experiments with multiple treatments. The current work presents the design, construction, and operation of laboratory PBRs. The materials are easily sourced and relatively inexpensive. The design could be duplicated with moderate skill. Each structure has a footprint of ~40 cm2 and hosts three 1 L glass bottles for triplicate replication. Bottles rest upon platforms containing magnetic stirrers and are arranged vertically within a 1 m high and 15 cm diameter polyvinyl chloride (PVC) pipe. The pipe interior is lined with light-emitting diodes (LEDs). These LEDs produce continuous light intensities from 0&#8211;2400 &#181;mol photons m-2 s-1 of photosynthetically active radiation (PAR). Users design a custom lighting program. The light intensity can be adjusted each second or held constant for longer durations. Oxygen produced from photosynthesis exits each bottle via a one-way volumetric gas sensor. Software is used to record gas sensor data. The amount of oxygen produced can be correlated to biomass growth. If biomass samples are required, a syringe can be used to extract culture. The method is suited for microalgae grown with bicarbonate as the carbon source. These PBRs are valuable to a laboratory that requires replicated experiments, light regime flexibility, and continuous high-resolution growth data.

This publication describes the design of laboratory photobioreactors (PBRs) with customizable light regimes. The growth of cyanobacteria or microalgae, using bicarbonate as their carbon source, is monitored continuously by measuring volumetric oxygen production. These PBRs facilitate rapid, replicated laboratory growth comparisons with little user intervention during experiments.

Operação de Fotobioreatores laboratoriais com Medições de Crescimento Online e Regimes de Luz Personalizáveis

The laboratory study of microalgae can be experimentally challenging. In addition to the cultivation requirements of non-photosynthetic microorganisms, ...

Biologia

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf can measure PSII absorption cross-section (&#963;PSII), maximum photochemical efficiency (Fv/Fm), effective photochemical efficiency (Fq&#8242;/Fm&#8242;), and non-photochemical quenching (NPQNSV) for various eukaryotic algae and cyanobacteria, almost all FRRf studies to date have focused on phytoplankton. Here, the protocol describes how to measure PSII photophysiology of an epizoic alga Colacium sp.&#160;Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), in its attached stage (attached to zooplankton), using cuvette-type FRRf. First, we estimated the effects of substrate zooplankton (Scapholeberis mucronata O.F. M&#252;ller 1776, Cladocera, Daphniidae) on baseline fluorescence and &#963;PSII, Fv/Fm, Fq&#8242;/Fm&#8242;, and NPQNSV of planktonic Colacium sp. To validate this methodology, we recorded photophysiology measurements of attached Colacium sp. on S. mucronata and compared these results with its planktonic stage. Representative results showed how the protocol could determine the effects of calcium (Ca) and manganese (Mn) on Colacium sp. photophysiology and identify the various effects of Mn enrichment between attached and planktonic stages. Finally, we discuss the adaptability of this protocol to other periphytic algae.

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II photophysiology and primary productivity. Here we describe a protocol to measure PSII photophysiology of epizoic alga, Colacium sp. on substrate zooplankton using cuvette-type FRRf.

Medindo fotofisiologia do estágio anexado de Colacium sp. por um fluorômetro de taxa de repetição rápida do tipo cuvette

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

An Assay to Measure the Accumulation of a Fluorescent Antibiotic Probe in Bacterial Cells

For probe accumulation analysis, streak glycerol stocks of the bacterial strains onto LB agar plates for an overnight incubation at 37 degrees Celsius. The next morning, pick a single colony from the plate for overnight culture in lysogeny broth at 37 degrees Celsius. The next morning, dilute the overnight culture approximately 50-fold in fresh medium.
When the culture reaches mid-log phase, pellet the bacteria by centrifugation, and decant the medium. Resuspend the bacteria in 1 milliliter of PBS, and centrifuge the bacteria again. Decant the supernatant, and resuspend the washed pellet in PBS to an optical density at 600 nanometers of two.
Add 10.1 microliters of 10 millimolar CCCP in PBS to 1 milliliter of bacteria, and incubate the bacteria at 37 degrees Celsius for 10 minutes. At the end of the incubation, collect the bacteria by centrifugation, and resuspend the pellet in 1 milliliter of 10-to-100 micromolar fluorescent antibiotic solution in PBS.
After a 30-minute incubation at 37 degrees Celsius, wash the cells by centrifugation four times in 1 milliliter of cold PBS per wash. After the wash, lyse the bacteria with 180 microliters of lysis buffer, and 70 microliters of lysozyme.
After 30 minutes at 37 degrees Celsius, freeze-thaw the bacteria three times at minus 78 degrees Celsius for 5 minutes and 34 degrees Celsius for 15 minutes respectively. After the last round of freeze-thawing, sonicate the sample for 20 minutes, followed by a 30-minute incubation at 65 degrees Celsius.
At the end of the incubation, collect the lysed sample by centrifugation, and strain the tube contents through a 10-kilodalton filter membrane. Wash the filter four times with 100 microliters of water per wash, and aliquot each wash into individual wells of a black flat-bottom 96-well plate. Then measure the fluorescence intensity on a plate reader with excitation and emission wavelengths appropriate to the fluorophore.